Name: sequencing of mrna from whole blood using nanopore sequencing
Uploaded: 2019-06-03T13:00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing at JoVE.com

Авторы благодарят Элисон Гросет за критическое чтение рукописи. Эта работа была финансово поддержана федеральным министерством продовольствия и сельского хозяйства Германии (BMEL) на основе решения парламента Федеративной Республики Германия через Федеральное ведомство по сельскому хозяйству и продовольствию (BLE).

<ol>
	<li>Shendure, J., Ji, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+DNA+sequencing.">Next-generation DNA sequencing.</a> Nature Biotechnology. 26 (10), 1135-1145 (2008).</li><li>Shendure, J., Lieberman Aiden, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expanding+scope+of+DNA+sequencing.">The expanding scope of DNA sequencing.</a> Nature Biotechnology. 30 (11), 1084-1094 (2012).</li><li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+next-generation+sequencing+systems.">Comparison of next-generation sequencing systems.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, 251364 (2012).</li><li>Levy, S. E., Myers, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advancements+in+Next-Generation+Sequencing.">Advancements in Next-Generation Sequencing.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 17, 95-115 (2016).</li><li>Lu, H., Giordano, F., Ning, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxford+Nanopore+MinION+Sequencing+and+Genome+Assembly.">Oxford Nanopore MinION Sequencing and Genome Assembly.</a> Genomics, Proteomics &amp; Bioinformatics. 14 (5), 265-279 (2016).</li><li>Jain, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanopore+sequencing+and+assembly+of+a+human+genome+with+ultra-long+reads.">Nanopore sequencing and assembly of a human genome with ultra-long reads.</a> Nature Biotechnology. 36 (4), 338-345 (2018).</li><li>Hoenen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanopore+Sequencing+as+a+Rapidly+Deployable+Ebola+Outbreak+Tool.">Nanopore Sequencing as a Rapidly Deployable Ebola Outbreak Tool.</a> Emerging Infectious Diseases. 22 (2), 331-334 (2016).</li><li>Quick, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time,+portable+genome+sequencing+for+Ebola+surveillance.">Real-time, portable genome sequencing for Ebola surveillance.</a> Nature. 530 (7589), 228-232 (2016).</li><li>Carette, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ebola+virus+entry+requires+the+cholesterol+transporter+Niemann-Pick+C1.">Ebola virus entry requires the cholesterol transporter Niemann-Pick C1.</a> Nature. 477 (7364), 340-343 (2011).</li><li>Ndungo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Single+Residue+in+Ebola+Virus+Receptor+NPC1+Influences+Cellular+Host+Range+in+Reptiles.">A Single Residue in Ebola Virus Receptor NPC1 Influences Cellular Host Range in Reptiles.</a> mSphere. 1 (2), (2016).</li><li>Martin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+siRNA+screen+identifies+a+druggable+host+pathway+essential+for+the+Ebola+virus+life+cycle.">A genome-wide siRNA screen identifies a druggable host pathway essential for the Ebola virus life cycle.</a> Genome Medicine. 10 (1), 58 (2018).</li><li>Roehr, J. T., Dieterich, C., Reinert, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flexbar+3.0+-+SIMD+and+multicore+parallelization.">Flexbar 3.0 - SIMD and multicore parallelization.</a> Bioinformatics. 33 (18), 2941-2942 (2017).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sequence+Alignment/Map+format+and+SAMtools.">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li><li>Kielbasa, S. M., Wan, R., Sato, K., Horton, P., Frith, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+seeds+tame+genomic+sequence+comparison.">Adaptive seeds tame genomic sequence comparison.</a> Genome Research. 21 (3), 487-493 (2011).</li><li>Don, R. H., Cox, P. T., Wainwright, B. J., Baker, K., Mattick, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Touchdown'+PCR+to+circumvent+spurious+priming+during+gene+amplification.">Touchdown' PCR to circumvent spurious priming during gene amplification.</a> Nucleic Acids Research. 19 (14), 4008 (1991).</li><li>Korbie, D. J., Mattick, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Touchdown+PCR+for+increased+specificity+and+sensitivity+in+PCR+amplification.">Touchdown PCR for increased specificity and sensitivity in PCR amplification.</a> Nature Protocols. 3 (9), 1452-1456 (2008).</li><li>Keller, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+RNA+Sequencing+of+the+Coding+Complete+Influenza+A+Virus+Genome.">Direct RNA Sequencing of the Coding Complete Influenza A Virus Genome.</a> Scientific Reports. 8 (1), 14408 (2018).</li><li>Greninger, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+metagenomic+identification+of+viral+pathogens+in+clinical+samples+by+real-time+nanopore+sequencing+analysis.">Rapid metagenomic identification of viral pathogens in clinical samples by real-time nanopore sequencing analysis.</a> Genome Medicine. 7, 99 (2015).</li><li>Castro-Wallace, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanopore+DNA+Sequencing+and+Genome+Assembly+on+the+International+Space+Station.">Nanopore DNA Sequencing and Genome Assembly on the International Space Station.</a> Scientific Reports. 7 (1), 18022 (2017).</li><li>Goordial, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Situ+Field+Sequencing+and+Life+Detection+in+Remote+(79+degrees+26'N)+Canadian+High+Arctic+Permafrost+Ice+Wedge+Microbial+Communities.">In Situ Field Sequencing and Life Detection in Remote (79 degrees 26'N) Canadian High Arctic Permafrost Ice Wedge Microbial Communities.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 2594 (2017).</li><li>Runtuwene, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanopore+sequencing+of+drug-resistance-associated+genes+in+malaria+parasites,+Plasmodium+falciparum.">Nanopore sequencing of drug-resistance-associated genes in malaria parasites, Plasmodium falciparum.</a> Scientific Reports. 8 (1), 8286 (2018).</li><li>Rang, F. J., Kloosterman, W. P., de Ridder, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+squiggle+to+basepair:+computational+approaches+for+improving+nanopore+sequencing+read+accuracy.">From squiggle to basepair: computational approaches for improving nanopore sequencing read accuracy.</a> Genome Biology. 19 (1), 90 (2018).</li></ol>

TH участвовал в программе «Оксфорд Наномор-технологии» (ОНТ) по раннему доступу с 2014 до 2015, и получил устройства Миньона и ячейки потока для предыдущего исследования 7 , проведенного национальными институтами здоровья, США, бесплатно или по сниженным расходам . Он был приглашен ОНТ представить часть этой работы на Лондонской вызова 2015 совещание в Лондоне, Великобритания, и ОНТ оплачивается для транспортировки и проживания. За работу, представленную в этой рукописи, не было получено никаких пособий (например, аппаратных средств или реагентов по сниженным затратам, возмещению путевых расходов и т.д.) из ОНТ. AM, КФ и РС нечего раскрывать.

За последние два десятилетия секвенирование биологических образцов стало все более важным аспектом исследований в широком диапазоне предметно-значимых областей. Разработка систем секвенирования второго поколения на основе последовательности плотных массивов ДНК с использованием итеративных циклов ферментативной манипуляции и сбора данных на основе изображений1 резко увеличила пропускную способность по сравнению с традиционного метода секвенирования Сэнгера, и позволяет анализировать несколько образцов, а также различные виды нуклеиновых кислот в данном образце параллельно4. Однако для большинства широко используемых систем второго поколения производится только короткое считывает, и все платформы полагаются на чувствительное, громоздкое и дорогостоящее оборудование3,4.
В отличие от платформ секвенирования второго поколения, используемое в данном протоколе устройство секвенирования основано на технологии наноруды. Здесь молекула одноцепочечной нуклеиновой кислоты проходит через наноруду, что приводит к модуляции ионного течения, которое также течет через те же наноруды, и которые могут быть измерены и обратно-перевод вывести последовательность молекулы нуклеиновой кислоты. Такой подход к секвенированию третьего поколения придает ряд преимуществ по сравнению с другими подходами. Основные преимущества, которые непосредственно связаны с уникальным рабочим принципом этой технологии являются чрезвычайно долго читать длина производства (читать длины до 8,8 х 105 нуклеотиды были зарегистрированы6), способность последовательности не только ДНК, но также РНК напрямую, которая недавно была продемонстрирована для полного генома вируса гриппа17, и способность анализировать данные в режиме реального времени, как они создаются, что позволяет быстрое метагеномики обнаружения патогенов в течение минут18. Дополнительными практическими преимуществами являются крайне небольшие размеры устройства секвенирования наноруд, позволяющие использовать его в любой лаборатории или на полевых миссиях в отдаленные места19,20, и низкую цену по сравнению с другими секвенированием Платформ. Что касается затрат на запуск, то в настоящее время для каждого запуска последовательности требуется новая ячейка потока, которая приводит к затратам в размере около $1 100 за пробег для реагентов по подготовке потока и библиотек. Эти затраты могут быть сокращены в некоторых случаях путем промывки и повторного использования ячейки потока, или путем штрихкодирования и секвенирования нескольких образцов в одном запуске. Кроме того, новый тип потока ячейки в настоящее время бета-тестирования небольшого числа лабораторий, которые потребуют использования адаптера ячейки потока (так называемый "flongle"), и должны значительно уменьшить расход ячейки цена и, таким образом, расходы.
Основные недостатки последовательности наноруды остается его точностью, с одним читать точности в диапазоне от 83 до 86% сообщается6,21,22, и большинство из неточностей, вызванных вставки/удалений ( indels)5,21. Тем не менее, высокая глубина чтения может компенсировать эти неточности, и недавнее исследование предложил на основе теоретических соображений, что чтение глубина > 10 может увеличить общую точность, чтобы > 99.8%21. Тем не менее потребуются дальнейшие улучшения в точности, особенно если анализ будет выполняться на одном уровне молекул, а не на уровне консенсусной последовательности. Использование технологии 1D2 , описанной в этом протоколе, основанный на добавлении адаптеров 1d2 и штрих-кодов (см. раздел 5,5), которые приводят к тому, что обе нити одной молекулы ДНК секвенированы одним и тем же наноштуф, увеличивает прочитанное точность, поскольку информация из обеих нитей ДНК может быть использована для определения последовательности. Кроме того, обходной стратегии, которые могут быть продолжены для того, чтобы объединить преимущества секвенирования наноруды (особенно долго читать длина) с более высокой точностью других технологий секвенирования является использование наноруды секвенирования информации как эшафот, который является затем полируется с помощью секвенирования данных с других платформ6.
Наиболее важным фактором успеха протокола, представленного здесь, является качество выборки и, в частности, количество и качество извлеченной РНК. Надлежащее хранение и быстрое извлечение РНК помогают в достижении адекватного выхода РНК. Использование надлежащих труб для сбора крови позволяет хранить пробы крови в течение одного месяца, но свертывание крови может быть проблемой, особенно когда образцы хранятся при повышенных температурах, которые могут быть в случае полевых условиях. Второй критический шаг является усиление целевых последовательностей, и особенно в полевых условиях, реакции ЦР часто выполняют менее хорошо, чем в стандартных лабораторных условиях7. С этой целью тщательное проектирование грунтовки и оптимизация имеет первостепенное значение для достижения надежного усиления. Кроме того, вложенные ЦР-подходы и СР-посадки, используемые в этом протоколе, могут увеличить как специфичность, так и чувствительность целевого амплификации генов4,7. В самом деле, по нашему опыту в Либерии и Гвинее с этой технологией вложенные протоколы требовались в полевых условиях с образцами полей даже для наборов грунтовки, которые позволяли усиления целевых показателей из лабораторных образцов и в лабораторных условиях с один раунд ЦР (7 и неопубликованные результаты).
В отличие от этих более критических шагов, подготовка библиотек и последовательность выполнения сами по себе являются довольно надежными процедурами. Однако в полевых условиях практические вопросы, такие, как наличие определенных единиц оборудования, могут быть проблематичными. Например, УФ-спектрофотометр необходим для определения концентраций ДНК до подготовки библиотеки образцов баркодированных. Однако, если такое устройство не будет доступно в полевых условиях, равное количество каждого образца может быть просто объединено, чтобы составить 45 мкл, необходимый для подготовки библиотеки, с различиями в образце входных материалах, которые обычно смягчаются большим количество считывает. Аналогичным образом, необходимость подключения к Интернету для выполнения секвенирования может быть проблемой, даже если базовый вызов больше не должен выполняться онлайн, но может быть выполнен локально; Однако, эта необходимость может быть удалена при определенных обстоятельствах производителем, если требуется.
Таким образом, представленный Протокол допускает относительно низкую стоимость секвенирования в местах, где отсутствует доступ к традиционному оборудованию секвенирования, в том числе в удаленных местах. Она может быть легко адаптирована к любой целевой РНК или ДНК, тем самым позволяя исследователям ответить на многочисленные биологические вопросы.

Секвенирование является мощным и важным инструментом в биологических и биомедицинских исследованиях. Он позволяет анализировать геномы, генетические вариации и профили РНК, и, таким образом, играет важную роль в расследовании заболеваний человека и животных, так1,2. Секвенирование Сэнгера, один из старейших методов секвенирования ДНК, до сих пор обычно используется по сей день и является угловым камнем молекулярной биологии. За последние 50 лет, эта технология была улучшена для достижения чтения длины более 1 000 NT и точность выше, чем 99,999%1. Однако секвенирование Сэнгера также имеет свои ограничения. Секвенирование большего набора образцов или анализ целых геномов с этим методом является трудоемким и дорогостоящим1,3. Методы секвенирования ДНК второго поколения, такие как 454 Пиросеквенирование и технология «Озарина», позволили нам значительно сократить затраты и рабочую нагрузку, необходимые для секвенирования в течение последнего десятилетия, и привели к огромному увеличению количество биологической последовательности информации, доступной4. Тем не менее, Индивидуальная секвенирование выполняется с использованием технологий второго поколения, и секвенирование в полевых условиях является сложным, так как необходимое оборудование громоздко и хрупко (аналогично устройствам секвенирования Сэнгера) и часто приходится быть откалиброван и обслуживается специально подготовленным персоналом. Кроме того, для многих из второго поколения технологии чтения длины довольно ограничены, что часто делает ниже по течению биоинформатики анализа этих данных сложной.
Секвенирование третьего поколения с использованием карманных устройств секвенирования наноруды (см. таблицу материалов) может послужить альтернативой этим установленным секвенированию платформ. В этих устройствах молекула одноцепочечной ДНК или РНК проходит через наноруду одновременно с ионного тока, который затем измеряется датчиком (Рисунок 1). По мере того как прядь пересекает наноруду, обнаруживается модуляция тока нуклеотидами, присутствния в поры в любой момент времени, и вычислительно назад-переведена в нуклеотидный последовательность5. Из-за этого оперативного принципа, секвенирование наноруды позволяет как поколения очень долго читает (близко к 1 х 106 нуклеотидов6) и анализ последовательности данных в режиме реального времени. Баркодирование возможно путем присоединения определенных последовательностей нуклеотидов к нуклеиновых кислот в образце, что позволяет анализировать несколько образцов в одном запуске последовательности, таким образом увеличивая пропускную способность выборки и понижая затраты на образец. Из-за высокой переносимости и простоты использования устройства для секвенирования наноруд успешно используются в полевых условиях в ходе недавней эпидемии болезни, вызванной вирусом Эбола, в Западной Африке, что подчеркивает их пригодность для быстрого развертывания в отдаленных регионах7 , 8.
Здесь мы описываем подробный протокол, совместимый с полем для секвенирования мРНК, кодирующего белок Ниманн-пика С1 (NPC1), который является облигатными рецептором для филовирусов, таких как эболавивирусы, и, как было доказано, ограничивает восприимчивость видов к Эти вирусы9,10. Протокол включает в себя извлечение всей РНК из образцов крови, специфическое усиление NPC1 мРНК путем RT-СР, баркокодирование образцов, подготовку библиотеки и секвенирование с устройством секвенирования наноруды. Анализ данных не может обсуждаться из-за ограниченности пространства, хотя в репрезентативных результатах представлены некоторые базовые указания; Тем не менее, заинтересованном читателю упоминается Предыдущая публикация11 для более подробного описания рабочего процесса, который мы использовали, а также публикаций других12,13,14 для детальной информации в отношении инструментов анализа, используемых в этом рабочем процессе.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1D2 adapter, barcode adapter mix, ABB buffer, elution buffer, RBF buffer, LBB beads</td>
			<td>Oxford Nanopore Technologies</td>
			<td>SQK-LSK308</td>
			<td>1D&#178; Sequencing Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blood collection tube with DNA/RNA stabilizing reagent</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1150</td>
			<td>DNA/RNA Shield - Blood Collection Tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blunt/TA ligase master mix</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0367S</td>
			<td>Blunt/TA Ligase Master Mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA-low binding reaction tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108051</td>
			<td>DNA LoBind Tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase buffer and DNase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11766050</td>
			<td>SuperScript&#8482; IV VILO&#8482; Master Mix with ezDNase&#8482; Enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flow cell</td>
			<td>Oxford Nanopore Technologies</td>
			<td>FLO-MIN105.24</td>
			<td>flow cell R9.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hot start high fidelity DNA polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0493L</td>
			<td>Q5 Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase (500 U)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnetic beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td>Agencourt AMPure XP beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnetic rack</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12321D</td>
			<td>DynaMag-2 Magnet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nanopore sequencing device</td>
			<td>Oxford Nanopore Technologies</td>
			<td>-</td>
			<td>MinION Mk 1B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR barcoding kit</td>
			<td>Oxford Nanopore Technologies</td>
			<td>EXP-PBC001</td>
			<td>PCR Barcoding Kit I (R9)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reverse transcriptase master mix</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11766050</td>
			<td>SuperScript&#8482; IV VILO&#8482; Master Mix with ezDNase&#8482; Enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA purification spin column, DNA/RNA prep buffer, DNA/RNA wash buffer, DNase I, DNA digestion buffer</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1151</td>
			<td>Quick-DNA/RNA Blood Tube Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rotating mixer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15920D</td>
			<td>HulaMixer Sample Mixer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0287S</td>
			<td>LongAmp Taq 2X Master Mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra II End-prep kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7546S</td>
			<td>NEBNext Ultra II End-Repair/dA-tailing Modul</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV spectrophotometer</td>
			<td>Implen</td>
			<td>-</td>
			<td>NanoPhotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vacuum manifold</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>S7000</td>
			<td>EZ-Vac Vacuum Manifold</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sequencing of mrna from whole blood using nanopore sequencing

Секвенирование в удаленных местоположениях и в условиях нехватки ресурсов создает уникальные проблемы. Секвенирование наноруды может быть успешно использовано в таких условиях и было развернуто в Западной Африке во время недавней эпидемии вируса Эбола, подчеркивая эту возможность. В дополнение к практическим преимуществам (низкая стоимость, простота транспортировки и использования оборудования), эта технология также обеспечивает фундаментальные преимущества по сравнению со вторым поколением подходов секвенирования, особенно очень долго читать длина, способность непосредственно последовательности РНК и доступность данных в режиме реального времени. Сырая точность чтения ниже, чем при других платформах секвенирования, что представляет собой основное ограничение этой технологии; Однако, это может быть частично смягчено высокой глубиной чтения, генерируемой. Здесь мы представляем протокол, совместимый с полем для секвенирования mRNAs, кодирующего Ниманн-пика С1, который является сотовым рецептором эболавивирусов. Этот протокол включает в себя извлечение РНК из образцов крови животных, а затем РТ-СР для обогащения цели, штриховое кодирование, подготовка библиотеки, и последовательность запуска сам, и может быть легко адаптирована для использования с другими целями ДНК или РНК.

В ходе репрезентативного эксперимента по проверке представленного протокола мы извлекли РНК из 10 различных образцов крови из пяти видов животных (т.е. 2 особи на одного вида (коза, овца, свинья, собака, крупный рогатый скот)) (Таблица 3). Урожайность РНК и качество после извлечения могут сильно варьироваться, в частности из-за различий в обработке образцов и хранении. В нашем представительном эксперименте мы наблюдали концентрацию РНК между 43 нг и 543 нг на мкл (Таблица 3). Кроме того, после усиления по RT-СР, гель анализ ВСНП-1 ЦР-продуктов показали различные исходы (рис. 2), с заметно слабее полос для образцов BC01 и BC02 (оба козла). Эти различия, скорее всего, вызваны различиями в качестве образцов, хотя различия в эффективности СЦР из-за различий в грунтовки до гена NPC1 различных видов не могут быть исключены. Однако эти различия в эффективности доходности и/или усиления не заметно повлияли на общий исход секвенирования. Кроме того, в образце BC10 (крупный рогатый скот) было совершено дополнительное неспецифическое средство для ЦР. В отличие от секвенирования Сэнгера, такие неспецифическая продукция не оказывает негативного влияния на результаты секвенирования наноруды, так как они отбрасываются при отображении полученных считений в эталонных последовательности в рамках анализа данных.
До каждого запуска последовательности рекомендуется качественная проверка используемой ячейки потока, при минимальном требовании в 800 общих пор. В нашем представительном эксперименте эта проверка качества вернула 1 102 поры, доступные для секвенирования. Поскольку данные предоставляются в режиме реального времени и могут быть проанализированы немедленно, длина последовательности выполнения может быть скорректирована для индивидуального приложения (т.е. до тех пор, пока не будет произведена достаточная последовательность данных для требуемого анализа). В наших экспериментах, последовательность запусков, как правило, выполняются в одночасье, и в случае нашего представителя эксперимента мы получили около 1 400 000 читает в течение такого 14 h перспективе.
В зависимости от типа анализа данных, который будет выполняться, может быть целесообразно обработать только подмножество полученных считывает. В случае нашего репрезентативного эксперимента для дальнейшего анализа была выбрана подгруппа из 10 000 считывает. С этой целью, FASTQ файлы, созданные во время секвенирования запуска были дополнительно обработаны в Ubuntu 18,04 LTS окружающей среды, и демультилеплет с помощью сгибает v 3.0.3 с параметрами оптимизированы для демультилирования данных последовательности наноруды (штрих-хвост длины 300 , штрих-код-частота ошибок 0,2, штрих-код-штраф-1)12. После демультилирования чтение карт и формирование консенсуса может быть сделано с использованием ряда различных инструментов, но подробное обсуждение аспекта биоинформатики в последовательности наноруд выходит за рамки этой рукописи. Однако, в случае с нашими репрезентативными результатами, считка сопоставления с ссылкой последовательность была выполнена с использованием Geneious 10.2.3. Из 10 000 считывает проанализированы, 5 457 показал длину между 1 750 и 2 000 нуклеотиды, который соответствует ожидаемым размерам для фрагментов ЦР усиливается как часть нашего рабочего процесса (1 769 NT, рис. 3). Дополнительный пик в распределении длины читает наблюдалось между 250 к 500 нуклеотиды, которые могут быть отнесены к неспецифическое продуктов ЦР. Demultiplexing считывает позволил назначение 87,6% из читает до один из 10 штрих-кодов/образцов проанализированных (Диаграмма 4). Доля демултиплезированных считывает для каждого штрих-кода варьировалась от 3,4% для штрих-кодов от 1 до 16,9% для штрих-кодов 10; Однако, из-за общего большого количества читает это все еще позволенные содержательный консенсус вызывая с высокой глубиной прочитаны даже для этих наборов данных по штрихкодов более низкого изобилия. Действительно, отображение отсортированных считывает в эталонных последовательности NPC1 в результате между 31,7% (штрих-код 2) и 100% (штрих-код 7 и 8) считывает отображение на ссылку, давая читать глубину более 90 читает в любом положении для каждого образца. Это то более чем достаточно, чтобы позволить уверенно консенсус базового вызова с незначительным частота ошибок.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59377/59377fig1.jpg"> Рисунок 1: Схематическое представление секвенирования ДНК с использованием технологии наноруды. Одноцепочечной молекулы ДНК проходит через наноруды встроенных в электрически устойчивой мембраны, с гелиаза регулирующих скорость перехода. Ионный ток одновременно проходит через поры и непрерывно измеряется. Модуляции тока, вызванные нуклеотидами, присутствними в поре, выявляются и возвращаются назад-переведены в нуклеотидный последовательность нити ДНК. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59377/59377fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59377/59377fig2.jpg"> Рисунок 2: усиление продуктов ЦР Ниманн-пика С1 из мРНК. мРНК была изолирована от козы (BC01 и 02), овец (BC03 и 04), свиней (BC05 и 06), собак (BC07 и 08), и крупного рогатого скота (BC09 и 10). Вложенные продукты ЦР были разделены в 0,8% агарозы гель в 1x ТЭ буфера (подготовленный из 50x ТЭ буфер: 242,28 g из тарис базы, 57,1 мл ледниковой ацетотической кислоты, 100 мл 0,5 м ЭДТА, dH2O к 1 L, pH с поправкой на 8,0) для 45 мин при 100 V и окрашенных Sybr Сейф. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59377/59377fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59377/59377fig3.jpg"> Рисунок 3: распространение 10 000 считывает из репрезентативного эксперимента. Указывается количество считений, полученных с учетом интервала считывания длины. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59377/59377fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59377/59377fig4.jpg"> Рисунок 4: распределение считывает после демультиплетений. Показаны количество и процент демултиплезированных (серый) и отображается (черный) для каждого штрих-кода. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59377/59377fig4large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.</a>
Таблица 1: обзор используемых наборов праймера. Начальное усиление целевых последовательностей было выполнено с набором грунтовки 1. Грунт комплект 2 затем использовался для вложенного усиления и дополнения адаптера. Адаптеры указаны красным цветом. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59377/table_1.xlsx">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.</a>
Таблица 2: обзор последовательности штрих-кодов. Для идентификации каждого секвенированного образца использовались индивидуальные штрих-коды. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59377/table_2.xlsx">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.</a>
Таблица 3: концентрации РНК, полученные после извлечения из образцов крови, последовательности в репрезентативной эксперимента. Показаны концентрации РНК двух особей от каждого из пяти видов, и указаны соотношения оптических плотностей на 260/280 Нм и 260/230 Нм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59377/table_3.xlsx">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing at JoVE.com

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

Секвенирование наноруды является новой технологией, которая позволяет экономически эффективной последовательности в отдаленных местах и ресурсов бедных условиях. Здесь мы представляем протокол для секвенирования mRNAs из цельной крови, совместимый с такими условиями.

Секвенирование мРНК из цельной крови с использованием секвенирования Наноруды

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...

Секвенирование нанопор третьего поколения является мощной новой технологией секвенирования, которая позволяет очень легко получить информацию о последовательности из широкого спектра образцов. Основными преимуществами этого метода являются портативность устройства секвенирования, чрезвычайно длинная длина чтения и доступность данных в режиме реального времени. Секвенирование нанопор является особенно полезной технологией во время вспышек болезней в отдаленных районах.Он успешно используется в полевых лабораториях во время и после вспышек вируса Эбола в Западной и Центральной Африке. Через nanospore секвенирования и использования устройства MinION для этой цели довольно легко, уход должен быть принят во время подготовки библиотеки и во время загрузки потока ячейки. Чтобы начать эту процедуру, создать приземления ПЦР, чтобы усилить cDNA с грунтовка установить один с помощью горячего начала высокой точности ДНК полимеразы с соответствующим буфером реакции в 50 микролитровый объем реакции с одним шаблоном микролитр.Если возможно, установите реакцию на льду или в прохладном блоке при четырех градусах по Цельсию. Инкубировать реакцию в термоциклере, как указано в текстовом протоколе. После этого перенесите 50 микролитров продукта ПЦР в 1,5 миллилитровую трубку с низкой связывающей реакцией ДНК.Повторное расследование магнитных бусин тщательно вихревых. Затем добавьте 50 микролитров бисера в реакцию ПЦР и хорошо перемешайте. Инкубировать образец на вращающемся миксере в течение пяти минут при комнатной температуре при повороте при температуре 15 об/мин.Кратко спина вниз образца, а затем поместить трубку на магнитной стойке гранул магнитных бусин. Подождите, пока супернатант был полностью выяснен, прежде чем продолжить. Далее, аспирировать супернатант, не нарушая гранулы шарика и отбросить его.Pipette 200 микролитров 70% этанола в реакционной трубке и инкубировать в течение 30 секунд при комнатной температуре. Аспирировать этанол, не нарушая гранулы шарика и отказаться от него. Повторите этот процесс мытья этанолом еще раз в общей сложности два моет.Воздух высушит гранулы в течение одной минуты при комнатной температуре. Затем снимите реакционной трубки с магнитной стойки. Повторное производство гранул в 30 микролитров нуклеазы свободной воды и инкубировать при комнатной температуре в течение двух минут.Поместите реакционной трубки обратно на магнитной стойке и ждать, пока реакция шарики полностью pelleted. После этого удалите супернатант, не нарушая гранулы и перенесите в новую 1,5 миллилитровую реакционной трубку. Если одновременно секвенировать несколько образцов, штрих-коды теперь могут быть добавлены двумя дополнительными этапами ПЦР с последующим очисткой ДНК, как показано ранее.Во-первых, объединить равное количество штрих-кодов ДНК из каждого образца в общей сложности один микрограмм ДНК в объеме 45 микролитров в 0,2 миллилитров реакции трубки. Для dA-Tailing добавьте семь микролитров буфера реакции конечной подготовки, три микролитров смеси фермента конечной подготовки и пять микролитров нуклеазы свободной воды. Аккуратно флик трубки для смешивания.В термоциклере инкубировать реакцию в течение пяти минут при 20 градусах по Цельсию, а затем пять минут при 65 градусах по Цельсию. Далее выполните очистку ПЦР реакции продукта, как указано в текстовом протоколе. Факультативно возьмите один микролитер для количественной оценки концентрации образца с помощью УФ-спектрофотометра.Объедините 22,5 микролитров ранее полученной очищенной ДНК с 2,5 микролитров адаптера 1D2 и 25 микролитров Blunt/TA Ligase Master Mix в новой 1,5 миллилитровой трубке с низкой связывающей реакцией ДНК. Аккуратно флик трубки для смешивания. Кратко спина вниз смесь и инкубировать при комнатной температуре в течение 10 минут.Затем выполните ПЦР очистку реакционной продукции, как указано в текстовом протоколе. Объедините 45 микролитров реакционной продукции с пятью микролитров смеси адаптера штрих-кодов и 50 микролитров Blunt/TA Ligase Master Mix в трубке с низкой связывающей реакцией ДНК. Аккуратно щелкнуть, чтобы смешать и инкубировать в течение 10 минут при комнатной температуре.Очистите продукт реакции, описанный в текстовом протоколе, и храните полученный продукт на льду или при четырех градусах Цельсия до готовности к использованию. Для начала выполните проверку качества ячейки потока перед использованием. С этой целью подключите устройство секвенирования к компьютеру-хозяину и откройте программное обеспечение.Вставьте ячейку потока в устройство секвенирования. Затем выберите тип ячейки потока из окна селектора и нажмите кнопку, доступную для подтверждения. В нижней части экрана щелкните ячейку потока проверки и выберите правильный тип ячейки потока.Нажмите на стартовый тест, чтобы начать проверку качества. Минимум 800 активных нанопоров в общей сложности требуется для потока ячейки, чтобы быть использованы. Во-первых, откройте покрытие грунтового порта, сдвинув его по часовой стрелке.Установите пипетку P1000 до 200 микролитров и вставьте наконечник в грунтовку порта. Затем отрегулируйте пипетку до 230 микролитров, сохраняя кончик в грунтовочном порту, чтобы составить от 20 до 30 микролитров буфера и удалить любые пузырьки воздуха. В новой 1,5 миллилитровой ДНК низкой связывающей реакционной трубки подготовьйте грунтовку, объединив 576 микролитров буфера RBF с 624 микролитров нуклеазной свободной воды.Аккуратно пипетки 800 микролитров подготовленной грунтовки смешайте в грунтовочном порту и подождите пять минут. После этого поднимите образец портового покрытия и пипетку еще 200 микролитров подготовленной грунтовочной смеси в грунтовку порта. Pipette 35 микролитров буфера RBF в новый чистый 1,5 миллилитров ДНК низкой связывающей реакционной трубки.Тщательно смешайте бусы LLB с помощью пипетки и добавьте 25,5 микролитров бисера в буфер RBF. Далее добавьте 2,5 микролитера нуклеазы свободной воды и 12 микролитров библиотеки ДНК и смешайте с помощью пипетки. Добавьте 75 микролитров образцовой смеси в медленном падении мудрым образом к ячейке потока через порт образца.Затем замените крышку порта образца, закройте грунтовку порта и закройте крышку устройства секвенирования. В программном обеспечении подтвердите, что ячейка потока по-прежнему доступна. Откройте новый эксперимент и навеяте параметры запуска, выбрав используемый комплект.Выберите живой basecalling. Начните секвенирование, нажав на начало эксперимента. Продолжайте секвенирование до тех пор, пока не будет собрано достаточное количество экспериментальных данных.В репрезентативном эксперименте РНК извлекается из 10 различных образцов крови пяти видов животных. Концентрации РНК наблюдаются между 43 нанограммами и 543 нанограммами на микролитер. После усиления RT-PCR гель-анализ продуктов MPC1 PCR показывает различные результаты с заметно более слабыми полосами для образцов BC01 и BC02.Эти различия, скорее всего, вызваны различиями в качестве выборки, хотя различия в эффективности ПЦР из-за различий в грунтовой привязки к гену MCP1 различных видов не могут быть исключены. Однако эти различия в урожайности и/или эффективности усиления не оказывают заметного влияния на общий результат последовательности. Затем выбирается подмножество из 10 000 полученных считывания и демултипировано для дальнейшего анализа.Из 10 000 проанализированных нуклеотидов 5 457 показывают длину от 1 750 до 2000 нуклеотидов, что соответствует ожидаемым размерам фрагментов ПЦР, усиленных в рамках нашего рабочего процесса. Дополнительный пик в распределении длины считых наблюдается между 250 до 500 нуклеотидов, которые могут быть отнесены к неспецифическим продуктам ПЦР. Демультиплексирование считывания позволяет присчитывания 87,6% считывания одному из 10 проанализированных образцов.Хотя этот метод является достаточно надежным, в полевых условиях, усиление ПЦР является наиболее проблематичным шагом. Во время нашего опыта, вложенные протоколы часто были необходимы для усиления целевых последовательностей. Помимо секвенирования генов животных-хозяина, этот метод также может быть использован для последовательности любой ДНК или РНК, включая вирусные или бактериальные патогены.Таким образом, секвенирование нанопор в настоящее время все чаще используется не только во время вспышек болезней или для научных исследований в отдаленных районах, но и в обычных лабораториях, где длинная длина чтения открывает новые захватывающие возможности для проведения исследований. Хотя ни один из используемых реагентов не является особо опасным, следует соблюдать стандартную гостистиваторную практику. Очевидно, что при секвенировании агентов болезни, все необходимые меры предосторожности для обработки этих агентов должны соблюдаться.

Research

JoVE Journal

Genetics

Methyl-binding DNA capture Sequencing for Patient Tissues

Метил-связывающий захват Секвенирование ДНК для ТКАНЕЙ Patient

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Обнаружение Copy Number Изменений Использование Single Cell Секвенирование

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Purification of High Molecular Weight Genomic DNA from Powdery Mildew for Long-Read Sequencing

Очистка ДНК с высоким молекулярным весом геномной от мучнистой росы для Long-Read Sequencing

The powdery mildew fungi are a group of economically important fungal plant pathogens. Relatively little is known about the molecular biology and genetics ...

Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

Ретроспективное микроРНК последовательности: Комплементарной ДНК библиотеки подготовка протокол с помощью образцов формалин Исправлена парафин врезанных РНК

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Обнаружение редких событий, с помощью Исправлена ошибка ДНК и РНК последовательности

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen

Сверхнизкое ввода геном последовательность подготовки библиотеки от Tardigrade единичная

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state ...

Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells

Изоляция, виртуализации и анализа внеклеточного микроРНК от мезенхимальных стволовых клеток человека

Extracellular and circulating RNAs (exRNA) are produced by many cell types of the body and exist in numerous bodily fluids such as saliva, plasma, serum, ...

Semiconductor Sequencing for Preimplantation Genetic Testing for Aneuploidy

Полупроводниковое секвенирование для предимплантационного генетического тестирования на анеуплоидию

Chromosomal aneuploidy, one of the main causes leading to embryonic development arrest, implantation failure, or pregnancy loss, has been well documented ...

Single-cell RNA Sequencing and Analysis of Human Pancreatic Islets

Одноклеточная РНК секвенирование и анализ островков поджелудочной железы человека

Pancreatic islets comprise of endocrine cells with distinctive hormone expression patterns. The endocrine cells show functional differences in response to ...

A Complete Pipeline for Isolating and Sequencing MicroRNAs, and Analyzing Them Using Open Source Tools

Полный трубопровод для изоляции и секвенирования микроРНК и анализа их с помощью инструментов с открытым исходным кодом

Half of all human transcripts are thought to be regulated by microRNAs. Therefore, quantifying microRNA expression can reveal underlying mechanisms in ...