Name: hox loci focused crispr/sgrna library screening identifying critical ctcf boundaries
Uploaded: 2019-03-31T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about HOX Loci Focused CRISPR/sgRNA Library Screening Identifying Critical CTCF Boundaries at JoVE.com

המחברים מודים גם Cesari ניקולס על עריכת כתב היד. העבודה נתמכה על ידי מענקים מן המכון הלאומי לבריאות (תרגום, R01DK110108, R01CA204044).

1. CTCF sgRNALibrary עיצוב באמצעות כלי מקוון
<ol><li>לעצב את sgRNA מיקוד CTCF אתרים מחייב לוקוסים HOX האנושי באמצעות ההפרעות גנטיות פלטפורמה (GPP) מעצב הכלי (https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design).</li>
	<li>לסנתז סך של 1,070 sgRNAs המורכב sgRNAs מיקוד 303 גנים מיקוד אקראי, פקדים חיובי 60, פקדים שאינם האדם-פילוח 500, ו- 207...

<ol>
	<li>Dixon, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topological+domains+in+mammalian+genomes+identified+by+analysis+of+chromatin+interactions.">Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions.</a> Nature. 485 (7398), 376-380 (2012).</li><li>Cuddapah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+the+insulator+binding+protein+CTCF+in+chromatin+barrier+regions+reveals+demarcation+of+active+and+repressive+domains.">Global analysis of the insulator binding protein CTCF in chromatin barrier regions reveals demarcation of active and repressive domains.</a> Genome research. 19 (1), 24-32 (2009).</li><li>Phillips, J. E., Corces, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF:+master+weaver+of+the+genome.">CTCF: master weaver of the genome.</a> Cell. 137 (7), 1194-1211 (2009).</li><li>Tang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF-Mediated+Human+3D+Genome+Architecture+Reveals+Chromatin+Topology+for+Transcription.">CTCF-Mediated Human 3D Genome Architecture Reveals Chromatin Topology for Transcription.</a> Cell. 163 (7), 1611-1627 (2015).</li><li>Lupianez, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruptions+of+topological+chromatin+domains+cause+pathogenic+rewiring+of+gene-enhancer+interactions.">Disruptions of topological chromatin domains cause pathogenic rewiring of gene-enhancer interactions.</a> Cell. 161 (5), 1012-1025 (2015).</li><li>Dowen, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+cell+identity+genes+occurs+in+insulated+neighborhoods+in+mammalian+chromosomes.">Control of cell identity genes occurs in insulated neighborhoods in mammalian chromosomes.</a> Cell. 159 (2), 374-387 (2014).</li><li>Phillips-Cremins, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architectural+protein+subclasses+shape+3D+organization+of+genomes+during+lineage+commitment.">Architectural protein subclasses shape 3D organization of genomes during lineage commitment.</a> Cell. 153 (6), 1281-1295 (2013).</li><li>Narendra, V., Bulajic, M., Dekker, J., Mazzoni, E. O., Reinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF-mediated+topological+boundaries+during+development+foster+appropriate+gene+regulation.">CTCF-mediated topological boundaries during development foster appropriate gene regulation.</a> Genes &amp; Development. 30 (24), 2657-2662 (2016).</li><li>Narendra, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF+establishes+discrete+functional+chromatin+domains+at+the+Hox+clusters+during+differentiation.">CTCF establishes discrete functional chromatin domains at the Hox clusters during differentiation.</a> Science. 347 (6225), 1017-1021 (2015).</li><li>Deng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HoxBlinc+RNA+Recruits+Set1/MLL+Complexes+to+Activate+Hox+Gene+Expression+Patterns+and+Mesoderm+Lineage+Development.">HoxBlinc RNA Recruits Set1/MLL Complexes to Activate Hox Gene Expression Patterns and Mesoderm Lineage Development.</a> Cell Reports. 14 (1), 103-114 (2016).</li><li>Patel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberrant+TAL1+activation+is+mediated+by+an+interchromosomal+interaction+in+human+T-cell+acute+lymphoblastic+leukemia.">Aberrant TAL1 activation is mediated by an interchromosomal interaction in human T-cell acute lymphoblastic leukemia.</a> Leukemia. 28 (2), 349-361 (2014).</li><li>Luo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF+boundary+remodels+chromatin+domain+and+drives+aberrant+HOX+gene+transcription+in+acute+myeloid+leukemia.">CTCF boundary remodels chromatin domain and drives aberrant HOX gene transcription in acute myeloid leukemia.</a> Blood. 132 (8), 837-848 (2018).</li><li>Dou, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medial+HOXA+genes+demarcate+haematopoietic+stem+cell+fate+during+human+development.">Medial HOXA genes demarcate haematopoietic stem cell fate during human development.</a> Nature Cell Biology. 18 (6), 595-606 (2016).</li><li>Lawrence, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+expression+of+the+Hoxa-9+homeobox+gene+impairs+the+proliferation+and+repopulating+ability+of+hematopoietic+stem+cells.">Loss of expression of the Hoxa-9 homeobox gene impairs the proliferation and repopulating ability of hematopoietic stem cells.</a> Blood. 106 (12), 3988-3994 (2005).</li><li>Deng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=USF1+and+hSET1A+mediated+epigenetic+modifications+regulate+lineage+differentiation+and+HoxB4+transcription.">USF1 and hSET1A mediated epigenetic modifications regulate lineage differentiation and HoxB4 transcription.</a> PLOS Genetics. 9 (6), e1003524 (2013).</li><li>Rawat, V. P., Humphries, R. K., Buske, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+Hox:+the+role+of+ParaHox+genes+in+normal+and+malignant+hematopoiesis.">Beyond Hox: the role of ParaHox genes in normal and malignant hematopoiesis.</a> Blood. 120 (3), 519-527 (2012).</li><li>Alharbi, R. A., Pettengell, R., Pandha, H. S., Morgan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+HOX+genes+in+normal+hematopoiesis+and+acute+leukemia.">The role of HOX genes in normal hematopoiesis and acute leukemia.</a> Leukemia. 27 (5), 1000-1008 (2013).</li><li>Rice, K. L., Licht, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HOX+deregulation+in+acute+myeloid+leukemia.">HOX deregulation in acute myeloid leukemia.</a> Journal of Clinical Investigation. 117 (4), 865-868 (2007).</li><li>Bassett, A. R., Kong, L., Liu, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+CRISPR+library+for+high-throughput+genetic+screening+in+Drosophila+cells.">A genome-wide CRISPR library for high-throughput genetic screening in Drosophila cells.</a> Journal of Genetics and Genomics. 42 (6), 301-309 (2015).</li><li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+deletion+screening+of+human+long+non-coding+RNAs+using+a+paired-guide+RNA+CRISPR-Cas9+library.">Genome-scale deletion screening of human long non-coding RNAs using a paired-guide RNA CRISPR-Cas9 library.</a> Nature Biotechnology. 34 (12), 1279-1286 (2016).</li><li>Kurata, J. S., Lin, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-focused+CRISPR-Cas9+library+screen+reveals+fitness-associated+miRNAs.">MicroRNA-focused CRISPR-Cas9 library screen reveals fitness-associated miRNAs.</a> RNA. 24 (7), 966-981 (2018).</li><li>Collins, C. T., Hess, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+HOXA9+in+leukemia:+dysregulation,+cofactors+and+essential+targets.">Role of HOXA9 in leukemia: dysregulation, cofactors and essential targets.</a> Oncogene. 35 (9), 1090-1098 (2016).</li><li>Kroon, E., Thorsteinsdottir, U., Mayotte, N., Nakamura, T., Sauvageau, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NUP98-HOXA9+expression+in+hemopoietic+stem+cells+induces+chronic+and+acute+myeloid+leukemias+in+mice.">NUP98-HOXA9 expression in hemopoietic stem cells induces chronic and acute myeloid leukemias in mice.</a> The EMBO Journal. 20 (3), 350-361 (2001).</li><li>Koike-Yusa, H., Li, Y., Tan, E. P., Velasco-Herrera Mdel, C., Yusa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+recessive+genetic+screening+in+mammalian+cells+with+a+lentiviral+CRISPR-guide+RNA+library.">Genome-wide recessive genetic screening in mammalian cells with a lentiviral CRISPR-guide RNA library.</a> Nature Biotechnology. 32 (3), 267-273 (2014).</li><li>Shalem, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+CRISPR-Cas9+knockout+screening+in+human+cells.">Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells.</a> Science. 343 (6166), 84-87 (2014).</li><li>Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+screens+in+human+cells+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system.</a> Science. 343 (6166), 80-84 (2014).</li><li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+sgRNAs+facilitate+CRISPR/Cas9-mediated+mouse+genome+targeting.">Dual sgRNAs facilitate CRISPR/Cas9-mediated mouse genome targeting.</a> The FEBS Journal. 281 (7), 1717-1725 (2014).</li><li>Sanjana, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+interrogation+of+functional+elements+in+the+noncoding+genome.">High-resolution interrogation of functional elements in the noncoding genome.</a> Science. 353 (6307), 1545-1549 (2016).</li><li>Rajagopal, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+mapping+of+regulatory+DNA.">High-throughput mapping of regulatory DNA.</a> Nature Biotechnology. 34 (2), 167-174 (2016).</li><li>Korkmaz, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genetic+screens+for+enhancer+elements+in+the+human+genome+using+CRISPR-Cas9.">Functional genetic screens for enhancer elements in the human genome using CRISPR-Cas9.</a> Nature Biotechnology. 34 (2), 192-198 (2016).</li><li>Rezaei, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FMS-Like+Tyrosine+Kinase+3+(FLT3)+and+Nucleophosmin+1+(NPM1)+in+Iranian+Adult+Acute+Myeloid+Leukemia+Patients+with+Normal+Karyotypes:+Mutation+Status+and+Clinical+and+Laboratory+Characteristics.">FMS-Like Tyrosine Kinase 3 (FLT3) and Nucleophosmin 1 (NPM1) in Iranian Adult Acute Myeloid Leukemia Patients with Normal Karyotypes: Mutation Status and Clinical and Laboratory Characteristics.</a> Turkish Journal of Haematology. 34 (4), 300-306 (2017).</li><li>Yaragatti, M., Basilico, C., Dailey, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+active+transcriptional+regulatory+modules+by+the+functional+assay+of+DNA+from+nucleosome-free+regions.">Identification of active transcriptional regulatory modules by the functional assay of DNA from nucleosome-free regions.</a> Genome Research. 18 (6), 930-938 (2008).</li><li>Wilken, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNase+I+hypersensitivity+analysis+of+the+mouse+brain+and+retina+identifies+region-specific+regulatory+elements.">DNase I hypersensitivity analysis of the mouse brain and retina identifies region-specific regulatory elements.</a> Epigenetics Chromatin. 8, 8 (2015).</li><li>Narlikar, L., Ovcharenko, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+regulatory+elements+in+eukaryotic+genomes.">Identifying regulatory elements in eukaryotic genomes.</a> Briefings in Functional Genomics and Proteomics. 8 (4), 215-230 (2009).</li><li>Hnisz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+proto-oncogenes+by+disruption+of+chromosome+neighborhoods.">Activation of proto-oncogenes by disruption of chromosome neighborhoods.</a> Science. 351 (6280), 1454-1458 (2016).</li></ol>

ג'ין חלבונים הקשורים sgRNA ספריות הוחלו במערכת הקרנה פונקציונלי לזיהוי גנים ורשתות ויסות פונקציות ספציפיות הסלולר דרך sgRNA העשרה24,25,26 ,27,28. מספר אזור ללא קידוד הקשורים sgRNA ספריות הוצגו גם במסכים פונקציונ...

מחקרים אחרונים של אינטראקציה עם הגנום חשף הטפסים גנום גרעינית יציבה תחומים שיוך topologically (TADs) שאינם נשמרים על פני סוגי תאים ו מינים. הארגון של הגנום לתחומים נפרדים מקלה ומגביל את האינטראקציות בין גורמים רגולטוריים (למשל, משפרי ואת היזמים). הגורם מחייב CCCTC (CTCF) נקשר טד גבולות ומשחק תפקיד קריטי באינטראקציות מגבילה של רכיבי ה-DNA ממוקמים TADs שכנים1. עם זאת, נתוני איגוד CTCF רחב של הגנום חשף למרות CTCF בעיקר אינטראקציה עם ה-DNA זהה-האתרים סוגי תאים שונים, הוא לעתים קרובות מתפקד כמחסום כרומטין באתר מסוים בסוג תא אחד אבל לא ביד השנייה, רומז כי פונקציות CTCF יחד עם פעילויות אחרות להיווצרות של כרומטין גבולות2. מה נותר עלום היא האלמנטים גבול (מחייב CTCF אתרים) קשורים ישירות לתפקוד הביולוגי של CTCF, איך קישורים אלה להתרחש. לכן, אנו משערים כי אתרי קישור CTCF ספציפיים בגנום ישירות לווסת את היווצרות של TADs, לשלוט יזם/משפר אינטראקציות בתוך תחומים אלה או בין תחומים סמוכים. השלמת האדם ואת העכבר הגנום רצפי פרויקטים וניתוחים epigenetic עוקבות חשפו חתימות המולקולריים והגנטיים חדשות של הגנום. עם זאת, תפקידו של חתימות/שינויים ספציפיים הכונה תפקוד התאים, כמו גם mechanism(s) המולקולרי שלהם, טרם להבין עד הסוף.
שורות מרובות של ראיות תומכות כי TADs בתיווך CTCF מייצגים כרומטין פונקציונלי תחומים3,4,5. למרות CTCF בעיקר אינטראקציה עם ה-DNA זהה-האתרים סוגי תאים שונים, נתונים CTCF שבב-seq רחב הגנום חשף כי CTCF לעיתים קרובות באמנות משמש חיץ כרומטין סוג תא אחד אך לא את שאר2. CTCF ממלא תפקיד חיוני במהלך הפיתוח על ידי מתווכים הגנום הארגוני4,6,7. שיבוש CTCF גבולות לקוי משפר/מקדם אינטראקציות, ביטוי גנים, שמוביל חסימה התפתחותית. הדבר מצביע על כך CTCF מתווכת TADs הם לא רק רכיבים מבניים, אלא גם יחידות רגולטוריות הדרושות משפר נאות פעולה וג'ין שעתוק5,8,9.
גנים HOX לשחק תפקידים חיוניים במהלך התפתחות עובריים, הם חנותם והמרגשים מוגבלים בדפוסי הביטוי שלהם. מיקומה HOXA טפסים שני TADs יציב הפרדת גנים anterior ואת אחורי על ידי יסוד הקשורים CTCF גבול hESCs והן תאים IMR901. דיווחים אחרונים הראו כי HoxBlinc, lncRNA לוקוס הקשורים HoxB , ומתווך היווצרות של CTCF ביים TADs משפר/יזם באינטראקציה לוקוס HOXB . זה מוביל הקדמי הפעלת גנים HOXB במהלך ESC מחויבות ובידול10. יתר על כן, לוקוסים גנים ספציפיים לרבות מיקומה HOXA , שינוי של CTCF מתווכת ביטוי גנים ספציפיים טד תחומים השתנה שושלת היוחסין פרופילים, היה קשור עם התפתחות המחלה הברית11,12. הראיות תומך בפונקציה הראשית עבור CTCF תיאום שעתוק גנים, קביעת זהות תא על-ידי ארגון הגנום לתחומים פונקציונלי.
למרות תפקידו בפיתוח עובריים, במהלך hematopoiesis, גנים HOX לווסת את תפקוד התא (HS/PC) hematopoietic של גזע, קדמון. פעולה זו מתבצעת על-ידי שליטה על האיזון בין התפשטות ובידול10,13,14,15. הביטוי של גנים HOX מוסדר בחוזקה ברחבי מפרט התמיינות של תאים hematopoietic, עם הביטוי הגבוהה ביותר ב- HS / ביטוי גנים מחשבים HOX פוחתת בהדרגה במהלך ההבשלה, עם רמות הנמוך שלו המתרחשים הבדיל תאים hematopoietic16. Dysregulation גנים HOX הוא מנגנון הדומיננטי של לוקמיה השינוי לפי dysregulating התחדשות עצמית ובידול מאפייני HS/מחשבים שמוביל שינוי לוקמיה17,18. עם זאת, המנגנון של ביסוס ושמירה על רגיל לעומת דפוסים oncogenic ביטוי של גנים HOX , כמו גם רשתות בקרה רגולטריות המשויך עדיין לא ברור.
CRISPR-Cas9 sgRNA ספריית ההקרנה כבר בשימוש נרחב לחקור חלבונים הגנים19 כמו גנים היטב גם ללא קידוד, כגון lncRNA20 ו- miRNA21 מינים שונים. עם זאת, עלות השימוש בספריה sgRNA CRISPR-Cas9 כדי לזהות מטרות חדשות גנומית נותרת גבוהה, כי רצף הגנום תפוקה גבוהה מוחל לעיתים קרובות כדי לוודא ההקרנה ספריית sgRNA. שלנו sgRNA מערכת הסינון מתמקדת לוקוסים הגנום ספציפיים, ערך את sgRNAs מיקוד דרך בשלב אחד RT-PCR על פי בביטוי הגן סמן, כגון HOXA9. בנוסף, ניתן להבחין סנגר רצף אישר sgRNA היה משולב לתוך הגנום, ויאסין מוטציות כדי לזהות את sgRNA מיקוד באתר. דרך ההקרנה CRISPR-Cas9 לוקוסים ספציפיים גנטי, הגבול כרומטין CBS7/9 זוהתה כרגולטור קריטי הקמת תחום כרומטין oncogenic ולשמירה על דפוסי ביטוי גנים HOX חוץ רחמי ב- AML פתוגנזה 12. השיטה יכול להיות מיושם באופן נרחב כדי לזהות לא רק התפקוד המסוים של גבול CTCF של התפתחות עוברית, hematopoiesis, leukemogenesis, אבל גם CTCF גבול כמטרות טיפוליות אפשריות לטיפול epigenetic בעתיד.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:689px;" width="689">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Lipofectamine 3000 reagent</td>
			<td style="width:155px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">L3000-008</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Proteinase K</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25530049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Puromycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1113802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stbl3 cells&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>&#160;C737303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEK293T</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MOLM-13</td>
			<td>DSMZ</td>
			<td>ACC 554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">lentiCRISPRv2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>52961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">psPAX2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pGEM&#174;-T Easy Vector Systems&#160;</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A137A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T4 ligase&#160;</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>&#160;M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAquick Gel Extract kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAuick PCR purification kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SingleShot&#8482; SYBR&#174;&#160;Green One-Step Kit</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1725095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">QIAGEN Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td style="width:100px;">12163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">&#160;11965084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI 1640&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal bovine serum (FBS)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">10-082-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin/streptomycin/L-glutamine&#160;</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:100px;">10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lenti-X Concentrator&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Clontech</td>
			<td style="width:100px;">631232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Trypan Blue Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Polybrene</td>
			<td style="width:155px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-134220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Genessee Scientific</td>
			<td>&#160;25-507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">TAE buffer&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>FERB49</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Surveyor&#174; Mutation Detection Kits</td>
			<td style="width:155px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:100px;">706020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Biorad Universal Hood II Gel Doc System</td>
			<td style="width:155px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:100px;">170-8126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Centrifuge 5424 R</td>
			<td style="width:155px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:100px;">5404000138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Digital Dry Baths/Block Heaters</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">88870002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">TSX Series Ultra-Low Freezers</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">TSX40086V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Forma&#8482; Steri-Cult&#8482; CO2&#160;Incubators</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">3308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Herasafe&#8482; KS, Class II Biological Safety Cabinet</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">51022484</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Sorvall&#8482; Legend&#8482; XT/XF Centrifuge Series</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">75004506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Fisherbrand&#8482;&#160;Isotemp&#8482; Water Baths</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">FSGPD02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:263px;">Thermo Scientific&#8482;&#160;Locator&#8482; Plus Rack and Box Systems</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">13-762-353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System</td>
			<td style="width:155px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:100px;">1855195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">MiniAmp&#8482; Thermal Cycler</td>
			<td style="width:155px;">Applied Biosystems technology</td>
			<td style="width:100px;">A37834</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:263px;">Thermo Scientific&#8482;&#160;Owl&#8482; EC300XL2 Compact Power Supply</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">7217581</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:263px;">Thermo Scientific&#8482;&#160;Owl&#8482; EasyCast&#8482; B1 Mini Gel Electrophoresis Systems</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">09-528-178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">VWR&#174; Tube Rotator and Rotisseries</td>
			<td style="width:155px;">VWR International</td>
			<td style="width:100px;">10136-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">VWR&#174; Incubating Mini Shaker</td>
			<td style="width:155px;">VWR International</td>
			<td style="width:100px;">12620-942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Analytical Balance MS104TS/00</td>
			<td style="width:155px;">METTLER TOLEDO</td>
			<td style="width:100px;">30133522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">DS-11 FX and DS-11 FX+ Spectrophotometer</td>
			<td style="width:155px;">DeNovix Inc.</td>
			<td style="width:100px;">DS-11 FX</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hox loci focused crispr/sgrna library screening identifying critical ctcf boundaries

גורם מחייב CCCTC (CTCF)-מתווכת יציב topologically שיוך תחומים (TADs) לשחק תפקיד קריטי באינטראקציות מגבילה של רכיבי ה-DNA הממוקמים שכנות TADs. CTCF תפקיד חשוב בוויסות יכולות הביטוי של גנים HOX השולטים התפתחות, גוף המתבנת, hematopoiesis ו- leukemogenesis. עם זאת, הוא נשאר ברובו לא ידוע אם וכיצד HOX לוקוסים הקשורים CTCF גבולות לווסת כרומטין הארגון ואת ביטוי גנים HOX . בפרוטוקול הנוכחי, ספרייה במאגר ספציפי sgRNA מיקוד CTCF כל האתרים מחייב לוקוסים HOXA/B/C/D נוצר כדי לבחון את ההשפעה של שיבוש כרומטין הקשורים CTCF גבולות על היווצרות טד, גנים HOX ביטוי. דרך CRISPR-Cas9 בדיקה גנטית, באתר איגוד CTCF ממוקם בין גנים HOXA7/HOXA9 (CBS7/9) התגלתה הרגולטור קריטי של כרומטין oncogenic תחום, כמו גם להיות חשוב לשמירה על גנים HOX חוץ רחמי הביטוי דפוסים לסידור מחדש MLL לוקמיה מיאלואידית חריפה (AML). לפיכך, לספריה זו sgRNA הקרנת הגישה מספק תובנות הרומן ארגון הגנום CTCF מתווכת גנים ספציפיים לוקוסים ואת מספקת גם בסיס אפיון פונקציונלי המבואר מרכיבים רגולטוריות גנטיים, שניהם קידוד ו noncoding, במהלך רגיל תהליכים ביולוגיים בעידן פרוייקט הגנום האנושי פוסט.

טכנולוגיית CRISPR-Cas9 הוא כלי מחקר רב עוצמה עבור פונקציונליות גנומית מחקרים. זה במהירות מחליף ג'ין קונבנציונאלי טכניקות עריכה ויש לו השירות גבוהה ליישומים הגנום כולו והן בודדים ממוקדות ג'ין. כאן, הראשון משובטים בנפרד לוקוסים ספציפי CRISPR-Cas9-מסודר במערך sgRNA הספרייה מכילה sgRNAs 1,070...

Watch this Scientific Journal Video about HOX Loci Focused CRISPR/sgRNA Library Screening Identifying Critical CTCF Boundaries at JoVE.com

HOX Loci Focused CRISPR/sgRNA Library Screening Identifying Critical CTCF Boundaries

ספרייה CRISPR/sgRNA הוחל כדי לחקור חלבונים. עם זאת, הכדאיות של ספרייה sgRNA לחשוף את הפונקציה של גבול CTCF ב הכונה נשאר נחקרו. כאן, אנו מתארים ספרייה ספציפית sgRNA לוקוסים HOX התירי את הפונקציה של גבולות CTCF HOX לוקוסים.

HOX לוקוסים Focused CRISPR/sgRNA ספריית הקרנת זיהוי קריטי CTCF גבולות

CCCTC-binding factor (CTCF)-mediated stable topologically associating domains (TADs) play a critical role in constraining interactions of DNA elements ...

SgRNA המפולג שלנו שנקרא הקרנת הספרייה, היא גישה גנטית רבת עוצמה לזהות ולהעריך את הפונקציה הביולוגית של האלמנטים שאינם קידוד ברחבי הגנום. טכניקה זו מאפשרת לנו לבחון את ההשפעה של שיבוש האתרים המחייבים הקשורים, גבולות כרומטיים או אלמנטים רגולטוריים אחרים על ביטוי גנים ממוקדים. הגישה שלנו יכולה לשמש כדי לזהות את התפקיד של CTCF, ארוך ללא קידוד RNAs ומשפרים, בוויסות גנים HOX בהתפתחות העוברית המוקדמת, כמו גם לוקמיה מסוימים עם חתימת גנים חריגה HOX.התחל הליך זה עם העיצוב של sgRNA מיקוד אתרי איגוד CTCF. שיבוט ספריית sgRNA בהכנת תא כמתואר בפרוטוקול הטקסט. כדי לארוז את lentivirus, cotransfect HEK293 T תאים עם 20 מיקרוגרם של וקטורים ספרייה מטוהרים, 15 מיקרוגרם של פלסמיד ארוז, ו 10 מיקרוגרם של פלסמיד המעטפה, במשך 48 שעות לפני קצירת הנגיפים.לאחר 48 שעות, לאסוף את הנגיף supernatant ולסנן אותו דרך 0.45 מיקרון חלבון נמוך מחייב קרום PVDF. לאחר מכן, לרכז את על טבעי lentiviral על ידי 50 לקפל, באמצעות concentrator. יש לייחס את הנגיפים המרוכזים ולאחסן אותם במקפיא של מינוס 80 מעלות צלזיוס.עבודה בארות נפרדות של צלחת 12 גם לערבב MOLM13 תאים עם מינונים שונים של lentivirus מרוכז עבור שש קבוצות סה"כ. מיד צנטריפוגה תערובות אלה ב 1000 פעמים גרם במשך שעתיים ב 33 מעלות צלזיוס. מעבירים את 12 צלחות באר בחזרה לאנקובטור ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך ארבע שעות.השאפת בעדינות את העל-טבעי מבלי להפריע ללאט התאים, והשהה מחדש את התאים שהתומרו עם RPMI 1640 Medium טרי בתוספת. לאחר מכן להעביר את התאים מושעה מחדש כדי T25 flasks ו דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות ללא puromycin. לאחר 48 שעות לפצל תאים אלה לשני flasks, קבוצת ניסוי שטופלו microliter אחד למיליליטר puromycin במשך חמישה ימים, קבוצת ביקורת ללא טיפול puromycin במשך חמישה ימים.למדוד את ערך MOI אופטימיזציה עבור ההעתקה על ידי חלוקת מספר תאים חיים שטופלו puromycin על ידי מספר התאים ללא טיפול puromycin. כדי לשנות את התאים עם הספרייה מאגר, להדביק 1.5 מיליון תאי MOLM13 בצלחת 6 באר עם 0.3 MOI של sgRNA מאגר lentivirus במדיום. השתמש בתאים ללא זיהום lentivirus כפקד.מיד צנטריפוגה צלחת ששת גם ב 1000 פעמים g במשך שעתיים ב 33 מעלות צלזיוס כדי ספין-להדביק את התאים. לאחר מכן, להעביר את הצלחות בחזרה לאנקובטור ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% פחמן דו חמצני במשך ארבע שעות. יש לשאוף בעדינות על-טבעי מבלי להפריע ללאט התאים, ולהשעות מחדש את התאים המתומרים במדיום טרי.לאחר מכן, להעביר את התאים כדי T25 flasks ו דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות ללא puromycin. לאחר 48 שעות, לטפל בתאים עם מיקרוגרם אחד למיליליטר puromycin במשך חמישה ימים. יש להחליף למדיום טרי לאחר יומיים ולשמור על צפיפות תאים אופטימלית.זרע את השיבוט היחיד ב 96 צלחות גם עם שיטות דילול מגבילות. דגירה אלה שיבוט יחיד ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. תרבות אותם במשך 3-4 שבועות.לספור את התאים MOLM13 משולב SgRNA עם 0.4%טריפאן כחול פתרון מכתים ולאחר מכן להעביר 10, 000 תאים חיים לגם לצלחת PCR 96 היטב. צנטריפוגה הצלחת ב 1000 פעמים g במשך חמש דקות ולאחר מכן להסיר ביסודיות להשליך את supernatant עם פיפטה. הימנע מלהפריע ללטף התאים.לאחר שטיפת התאים כמתואר בטקסט להוסיף 50 microliters של תות התא לערבב מאסטר לכל באר. פיפטה למעלה ולמטה חמש פעמים כדי להשעות מחדש את לוח התאים. הדגירה את התערובת במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.לאחר מכן, מעבירים את התערובת ל-37 מעלות במשך חמש דקות, ואז 75 מעלות במשך חמש דקות נוספות. עכשיו להוסיף microliter אחד של lysate תא ל הבאר PCR המכיל את תערובת התגובה QPCR RT. תערובת זו כוללת את הגנים סמן קדימה והפך פריימר, תעתיק הפוך ותערובת תגובה צעד אחד.הפעל את תגובת שעתוק הפוכה במשך 10 דקות ב 50 מעלות צלזיוס ואחריו הפעלת פולמריזציה, ו DNA-denaturation במשך דקה אחת ב 95 מעלות צלזיוס. בצע את RT PCR עם 40 מחזורים של תגובת PCR כמפורט בפרוטוקול הטקסט. ודא את שיבוטי הביטוי מופחת HOXA9 באמצעות רצף סנגר ולבצע PCR עם דנ"א הגנום MOLM13 כמתואר בפרוטוקול הטקסט.לחלץ ולטהר את מוצרי PCR עם ערכת טיהור PCR. Ligate את מוצרי PCR מטוהרים לתוך וקטור T עם חיץ קשירה T4, DNA וקטור T, DNA PCR ו- T4 ligase. מניחים את תערובת הרצועות באינקובטור ב 16 מעלות צלזיוס לילה.מעבירים את תערובת הקשירה לתאים מוסמכים אלפא DH5 צלחת על צלחת אגר אנטיביוטי אמפצילין LB. דגירה הצלחות לילה ב 37 מעלות צלזיוס. בחרו את השיבוטים הבודדים מצלחת ה-LB ואמתו אותם על-ידי רצף גנוטיפינג וסנגר.הגדר את קבוצת תערובת הטרודופלקס עם 200 ננוגרם של הייחוס, ו 200 ננוגרם של אמפיליקונים PCR בדיקה בצינור PCR 0.2 מיליליטר. כלול את קבוצת תערובת homoduplex עם רק 400 ננוגרם של אמפיליקונים PCR הפניה כפקד. בנפרד דגירה תערובת הטרודופלקס ו homoduplex ב 95 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות בבקבוק ליטר אחד מלא 800 מיליליטר של מים.לאחר מכן, לקרר את תערובות בהדרגה לטמפרטורת החדר כדי anneal וצורת הטרודופלקס או homoduplex. עכשיו, בנפרד לעכל 400 ננוגרם של תערובת הטרודופלקס annealed ו homoduplex עם microliter אחד של נוקלאז גילוי מוטציה indel, ושני microliters של חיץ תגובת נוקלאז ב 42 מעלות צלזיוס במשך 60 דקות. לנתח את הדגימות מתעכל עם אלקטרופורזה ג'ל אגרוז.יש לחתוך את הדנ"א של תערובת ההטרודופלקס לרסיסים קטנים ואין לחתוך את הדנ"א ההומודופלקס. sgRNA מיקוד MOLM13 שיבוטים חיוביים אושרו עם שיטת RT qPCR, בהתבסס על רמות הביטוי של גנים HOXA9 עם ההשוואה עם תאי הבקרה. מתוך 528 השיבוטים ששרדו, 10 שיבוטים הציגו ירידה של יותר מ-50% ברמות HOXA9.sgRNAs משולב HOXA9 מופחת, HOXA9 ללא שינוי HOXA9 שיבוטים מוגברת, אושרו עוד יותר על ידי הגברה PCR של sgRNA וזיהוי על ידי רצף סנגר. שישה מתוך עשרה שיבוטים המראים ירידה ברמות HOXA9 הכילו sgRNAs מיקוד באתר CBS79, כפי שנקבע על ידי רצף סנגר. מוטציות Indel של שיבוטים חיוביים sgRNA משולב נקבעו על ידי pcR מבוסס genotyping ועיכול גרעין.המחיקה ההטרוזיגית של אתר CTCF הממוקם בין הגנים HOXA7 ו HOXA9 זוהתה על ידי genotyping מבוסס PCR. שיבוטים ירד HOXA9 חמש, שש, 28 ו 121 הציג מחיקה במיקום הגבול CBS79. תוצאות דומות נצפו עבור מוטציות indel באתר CBS79 שנותחו על ידי הבדיקה עיכול גרעין.בעת ביצוע הליך זה, חשוב לעשות כמויות שוות של הטרודופלקסים ו homoduplexes על מנת לזהות מוטציות indel הנגרמת על ידי sgRNA באמצעות הבדיקה עיכול גרעין. הגישה שלנו מאפשרת ניצול של הסמן שנבחר, לבצע רצף הדור הבא על גן היעד כדי לגלות את ההשפעות של הגן על leukemogenesis. בסך הכל הגישה שלנו מונעת RPC של לתיקון תפקודי וצמצום של אלמנטים גנטיים לא סדירים ציין במהלך תהליך ביולוגי נורמלי leukemogenesis בשגיאת פרויקט הגנום שלאחר המוות.

Research

JoVE Journal

Genetics

HOX Loci Focused CRISPR/sgRNA Library Screening Identifying Critical CTCF Boundaries

A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source

פרוטוקול אוניברסלי עבור gRNA בקנה מידה גדול ספריית הפקה מכל מקור ה-DNA

The popularity of the CRISPR/Cas9 system for both genome and epigenome engineering stems from its simplicity and adaptability. An effector (the Cas9 ...

G2-seq: A High Throughput Sequencing-based Technique for Identifying Late Replicating Regions of the Genome

G2-seq: תפוקה גבוהה המבוססת על רצף טכניקה לזיהוי מאוחר לבצע שיכפול אזורים בגנום

Numerous techniques have been developed to follow the progress of DNA replication through the S phase of the cell cycle. Most of these techniques have ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

DNA חזקים בידוד ובנייה ספריית רצף תפוקה גבוהה עבור דגימות עשבייה

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

רצף MicroRNA רטרוספקטיבה: DNA משלימים ספריית הכנת פרוטוקול באמצעות פורמלין-קבוע RNA פרפין-מוטבע דגימות

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of ...

Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen

הגנום קלט ultralow רצף ספריית הכנה מ להצטננות Tardigrade

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state ...

Bronchoalveolar Lavage Exosomes in Lipopolysaccharide-induced Septic Lung Injury

Exosomes Bronchoalveolar שטיפה בפציעה ליפופוליסכריד-induced ריאות זיהומית

Acute lung injury (ALI) and acute respiratory distress syndrome (ARDS) represent a heterogeneous group of lung diseases which continues to have a high ...

Mating-based Overexpression Library Screening in Yeast

ביטוי ההזדווגות מבוססי ספריית הקרנה שמרים

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool ...

Screening Cotton Genotypes for Reniform Nematode Resistance

הקרנת כותנה גנוטיפים לעמידות בפני ההתנגדות של רנפורם

A rapid non-destructive reniform nematode (Rotylenchulus reniformis) screening protocol is needed for the development of resistant cotton (Gossypium ...

Identifying Mutations by High Resolution Melting in a TILLING Population of Rice

זיהוי מוטציות על ידי ברזולוציה גבוהה התכה באוכלוסיית לעיבוד לקרקע של אורז

Target Induced Local Lesions In Genomes (TILLING) is a strategy of reverse genetics for the high-throughput screening of induced mutations. However, the ...

Screening and Identification of RNA Silencing Suppressors from Secreted Effectors of Plant Pathogens

הקרנה וזיהוי של רנ א השתקה דכאי מ מופרש העריקים של פתוגנים צמח

RNA silencing is an evolutionarily conserved, sequence-specific gene regulation mechanism in eukaryotes. Several plant pathogens have evolved proteins ...