Name: hox loci focused crispr/sgrna library screening identifying critical ctcf boundaries
Uploaded: 2019-03-31T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about HOX Loci Focused CRISPR/sgRNA Library Screening Identifying Critical CTCF Boundaries at JoVE.com

Die Autoren danken auch Nicholas Cesari für das Manuskript zu bearbeiten. Die Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem National Institute of Health (s.h., R01DK110108, R01CA204044).

(1) CTCF SgRNALibrary Design mit einem Online-Tool
<ol><li>Entwerfen Sie die SgRNA targeting CTCF Bindungsstellen in den menschlichen HOX -Loci mit der genetischen Störung Plattform (GPP) Designer-Tool (https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design).</li>
	<li>Insgesamt 1.070 SgRNAs bestehend aus SgRNAs, die Ausrichtung auf 303 zufällige Gene targeting, 60 Positivkontrollen, 500 non-Human-targeting Kontrollen und 207 CTCF Elemente oder LncRNA gezielt Gene (Abb...

<ol>
	<li>Dixon, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topological+domains+in+mammalian+genomes+identified+by+analysis+of+chromatin+interactions.">Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions.</a> Nature. 485 (7398), 376-380 (2012).</li><li>Cuddapah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+the+insulator+binding+protein+CTCF+in+chromatin+barrier+regions+reveals+demarcation+of+active+and+repressive+domains.">Global analysis of the insulator binding protein CTCF in chromatin barrier regions reveals demarcation of active and repressive domains.</a> Genome research. 19 (1), 24-32 (2009).</li><li>Phillips, J. E., Corces, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF:+master+weaver+of+the+genome.">CTCF: master weaver of the genome.</a> Cell. 137 (7), 1194-1211 (2009).</li><li>Tang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF-Mediated+Human+3D+Genome+Architecture+Reveals+Chromatin+Topology+for+Transcription.">CTCF-Mediated Human 3D Genome Architecture Reveals Chromatin Topology for Transcription.</a> Cell. 163 (7), 1611-1627 (2015).</li><li>Lupianez, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruptions+of+topological+chromatin+domains+cause+pathogenic+rewiring+of+gene-enhancer+interactions.">Disruptions of topological chromatin domains cause pathogenic rewiring of gene-enhancer interactions.</a> Cell. 161 (5), 1012-1025 (2015).</li><li>Dowen, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+cell+identity+genes+occurs+in+insulated+neighborhoods+in+mammalian+chromosomes.">Control of cell identity genes occurs in insulated neighborhoods in mammalian chromosomes.</a> Cell. 159 (2), 374-387 (2014).</li><li>Phillips-Cremins, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architectural+protein+subclasses+shape+3D+organization+of+genomes+during+lineage+commitment.">Architectural protein subclasses shape 3D organization of genomes during lineage commitment.</a> Cell. 153 (6), 1281-1295 (2013).</li><li>Narendra, V., Bulajic, M., Dekker, J., Mazzoni, E. O., Reinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF-mediated+topological+boundaries+during+development+foster+appropriate+gene+regulation.">CTCF-mediated topological boundaries during development foster appropriate gene regulation.</a> Genes &amp; Development. 30 (24), 2657-2662 (2016).</li><li>Narendra, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF+establishes+discrete+functional+chromatin+domains+at+the+Hox+clusters+during+differentiation.">CTCF establishes discrete functional chromatin domains at the Hox clusters during differentiation.</a> Science. 347 (6225), 1017-1021 (2015).</li><li>Deng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HoxBlinc+RNA+Recruits+Set1/MLL+Complexes+to+Activate+Hox+Gene+Expression+Patterns+and+Mesoderm+Lineage+Development.">HoxBlinc RNA Recruits Set1/MLL Complexes to Activate Hox Gene Expression Patterns and Mesoderm Lineage Development.</a> Cell Reports. 14 (1), 103-114 (2016).</li><li>Patel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberrant+TAL1+activation+is+mediated+by+an+interchromosomal+interaction+in+human+T-cell+acute+lymphoblastic+leukemia.">Aberrant TAL1 activation is mediated by an interchromosomal interaction in human T-cell acute lymphoblastic leukemia.</a> Leukemia. 28 (2), 349-361 (2014).</li><li>Luo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF+boundary+remodels+chromatin+domain+and+drives+aberrant+HOX+gene+transcription+in+acute+myeloid+leukemia.">CTCF boundary remodels chromatin domain and drives aberrant HOX gene transcription in acute myeloid leukemia.</a> Blood. 132 (8), 837-848 (2018).</li><li>Dou, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medial+HOXA+genes+demarcate+haematopoietic+stem+cell+fate+during+human+development.">Medial HOXA genes demarcate haematopoietic stem cell fate during human development.</a> Nature Cell Biology. 18 (6), 595-606 (2016).</li><li>Lawrence, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+expression+of+the+Hoxa-9+homeobox+gene+impairs+the+proliferation+and+repopulating+ability+of+hematopoietic+stem+cells.">Loss of expression of the Hoxa-9 homeobox gene impairs the proliferation and repopulating ability of hematopoietic stem cells.</a> Blood. 106 (12), 3988-3994 (2005).</li><li>Deng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=USF1+and+hSET1A+mediated+epigenetic+modifications+regulate+lineage+differentiation+and+HoxB4+transcription.">USF1 and hSET1A mediated epigenetic modifications regulate lineage differentiation and HoxB4 transcription.</a> PLOS Genetics. 9 (6), e1003524 (2013).</li><li>Rawat, V. P., Humphries, R. K., Buske, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+Hox:+the+role+of+ParaHox+genes+in+normal+and+malignant+hematopoiesis.">Beyond Hox: the role of ParaHox genes in normal and malignant hematopoiesis.</a> Blood. 120 (3), 519-527 (2012).</li><li>Alharbi, R. A., Pettengell, R., Pandha, H. S., Morgan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+HOX+genes+in+normal+hematopoiesis+and+acute+leukemia.">The role of HOX genes in normal hematopoiesis and acute leukemia.</a> Leukemia. 27 (5), 1000-1008 (2013).</li><li>Rice, K. L., Licht, J. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+CRISPR+library+for+high-throughput+genetic+screening+in+Drosophila+cells.">A genome-wide CRISPR library for high-throughput genetic screening in Drosophila cells.</a> Journal of Genetics and Genomics. 42 (6), 301-309 (2015).</li><li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+deletion+screening+of+human+long+non-coding+RNAs+using+a+paired-guide+RNA+CRISPR-Cas9+library.">Genome-scale deletion screening of human long non-coding RNAs using a paired-guide RNA CRISPR-Cas9 library.</a> Nature Biotechnology. 34 (12), 1279-1286 (2016).</li><li>Kurata, J. S., Lin, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-focused+CRISPR-Cas9+library+screen+reveals+fitness-associated+miRNAs.">MicroRNA-focused CRISPR-Cas9 library screen reveals fitness-associated miRNAs.</a> RNA. 24 (7), 966-981 (2018).</li><li>Collins, C. T., Hess, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+HOXA9+in+leukemia:+dysregulation,+cofactors+and+essential+targets.">Role of HOXA9 in leukemia: dysregulation, cofactors and essential targets.</a> Oncogene. 35 (9), 1090-1098 (2016).</li><li>Kroon, E., Thorsteinsdottir, U., Mayotte, N., Nakamura, T., Sauvageau, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NUP98-HOXA9+expression+in+hemopoietic+stem+cells+induces+chronic+and+acute+myeloid+leukemias+in+mice.">NUP98-HOXA9 expression in hemopoietic stem cells induces chronic and acute myeloid leukemias in mice.</a> The EMBO Journal. 20 (3), 350-361 (2001).</li><li>Koike-Yusa, H., Li, Y., Tan, E. P., Velasco-Herrera Mdel, C., Yusa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+recessive+genetic+screening+in+mammalian+cells+with+a+lentiviral+CRISPR-guide+RNA+library.">Genome-wide recessive genetic screening in mammalian cells with a lentiviral CRISPR-guide RNA library.</a> Nature Biotechnology. 32 (3), 267-273 (2014).</li><li>Shalem, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+CRISPR-Cas9+knockout+screening+in+human+cells.">Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells.</a> Science. 343 (6166), 84-87 (2014).</li><li>Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+screens+in+human+cells+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system.</a> Science. 343 (6166), 80-84 (2014).</li><li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+sgRNAs+facilitate+CRISPR/Cas9-mediated+mouse+genome+targeting.">Dual sgRNAs facilitate CRISPR/Cas9-mediated mouse genome targeting.</a> The FEBS Journal. 281 (7), 1717-1725 (2014).</li><li>Sanjana, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+interrogation+of+functional+elements+in+the+noncoding+genome.">High-resolution interrogation of functional elements in the noncoding genome.</a> Science. 353 (6307), 1545-1549 (2016).</li><li>Rajagopal, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+mapping+of+regulatory+DNA.">High-throughput mapping of regulatory DNA.</a> Nature Biotechnology. 34 (2), 167-174 (2016).</li><li>Korkmaz, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genetic+screens+for+enhancer+elements+in+the+human+genome+using+CRISPR-Cas9.">Functional genetic screens for enhancer elements in the human genome using CRISPR-Cas9.</a> Nature Biotechnology. 34 (2), 192-198 (2016).</li><li>Rezaei, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FMS-Like+Tyrosine+Kinase+3+(FLT3)+and+Nucleophosmin+1+(NPM1)+in+Iranian+Adult+Acute+Myeloid+Leukemia+Patients+with+Normal+Karyotypes:+Mutation+Status+and+Clinical+and+Laboratory+Characteristics.">FMS-Like Tyrosine Kinase 3 (FLT3) and Nucleophosmin 1 (NPM1) in Iranian Adult Acute Myeloid Leukemia Patients with Normal Karyotypes: Mutation Status and Clinical and Laboratory Characteristics.</a> Turkish Journal of Haematology. 34 (4), 300-306 (2017).</li><li>Yaragatti, M., Basilico, C., Dailey, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+active+transcriptional+regulatory+modules+by+the+functional+assay+of+DNA+from+nucleosome-free+regions.">Identification of active transcriptional regulatory modules by the functional assay of DNA from nucleosome-free regions.</a> Genome Research. 18 (6), 930-938 (2008).</li><li>Wilken, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNase+I+hypersensitivity+analysis+of+the+mouse+brain+and+retina+identifies+region-specific+regulatory+elements.">DNase I hypersensitivity analysis of the mouse brain and retina identifies region-specific regulatory elements.</a> Epigenetics Chromatin. 8, 8 (2015).</li><li>Narlikar, L., Ovcharenko, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+regulatory+elements+in+eukaryotic+genomes.">Identifying regulatory elements in eukaryotic genomes.</a> Briefings in Functional Genomics and Proteomics. 8 (4), 215-230 (2009).</li><li>Hnisz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+proto-oncogenes+by+disruption+of+chromosome+neighborhoods.">Activation of proto-oncogenes by disruption of chromosome neighborhoods.</a> Science. 351 (6280), 1454-1458 (2016).</li></ol>

Protein-kodierenden gen bezogene SgRNA Bibliotheken in einem funktionalen Screeningsystem zur Identifizierung von Genen und Netzwerke zur Regelung bestimmter Zellfunktionen durch SgRNA Bereicherung24,25,26 angewendet wurden ,27,28. Mehrere nicht-kodierende Region bezogene SgRNA Bibliotheken zeigten sich auch in Gen-spezifischen funktionalen Bildschirme für d...

Neuere Genom Interaktion Studien gezeigt, dass die menschliche Genom Formen topologisch verknüpfen Domänen (TADs) stabil, die in Zelle Arten und Arten konserviert sind. Die Organisation des Genoms in separaten Domänen erleichtert und schränkt die Wechselwirkungen zwischen regulatorische Elemente (z. B. Geschmacksverstärker und Promotoren). CCCTC-Bindungsfaktor (CTCF) bindet an TAD Grenzen und spielt eine entscheidende Rolle in einschränkende Interaktionen von DNA-Elemente, die in benachbarten TADs1befinden. Genom breite CTCF binden von Daten ergaben jedoch, dass obwohl CTCF meist mit der gleichen DNA-Standorten in verschiedenen Zelltypen interagiert, es oft als Chromatin Barriere an einem bestimmten Standort in einer Zelle Art aber nicht in das andere dient, was darauf hindeutet, dass CTCF Funktionen zusammen mit den anderen Aktivitäten bei der Bildung von Chromatin Grenzen2. Unbekannt geblieben ist, ob der Randelemente (CTCF-Bindungsstellen) direkt auf die biologische Funktion von CTCF verknüpft sind, und wie diese Links auftreten. Daher vermuten wir, dass bestimmte CTCF Bindungsstellen im Genom direkt die Bildung von TADs regulieren und Promotor/Enhancer Interaktionen innerhalb dieser Domänen oder zwischen benachbarten Domänen zu kontrollieren. Die Vollendung von Mensch und Maus Genom-Sequenzierung Projekte und späteren epigenetischen Analysen haben neue molekulare und genetische Signaturen des Genoms aufgedeckt. Die Rolle der Signaturen/Anpassungen in der Genregulation und zelluläre Funktion sowie ihre molekulare Mechanismen müssen jedoch noch nicht vollständig verstanden werden.
Mehrere Linien des Beweises unterstützen, dass CTCF-vermittelten TADs funktionale Chromatin Domänen3,4,5darstellen. Obwohl CTCF meist mit der gleichen DNA-Standorten in verschiedenen Zelltypen interagiert, zufolge Genom breite CTCF ChIP-Seq-Daten CTCF fungiert oft als Chromatin Barriere in einer Zelle Art aber nicht in die anderen2. CTCF spielt eine wesentliche Rolle bei der Entwicklung von Vermittlung Genom Organisation4,6,7. Störung der CTCF Grenzen beeinträchtigt Enhancer/Promotor Interaktionen und Genexpression, was zu Entwicklungsstörungen Blockade. Dies deutet darauf hin, dass CTCF TADs vermittelt nicht nur strukturelle Komponenten, sondern auch regulatorische Einheiten für richtige Enhancer Aktion und gen Transkription5,8,9erforderlich sind.
HOX -Gene spielen eine kritische Rolle während der Embryonalentwicklung und sie sind zeitlich und räumlich eingeschränkt ihre Expressionsmuster. HOXA -Locus bildet zwei stabile TADs Front- und Seitenzahnbereich Gene durch eine CTCF-assoziierten Randelement in Zellkulturen und IMR90 Zellen1zu trennen. Die jüngsten Berichte zeigten, dass HoxBlinc, ein HoxB Locus verbunden LncRNA, die Bildung von CTCF vermittelt TADs und Enhancer/Promotor Interaktionen in den HOXB Locus gerichtet. Dies führt zu anterioren HOXB Genaktivierung bei ESC Engagement und Differenzierung10. Darüber hinaus an bestimmte gen-Loci einschließlich der HOXA -Lokus, Änderung der CTCF TAD Domänen geändert Linie spezifisches Gen Expressionsprofile vermittelt und wurde im Zusammenhang mit der Entwicklung der Krankheit Staaten11,12. Der Beweis stützt eine primäre Funktion für CTCF Gentranskription koordinieren und Bestimmung der Zelle Identität durch die Organisation des Genoms in Funktionsbereiche.
Trotz seiner Rolle in der embryonalen Entwicklung, während der Hämatopoese regulieren HOX -Gene hämatopoetischen Stammzellen und Vorläuferzellen (HS/PC) Zellfunktion. Dies geschieht durch die Förderung des Gleichgewichts zwischen Proliferation und Differenzierung10,13,14,15. Der Ausdruck der HOX -Gene ist streng reguliert, während die Spezifikation und die Differenzierung von hämatopoetischen Zellen mit höchsten Ausdruck in HS / Stk. HOX -gen-Expression sinkt allmählich während der Reifung, mit den niedrigsten Stand Auftritt unterschieden hämatopoetischen Zellen16. HOX -gen Dysregulation ist eine dominante Mechanismus der leukämischen Transformation durch Dysregulating Selbsterneuerung und Differenzierung Eigenschaften der HS/PCs zu leukämischen Transformation17,18. Der Mechanismus der Einführung und Aufrechterhaltung von Normal vs. onkogenen Expressionsmuster der HOX -Gene sowie damit verbundenen Regulationsnetzwerke bleibt jedoch unklar.
CRISPR-Cas9-SgRNA-Bibliothek-Screening wurde weithin verwendet, um Protein-kodierenden Gene19 als auch als nicht-kodierenden Gene, z. B. LncRNA20 und MiRNA21 in verschiedenen Arten zu verhören. Die Kosten die CRISPR-Cas9-SgRNA-Bibliothek verwenden, um neue genomische Ziele identifizieren bleibt jedoch hoch, da Hochdurchsatz-Genoms oft angewendet wird, um zu überprüfen, die SgRNA-Bibliothek-Screening. Unsere SgRNA screening-System konzentriert sich auf die spezifischen Genom-Loci und wertet das targeting SgRNAs durch One-Step RT-PCR nach der Marker-gen-Expression, z. B. HOXA9. Darüber hinaus kann Sanger-Sequenzierung bestätigt, dass die SgRNA in das Genom und Indel Mutationen integriert wurde erkannt werden, um die SgRNA Ausrichtung der Website zu identifizieren. Durch die Loci-spezifische CRISPR-Cas9 genetisches Screening, wurde die CBS7/9-Chromatin-Grenze als kritische Regulator für onkogenen Chromatin Domäne Aufbau und Pflege von ektopische HOX gen Expressionsmuster in AML Pathogenese identifiziert 12. die Methode kann weit angewendet werden, um nicht nur spezifische Funktion von CTCF Grenze in der Embryonalentwicklung, Blutbildung, Leukemogenesis, aber auch CTCF Grenze als mögliche therapeutische Ziele für künftige epigenetische Therapie zu identifizieren.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:689px;" width="689">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Lipofectamine 3000 reagent</td>
			<td style="width:155px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">L3000-008</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Proteinase K</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25530049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Puromycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1113802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stbl3 cells&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>&#160;C737303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEK293T</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MOLM-13</td>
			<td>DSMZ</td>
			<td>ACC 554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">lentiCRISPRv2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>52961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">psPAX2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pGEM&#174;-T Easy Vector Systems&#160;</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A137A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T4 ligase&#160;</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>&#160;M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAquick Gel Extract kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAuick PCR purification kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SingleShot&#8482; SYBR&#174;&#160;Green One-Step Kit</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1725095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">QIAGEN Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td style="width:100px;">12163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">&#160;11965084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI 1640&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal bovine serum (FBS)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">10-082-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin/streptomycin/L-glutamine&#160;</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:100px;">10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lenti-X Concentrator&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Clontech</td>
			<td style="width:100px;">631232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Trypan Blue Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Polybrene</td>
			<td style="width:155px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-134220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Genessee Scientific</td>
			<td>&#160;25-507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">TAE buffer&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>FERB49</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Surveyor&#174; Mutation Detection Kits</td>
			<td style="width:155px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:100px;">706020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Biorad Universal Hood II Gel Doc System</td>
			<td style="width:155px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:100px;">170-8126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Centrifuge 5424 R</td>
			<td style="width:155px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:100px;">5404000138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Digital Dry Baths/Block Heaters</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">88870002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">TSX Series Ultra-Low Freezers</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">TSX40086V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Forma&#8482; Steri-Cult&#8482; CO2&#160;Incubators</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">3308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Herasafe&#8482; KS, Class II Biological Safety Cabinet</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">51022484</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Sorvall&#8482; Legend&#8482; XT/XF Centrifuge Series</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">75004506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Fisherbrand&#8482;&#160;Isotemp&#8482; Water Baths</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">FSGPD02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:263px;">Thermo Scientific&#8482;&#160;Locator&#8482; Plus Rack and Box Systems</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">13-762-353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System</td>
			<td style="width:155px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:100px;">1855195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">MiniAmp&#8482; Thermal Cycler</td>
			<td style="width:155px;">Applied Biosystems technology</td>
			<td style="width:100px;">A37834</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:263px;">Thermo Scientific&#8482;&#160;Owl&#8482; EC300XL2 Compact Power Supply</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">7217581</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:263px;">Thermo Scientific&#8482;&#160;Owl&#8482; EasyCast&#8482; B1 Mini Gel Electrophoresis Systems</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">09-528-178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">VWR&#174; Tube Rotator and Rotisseries</td>
			<td style="width:155px;">VWR International</td>
			<td style="width:100px;">10136-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">VWR&#174; Incubating Mini Shaker</td>
			<td style="width:155px;">VWR International</td>
			<td style="width:100px;">12620-942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Analytical Balance MS104TS/00</td>
			<td style="width:155px;">METTLER TOLEDO</td>
			<td style="width:100px;">30133522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">DS-11 FX and DS-11 FX+ Spectrophotometer</td>
			<td style="width:155px;">DeNovix Inc.</td>
			<td style="width:100px;">DS-11 FX</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hox loci focused crispr/sgrna library screening identifying critical ctcf boundaries

CCCTC-Bindungsfaktor (CTCF)-vermittelten stabile topologisch Domänen zuordnen (TADs) spielen eine entscheidende Rolle in einschränkende Interaktionen von DNA-Elemente, die im benachbarten TADs befinden. CTCF spielt eine wichtige Rolle bei der Regulierung des räumlichen und zeitlichen Ausdrucks der HOX -Gene, die embryonale Entwicklung, Körper Musterung, Blutbildung und Leukemogenesis zu steuern. Es bleibt jedoch weitgehend unbekannt, ob und wie HOX Loci verbundenen CTCF Grenzen Chromatin Organisation und HOX -gen-Expression zu regulieren. In dem aktuellen Protokoll hat eine spezifische SgRNA gepoolte Bibliothek gezielt alle CTCF Bindungsstellen in den HOXA/B/C/D -Loci generiert, um die Auswirkungen der Störung CTCF-assoziierten Chromatin Grenzen auf TAD Bildung und HOX -gen untersuchen Ausdruck. Durch CRISPR-Cas9 wurde genetisches Screening, die CTCF Bindungsstelle befindet sich zwischen HOXA7/HOXA9 -Gene (CBS7/9) als kritische Regulator des onkogenen Chromatin Domäne sowie als wichtig für die Aufrechterhaltung der ektopische HOX -Gen identifiziert Expressionsmuster in neu geordnet, MLL akute myeloische Leukämie (AML). Also, diese SgRNA Bibliothek screening-Ansatz bietet neue Einblicke in CTCF vermittelte Genom-Organisation in spezifischen Gen-Loci und auch die Grundlage für die funktionelle Charakterisierung der kommentierten genetische regulatorischen Elemente, beide Codierung und Forensisches, während normale biologische Prozesse in der Post-humanen Genom-Projekt-Ära.

CRISPR-Cas9-Technologie ist eine leistungsfähige Recherche-Tool für funktionelle Genomforschung Studien. Es ist schnell ersetzt konventionelle gen Bearbeitung Techniken und hohem Nutzwert für genomweite und individuelle gen ausgerichtete Anwendungen hat. Hier enthält die erste individuell geklonte Loci-spezifische CRISPR-Cas9 angeordneten SgRNA Bibliothek 1.070 SgRNAs bestehend aus SgRNAs, die Ausrichtung auf 303 zufällige Gene targeting, 60 Positivkontrollen, 500 non-Human-targeting...

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HOX Loci Focused CRISPR/sgRNA Library Screening Identifying Critical CTCF Boundaries

Eine CRISPR/SgRNA-Bibliothek wurde zur Vernehmung Protein-kodierenden Gene angewandt. Die Machbarkeit einer SgRNA Bibliothek um die Funktion einer CTCF Grenze in Genregulation zu entdecken bleibt jedoch unerforscht. Hier beschreiben wir eine HOX Loci spezifische SgRNA Bibliothek um die Funktion von CTCF Grenzen in HOX Loci zu erhellen.

HOX Loci Focused CRISPR/SgRNA Bibliothek Screening identifizieren kritische CTCF Grenzen

CCCTC-binding factor (CTCF)-mediated stable topologically associating domains (TADs) play a critical role in constraining interactions of DNA elements ...

Unsere gepoolte sgRNA, das Bibliotheksscreening, ist ein leistungsstarker genetischer Ansatz, um die biologische Funktion der nicht kodierenden Elemente im gesamten Genom zu identifizieren und zu bewerten. Diese Technik ermöglicht es uns, die Wirkung der Störung der bindungsstellen assoziierten, chromatischen Grenzen oder andere regulatorische Elemente auf die gezielte Genexpression zu untersuchen. Unser Ansatz kann verwendet werden, um die Rolle von CTCF, langen nicht-kodierenden RNAs und Enhancer, bei der HOX-Genregulation in der frühen embryonalen Entwicklung sowie bestimmter Leukämien mit einer abnormen HOX-Gensignatur zu identifizieren.Beginnen Sie dieses Verfahren mit dem Entwurf einer sgRNA, die auf CTCF-Bindungsstellen abzielt. Klonen der sgRNA-Bibliothek in der Zellvorbereitung, wie im Textprotokoll beschrieben. Um das Lentivirus zu verpacken, kotranssektieren HEK293 T-Zellen mit 20 Mikrogramm gereinigter Bibliotheksvektoren, 15 Mikrogramm des verpackten Plasmids und 10 Mikrogramm des Hüllwasserplasmids 48 Stunden vor der Ernte der Viren.Sammeln Sie nach 48 Stunden den Virusüberstand und filtern Sie ihn durch eine 0,45 Mikrometer-proteinarme PVDF-Membran. Als nächstes konzentrieren Sie den lentiviralen Überstand um das 50-fache, indem Sie den Konzentrator verwenden. Aliquot die konzentrierten Viren und speichern Sie sie in einem minus 80 Grad Celsius Gefrierschrank.Arbeiten Sie in separaten Brunnen einer 12-Well-Platte, um MOLM13-Zellen mit verschiedenen Dosen des konzentrierten Lentivirus für sechs Gesamtgruppen zu mischen. Diese Mischungen sofort bei 1000-fachg für zwei Stunden bei 33 Grad Celsius zentrieren. Übertragen Sie die 12 Brunnenplatten vier Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid zurück in den Inkubator.Den Überstand sanft ansaugen, ohne die Zellpalette zu stören, und die transduced Zellen mit frisch ergänztem RPMI 1640 Medium wieder aufhängen. Dann die wieder suspendierten Zellen auf T25-Flaschen übertragen und bei 37 Grad Celsius 48 Stunden ohne Puromycin brüten. Nach 48 Stunden teilten diese Zellen in zwei Kolben, eine experimentelle Gruppe mit einem Mikroliter pro Milliliter Puromycin für fünf Tage behandelt, und eine Kontrollgruppe ohne Puromycin-Behandlung für fünf Tage.Messen Sie den optimierten MOI-Wert für die Transduktion, indem Sie die Anzahl der mit Puromycin behandelten lebenden Zellen durch die Anzahl der Zellen ohne Puromycin-Behandlung dividieren. Um die Zellen mit der gepoolten Bibliothek zu transducieren, infizieren Sie 1,5 Millionen MOLM13-Zellen in einer 6-Well-Platte mit 0,3 MOI von sgRNA gepooltem Lentivirus im Medium. Verwenden Sie die Zellen ohne die Lentivirus-Infektion als Kontrolle.Sofort zentrieren Sie die sechs Brunnenplatte bei 1000 mal g für zwei Stunden bei 33 Grad Celsius, um die Zellen zu spritzen. Dann übertragen Sie die Platten zurück zum Inkubator bei 37 Grad Celsius in 5% Kohlendioxid für vier Stunden. Befangen Überstand ansaugen, ohne die Zellpalette zu stören, und die transduced Zellen mit frischem Medium wieder aufhängen.Dann übertragen Sie die Zellen auf T25-Flaschen und brüten bei 37 Grad Celsius für 48 Stunden ohne Puromycin. Nach 48 Stunden behandeln Sie die Zellen fünf Tage lang mit einem Mikrogramm pro Milliliter Puromycin. Austausch nach frischem Medium nach zwei Tagen und Aufrechterhaltung einer optimalen Zelldichte.Säen Sie den einzelnen Klon in 96 Brunnenplatten mit begrenzenden Verdünnungsmethoden. Inkubieren Sie diese einzelnen Klon bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Kultur sie für 3-4 Wochen.Zählen Sie die sgRNA integrierten MOLM13-Zellen mit 0,4%Trypan Blue Lösungsfärbung und übertragen Sie dann 10.000 lebende Zellen pro Brunnen auf eine 96 Well PCR-Platte. Zentrifugieren Sie die Platte fünf Minuten lang bei 1000 mal g und entfernen Sie den Überstand dann gründlich mit einer Pipette. Vermeiden Sie es, die Zellpalette zu stören.Nach dem Waschen der Zellen, wie im Text beschrieben, fügen Sie 50 Mikroliter der Zelllyse-Master-Mischung zu jedem Brunnen hinzu. Pipette fünfmal nach oben und unten, um die Zellpalette wieder aufzuhängen. Inkubieren Sie die Mischung für 10 Minuten bei Raumtemperatur.Dann übertragen Sie die Mischung auf 37 Grad Celsius für fünf Minuten, und dann 75 Grad Celsius für weitere fünf Minuten. Fügen Sie nun einen Mikroliter Zelllysat in die PCR-Bohrungen ein, die den RT qPCR-Reaktionsmix enthalten. Diese Mischung umfasst die Markergene Vorwärts- und Rückwärtsgrundierung, Reverse-Transkriptase und One-Step-Reaktionsmix.Führen Sie die umgekehrte Transkriptionsreaktion 10 Minuten bei 50 Grad Celsius, gefolgt von Polymerisationsaktivierung und DNA-Denaturierung für eine Minute bei 95 Grad Celsius. Führen Sie RT PCR mit 40 Zyklen PCR-Reaktion, wie im Textprotokoll beschrieben. Überprüfen Sie die HOXA9 verminderten Expressionsklone durch Sanger-Sequenzierung und führen Sie PCR mit MOLM13-Genom-DNA durch, wie im Textprotokoll beschrieben.Extrahieren und reinigen Sie die PCR-Produkte mit dem PCR-Reinigungskit. Ligate die gereinigten PCR-Produkte in den T-Vektor mit T4-Ligationspuffer, T-Vektor-DNA, PCR-DNA und T4-Ligase. Legen Sie die Ligationsmischung über Nacht bei 16 Grad Celsius in einen Brutkasten.Übertragen Sie die Ligationsmischung in DH5 alpha kompetente Zellen und Platte auf einem LB Ampicillin Antibiotikum Agarplatte. Die Teller über Nacht bei 37 Grad Celsius bebrüten. Wählen Sie die einzelnen Klone aus der LB-Platte und verifizieren Sie sie durch Genotypisierung und Sanger-Sequenzierung.Richten Sie die Heteroduplex-Mischungsgruppe mit 200 Nanogramm der Referenz und 200 Nanogramm Test-PCR-Amplicons in einer 0,2 Milliliter-PCR-Röhre ein. Fügen Sie die Homoduplex-Mischungsgruppe mit nur 400 Nanogramm Referenz-PCR-Amplicons als Steuerung ein. Die Heteroduplex- und Homoduplex-Mischung bei 95 Grad Celsius fünf Minuten lang in einem mit 800 Millilitern Wasser gefüllten Ein-Liter-Becher separat bebrüten.Dann abkühlen die Mischungen allmählich auf Raumtemperatur zu anneal und bilden die Heteroduplex oder Homoduplex. Nun 400 Nanogramm der geglühten Heteroduplex- und Homoduplex-Mischung mit einem Mikroliter Indelmutationsdetekperund und zwei Mikroliter Nuklease-Reaktionspuffer bei 42 Grad Celsius für 60 Minuten separat verdauen. Analysieren Sie die verdauten Proben mit Agarose-Gel-Elektrophorese.Die Heteroduplex-Gemisch-DNA sollte in kleine Fragmente geschnitten werden und die Homoduplex-DNA sollte nicht geschnitten werden. sgRNA targeting MOLM13 positive clones wurden mit der RT qPCR Methode bestätigt, basierend auf den Expressionsniveaus von HOXA9-Genen mit dem Vergleich mit den Kontrollzellen. Von den 528 überlebenden Klonen, die gescreent wurden, zeigten 10 Klone eine Reduzierung der HOXA9-Spiegel um mehr als 50 %.sgRNAs, die in die HOXA9 integriert sind, reduziert, HOXA9 unverändert und HOXA9 erhöhte Klone, wurden durch PCR-Verstärkung der sgRNA und Identifikation durch Sanger-Sequenz weiter bestätigt. Sechs von zehn Klonen, die eine Verringerung der HOXA9-Werte aufweisen, enthielten sgRNAs, die auf die CBS79-Site abzielen, wie durch Sanger-Sequenzierung bestimmt. Indelmutationen integrierter sgRNA-positiver Klone wurden durch PCR-basierte Genotypisierung und Nukleaseverdauung bestimmt.Die heterozygote Löschung der CTCF-Site zwischen HOXA7 und HOXA9-Genen wurde durch PCR-basierte Genotypisierung identifiziert. Die HOXA9-verringerten Klone fünf, sechs, 28 und 121 zeigten die Löschung an der CBS79-Grenze. Ähnliche Ergebnisse wurden für die Indelmutationen an der CBS79-Site beobachtet, die durch den Nuklease-Verdauungstest analysiert wurden.Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, gleiche Mengen an Heteroduplexen und Homoduplexen herzustellen, um sgRNA-induzierte Indelmutationen durch den Nuklease-Verdauungstest zu erkennen. Unser Ansatz ermöglicht die Nutzung des ausgewählten Markers, um eine Sequenzierung der nächsten Generation am Zielgen durchzuführen, um die Auswirkungen des Gens auf die Leukemogenese zu entdecken. Insgesamt verhindert unser Ansatz RPCs zur funktionellen Korrektheit und Reduktion einer festgestellten genetischen unregelmäßigen Elemente während des normalen biologischen Prozesses und Leukemogenese im posthumen Genomprojektfehler.

Research

JoVE Journal

Genetics

HOX Loci Focused CRISPR/sgRNA Library Screening Identifying Critical CTCF Boundaries

A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source

Ein universelles Protokoll für groß angelegte gRNA Bibliothek Produktion aus jeder DNA-Quelle

The popularity of the CRISPR/Cas9 system for both genome and epigenome engineering stems from its simplicity and adaptability. An effector (the Cas9 ...

Forschung

Genetik

G2-seq: A High Throughput Sequencing-based Technique for Identifying Late Replicating Regions of the Genome

G2-Seq: Ein hoher Durchsatz Sequenzierung-basierten Methode zur Identifizierung von spät repliziert Regionen des Genoms

Numerous techniques have been developed to follow the progress of DNA replication through the S phase of the cell cycle. Most of these techniques have ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Robuste DNA-Isolierung und Hochdurchsatz-Sequenzierung Bibliotheksbau für Herbar

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

Retrospektive RNA Sequenzierung: Komplementäre DNA Bibliothek Vorbereitung Protokoll mit Formalin fixierten Paraffin-eingebetteten RNA-Proben

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of ...

Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen

Frequenzverschiebungen Eingabe Genom Sequenzierung Bibliothek Vorbereitung von einem einzigen Tardigrade Exemplar

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state ...

Bronchoalveolar Lavage Exosomes in Lipopolysaccharide-induced Septic Lung Injury

Alvéolaire Lavage Exosomen in Lipopolysaccharid-induzierte septischen Lungenschädigung

Acute lung injury (ALI) and acute respiratory distress syndrome (ARDS) represent a heterogeneous group of lung diseases which continues to have a high ...

Mating-based Overexpression Library Screening in Yeast

Paarung-basierte Überexpression Bibliothek Screening in der Hefe

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool ...

Screening Cotton Genotypes for Reniform Nematode Resistance

Screening Cotton Genotypes auf Reniform Nematode Resistenz

A rapid non-destructive reniform nematode (Rotylenchulus reniformis) screening protocol is needed for the development of resistant cotton (Gossypium ...

Identifying Mutations by High Resolution Melting in a TILLING Population of Rice

Identifizieren von Mutationen durch hochauflösendes Schmelzen in einer TILLING-Bevölkerung von Reis

Target Induced Local Lesions In Genomes (TILLING) is a strategy of reverse genetics for the high-throughput screening of induced mutations. However, the ...

Screening and Identification of RNA Silencing Suppressors from Secreted Effectors of Plant Pathogens

Screening und Identifizierung von RNA-Silencing Suppressoren von sezernierten Effektoren von Pflanzenpathogenen

RNA silencing is an evolutionarily conserved, sequence-specific gene regulation mechanism in eukaryotes. Several plant pathogens have evolved proteins ...