Name: hox loci focused crispr/sgrna library screening identifying critical ctcf boundaries
Uploaded: 2019-03-31T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about HOX Loci Focused CRISPR/sgRNA Library Screening Identifying Critical CTCF Boundaries at JoVE.com

Forfatterne også takke Nicholas Cesari redigeringsværktøjer håndskriftet. Arbejdet blev støttet af tilskud fra National Institute of Health (S.H., R01DK110108, R01CA204044).

1. CTCF sgRNALibrary Design ved hjælp af et Online-værktøj
<ol><li>Design sgRNA målretning CTCF bindingssteder i de menneskelige HOX loci ved hjælp af genetiske undertrykkelse af netbårne platform (GPP) designer værktøj (https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design).</li>
	<li>Syntetisere ialt 1,070 sgRNAs bestående af sgRNAs rettet mod 303 tilfældige målretning gener, 60 positive kontroller, 500 ikke-menneskelige-targeting kontrol, og 207 CTCF elementer eller lncRNA ret...

<ol>
	<li>Dixon, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topological+domains+in+mammalian+genomes+identified+by+analysis+of+chromatin+interactions.">Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions.</a> Nature. 485 (7398), 376-380 (2012).</li><li>Cuddapah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+the+insulator+binding+protein+CTCF+in+chromatin+barrier+regions+reveals+demarcation+of+active+and+repressive+domains.">Global analysis of the insulator binding protein CTCF in chromatin barrier regions reveals demarcation of active and repressive domains.</a> Genome research. 19 (1), 24-32 (2009).</li><li>Phillips, J. E., Corces, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF:+master+weaver+of+the+genome.">CTCF: master weaver of the genome.</a> Cell. 137 (7), 1194-1211 (2009).</li><li>Tang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF-Mediated+Human+3D+Genome+Architecture+Reveals+Chromatin+Topology+for+Transcription.">CTCF-Mediated Human 3D Genome Architecture Reveals Chromatin Topology for Transcription.</a> Cell. 163 (7), 1611-1627 (2015).</li><li>Lupianez, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruptions+of+topological+chromatin+domains+cause+pathogenic+rewiring+of+gene-enhancer+interactions.">Disruptions of topological chromatin domains cause pathogenic rewiring of gene-enhancer interactions.</a> Cell. 161 (5), 1012-1025 (2015).</li><li>Dowen, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+cell+identity+genes+occurs+in+insulated+neighborhoods+in+mammalian+chromosomes.">Control of cell identity genes occurs in insulated neighborhoods in mammalian chromosomes.</a> Cell. 159 (2), 374-387 (2014).</li><li>Phillips-Cremins, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architectural+protein+subclasses+shape+3D+organization+of+genomes+during+lineage+commitment.">Architectural protein subclasses shape 3D organization of genomes during lineage commitment.</a> Cell. 153 (6), 1281-1295 (2013).</li><li>Narendra, V., Bulajic, M., Dekker, J., Mazzoni, E. O., Reinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF-mediated+topological+boundaries+during+development+foster+appropriate+gene+regulation.">CTCF-mediated topological boundaries during development foster appropriate gene regulation.</a> Genes &amp; Development. 30 (24), 2657-2662 (2016).</li><li>Narendra, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF+establishes+discrete+functional+chromatin+domains+at+the+Hox+clusters+during+differentiation.">CTCF establishes discrete functional chromatin domains at the Hox clusters during differentiation.</a> Science. 347 (6225), 1017-1021 (2015).</li><li>Deng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HoxBlinc+RNA+Recruits+Set1/MLL+Complexes+to+Activate+Hox+Gene+Expression+Patterns+and+Mesoderm+Lineage+Development.">HoxBlinc RNA Recruits Set1/MLL Complexes to Activate Hox Gene Expression Patterns and Mesoderm Lineage Development.</a> Cell Reports. 14 (1), 103-114 (2016).</li><li>Patel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberrant+TAL1+activation+is+mediated+by+an+interchromosomal+interaction+in+human+T-cell+acute+lymphoblastic+leukemia.">Aberrant TAL1 activation is mediated by an interchromosomal interaction in human T-cell acute lymphoblastic leukemia.</a> Leukemia. 28 (2), 349-361 (2014).</li><li>Luo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF+boundary+remodels+chromatin+domain+and+drives+aberrant+HOX+gene+transcription+in+acute+myeloid+leukemia.">CTCF boundary remodels chromatin domain and drives aberrant HOX gene transcription in acute myeloid leukemia.</a> Blood. 132 (8), 837-848 (2018).</li><li>Dou, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medial+HOXA+genes+demarcate+haematopoietic+stem+cell+fate+during+human+development.">Medial HOXA genes demarcate haematopoietic stem cell fate during human development.</a> Nature Cell Biology. 18 (6), 595-606 (2016).</li><li>Lawrence, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+expression+of+the+Hoxa-9+homeobox+gene+impairs+the+proliferation+and+repopulating+ability+of+hematopoietic+stem+cells.">Loss of expression of the Hoxa-9 homeobox gene impairs the proliferation and repopulating ability of hematopoietic stem cells.</a> Blood. 106 (12), 3988-3994 (2005).</li><li>Deng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=USF1+and+hSET1A+mediated+epigenetic+modifications+regulate+lineage+differentiation+and+HoxB4+transcription.">USF1 and hSET1A mediated epigenetic modifications regulate lineage differentiation and HoxB4 transcription.</a> PLOS Genetics. 9 (6), e1003524 (2013).</li><li>Rawat, V. P., Humphries, R. K., Buske, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+Hox:+the+role+of+ParaHox+genes+in+normal+and+malignant+hematopoiesis.">Beyond Hox: the role of ParaHox genes in normal and malignant hematopoiesis.</a> Blood. 120 (3), 519-527 (2012).</li><li>Alharbi, R. A., Pettengell, R., Pandha, H. S., Morgan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+HOX+genes+in+normal+hematopoiesis+and+acute+leukemia.">The role of HOX genes in normal hematopoiesis and acute leukemia.</a> Leukemia. 27 (5), 1000-1008 (2013).</li><li>Rice, K. L., Licht, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HOX+deregulation+in+acute+myeloid+leukemia.">HOX deregulation in acute myeloid leukemia.</a> Journal of Clinical Investigation. 117 (4), 865-868 (2007).</li><li>Bassett, A. R., Kong, L., Liu, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+CRISPR+library+for+high-throughput+genetic+screening+in+Drosophila+cells.">A genome-wide CRISPR library for high-throughput genetic screening in Drosophila cells.</a> Journal of Genetics and Genomics. 42 (6), 301-309 (2015).</li><li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+deletion+screening+of+human+long+non-coding+RNAs+using+a+paired-guide+RNA+CRISPR-Cas9+library.">Genome-scale deletion screening of human long non-coding RNAs using a paired-guide RNA CRISPR-Cas9 library.</a> Nature Biotechnology. 34 (12), 1279-1286 (2016).</li><li>Kurata, J. S., Lin, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-focused+CRISPR-Cas9+library+screen+reveals+fitness-associated+miRNAs.">MicroRNA-focused CRISPR-Cas9 library screen reveals fitness-associated miRNAs.</a> RNA. 24 (7), 966-981 (2018).</li><li>Collins, C. T., Hess, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+HOXA9+in+leukemia:+dysregulation,+cofactors+and+essential+targets.">Role of HOXA9 in leukemia: dysregulation, cofactors and essential targets.</a> Oncogene. 35 (9), 1090-1098 (2016).</li><li>Kroon, E., Thorsteinsdottir, U., Mayotte, N., Nakamura, T., Sauvageau, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NUP98-HOXA9+expression+in+hemopoietic+stem+cells+induces+chronic+and+acute+myeloid+leukemias+in+mice.">NUP98-HOXA9 expression in hemopoietic stem cells induces chronic and acute myeloid leukemias in mice.</a> The EMBO Journal. 20 (3), 350-361 (2001).</li><li>Koike-Yusa, H., Li, Y., Tan, E. P., Velasco-Herrera Mdel, C., Yusa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+recessive+genetic+screening+in+mammalian+cells+with+a+lentiviral+CRISPR-guide+RNA+library.">Genome-wide recessive genetic screening in mammalian cells with a lentiviral CRISPR-guide RNA library.</a> Nature Biotechnology. 32 (3), 267-273 (2014).</li><li>Shalem, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+CRISPR-Cas9+knockout+screening+in+human+cells.">Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells.</a> Science. 343 (6166), 84-87 (2014).</li><li>Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+screens+in+human+cells+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system.</a> Science. 343 (6166), 80-84 (2014).</li><li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+sgRNAs+facilitate+CRISPR/Cas9-mediated+mouse+genome+targeting.">Dual sgRNAs facilitate CRISPR/Cas9-mediated mouse genome targeting.</a> The FEBS Journal. 281 (7), 1717-1725 (2014).</li><li>Sanjana, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+interrogation+of+functional+elements+in+the+noncoding+genome.">High-resolution interrogation of functional elements in the noncoding genome.</a> Science. 353 (6307), 1545-1549 (2016).</li><li>Rajagopal, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+mapping+of+regulatory+DNA.">High-throughput mapping of regulatory DNA.</a> Nature Biotechnology. 34 (2), 167-174 (2016).</li><li>Korkmaz, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genetic+screens+for+enhancer+elements+in+the+human+genome+using+CRISPR-Cas9.">Functional genetic screens for enhancer elements in the human genome using CRISPR-Cas9.</a> Nature Biotechnology. 34 (2), 192-198 (2016).</li><li>Rezaei, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FMS-Like+Tyrosine+Kinase+3+(FLT3)+and+Nucleophosmin+1+(NPM1)+in+Iranian+Adult+Acute+Myeloid+Leukemia+Patients+with+Normal+Karyotypes:+Mutation+Status+and+Clinical+and+Laboratory+Characteristics.">FMS-Like Tyrosine Kinase 3 (FLT3) and Nucleophosmin 1 (NPM1) in Iranian Adult Acute Myeloid Leukemia Patients with Normal Karyotypes: Mutation Status and Clinical and Laboratory Characteristics.</a> Turkish Journal of Haematology. 34 (4), 300-306 (2017).</li><li>Yaragatti, M., Basilico, C., Dailey, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+active+transcriptional+regulatory+modules+by+the+functional+assay+of+DNA+from+nucleosome-free+regions.">Identification of active transcriptional regulatory modules by the functional assay of DNA from nucleosome-free regions.</a> Genome Research. 18 (6), 930-938 (2008).</li><li>Wilken, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNase+I+hypersensitivity+analysis+of+the+mouse+brain+and+retina+identifies+region-specific+regulatory+elements.">DNase I hypersensitivity analysis of the mouse brain and retina identifies region-specific regulatory elements.</a> Epigenetics Chromatin. 8, 8 (2015).</li><li>Narlikar, L., Ovcharenko, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+regulatory+elements+in+eukaryotic+genomes.">Identifying regulatory elements in eukaryotic genomes.</a> Briefings in Functional Genomics and Proteomics. 8 (4), 215-230 (2009).</li><li>Hnisz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+proto-oncogenes+by+disruption+of+chromosome+neighborhoods.">Activation of proto-oncogenes by disruption of chromosome neighborhoods.</a> Science. 351 (6280), 1454-1458 (2016).</li></ol>

Protein-kodning gen relateret sgRNA biblioteker har været anvendt i en funktionel screening system til identifikation af gener og regulering af specifikke cellulære funktioner gennem sgRNA berigelse24,25,26 -netværk ,27,28. Flere ikke-kodende region relateret sgRNA biblioteker blev også vist i gen-specifikke funktionelle skærme til distale og proksimale ...

Nylige genom interaktion undersøgelser afslørede, at de menneskelige nukleare genom former stabil topologisk sætter domæner (TADs), der er bevaret på tværs af celletyper og arter. Organisation af genomet i separate domæner letter og begrænser interaktioner mellem regulerende elementer (fx smagsforstærkere og promotorer). CCCTC-bindende faktor (CTCF) bindes til TAD grænser og spiller en afgørende rolle i Begrænsningsfacetten vekselvirkninger mellem DNA elementer, der er placeret i nærliggende TADs1. Genom bred CTCF bindende data viste imidlertid, at selv om CTCF for det meste interagerer med de samme DNA-sites i forskellige celletyper, det ofte fungerer som en kromatin barriere på en bestemt lokalitet i én celletype, men ikke i den anden, hvilket tyder på at CTCF funktioner sammen med andre aktiviteter i dannelsen af kromatin grænser2. Hvad forbliver ukendt er om grænsen elementer (CTCF-bindingssteder) er direkte knyttet til den biologiske funktion af CTCF, og hvordan disse links forekommer. Derfor, vi hypotesen om, at specifikke CTCF bindingssteder i genomet direkte regulerer dannelsen af TADs og styre promotor/forstærker interaktioner i disse domæner eller mellem tilstødende domæner. Færdiggørelsen af de menneskelige og mus genome sequencing projekter og efterfølgende epigenetiske analyser har afsløret nye molekylære og genetiske signaturer af genomet. Men rollen som særlige signaturer/ændringer i genregulering samt cellefunktion og deres molekylære mekanismer, har endnu at være fuldt forstået.
Flere linjer af beviser støtter, at en CTCF-medieret TADs repræsenterer funktionel kromatin domæner3,4,5. Selv om CTCF for det meste interagerer med de samme DNA-sites i forskellige celletyper, viste genom bred CTCF ChIP-seq data, at CTCF ofte fungerer som kromatin barriere i én celletype, men ikke i de andre2. CTCF spiller en væsentlig rolle i udviklingen af mægle genom organisation4,6,7. Afbrydelse af CTCF grænser nedsat forstærker/promotor interaktioner og genekspression, fører til udviklingsmæssige blokering. Dette tyder på, at CTCF medieret TADs er ikke kun strukturelle komponenter, men også administrative enheder kræves for korrekt enhancer handling og gen transskription5,8,9.
HOX gener spiller en kritisk rolle i løbet af fosterudviklingen, og de er tidsmæssigt og rumligt begrænsede i deres udtryk mønstre. HOXA locus danner to stabile TADs adskille anteriore og posteriore gener af en CTCF-associerede grænse element i både hESCs og IMR90 celler1. De seneste rapporter viste, at HoxBlinc, en HoxB locus forbundet lncRNA, medierer dannelsen af CTCF instrueret TADs og forstærker/promotor interaktioner i HOXB locus. Dette fører til forreste HOXB genaktivering under ESC engagement og differentiering10. Desuden på bestemte gen loci herunder HOXA locus, ændring af CTCF medieret TAD domæner ændret lineage bestemt gen expression profiler og var forbundet med udvikling af sygdom stater11,12. Beviser understøtter en primær funktion for CTCF i koordinere gen transskription og bestemmelse af celle identitet ved at organisere genomet i funktionelle domæner.
Trods sin rolle i den embryonale udvikling, under bloddannelsen, regulere HOX gener hæmatopoietisk stilk og stamfader celle (HS/PC) funktion. Dette gøres ved at styre balancen mellem spredning og differentiering10,13,14,15. Udtryk af gener, HOX er stramt reguleret i hele specifikation og differentiering af hæmatopoietisk celler med højeste udtryk i HS / pc'er. HOX genekspression aftager gradvist under modning, med dens laveste niveauer forekommende i opdelte hæmatopoietisk celler16. HOX gen dysregulering er en dominerende mekanisme leukemic transformation af dysregulating selvfornyelse og differentiering egenskaber af HS/pc'er fører til leukemic transformation17,18. Men mekanismen for etablering og vedligeholdelse af normal vs. muterede udtryk mønstre af HOX gener samt tilknyttede regulerende net uklart.
CRISPR-Cas9 sgRNA bibliotek screening har været meget anvendt til at afhøre protein-kodning gener19 som godt ikke-kodende gener, som lncRNA20 og miRNA21 i forskellige arter. Men omkostningerne til at bruge biblioteket CRISPR-Cas9 sgRNA til at identificere nye genomisk mål forbliver høj, fordi høj overførselshastighed genome sequencing er ofte anvendt til at kontrollere sgRNA bibliotek screening. Vores sgRNA screening system er fokuseret på specifikke genom loci og evaluerer den målretning sgRNAs gennem et-trins RT-PCR ifølge markør Gen-ekspression, såsom HOXA9. Derudover kan Sanger sekventering bekræftet, at sgRNA var integreret i genomet, og Indel mutationer påvises for at identificere sgRNA målretning site. Gennem loci-specifikke CRISPR-Cas9 genetisk screening, er CBS7/9 kromatin grænse blevet identificeret som en kritisk regulator for oprettelse af muterede kromatin domæne og vedligeholde ektopisk HOX gen expression mønstre i AML patogenese 12. metoden kan anvendes bredt til at identificere ikke kun specifikke funktion af CTCF grænse i fosterudviklingen, bloddannelsen, årsager, men også CTCF grænse som potentielle terapeutiske mål for fremtidige epigenetiske terapi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:689px;" width="689">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Lipofectamine 3000 reagent</td>
			<td style="width:155px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">L3000-008</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Proteinase K</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25530049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Puromycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1113802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stbl3 cells&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>&#160;C737303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEK293T</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MOLM-13</td>
			<td>DSMZ</td>
			<td>ACC 554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">lentiCRISPRv2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>52961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">psPAX2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pGEM&#174;-T Easy Vector Systems&#160;</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A137A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T4 ligase&#160;</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>&#160;M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAquick Gel Extract kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAuick PCR purification kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SingleShot&#8482; SYBR&#174;&#160;Green One-Step Kit</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1725095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">QIAGEN Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td style="width:100px;">12163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">&#160;11965084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI 1640&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal bovine serum (FBS)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">10-082-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin/streptomycin/L-glutamine&#160;</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:100px;">10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lenti-X Concentrator&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Clontech</td>
			<td style="width:100px;">631232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Trypan Blue Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Polybrene</td>
			<td style="width:155px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-134220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Genessee Scientific</td>
			<td>&#160;25-507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">TAE buffer&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>FERB49</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Surveyor&#174; Mutation Detection Kits</td>
			<td style="width:155px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:100px;">706020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Biorad Universal Hood II Gel Doc System</td>
			<td style="width:155px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:100px;">170-8126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Centrifuge 5424 R</td>
			<td style="width:155px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:100px;">5404000138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Digital Dry Baths/Block Heaters</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">88870002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">TSX Series Ultra-Low Freezers</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">TSX40086V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Forma&#8482; Steri-Cult&#8482; CO2&#160;Incubators</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">3308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Herasafe&#8482; KS, Class II Biological Safety Cabinet</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">51022484</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Sorvall&#8482; Legend&#8482; XT/XF Centrifuge Series</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">75004506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Fisherbrand&#8482;&#160;Isotemp&#8482; Water Baths</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">FSGPD02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:263px;">Thermo Scientific&#8482;&#160;Locator&#8482; Plus Rack and Box Systems</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">13-762-353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System</td>
			<td style="width:155px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:100px;">1855195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">MiniAmp&#8482; Thermal Cycler</td>
			<td style="width:155px;">Applied Biosystems technology</td>
			<td style="width:100px;">A37834</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:263px;">Thermo Scientific&#8482;&#160;Owl&#8482; EC300XL2 Compact Power Supply</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">7217581</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:263px;">Thermo Scientific&#8482;&#160;Owl&#8482; EasyCast&#8482; B1 Mini Gel Electrophoresis Systems</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">09-528-178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">VWR&#174; Tube Rotator and Rotisseries</td>
			<td style="width:155px;">VWR International</td>
			<td style="width:100px;">10136-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">VWR&#174; Incubating Mini Shaker</td>
			<td style="width:155px;">VWR International</td>
			<td style="width:100px;">12620-942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Analytical Balance MS104TS/00</td>
			<td style="width:155px;">METTLER TOLEDO</td>
			<td style="width:100px;">30133522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">DS-11 FX and DS-11 FX+ Spectrophotometer</td>
			<td style="width:155px;">DeNovix Inc.</td>
			<td style="width:100px;">DS-11 FX</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hox loci focused crispr/sgrna library screening identifying critical ctcf boundaries

CCCTC-bindende faktor (CTCF)-medieret stabil topologisk knytte domæner (TADs) spiller en afgørende rolle i Begrænsningsfacetten vekselvirkninger mellem DNA elementer, der er placeret i nabolandet TADs. CTCF spiller en vigtig rolle i reguleringen af den rumlige og tidsmæssige udtryk for HOX gener, der styrer embryonale udvikling, krop mønstre, bloddannelsen og årsager. Det er imidlertid stort set ukendt, om og hvordan HOX loci forbundet CTCF grænser regulere kromatin organisation og HOX genekspression. I den nuværende protokol, er en bestemt sgRNA poolede bibliotek rettet mod alle CTCF bindingssteder i HOXA/B/C/D loci genereret for at undersøge virkningerne af forstyrre CTCF-associerede kromatin grænser på TAD dannelse og HOX gen udtryk. Gennem CRISPR-Cas9 er genetisk screening, CTCF bindingssted ligger mellem HOXA7/HOXA9 gener (CBS7/9) blevet identificeret som en kritisk regulator af muterede kromatin domæne, samt at være vigtige for at opretholde ektopisk HOX gen udtrykket mønstre i MLL-omarrangeret akut myeloid leukæmi (AML). Således, denne sgRNA bibliotek screening tilgang giver ny indsigt i CTCF medieret genom organisation i bestemte gen loci og giver også et grundlag for den funktionelle karakterisering af de kommenterede genetiske regulerende elementer, begge kodning og Noncoding, under normale biologiske processer i den post-menneskelige genom-projektet æra.

CRISPR-Cas9 teknologi er en kraftfuld analyseværktøj for funktionelle genomisk undersøgelser. Det erstatter hurtigt konventionelle gen redigering teknikker og har høj nytteværdi for både genome-wide og individuelle gen-fokuserede ansøgninger. Her, indeholder den første individuelt klonede loci-specifikke CRISPR-Cas9-klædt sgRNA bibliotek 1,070 sgRNAs bestående af sgRNAs rettet mod 303 tilfældige målretning gener, 60 positive kontroller, 500 ikke-menneskelige-targeting kontrol,...

Watch this Scientific Journal Video about HOX Loci Focused CRISPR/sgRNA Library Screening Identifying Critical CTCF Boundaries at JoVE.com

HOX Loci Focused CRISPR/sgRNA Library Screening Identifying Critical CTCF Boundaries

En CRISPR/sgRNA bibliotek er blevet anvendt til spørgekriterierne protein-kodning gener. Dog stadig gennemførligheden af et sgRNA bibliotek til at afsløre funktionen af en CTCF grænse RIBOREGULATION uudforsket. Her beskriver vi et HOX loci specifikke sgRNA bibliotek for at klarlægge funktionen af CTCF grænser i HOX loci.

HOX Loci fokus CRISPR/sgRNA bibliotek Screening at identificere kritiske CTCF grænser

CCCTC-binding factor (CTCF)-mediated stable topologically associating domains (TADs) play a critical role in constraining interactions of DNA elements ...

Vores pooled sgRNA kaldet biblioteket screening, er en kraftfuld genetisk tilgang til at identificere og evaluere den biologiske funktion af ikke-kodning elementer i hele genomet. Denne teknik giver os mulighed for at undersøge effekten af at forstyrre de tilknyttede bindingssteder, kromatiske grænser eller andre lovgivningsmæssige elementer på målrettede gener udtryk. Vores tilgang kan bruges til at identificere den rolle, CTCF, lange ikke-kodning RNA'er og smagsforbedre, i HOX genregulering i tidlig embryonal udvikling, samt visse leukæmi med en afvigende HOX gen signatur.Begynd denne procedure med udformningen af et sgRNA rettet mod CTCF-bindingssteder. Kloning af sgRNA-biblioteket i celleforberedelse som beskrevet i tekstprotokollen. For at pakke lentivirus, cotransfect HEK293 T celler med 20 mikrogram renset bibliotek vektorer, 15 mikrogram af de emballerede plasmid, og 10 mikrogram af kuverten plasmid, i 48 timer før høst af virus.Efter 48 timer indsamles virussupernatanten, og den filtreres gennem en 0,45 mikron lavproteinbindende PVDF-membran. Dernæst koncentrere lentiviral supernatant med 50 gange, ved hjælp af koncentrator. Aliquot de koncentrerede vira og gemme dem i et minus 80 grader celsius fryser.Arbejd i separate brønde af en 12 brøndplade til at blande MOLM13 celler med forskellige doser af den koncentrerede lentivirus for seks i alt grupper. Straks centrifuge disse blandinger ved 1000 gange g i to timer ved 33 grader celsius. Overfør de 12 brøndplader tilbage til inkubatoren ved 37 grader celsius og 5% kuldioxid i fire timer.Inspirer forsigtigt supernatanten uden at forstyrre cellepaletten, og re-suspendere de transduced celler med frisk suppleret RPMI 1640 Medium. Derefter overføres de re-suspenderede celler til T25 kolber og inkuberes ved 37 grader celsius i 48 timer uden puromycin. Efter 48 timer opdeles disse celler i to kolber, en forsøgsgruppe behandlet med en mikroliter pr. milliliter puromycin i fem dage, og en kontrolgruppe uden puromycinbehandling i fem dage.Den optimerede MOI-værdi for transduktion måles ved at dividere antallet af levende celler behandlet med puromycin med antallet af celler uden puromycinbehandling. At transduce cellerne med det samlede bibliotek, inficere 1,5 millioner MOLM13 celler i en 6 brønd plade med 0,3 MOI af sgRNA pooled lentivirus i medium. Brug cellerne uden lentivirus infektion som en kontrol.Straks centrifuge de seks brøndplade ved 1000 gange g i to timer ved 33 grader celsius til at spinfect cellerne. Derefter overføres pladerne tilbage til inkubatoren ved 37 grader celsius i 5% kuldioxid i fire timer. Inspirer forsigtigt supernatant uden at forstyrre cellepaletten, og re-suspendere de transduced celler med frisk medium.Derefter overføres cellerne til T25 kolber og inkuberes ved 37 grader celsius i 48 timer uden puromycin. Efter 48 timer behandles cellerne med et mikrogram pr. milliliter puromycin i fem dage. Veksle til frisk medium efter to dage og opretholde en optimal celletæthed.Frø enkelt klon i 96 godt plader med begrænsende fortynding metoder. Inkuber disse enkelt klon ved 37 grader celsius og 5% kuldioxid. Kultur dem i 3-4 uger.Tæl de sgRNA integrerede MOLM13 celler med 0,4% Trypan Blue opløsning farvning og derefter overføre 10, 000 levende celler per brønd til en 96 brønd PCR plade. Centrifuge pladen ved 1000 gange g i fem minutter og derefter grundigt fjerne og kassere supernatant med en pipette. Undgå at forstyrre cellepaletten.Efter vask af cellerne som beskrevet i teksten tilføje 50 mikroliter af cellen lysis master mix til hver brønd. Pipette op og ned fem gange for at re-suspendere cellepaletten. Bland blandingen inkuberes i 10 minutter ved stuetemperatur.Derefter overføre blandingen til 37 grader celsius i fem minutter, og derefter 75 grader celsius i yderligere fem minutter. Nu tilføje en mikroliter af celle lysat til PCR brønde, der indeholder RT qPCR reaktion mix. Denne blanding omfatter markør gener frem og tilbage primer, omvendt transskriptionase og One-Step reaktion mix.Kør den omvendte transskriptionsreaktion i 10 minutter ved 50 grader celsius efterfulgt af polymeriseringsaktivering og DNA-denaturering i et minut ved 95 grader celsius. Udfør RT PCR med 40 cyklusser af PCR-reaktion som beskrevet i tekstprotokollen. Kontroller HOXA9-formindskede udtrykskloner gennem Sanger-sekvensering, og udfør PCR med MOLM13 genom-DNA som beskrevet i tekstprotokollen.Ekstrakt og rense PCR produkter med PCR rensning kit. Dumærk de rensede PCR-produkter ind i T-vektoren med T4 ligationsbuffer, T-vektor-DNA, PCR-DNA og T4-ligase. Placer ligation mix i en kuvøse ved 16 grader celsius natten over.Overfør ligation mix i DH5 alpha kompetente celler og plade på en LB ampicillin antibiotikum agar plade. Inkuber pladerne natten over ved 37 grader celsius. Vælg de enkelte kloner fra LB pladen og kontrollere dem ved genotyping og Sanger sekventering.Opsæt heteroduplex-blandingsgruppen med 200 nanogram reference og 200 nanogram test-PCR-ampliconer i et 0,2 milliliter PCR-rør. Medtag homoduplex blanding gruppe med kun 400 nanogram reference PCR amplicons som en kontrol. Separat inkubere heteroduplex og homoduplex blandingen ved 95 grader celsius i fem minutter i en en liter bæger fyldt med 800 milliliter vand.Derefter afkøles blandingerne gradvist til stuetemperatur til glødemiddel og danne heteroduplex eller homoduplex. Nu, separat fordøje 400 nanogram af den udglødede heteroduplex og homoduplex blanding med en mikroliter af indel mutation detektion nuklease, og to mikroliter af nuklease reaktion buffer på 42 grader celsius i 60 minutter. Analysér de fordøjede prøver med agarosegelelektroforese.Heteroduplex blandingen DNA skal skæres i små fragmenter og homoduplex DNA bør ikke skæres. sgRNA rettet mod MOLM13 positive kloner blev bekræftet med RT qPCR-metoden, baseret på EKSpressionsniveauerne for HOXA9-gener med sammenligningen med kontrolcellerne. Ud af de 528 overlevende kloner, der blev screenet, udviste 10 kloner mere end 50 % reduktion i HOXA9-niveauer.sgRNAs integreret i HOXA9 reduceret, HOXA9 uændret og HOXA9 øget kloner, blev yderligere bekræftet ved PCR forstærkning af sgRNA og identifikation af Sanger sekvens. Seks ud af ti kloner, der viste en reduktion i HOXA9-niveauerne, indeholdt sgRNAs rettet mod CBS79-webstedet, som bestemt af Sanger-sekvensering. Indel mutationer af integrerede sgRNA positive kloner blev bestemt af PCR-baserede genotyping og nuklease fordøjelse.Den heterozygots sletning af CTCF site placeret mellem HOXA7 og HOXA9 gener blev identificeret ved PCR-baseret genotyping. HOXA9-reducerede kloner fem, seks, 28 og 121 udviste sletning i CBS79 grænse placering. Lignende resultater blev observeret for de indel mutationer i CBS79 stedet, der blev analyseret af nuklease fordøjelsesanalyse.Når du udfører denne procedure, er det vigtigt at gøre lige store mængder af heteroduplexes og homoduplexes for at opdage sgRNA-induceret indel mutationer gennem nuklease fordøjelsesanalyse. Vores tilgang gør det muligt at udnytte den valgte markør, at udføre næste generations sekvensering på målgenet for at opdage genets virkninger på leukemogenese. Samlet vores tilgang forhindrer RPC's for den funktionelle korrekt og reduktion af en kendt genetiske uregelmæssige elementer under normal biologisk proces og leukemogenese i posthume genom projekt fejl.

Research

JoVE Journal

Genetics

HOX Loci Focused CRISPR/sgRNA Library Screening Identifying Critical CTCF Boundaries

A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source

En universel protokol for storstilet gRNA bibliotek produktion fra enhver kilde, DNA

The popularity of the CRISPR/Cas9 system for both genome and epigenome engineering stems from its simplicity and adaptability. An effector (the Cas9 ...

G2-seq: A High Throughput Sequencing-based Technique for Identifying Late Replicating Regions of the Genome

G2-seq: En High Throughput sekventering-baseret teknik til identifikation af sent replikerende regioner i genomet

Numerous techniques have been developed to follow the progress of DNA replication through the S phase of the cell cycle. Most of these techniques have ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Robust DNA isoleret og høj overførselshastighed sekventering bibliotek konstruktion til Herbarium prøver

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

Retrospektiv mikroRNA sekventering: Supplerende DNA bibliotek forberedelse protokollen ved hjælp af Formalin-fast Paraffin-embedded RNA prøver

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of ...

Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen

Ultralow Input Genome Sequencing bibliotek forberedelse fra en enkelt Tardigrade prøvemateriale

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state ...

Bronchoalveolar Lavage Exosomes in Lipopolysaccharide-induced Septic Lung Injury

Bronchoalveolar Lavage Exosomes i LPS-induceret septisk lunge skade

Acute lung injury (ALI) and acute respiratory distress syndrome (ARDS) represent a heterogeneous group of lung diseases which continues to have a high ...

Mating-based Overexpression Library Screening in Yeast

Parring-baserede overekspression bibliotek Screening i gær

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool ...

Screening Cotton Genotypes for Reniform Nematode Resistance

Screening af bomuld genotyper for Reniform nematode resistens

A rapid non-destructive reniform nematode (Rotylenchulus reniformis) screening protocol is needed for the development of resistant cotton (Gossypium ...

Identifying Mutations by High Resolution Melting in a TILLING Population of Rice

Identificering af mutationer ved høj opløsning smelter i en TILLING population af ris

Target Induced Local Lesions In Genomes (TILLING) is a strategy of reverse genetics for the high-throughput screening of induced mutations. However, the ...

Screening and Identification of RNA Silencing Suppressors from Secreted Effectors of Plant Pathogens

Screening og identifikation af RNA-lyddæmpningsundertrykkere fra udskillede effektorer af plantepatogener

RNA silencing is an evolutionarily conserved, sequence-specific gene regulation mechanism in eukaryotes. Several plant pathogens have evolved proteins ...