Name: hox loci focused crispr/sgrna library screening identifying critical ctcf boundaries
Uploaded: 2019-03-31T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about HOX Loci Focused CRISPR/sgRNA Library Screening Identifying Critical CTCF Boundaries at JoVE.com

De auteurs bedanken ook Nicholas Cesari voor het bewerken van het manuscript. Het werk werd gesteund door subsidies van het National Institute of Health (S.H., R01DK110108, R01CA204044).

1. CTCF sgRNALibrary Design met behulp van een Online Tool
<ol><li>Het ontwerp van de sgRNA dat targeting CTCF bandplaatsen in de menselijke HOX loci hulpprogramma voor het genetische perturbation platform (GPP) ontwerper (https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design).</li>
	<li>Synthetiseren totaal 1,070 sgRNAs bestaande uit sgRNAs dat targeting 303 willekeurige targeting genen, 60 positieve controles, 500 niet-mens-targeting besturingselementen, en 207 CTCF elementen of lncRNA ge...

<ol>
	<li>Dixon, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topological+domains+in+mammalian+genomes+identified+by+analysis+of+chromatin+interactions.">Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions.</a> Nature. 485 (7398), 376-380 (2012).</li><li>Cuddapah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+the+insulator+binding+protein+CTCF+in+chromatin+barrier+regions+reveals+demarcation+of+active+and+repressive+domains.">Global analysis of the insulator binding protein CTCF in chromatin barrier regions reveals demarcation of active and repressive domains.</a> Genome research. 19 (1), 24-32 (2009).</li><li>Phillips, J. E., Corces, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF:+master+weaver+of+the+genome.">CTCF: master weaver of the genome.</a> Cell. 137 (7), 1194-1211 (2009).</li><li>Tang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF-Mediated+Human+3D+Genome+Architecture+Reveals+Chromatin+Topology+for+Transcription.">CTCF-Mediated Human 3D Genome Architecture Reveals Chromatin Topology for Transcription.</a> Cell. 163 (7), 1611-1627 (2015).</li><li>Lupianez, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruptions+of+topological+chromatin+domains+cause+pathogenic+rewiring+of+gene-enhancer+interactions.">Disruptions of topological chromatin domains cause pathogenic rewiring of gene-enhancer interactions.</a> Cell. 161 (5), 1012-1025 (2015).</li><li>Dowen, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+cell+identity+genes+occurs+in+insulated+neighborhoods+in+mammalian+chromosomes.">Control of cell identity genes occurs in insulated neighborhoods in mammalian chromosomes.</a> Cell. 159 (2), 374-387 (2014).</li><li>Phillips-Cremins, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architectural+protein+subclasses+shape+3D+organization+of+genomes+during+lineage+commitment.">Architectural protein subclasses shape 3D organization of genomes during lineage commitment.</a> Cell. 153 (6), 1281-1295 (2013).</li><li>Narendra, V., Bulajic, M., Dekker, J., Mazzoni, E. O., Reinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF-mediated+topological+boundaries+during+development+foster+appropriate+gene+regulation.">CTCF-mediated topological boundaries during development foster appropriate gene regulation.</a> Genes &amp; Development. 30 (24), 2657-2662 (2016).</li><li>Narendra, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF+establishes+discrete+functional+chromatin+domains+at+the+Hox+clusters+during+differentiation.">CTCF establishes discrete functional chromatin domains at the Hox clusters during differentiation.</a> Science. 347 (6225), 1017-1021 (2015).</li><li>Deng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HoxBlinc+RNA+Recruits+Set1/MLL+Complexes+to+Activate+Hox+Gene+Expression+Patterns+and+Mesoderm+Lineage+Development.">HoxBlinc RNA Recruits Set1/MLL Complexes to Activate Hox Gene Expression Patterns and Mesoderm Lineage Development.</a> Cell Reports. 14 (1), 103-114 (2016).</li><li>Patel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberrant+TAL1+activation+is+mediated+by+an+interchromosomal+interaction+in+human+T-cell+acute+lymphoblastic+leukemia.">Aberrant TAL1 activation is mediated by an interchromosomal interaction in human T-cell acute lymphoblastic leukemia.</a> Leukemia. 28 (2), 349-361 (2014).</li><li>Luo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF+boundary+remodels+chromatin+domain+and+drives+aberrant+HOX+gene+transcription+in+acute+myeloid+leukemia.">CTCF boundary remodels chromatin domain and drives aberrant HOX gene transcription in acute myeloid leukemia.</a> Blood. 132 (8), 837-848 (2018).</li><li>Dou, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medial+HOXA+genes+demarcate+haematopoietic+stem+cell+fate+during+human+development.">Medial HOXA genes demarcate haematopoietic stem cell fate during human development.</a> Nature Cell Biology. 18 (6), 595-606 (2016).</li><li>Lawrence, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+expression+of+the+Hoxa-9+homeobox+gene+impairs+the+proliferation+and+repopulating+ability+of+hematopoietic+stem+cells.">Loss of expression of the Hoxa-9 homeobox gene impairs the proliferation and repopulating ability of hematopoietic stem cells.</a> Blood. 106 (12), 3988-3994 (2005).</li><li>Deng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=USF1+and+hSET1A+mediated+epigenetic+modifications+regulate+lineage+differentiation+and+HoxB4+transcription.">USF1 and hSET1A mediated epigenetic modifications regulate lineage differentiation and HoxB4 transcription.</a> PLOS Genetics. 9 (6), e1003524 (2013).</li><li>Rawat, V. P., Humphries, R. K., Buske, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+Hox:+the+role+of+ParaHox+genes+in+normal+and+malignant+hematopoiesis.">Beyond Hox: the role of ParaHox genes in normal and malignant hematopoiesis.</a> Blood. 120 (3), 519-527 (2012).</li><li>Alharbi, R. A., Pettengell, R., Pandha, H. S., Morgan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+HOX+genes+in+normal+hematopoiesis+and+acute+leukemia.">The role of HOX genes in normal hematopoiesis and acute leukemia.</a> Leukemia. 27 (5), 1000-1008 (2013).</li><li>Rice, K. L., Licht, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HOX+deregulation+in+acute+myeloid+leukemia.">HOX deregulation in acute myeloid leukemia.</a> Journal of Clinical Investigation. 117 (4), 865-868 (2007).</li><li>Bassett, A. R., Kong, L., Liu, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+CRISPR+library+for+high-throughput+genetic+screening+in+Drosophila+cells.">A genome-wide CRISPR library for high-throughput genetic screening in Drosophila cells.</a> Journal of Genetics and Genomics. 42 (6), 301-309 (2015).</li><li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+deletion+screening+of+human+long+non-coding+RNAs+using+a+paired-guide+RNA+CRISPR-Cas9+library.">Genome-scale deletion screening of human long non-coding RNAs using a paired-guide RNA CRISPR-Cas9 library.</a> Nature Biotechnology. 34 (12), 1279-1286 (2016).</li><li>Kurata, J. S., Lin, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-focused+CRISPR-Cas9+library+screen+reveals+fitness-associated+miRNAs.">MicroRNA-focused CRISPR-Cas9 library screen reveals fitness-associated miRNAs.</a> RNA. 24 (7), 966-981 (2018).</li><li>Collins, C. T., Hess, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+HOXA9+in+leukemia:+dysregulation,+cofactors+and+essential+targets.">Role of HOXA9 in leukemia: dysregulation, cofactors and essential targets.</a> Oncogene. 35 (9), 1090-1098 (2016).</li><li>Kroon, E., Thorsteinsdottir, U., Mayotte, N., Nakamura, T., Sauvageau, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NUP98-HOXA9+expression+in+hemopoietic+stem+cells+induces+chronic+and+acute+myeloid+leukemias+in+mice.">NUP98-HOXA9 expression in hemopoietic stem cells induces chronic and acute myeloid leukemias in mice.</a> The EMBO Journal. 20 (3), 350-361 (2001).</li><li>Koike-Yusa, H., Li, Y., Tan, E. P., Velasco-Herrera Mdel, C., Yusa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+recessive+genetic+screening+in+mammalian+cells+with+a+lentiviral+CRISPR-guide+RNA+library.">Genome-wide recessive genetic screening in mammalian cells with a lentiviral CRISPR-guide RNA library.</a> Nature Biotechnology. 32 (3), 267-273 (2014).</li><li>Shalem, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+CRISPR-Cas9+knockout+screening+in+human+cells.">Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells.</a> Science. 343 (6166), 84-87 (2014).</li><li>Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+screens+in+human+cells+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system.</a> Science. 343 (6166), 80-84 (2014).</li><li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+sgRNAs+facilitate+CRISPR/Cas9-mediated+mouse+genome+targeting.">Dual sgRNAs facilitate CRISPR/Cas9-mediated mouse genome targeting.</a> The FEBS Journal. 281 (7), 1717-1725 (2014).</li><li>Sanjana, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+interrogation+of+functional+elements+in+the+noncoding+genome.">High-resolution interrogation of functional elements in the noncoding genome.</a> Science. 353 (6307), 1545-1549 (2016).</li><li>Rajagopal, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+mapping+of+regulatory+DNA.">High-throughput mapping of regulatory DNA.</a> Nature Biotechnology. 34 (2), 167-174 (2016).</li><li>Korkmaz, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genetic+screens+for+enhancer+elements+in+the+human+genome+using+CRISPR-Cas9.">Functional genetic screens for enhancer elements in the human genome using CRISPR-Cas9.</a> Nature Biotechnology. 34 (2), 192-198 (2016).</li><li>Rezaei, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FMS-Like+Tyrosine+Kinase+3+(FLT3)+and+Nucleophosmin+1+(NPM1)+in+Iranian+Adult+Acute+Myeloid+Leukemia+Patients+with+Normal+Karyotypes:+Mutation+Status+and+Clinical+and+Laboratory+Characteristics.">FMS-Like Tyrosine Kinase 3 (FLT3) and Nucleophosmin 1 (NPM1) in Iranian Adult Acute Myeloid Leukemia Patients with Normal Karyotypes: Mutation Status and Clinical and Laboratory Characteristics.</a> Turkish Journal of Haematology. 34 (4), 300-306 (2017).</li><li>Yaragatti, M., Basilico, C., Dailey, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+active+transcriptional+regulatory+modules+by+the+functional+assay+of+DNA+from+nucleosome-free+regions.">Identification of active transcriptional regulatory modules by the functional assay of DNA from nucleosome-free regions.</a> Genome Research. 18 (6), 930-938 (2008).</li><li>Wilken, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNase+I+hypersensitivity+analysis+of+the+mouse+brain+and+retina+identifies+region-specific+regulatory+elements.">DNase I hypersensitivity analysis of the mouse brain and retina identifies region-specific regulatory elements.</a> Epigenetics Chromatin. 8, 8 (2015).</li><li>Narlikar, L., Ovcharenko, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+regulatory+elements+in+eukaryotic+genomes.">Identifying regulatory elements in eukaryotic genomes.</a> Briefings in Functional Genomics and Proteomics. 8 (4), 215-230 (2009).</li><li>Hnisz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+proto-oncogenes+by+disruption+of+chromosome+neighborhoods.">Activation of proto-oncogenes by disruption of chromosome neighborhoods.</a> Science. 351 (6280), 1454-1458 (2016).</li></ol>

Eiwit-codeert genen gerelateerde sgRNA bibliotheken zijn toegepast in een functionele screening systeem op identificatie van genen en netwerken regulering van de specifieke cellulaire functies via sgRNA verrijking24,25,26 ,27,28. Verschillende niet-coderende regio gerelateerde sgRNA bibliotheken werden ook getoond in gen-specifieke functionele screens voor di...

Recente genoom interactie onderzoek uitgewezen dat het menselijk genoom van de nucleaire vormen stabiele topologisch associëren domeinen (TADs) die zijn bewaard in de celtypen en soorten. De organisatie van het genoom in aparte domeinen vergemakkelijkt en interacties tussen regelgevende elementen (bijvoorbeeld versterkers en initiatiefnemers) beperkt. De CCCTC-bindende factor (CTCF) bindt aan TAD grenzen en speelt een cruciale rol in beperkende interacties van DNA-elementen die zich in aangrenzende TADs1 bevinden. Echter, genoom-brede CTCF bindende gegevens bleek dat hoewel CTCF meestal met dezelfde DNA-sites in verschillende celtypen communiceert, het vaak als een barrière van de chromatine op een specifieke site in één celtype maar niet in de andere fungeert, wat suggereert dat CTCF-functies samen met andere activiteiten in de vorming van chromatine grenzen2. Wat blijft onbekend is of de grens elementen (CTCF-bandplaatsen) rechtstreeks gekoppeld zijn aan de biologische functie van CTCF, en hoe deze koppelingen optreden. We veronderstellen daarom dat specifieke CTCF bandplaatsen in het genoom direct de vorming van TADs regelen en promotor/versterker interacties binnen deze domeinen of tussen naburige domeinen. De voltooiing van de mens en de muis genoom sequencing projecten en de daaropvolgende epigenetische analyses hebben ontdekt nieuwe moleculaire en genetische handtekeningen van het genoom. De rol van specifieke handtekeningen/wijzigingen in genexpressie en cellulaire functie, evenals hun moleculaire mechanism(s), moeten echter nog volledig worden begrepen.
Meerdere lijnen van bewijsmateriaal ondersteunen dat de CTCF-gemedieerde TADs functionele chromatine domeinen3,4,5 vertegenwoordigen Hoewel CTCF meestal met dezelfde DNA-sites in verschillende celtypen communiceert, bleek genoom-brede CTCF ChIP-seq gegevens dat de CTCF vaak als een barrière van de chromatine in één celtype maar niet in de andere2 fungeert. CTCF speelt een essentiële rol tijdens de ontwikkeling door het genoom organisatie4,6,7te bemiddelen. Verstoring van de CTCF grenzen verminderde versterker/promotor interacties en genexpressie, leidt tot ontwikkelingsstoornissen verstopping. Dit suggereert dat CTCF TADs gemedieerde zijn niet alleen de structurele onderdelen, maar ook de regelgevende eenheden vereist voor een juiste versterker actie en gene transcriptie5,8,9.
HOX -genen spelen een kritieke rol tijdens de embryonale ontwikkeling en ze zijn stoffelijk als ruimtelijk beperkt in hun expressiepatronen. De locus HOXA vormt twee stabiele TADs anterior en posterior genen te scheiden door een element van de CTCF-geassocieerde grens in zowel hESCs als IMR90 cellen1. Uit recente rapporten blijkt dat HoxBlinc, een HoxB verbonden locus lncRNA, de vorming van CTCF bemiddelt geregisseerd TADs en versterker/promotor-interacties in de locus HOXB . Dit leidt tot anterior HOXB gene activering tijdens ESC inzet en differentiatie10. Anderzijds op specifiek gen loci met inbegrip van het HOXA locus, wijziging van de CTCF gemedieerde TAD domeinen veranderd lineage specifiek gen expressieprofielen en werd geassocieerd met de ontwikkeling van ziekte staten11,12. Het bewijs ondersteunt een primaire functie voor CTCF in coördinatie van de transcriptie van het gen en het bepalen van de cel identiteit door het organiseren van het genoom in functionele domeinen.
Ondanks haar rol in de ontwikkeling van het embryo, tijdens Haematopoiese, reguleren HOX -genen hematopoietische stamcellen en voorlopercellen functie van de cel (HS/PC). Dit wordt gedaan door het beheersen van het evenwicht tussen de proliferatie en differentiatie10,13,14,15. De expressie van HOX -genen is strak geregeld gedurende de specificatie en de differentiatie van hematopoietische cellen, met de hoogste expressie in HS / PCs. HOX genexpressie daalt geleidelijk tijdens de rijping, met het laagste niveau die zich in gedifferentieerde hematopoietische cellen16. HOX gene disregulatie is een dominante mechanisme van leukemische transformatie door dysregulating eigenschappen van de zelf-vernieuwing en differentiatie van HS/PCs leidt tot leukemische transformatie17,18. Het mechanisme van het opzetten en onderhouden van de normale vs. oncogene expressiepatronen van HOX -genen, alsmede bijbehorende regulerende netwerken blijft echter onduidelijk.
CRISPR-Cas9 sgRNA bibliotheek screening is wijd verbeid gebruikt om te ondervragen van eiwit-codeert genen19 als ook als niet-codeert genen, zoals lncRNA20 en miRNA21 in verschillende soorten. De kosten voor het gebruik van de CRISPR-Cas9-sgRNA-bibliotheek te identificeren van nieuwe genomic doelstellingen blijft echter hoog, omdat high-throughput genoom sequencing vaak toegepast wordt om te controleren of de sgRNA bibliotheek screening. Onze sgRNA screening systeem is gericht op de specifieke genoom loci en resulteert in de targeting sgRNAs via one-step RT-PCR volgens de genexpressie markering, zoals HOXA9. Bovendien kan Sanger sequencing bevestigd dat de sgRNA werd geïntegreerd in het genoom, en Indel mutaties worden gedetecteerd om te identificeren van de sgRNA dat targeting site. Via de loci-specifieke CRISPR-Cas9 genetische screening, is de grens van de chromatine CBS7/9 geïdentificeerd als een kritische regulator voor totstandbrenging oncogene chromatine domein en het onderhoud van ectopische HOX gen expressiepatronen in AML pathogenese 12. de methode kan algemeen worden toegepast om te identificeren niet alleen specifieke functie van de CTCF grens in de embryonale ontwikkeling, Haematopoiese, leukemogenesis, maar ook CTCF grens als therapeutisch doelwit voor toekomstige Epigenetische therapie.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:689px;" width="689">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Lipofectamine 3000 reagent</td>
			<td style="width:155px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">L3000-008</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Proteinase K</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25530049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Puromycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1113802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stbl3 cells&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>&#160;C737303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEK293T</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MOLM-13</td>
			<td>DSMZ</td>
			<td>ACC 554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">lentiCRISPRv2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>52961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">psPAX2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pGEM&#174;-T Easy Vector Systems&#160;</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A137A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T4 ligase&#160;</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>&#160;M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAquick Gel Extract kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAuick PCR purification kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SingleShot&#8482; SYBR&#174;&#160;Green One-Step Kit</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1725095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">QIAGEN Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td style="width:100px;">12163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">&#160;11965084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI 1640&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal bovine serum (FBS)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">10-082-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin/streptomycin/L-glutamine&#160;</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:100px;">10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lenti-X Concentrator&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Clontech</td>
			<td style="width:100px;">631232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Trypan Blue Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Polybrene</td>
			<td style="width:155px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-134220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Genessee Scientific</td>
			<td>&#160;25-507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">TAE buffer&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>FERB49</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Surveyor&#174; Mutation Detection Kits</td>
			<td style="width:155px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:100px;">706020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Biorad Universal Hood II Gel Doc System</td>
			<td style="width:155px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:100px;">170-8126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Centrifuge 5424 R</td>
			<td style="width:155px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:100px;">5404000138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Digital Dry Baths/Block Heaters</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">88870002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">TSX Series Ultra-Low Freezers</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">TSX40086V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Forma&#8482; Steri-Cult&#8482; CO2&#160;Incubators</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">3308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Herasafe&#8482; KS, Class II Biological Safety Cabinet</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">51022484</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Sorvall&#8482; Legend&#8482; XT/XF Centrifuge Series</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">75004506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Fisherbrand&#8482;&#160;Isotemp&#8482; Water Baths</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">FSGPD02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:263px;">Thermo Scientific&#8482;&#160;Locator&#8482; Plus Rack and Box Systems</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">13-762-353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System</td>
			<td style="width:155px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:100px;">1855195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">MiniAmp&#8482; Thermal Cycler</td>
			<td style="width:155px;">Applied Biosystems technology</td>
			<td style="width:100px;">A37834</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:263px;">Thermo Scientific&#8482;&#160;Owl&#8482; EC300XL2 Compact Power Supply</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">7217581</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:263px;">Thermo Scientific&#8482;&#160;Owl&#8482; EasyCast&#8482; B1 Mini Gel Electrophoresis Systems</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">09-528-178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">VWR&#174; Tube Rotator and Rotisseries</td>
			<td style="width:155px;">VWR International</td>
			<td style="width:100px;">10136-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">VWR&#174; Incubating Mini Shaker</td>
			<td style="width:155px;">VWR International</td>
			<td style="width:100px;">12620-942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Analytical Balance MS104TS/00</td>
			<td style="width:155px;">METTLER TOLEDO</td>
			<td style="width:100px;">30133522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">DS-11 FX and DS-11 FX+ Spectrophotometer</td>
			<td style="width:155px;">DeNovix Inc.</td>
			<td style="width:100px;">DS-11 FX</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hox loci focused crispr/sgrna library screening identifying critical ctcf boundaries

CCCTC-bindende factor (CTCF)-gemedieerde stabiele topologisch associëren domeinen (TADs) spelen een cruciale rol in beperkende interacties van DNA-elementen die zich bevinden in het naburige TADs. CTCF speelt een belangrijke rol bij de regulering van de ruimtelijke en temporele expressie van HOX -genen waarmee embryonale ontwikkeling, lichaam patronen, Haematopoiese en leukemogenesis. Het blijft echter grotendeels onbekend of en hoe HOX loci verbonden CTCF grenzen chromatine organisatie en expressie van HOX -genen regelen. In het huidige protocol, is een specifieke sgRNA gepoolde bibliotheek gericht op alle CTCF bandplaatsen in de HOXA/B/C/D loci gegenereerd om te onderzoeken van de effecten van CTCF-geassocieerde chromatine grenzen op TAD vorming en HOX gen verstoren expressie. Via CRISPR-Cas9 is genetische screening, de CTCF binding site gelegen tussen HOXA7/HOXA9 genen (CBS7/9) geïdentificeerd als een kritische regulator van oncogene chromatine domein, maar ook als belangrijk voor het behoud van ectopische HOX -genen expressiepatronen in MLL-herschikt acute myeloïde leukemie (AML). Dus, deze sgRNA bibliotheek screening aanpak biedt nieuwe inzichten in CTCF gemedieerde genoom organisatie in specifiek gen loci en biedt ook een basis voor de functionele karakterisering van de geannoteerde genetische regelgevende elementen, zowel codering en Noncoding, tijdens normale biologische processen in het post-menselijke genoom project tijdperk.

CRISPR-Cas9-technologie is een krachtig onderzoekhulpmiddel voor functioneel genomisch studies. Het is snel ter vervanging van conventionele gene bewerken technieken en heeft hoge nut voor genoom-brede zowel individuele gene gerichte toepassingen. Hier, bevat de eerste individueel gekloonde loci-specifieke CRISPR-Cas9-gekleed sgRNA bibliotheek 1,070 sgRNAs bestaande uit sgRNAs dat targeting 303 willekeurige targeting genen, 60 positieve controles, 500 niet-mens-targeting besturingselement...

Watch this Scientific Journal Video about HOX Loci Focused CRISPR/sgRNA Library Screening Identifying Critical CTCF Boundaries at JoVE.com

HOX Loci Focused CRISPR/sgRNA Library Screening Identifying Critical CTCF Boundaries

Een CRISPR/sgRNA-bibliotheek is toegepast op het ondervragen van eiwit-codeert genen. De haalbaarheid van een bibliotheek van de sgRNA aan het licht brengen van de functie van een scheidingswand CTCF in genregulatie blijft echter onontgonnen. Hier beschrijven we een HOX loci specifieke sgRNA bibliotheek te verhelderen van de functie van CTCF grenzen in HOX loci.

HOX Loci gericht CRISPR/sgRNA bibliotheek Screening identificeren kritische CTCF grenzen

CCCTC-binding factor (CTCF)-mediated stable topologically associating domains (TADs) play a critical role in constraining interactions of DNA elements ...

Onze gepoolde sgRNA genaamd de bibliotheek screening, is een krachtige genetische benadering te identificeren en te evalueren van de biologische functie van de niet-codering elementen in het hele genoom. Deze techniek stelt ons in staat om het effect van het verstoren van de bindende sites geassocieerd, chromatische grenzen of andere regelgevende elementen op gerichte genen expressie te onderzoeken. Onze aanpak kan worden gebruikt om de rol van CTCF, lange niet-codering RNAs en versterkers, in HOX-genregulatie in de vroege embryonale ontwikkeling te identificeren, evenals bepaalde leukemie met een afwijkende HOX-genhandtekening.Begin deze procedure met het ontwerp van een sgRNA targeting CTCF binding sites. Klonen van de sgRNA-bibliotheek in celvoorbereiding zoals beschreven in het tekstprotocol. Om het lentivirus te verpakken, cotransfect HEK293 T-cellen met 20 microgram gezuiverde bibliotheekvectoren, 15 microgram van de verpakte plasmide en 10 microgram van de envelop plasmide, gedurende 48 uur voordat de virussen worden geoogst.Na 48 uur, verzamel het virus supernatant en filter het door een 0,45 micron laag eiwitbindende PVDF membraan. Concentreer vervolgens de lentivirale supernatant met 50 voudig, met behulp van de concentrator. Aliquot de geconcentreerde virussen en bewaar ze in een min 80 graden Celsius vriezer.Werk in afzonderlijke putten van een 12 putplaat om MOLM13-cellen te mengen met verschillende doses van het geconcentreerde lentivirus voor zes totale groepen. Onmiddellijk centrifugeren deze mengsels op 1000 keer g gedurende twee uur op 33 graden Celsius. Breng de 12 putplaten terug naar de couveuse bij 37 graden Celsius en 5% kooldioxide gedurende vier uur.Zuid voorzichtig aanzuigen zonder het celpalet te verstoren en de getransduceerde cellen opnieuw op te schorten met verse aangevuld RPMI 1640 Medium. Breng vervolgens de opnieuw opgehangen cellen over naar T25-kolven en broeden vervolgens 48 uur lang zonder puromycine bij 37 graden Celsius. Na 48 uur split deze cellen in twee kolven, een experimentele groep behandeld met een microliter per milliliter puromycine gedurende vijf dagen, en een controlegroep zonder puromycine behandeling gedurende vijf dagen.Meet de geoptimaliseerde MOI-waarde voor transductie door het aantal levende cellen behandeld met puromycine te delen door het aantal cellen zonder puromycinebehandeling. Om de cellen met de gepoolde bibliotheek te herleiden, infecteer 1,5 miljoen MOLM13-cellen in een 6-putplaat met 0,3 MOI sgRNA-gepoold lentivirus in medium. Gebruik de cellen zonder de lentivirus infectie als een controle.Onmiddellijk centrifugeren de zes put plaat op 1000 keer g gedurende twee uur op 33 graden celsius om de cellen spinfect. Breng de platen vervolgens gedurende vier uur terug naar de couveuse bij 37 graden celsius in 5% kooldioxide. Voorzichtig aanzuigen supernatant zonder verstoring van de cel palet, en opnieuw opschorten van de getransduceerde cellen met vers medium.Breng de cellen vervolgens 48 uur zonder puromycine over op T25-kolven en incubeer op 37 graden Celsius. Behandel de cellen na 48 uur vijf dagen met één microgram per milliliter puromycine. Ruil na twee dagen in op vers medium en behoud een optimale celdichtheid.Zaad de enkele kloon in 96 goed platen met beperkende verdunningsmethoden. Broed deze enkele kloon uit op 37 graden Celsius en 5% kooldioxide. Cultuur ze voor 3-4 weken.Tel de sgRNA geïntegreerde MOLM13 cellen met 0,4%Trypan Blue oplossing vlekken en breng vervolgens 10.000 levende cellen per put naar een 96 goed PCR plaat. Centrifuge de plaat op 1000 keer g gedurende vijf minuten en verwijder vervolgens grondig en gooi de supernatant met een pipet. Vermijd het verstoren van het celpalet.Na het wassen van de cellen zoals beschreven in de tekst voeg 50 microliters van de cel lyse master mix aan elke put. Pipette vijf keer op en neer om het celpalet opnieuw op te schorten. Incubeer het mengsel gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.Breng het mengsel vervolgens gedurende vijf minuten over op 37 graden celsius en vervolgens 75 graden celsius gedurende nog eens vijf minuten. Voeg nu een microliter cellysaat toe aan de PCR-putten met de RT qPCR-reactiemix. Deze mix omvat de marker genen vooruit en reverse primer, reverse transcriptase en One-Step reactie mix.Voer de omgekeerde transcriptiereactie gedurende 10 minuten uit op 50 graden Celsius, gevolgd door polymerisatieactivering en DNA-denaturatie gedurende een minuut bij 95 graden Celsius. Voer RT PCR uit met 40 cycli van PCR-reactie zoals beschreven in het tekstprotocol. Controleer de HOXA9 verminderde expressie klonen door middel van Sanger sequencing en voer PCR met MOLM13 genoom DNA zoals beschreven in het tekstprotocol.Haal de PCR-producten uit en zuiver ze met de PCR-zuiveringskit. Ligate de gezuiverde PCR producten in de T vector met T4 ligatie buffer, T vector DNA, PCR DNA en T4 ligase. Plaats de ligatie mix in een couveuse op 16 graden Celsius 's nachts.Breng de ligatie mix in DH5 alpha bevoegde cellen en plaat op een LB ampicilline antibioticum agar plaat. Incubeer de platen 's nachts op 37 graden celsius. Kies de enkele klonen van de LB-plaat en verifieer ze door genotyperen en Sanger sequencing.Stel de heteroduplex mengselgroep op met 200 nanogram van de referentie en 200 nanogram test-PCR-amplicons in een PCR-buis van 0,2 milliliter. Neem de homoduplex mengsel groep met slechts 400 nanogram referentie PCR amplicons als een controle. Afzonderlijk incubeer het heteroduplex en homoduplex mengsel bij 95 graden celsius gedurende vijf minuten in een een liter beker gevuld met 800 milliliter water.Vervolgens koel je de mengsels geleidelijk af tot kamertemperatuur tot anneal en vorm je de heteroduplex of homoduplex. Nu, afzonderlijk verteren 400 nanogram van de geannealed heteroduplex en homoduplex mengsel met een microliter van indel mutatie detectie nuclease, en twee microliters van nuclease reactie buffer op 42 graden Celsius gedurende 60 minuten. Analyseer de verteerde monsters met agarose gel elektroforese.Het heteroduplexmengsel DNA moet in kleine stukjes worden gesneden en het homoduplex-DNA mag niet worden gesneden. sgRNA targeting MOLM13 positieve klonen werden bevestigd met de RT qPCR methode, gebaseerd op de expressieniveaus van HOXA9 genen met de vergelijking met de controlecellen. Van de 528 gescreende klonen vertoonden 10 klonen meer dan 50% minder HOXA9-niveaus.sgRNAs geïntegreerd in de HOXA9 verminderd, HOXA9 ongewijzigd en HOXA9 verhoogde klonen, werden verder bevestigd door PCR versterking van de sgRNA en identificatie door Sanger sequentie. Zes van de tien klonen met een vermindering van HOXA9 niveaus bevatte sgRNAs gericht op de CBS79 site, zoals bepaald door Sanger sequencing. Indel mutaties van geïntegreerde sgRNA positieve klonen werden bepaald door PCR-gebaseerde genotypering en nuclease spijsvertering.De heterozygoot verwijdering van de CTCF-site tussen HOXA7- en HOXA9-genen werd geïdentificeerd door op PCR gebaseerde genotypering. HOXA9-verminderde klonen vijf, zes, 28 en 121 vertoonden verwijdering in de CBS79 grenslocatie. Vergelijkbare resultaten werden waargenomen voor de indel mutaties in de CBS79 site die werden geanalyseerd door de nuclease spijsvertering test.Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om gelijke hoeveelheden heteroduplexen en homoduplexen te maken om sgRNA-geïnduceerde indelmutaties te detecteren door middel van de nuclease spijsverteringstest. Onze aanpak maakt het gebruik van de geselecteerde marker mogelijk, om de volgende generatie sequencing uit te voeren op het doelgen om de effecten van het gen op leukemogenese te ontdekken. Over het algemeen voorkomt onze aanpak RPC's voor de functionele correcte en reductie van een bekende genetische onregelmatige elementen tijdens normaal biologisch proces en leukemogenese in de postume genoomprojectfout.

Research

JoVE Journal

Genetics

HOX Loci Focused CRISPR/sgRNA Library Screening Identifying Critical CTCF Boundaries

A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source

Een universeel Protocol voor grootschalige gRNA bibliotheek productie uit elke bron van DNA

The popularity of the CRISPR/Cas9 system for both genome and epigenome engineering stems from its simplicity and adaptability. An effector (the Cas9 ...

G2-seq: A High Throughput Sequencing-based Technique for Identifying Late Replicating Regions of the Genome

G2-seq: Een High Throughput Sequencing gebaseerde techniek voor het identificeren van laat repliceren regio's van het genoom

Numerous techniques have been developed to follow the progress of DNA replication through the S phase of the cell cycle. Most of these techniques have ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Robuuste DNA isolatie en High-throughput Sequencing bibliotheek bouw voor Herbarium Specimens

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

Retrospectieve MicroRNA Sequencing: CDNA Bibliotheek voorbereiding Protocol met behulp van formaline-vaste paraffine-ingebedde RNA Specimens

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of ...

Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen

Ultralow Input genoom Sequencing bibliotheek bereiding op basis van een enkel exemplaar van de Tardigrade

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state ...

Bronchoalveolar Lavage Exosomes in Lipopolysaccharide-induced Septic Lung Injury

Bronchoalveolar Lavage Exosomes Lipopolysaccharide-geïnduceerde septische long letsel

Acute lung injury (ALI) and acute respiratory distress syndrome (ARDS) represent a heterogeneous group of lung diseases which continues to have a high ...

Mating-based Overexpression Library Screening in Yeast

Paring gebaseerde overexpressie bibliotheek Screening in het gist

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool ...

Screening Cotton Genotypes for Reniform Nematode Resistance

Screening van katoen genotypes voor Reniform nematode resistentie

A rapid non-destructive reniform nematode (Rotylenchulus reniformis) screening protocol is needed for the development of resistant cotton (Gossypium ...

Identifying Mutations by High Resolution Melting in a TILLING Population of Rice

Identificeren van mutaties door een hoge resolutie smelting in een TILLING populatie van rijst

Target Induced Local Lesions In Genomes (TILLING) is a strategy of reverse genetics for the high-throughput screening of induced mutations. However, the ...

Screening and Identification of RNA Silencing Suppressors from Secreted Effectors of Plant Pathogens

Screening en identificatie van RNA Silencing Suppressors van secreted effectors of Plant Pathogens

RNA silencing is an evolutionarily conserved, sequence-specific gene regulation mechanism in eukaryotes. Several plant pathogens have evolved proteins ...