Name: hox loci focused crispr/sgrna library screening identifying critical ctcf boundaries
Uploaded: 2019-03-31T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about HOX Loci Focused CRISPR/sgRNA Library Screening Identifying Critical CTCF Boundaries at JoVE.com

लेखक भी पांडुलिपि संपादन के लिए निकोलस Cesari धंयवाद । इस कार्य के लिए राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एसएच, R01DK110108, R01CA204044) से अनुदान का समर्थन किया गया था ।

1. सीटीसीएफ एक ऑनलाइन उपकरण का उपयोग कर sgRNALibrary डिजाइन
<ol><li>मानव Hox loci में आनुवंशिक क्षोभ मंच (gpp) डिजाइनर उपकरण (https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design) का उपयोग कर sgRNA लक्ष्यीकरण ctcf बाध्यकारी साइटों को डिजाइन ।</li>
	<li>कुल १...

<ol>
	<li>Dixon, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topological+domains+in+mammalian+genomes+identified+by+analysis+of+chromatin+interactions.">Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions.</a> Nature. 485 (7398), 376-380 (2012).</li><li>Cuddapah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+the+insulator+binding+protein+CTCF+in+chromatin+barrier+regions+reveals+demarcation+of+active+and+repressive+domains.">Global analysis of the insulator binding protein CTCF in chromatin barrier regions reveals demarcation of active and repressive domains.</a> Genome research. 19 (1), 24-32 (2009).</li><li>Phillips, J. E., Corces, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF:+master+weaver+of+the+genome.">CTCF: master weaver of the genome.</a> Cell. 137 (7), 1194-1211 (2009).</li><li>Tang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF-Mediated+Human+3D+Genome+Architecture+Reveals+Chromatin+Topology+for+Transcription.">CTCF-Mediated Human 3D Genome Architecture Reveals Chromatin Topology for Transcription.</a> Cell. 163 (7), 1611-1627 (2015).</li><li>Lupianez, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruptions+of+topological+chromatin+domains+cause+pathogenic+rewiring+of+gene-enhancer+interactions.">Disruptions of topological chromatin domains cause pathogenic rewiring of gene-enhancer interactions.</a> Cell. 161 (5), 1012-1025 (2015).</li><li>Dowen, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+cell+identity+genes+occurs+in+insulated+neighborhoods+in+mammalian+chromosomes.">Control of cell identity genes occurs in insulated neighborhoods in mammalian chromosomes.</a> Cell. 159 (2), 374-387 (2014).</li><li>Phillips-Cremins, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architectural+protein+subclasses+shape+3D+organization+of+genomes+during+lineage+commitment.">Architectural protein subclasses shape 3D organization of genomes during lineage commitment.</a> Cell. 153 (6), 1281-1295 (2013).</li><li>Narendra, V., Bulajic, M., Dekker, J., Mazzoni, E. O., Reinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF-mediated+topological+boundaries+during+development+foster+appropriate+gene+regulation.">CTCF-mediated topological boundaries during development foster appropriate gene regulation.</a> Genes &amp; Development. 30 (24), 2657-2662 (2016).</li><li>Narendra, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF+establishes+discrete+functional+chromatin+domains+at+the+Hox+clusters+during+differentiation.">CTCF establishes discrete functional chromatin domains at the Hox clusters during differentiation.</a> Science. 347 (6225), 1017-1021 (2015).</li><li>Deng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HoxBlinc+RNA+Recruits+Set1/MLL+Complexes+to+Activate+Hox+Gene+Expression+Patterns+and+Mesoderm+Lineage+Development.">HoxBlinc RNA Recruits Set1/MLL Complexes to Activate Hox Gene Expression Patterns and Mesoderm Lineage Development.</a> Cell Reports. 14 (1), 103-114 (2016).</li><li>Patel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberrant+TAL1+activation+is+mediated+by+an+interchromosomal+interaction+in+human+T-cell+acute+lymphoblastic+leukemia.">Aberrant TAL1 activation is mediated by an interchromosomal interaction in human T-cell acute lymphoblastic leukemia.</a> Leukemia. 28 (2), 349-361 (2014).</li><li>Luo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF+boundary+remodels+chromatin+domain+and+drives+aberrant+HOX+gene+transcription+in+acute+myeloid+leukemia.">CTCF boundary remodels chromatin domain and drives aberrant HOX gene transcription in acute myeloid leukemia.</a> Blood. 132 (8), 837-848 (2018).</li><li>Dou, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medial+HOXA+genes+demarcate+haematopoietic+stem+cell+fate+during+human+development.">Medial HOXA genes demarcate haematopoietic stem cell fate during human development.</a> Nature Cell Biology. 18 (6), 595-606 (2016).</li><li>Lawrence, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+expression+of+the+Hoxa-9+homeobox+gene+impairs+the+proliferation+and+repopulating+ability+of+hematopoietic+stem+cells.">Loss of expression of the Hoxa-9 homeobox gene impairs the proliferation and repopulating ability of hematopoietic stem cells.</a> Blood. 106 (12), 3988-3994 (2005).</li><li>Deng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=USF1+and+hSET1A+mediated+epigenetic+modifications+regulate+lineage+differentiation+and+HoxB4+transcription.">USF1 and hSET1A mediated epigenetic modifications regulate lineage differentiation and HoxB4 transcription.</a> PLOS Genetics. 9 (6), e1003524 (2013).</li><li>Rawat, V. P., Humphries, R. K., Buske, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+Hox:+the+role+of+ParaHox+genes+in+normal+and+malignant+hematopoiesis.">Beyond Hox: the role of ParaHox genes in normal and malignant hematopoiesis.</a> Blood. 120 (3), 519-527 (2012).</li><li>Alharbi, R. A., Pettengell, R., Pandha, H. S., Morgan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+HOX+genes+in+normal+hematopoiesis+and+acute+leukemia.">The role of HOX genes in normal hematopoiesis and acute leukemia.</a> Leukemia. 27 (5), 1000-1008 (2013).</li><li>Rice, K. L., Licht, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HOX+deregulation+in+acute+myeloid+leukemia.">HOX deregulation in acute myeloid leukemia.</a> Journal of Clinical Investigation. 117 (4), 865-868 (2007).</li><li>Bassett, A. R., Kong, L., Liu, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+CRISPR+library+for+high-throughput+genetic+screening+in+Drosophila+cells.">A genome-wide CRISPR library for high-throughput genetic screening in Drosophila cells.</a> Journal of Genetics and Genomics. 42 (6), 301-309 (2015).</li><li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+deletion+screening+of+human+long+non-coding+RNAs+using+a+paired-guide+RNA+CRISPR-Cas9+library.">Genome-scale deletion screening of human long non-coding RNAs using a paired-guide RNA CRISPR-Cas9 library.</a> Nature Biotechnology. 34 (12), 1279-1286 (2016).</li><li>Kurata, J. S., Lin, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-focused+CRISPR-Cas9+library+screen+reveals+fitness-associated+miRNAs.">MicroRNA-focused CRISPR-Cas9 library screen reveals fitness-associated miRNAs.</a> RNA. 24 (7), 966-981 (2018).</li><li>Collins, C. T., Hess, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+HOXA9+in+leukemia:+dysregulation,+cofactors+and+essential+targets.">Role of HOXA9 in leukemia: dysregulation, cofactors and essential targets.</a> Oncogene. 35 (9), 1090-1098 (2016).</li><li>Kroon, E., Thorsteinsdottir, U., Mayotte, N., Nakamura, T., Sauvageau, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NUP98-HOXA9+expression+in+hemopoietic+stem+cells+induces+chronic+and+acute+myeloid+leukemias+in+mice.">NUP98-HOXA9 expression in hemopoietic stem cells induces chronic and acute myeloid leukemias in mice.</a> The EMBO Journal. 20 (3), 350-361 (2001).</li><li>Koike-Yusa, H., Li, Y., Tan, E. P., Velasco-Herrera Mdel, C., Yusa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+recessive+genetic+screening+in+mammalian+cells+with+a+lentiviral+CRISPR-guide+RNA+library.">Genome-wide recessive genetic screening in mammalian cells with a lentiviral CRISPR-guide RNA library.</a> Nature Biotechnology. 32 (3), 267-273 (2014).</li><li>Shalem, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+CRISPR-Cas9+knockout+screening+in+human+cells.">Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells.</a> Science. 343 (6166), 84-87 (2014).</li><li>Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+screens+in+human+cells+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system.</a> Science. 343 (6166), 80-84 (2014).</li><li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+sgRNAs+facilitate+CRISPR/Cas9-mediated+mouse+genome+targeting.">Dual sgRNAs facilitate CRISPR/Cas9-mediated mouse genome targeting.</a> The FEBS Journal. 281 (7), 1717-1725 (2014).</li><li>Sanjana, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+interrogation+of+functional+elements+in+the+noncoding+genome.">High-resolution interrogation of functional elements in the noncoding genome.</a> Science. 353 (6307), 1545-1549 (2016).</li><li>Rajagopal, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+mapping+of+regulatory+DNA.">High-throughput mapping of regulatory DNA.</a> Nature Biotechnology. 34 (2), 167-174 (2016).</li><li>Korkmaz, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genetic+screens+for+enhancer+elements+in+the+human+genome+using+CRISPR-Cas9.">Functional genetic screens for enhancer elements in the human genome using CRISPR-Cas9.</a> Nature Biotechnology. 34 (2), 192-198 (2016).</li><li>Rezaei, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FMS-Like+Tyrosine+Kinase+3+(FLT3)+and+Nucleophosmin+1+(NPM1)+in+Iranian+Adult+Acute+Myeloid+Leukemia+Patients+with+Normal+Karyotypes:+Mutation+Status+and+Clinical+and+Laboratory+Characteristics.">FMS-Like Tyrosine Kinase 3 (FLT3) and Nucleophosmin 1 (NPM1) in Iranian Adult Acute Myeloid Leukemia Patients with Normal Karyotypes: Mutation Status and Clinical and Laboratory Characteristics.</a> Turkish Journal of Haematology. 34 (4), 300-306 (2017).</li><li>Yaragatti, M., Basilico, C., Dailey, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+active+transcriptional+regulatory+modules+by+the+functional+assay+of+DNA+from+nucleosome-free+regions.">Identification of active transcriptional regulatory modules by the functional assay of DNA from nucleosome-free regions.</a> Genome Research. 18 (6), 930-938 (2008).</li><li>Wilken, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNase+I+hypersensitivity+analysis+of+the+mouse+brain+and+retina+identifies+region-specific+regulatory+elements.">DNase I hypersensitivity analysis of the mouse brain and retina identifies region-specific regulatory elements.</a> Epigenetics Chromatin. 8, 8 (2015).</li><li>Narlikar, L., Ovcharenko, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+regulatory+elements+in+eukaryotic+genomes.">Identifying regulatory elements in eukaryotic genomes.</a> Briefings in Functional Genomics and Proteomics. 8 (4), 215-230 (2009).</li><li>Hnisz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+proto-oncogenes+by+disruption+of+chromosome+neighborhoods.">Activation of proto-oncogenes by disruption of chromosome neighborhoods.</a> Science. 351 (6280), 1454-1458 (2016).</li></ol>

प्रोटीन कोडन जीन संबंधित sgrna पुस्तकालयों एक कार्यात्मक स्क्रीनिंग प्रणाली में जीन और नेटवर्क के माध्यम से विशिष्ट सेलुलर कार्यों को विनियमित करने के लिए पहचान करने के लिए लागू किया गया है sgrna संवर्धन<sup ...

हाल ही में जीनोम इंटरेक्शन अध्ययनों से पता चला है कि मानव परमाणु जीनोम स्थिर सांस्थितिकत: डोमेन (tads) है कि सेल प्रकार और प्रजातियों के पार संरक्षित कर रहे है जोड़ रूपों । अलग डोमेन में जीनोम के संगठन की सुविधा और नियामक तत्वों (जैसे, enhancers और प्रमोटरों) के बीच बातचीत को प्रतिबंधित । CCCTC-बाध्यकारी कारक (CTCF) बालक सीमाओं को बांधता है और डीएनए तत्वों है कि पड़ोसी TADs1में स्थित है की बातचीत को विवश में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । हालांकि, जीनोम वाइड CTCF बाइंडिंग डेटा से पता चला है कि यद्यपि CTCF अधिकांशतः विभिन्न प्रकार के सेल प्रकारों में समान डीएनए-साइट्स के साथ इंटरैक्ट करता है, लेकिन यह प्रायः एक कक्ष प्रकार में किसी विशिष्ट साइट पर क्रोमेटिन अवरोध के रूप में कार्य करता है, लेकिन दूसरे में नहीं, यह सुझाता है कि CTCF फ़ंक्शंस एक साथ क्रोमेटिन सीमाओं के गठन में अन्य गतिविधियों के साथ2. क्या अज्ञात रहता है कि क्या सीमा तत्वों (CTCF-बाइंडिंग साइटें) सीधे CTCF के जैविक कार्य से जुड़े होते हैं, और ये लिंक्स कैसे होती हैं । इसलिए, हम परिकल्पना करते है कि विशिष्ट CTCF जेनोम में बाध्यकारी साइटों सीधे TADs के गठन को विनियमित करने और इन डोमेन के भीतर या पड़ोसी डोमेन के बीच नियंत्रण प्रवर्तक/ मानव और माउस जीनोम अनुक्रमण परियोजनाओं के पूरा होने और बाद में एपिजेनेटिक विश्लेषण जीनोम के नए आणविक और आनुवंशिक हस्ताक्षर का पर्दाफाश किया है । तथापि, जीन विनियमन और सेल्युलर कार्य के साथ-साथ उनके आणविक तंत्र (नों) में विशिष्ट हस्ताक्षरों/संशोधनों की भूमिका को अभी पूरी तरह से समळाा जाना है ।
सबूत समर्थन की एकाधिक पंक्तियां कि ctcf-mediated tads कार्यात्मक क्रोमेटिन डोमेन3,4,5का प्रतिनिधित्व करते हैं । हालांकि ctcf ज्यादातर विभिंन प्रकार के सेल में एक ही डीएनए-साइटों के साथ बातचीत, जीनोम वाइड ctcf चिप seq डेटा से पता चला है कि ctcf अक्सर एक कोशिका प्रकार में एक क्रोमेटिन बाधा के रूप में काम करता है, लेकिन अंय2में नहीं । ctcf जीनोम संगठन4,6,7का मध्यस्थता करके विकास के दौरान एक आवश्यक भूमिका निभाता है । सीटीसीएफ की सीमाओं में व्यवधान/प्रमोटर इंटरैक्शन और जीन एक्सप्रेशन, जिससे विकासात्मक रुकावट उत्पन्न होती है । यह पता चलता है कि ctcf मध्यस्थता tads न केवल संरचनात्मक घटक हैं, लेकिन यह भी नियामक इकाइयों उचित बढ़ाने कार्रवाई और जीन ट्रांसक्रिप्शन के लिए आवश्यक5,8,9.
hox जीन भ्रूण के विकास के दौरान महत्वपूर्ण भूमिका निभाते है और वे अस्थाई रूप से और स्थानिक अपनी अभिव्यक्ति पैटर्न में प्रतिबंधित कर रहे हैं । होक्सा लोकस, दोनों हेस्क्स और IMR90 कक्ष1में एक ctcf-संबद्ध सीमा तत्व द्वारा पूर्वकाल और पश्च जीन को अलग करने वाले दो स्थिर tads बनाता है । हाल की रिपोर्टों का प्रदर्शन किया है कि Hoxblinc, एक hoxb लोकस संबद्ध lncRNA, ctcf के गठन का निर्देश tads और enhancer/ यह ईएससी प्रतिबद्धता और भेदभाव10के दौरान पूर्वकाल hoxb जीन सक्रियण की ओर जाता है । इसके अलावा, विशिष्ट जीन loci में Hoxa लोकस सहित, CTCF मध्यस्थता बालक डोमेन के परिवर्तन वंश विशिष्ट जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल बदल गया और रोग राज्यों के विकास के साथ जुड़ा हुआ था11,12. सबूत जीन प्रतिलेखन समंवय में ctcf के लिए एक प्राथमिक समारोह का समर्थन करता है और कार्यात्मक डोमेन में जीनोम आयोजन द्वारा सेल पहचान का निर्धारण ।
भ्रूणीय विकास में अपनी भूमिका के बावजूद, हेमेटोपॉयसिस के दौरान, Hox जीन hematopoiesis स्टेम और संतति कोशिका (एच एस/पीसी) समारोह को विनियमित । यह प्रसार और भेदभाव10,13,14,15के बीच संतुलन को नियंत्रित करने के द्वारा किया जाता है । होक्स जीन की अभिव्यक्ति, एच एस/पीसीएस में उच्चतम अभिव्यक्ति के साथ, हेमटोपोयटिक कोशिकाओं के विशिष्टीकरण और विभेद के दौरान कसकर विनियमित होती है । होक्स जीन अभिव्यक्ति धीरे परिपक्वता के दौरान कम हो जाती है, अपने निंनतम स्तर के साथ विभेदक टेम कोशिकाओं में होने वाली16. hox जीन dysregulation, ल्यूसेमिक परिवर्तन17,18करने के लिए अग्रणी एच एस के-नवीकरण और भेदभाव गुणों के द्वारा ल्यूलेमिक परिवर्तन का एक प्रमुख तंत्र है । हालांकि, स्थापित करने और hox जीन के अर्बुदीय अभिव्यक्ति पैटर्न बनाम के रूप में अच्छी तरह से जुड़े नियामक नेटवर्क की स्थापना और बनाए रखने की व्यवस्था अस्पष्ट बनी हुई है ।
CRISPR-Cas9 sgRNA पुस्तकालय स्क्रीनिंग व्यापक रूप से प्रोटीन-कोडिंग जीन19 के रूप में अच्छी तरह से गैर कोडिंग जीन, जैसे lncrna20 और मिरना21 के रूप में विभिंन प्रजातियों में पूछताछ करने के लिए इस्तेमाल किया गया है । हालांकि, लागत CRISPR-Cas9 sgRNA पुस्तकालय का उपयोग करने के लिए नए जीनोमिक लक्ष्यों की पहचान उच्च रहता है, क्योंकि उच्च थ्रॉपुट जीनोम अनुक्रमण अक्सर sgRNA पुस्तकालय स्क्रीनिंग सत्यापित करने के लिए लागू किया जाता है । हमारी sgRNA स्क्रीनिंग प्रणाली विशिष्ट जीनोम loci पर ध्यान केंद्रित है और एक कदम आर टी के माध्यम से लक्ष्यीकरण Sgrna, मार्कर जीन अभिव्यक्ति के अनुसार पीसीआर, HOXA9जैसे मूल्यांकन करता है । इसके अतिरिक्त, Sanger अनुक्रमण पुष्टि की है कि sgRNA जीनोम में एकीकृत किया गया था, और Indel म्यूटेशन sgRNA लक्ष्यीकरण साइट की पहचान करने के लिए पता लगाया जा सकता है । loci-विशिष्ट crispr-Cas9 आनुवंशिक स्क्रीनिंग के माध्यम से, CBS7/9 क्रोमेटिन सीमा अर्बुदीय क्रोमेटिन डोमेन की स्थापना और एएमएल रोगजनन में अस्थानिक hox जीन अभिव्यक्ति पैटर्न को बनाए रखने के लिए एक महत्वपूर्ण नियामक के रूप में पहचान की गई है 12. विधि व्यापक रूप से भ्रूण के विकास में सीटीसीएफ सीमा के न केवल विशिष्ट समारोह की पहचान करने के लिए लागू किया जा सकता है, hematopoiesis, ल्यूकेजेनेसिस, लेकिन यह भी भविष्य की पश् चजात चिकित्सा के लिए संभावित चिकित्सकीय लक्ष्य के रूप में ctcf सीमा.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:689px;" width="689">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Lipofectamine 3000 reagent</td>
			<td style="width:155px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">L3000-008</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Proteinase K</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25530049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Puromycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1113802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stbl3 cells&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>&#160;C737303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEK293T</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MOLM-13</td>
			<td>DSMZ</td>
			<td>ACC 554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">lentiCRISPRv2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>52961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">psPAX2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pGEM&#174;-T Easy Vector Systems&#160;</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A137A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T4 ligase&#160;</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>&#160;M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAquick Gel Extract kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAuick PCR purification kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SingleShot&#8482; SYBR&#174;&#160;Green One-Step Kit</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1725095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">QIAGEN Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td style="width:100px;">12163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">&#160;11965084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI 1640&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal bovine serum (FBS)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">10-082-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin/streptomycin/L-glutamine&#160;</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:100px;">10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lenti-X Concentrator&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Clontech</td>
			<td style="width:100px;">631232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Trypan Blue Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Polybrene</td>
			<td style="width:155px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-134220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Genessee Scientific</td>
			<td>&#160;25-507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">TAE buffer&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>FERB49</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Surveyor&#174; Mutation Detection Kits</td>
			<td style="width:155px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:100px;">706020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Biorad Universal Hood II Gel Doc System</td>
			<td style="width:155px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:100px;">170-8126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Centrifuge 5424 R</td>
			<td style="width:155px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:100px;">5404000138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Digital Dry Baths/Block Heaters</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">88870002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">TSX Series Ultra-Low Freezers</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">TSX40086V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Forma&#8482; Steri-Cult&#8482; CO2&#160;Incubators</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">3308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Herasafe&#8482; KS, Class II Biological Safety Cabinet</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">51022484</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Sorvall&#8482; Legend&#8482; XT/XF Centrifuge Series</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">75004506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Fisherbrand&#8482;&#160;Isotemp&#8482; Water Baths</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">FSGPD02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:263px;">Thermo Scientific&#8482;&#160;Locator&#8482; Plus Rack and Box Systems</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">13-762-353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System</td>
			<td style="width:155px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:100px;">1855195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">MiniAmp&#8482; Thermal Cycler</td>
			<td style="width:155px;">Applied Biosystems technology</td>
			<td style="width:100px;">A37834</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:263px;">Thermo Scientific&#8482;&#160;Owl&#8482; EC300XL2 Compact Power Supply</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">7217581</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:263px;">Thermo Scientific&#8482;&#160;Owl&#8482; EasyCast&#8482; B1 Mini Gel Electrophoresis Systems</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">09-528-178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">VWR&#174; Tube Rotator and Rotisseries</td>
			<td style="width:155px;">VWR International</td>
			<td style="width:100px;">10136-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">VWR&#174; Incubating Mini Shaker</td>
			<td style="width:155px;">VWR International</td>
			<td style="width:100px;">12620-942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Analytical Balance MS104TS/00</td>
			<td style="width:155px;">METTLER TOLEDO</td>
			<td style="width:100px;">30133522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">DS-11 FX and DS-11 FX+ Spectrophotometer</td>
			<td style="width:155px;">DeNovix Inc.</td>
			<td style="width:100px;">DS-11 FX</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hox loci focused crispr/sgrna library screening identifying critical ctcf boundaries

ccctc-बाध्यकारी कारक (ctcf)-मध्यस्थता स्थिर सांस्थितिकत: जोड़ डोमेन (tads) पड़ोसी tads में स्थित डीएनए तत्वों की बातचीत को विवश करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं । CTCF होक्स जीन के स्थानिक और लौकिक अभिव्यक्ति को विनियमित करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है जो भ्रूण के विकास, शरीर की पैटेनिंग, हेमेटोपॉइसिस और ल्यूकीजेनेसिस को नियंत्रित करता है । हालांकि, यह काफी हद तक अज्ञात है कि क्या और कैसे hox loci जुड़े ctcf सीमाएं क्रोमेटिन संगठन और hox जीन अभिव्यक्ति को विनियमित । वर्तमान प्रोटोकॉल में, एक विशिष्ट sgrna परित पुस्तकालय hoxa/B/C/डी loci में सभी ctcf बाइंडिंग साइटों को लक्षित करने के लिए उत्पंन किया गया है के प्रभाव की जांच करने के लिए ctcf-संबद्ध क्रोमेटिन सीमाओं पर बालक के गठन और hoxa जीन अभिव्यक्ति. CRISPR-Cas9 जेनेटिक स्क्रीनिंग के माध्यम से, HOXA7/HOXA9 जीन (CBS7/9) के बीच स्थित ctcf बाइंडिंग साइट को ऑन्कोजेनिक क्रोमेटिन डोमेन के एक महत्वपूर्ण नियामक के रूप में पहचाना गया है, साथ ही यह एटॉपिक होक्स जीन को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है । MLL में अभिव्यक्ति पैटर्न-एक्यूट माइलॉयड ल्यूकेमिया (एएमएल) rearranged । इस प्रकार, इस sgRNA पुस्तकालय स्क्रीनिंग दृष्टिकोण विशिष्ट जीन loci में CTCF मध्यस्थता जीनोम संगठन में उपंयास अंतर्दृष्टि प्रदान करता है और यह भी एनोटेटेड आनुवंशिक नियामक तत्वों के कार्यात्मक लक्षण वर्णन के लिए एक आधार प्रदान करता है, दोनों कोडिंग और गैर कोडिंग, मानव जीनोम परियोजना के बाद के दौर में सामान्य जैविक प्रक्रियाओं के दौरान ।

CRISPR-Cas9 प्रौद्योगिकी कार्यात्मक जीनोमिक अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली अनुसंधान उपकरण है । यह तेजी से पारंपरिक जीन संपादन तकनीकों की जगह है और दोनों जीनोम चौड़ा और व्यक्तिगत जीन के लिए उच्च उपय?...

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HOX Loci Focused CRISPR/sgRNA Library Screening Identifying Critical CTCF Boundaries

प्रोटीन कोडिंग जीन से पूछताछ करने के लिए एक CRISPR/sgRNA पुस्तकालय लागू किया गया है । तथापि, जीन विनियमन में सीटीसीएफ सीमा के कार्य को उजागर करने के लिए एक sgRNA पुस्तकालय की व्यवहार्यता बेरोज़गारी बनी हुई है । यहां, हम hox loci में CTCF सीमाओं के समारोह को स्पष्ट करने के लिए एक hox Loci विशिष्ट sgrna पुस्तकालय का वर्णन ।

Hox Loci केंद्रित CRISPR/sgRNA पुस्तकालय स्क्रीनिंग महत्वपूर्ण CTCF सीमाओं की पहचान

CCCTC-binding factor (CTCF)-mediated stable topologically associating domains (TADs) play a critical role in constraining interactions of DNA elements ...

हमारे पूल्ड sgRNA पुस्तकालय स्क्रीनिंग कहा जाता है, जीनोम भर में noncoding तत्वों के जैविक समारोह की पहचान और मूल्यांकन करने के लिए एक शक्तिशाली आनुवंशिक दृष्टिकोण है । यह तकनीक हमें लक्षित जीन अभिव्यक्ति पर बाध्यकारी साइटों, रंगीन सीमाओं या अन्य नियामक तत्वों को बाधित करने के प्रभाव की जांच करने की अनुमति देती है। हमारे दृष्टिकोण का उपयोग सीटीसीएफ, लंबे गैर-कोडिंग आरएनए और एन् बढ़ाने वालों की भूमिका की पहचान करने के लिए किया जा सकता है, जो प्रारंभिक भ्रूणीय विकास में होक्स जीन विनियमन में, साथ ही एक एबररेंट होक्स जीन हस्ताक्षर के साथ कुछ ल्यूकेमियास भी है।सीटीसीएफ बाध्यकारी साइटों को लक्षित करने वाले SgRNA के डिजाइन के साथ इस प्रक्रिया को शुरू करें। पाठ प्रोटोकॉल में वर्णित सेल तैयारी में SgRNA पुस्तकालय की क्लोनिंग। लेंटीवायरस को पैकेज करने के लिए, वायरस की कटाई से पहले 48 घंटे के लिए शुद्ध पुस्तकालय वैक्टर के 20 माइक्रोग्राम के साथ HEK293 टी कोशिकाओं, पैक प्लाज्मिड के 15 माइक्रोग्राम, और लिफाफा प्लाज्मिड के 10 माइक्रोग्राम के साथ।48 घंटे के बाद, वायरस सुपरनिटेंट एकत्र करें और इसे 0.45 माइक्रोन कम प्रोटीन बाइंडिंग पीवीडीएफ झिल्ली के माध्यम से फ़िल्टर करें। इसके बाद, ध्यान केंद्रित करते हुए लेंटीविरल सुपरनेट को 50 गुना तक केंद्रित करें। ध्यान केंद्रित वायरस Aliquot और उन्हें एक शून्य से 80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में स्टोर।छह कुल समूहों के लिए केंद्रित लेंटीवायरस की विभिन्न खुराकों के साथ MOLM13 कोशिकाओं को मिलाने के लिए 12 अच्छी तरह से प्लेट के अलग-अलग कुओं में काम करें। इन मिश्रणों को तुरंत 33 डिग्री सेल्सियस पर दो घंटे के लिए 1000 बार जी पर अपकेंद्रित्र करें। 12 अच्छी प्लेटों को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% कार्बन डाइऑक्साइड को चार घंटे के लिए इनक्यूबेटर में वापस स्थानांतरित करें।धीरे-धीरे सेल पैलेट को परेशान किए बिना सुपरनेट को एस्पिरेट करें, और ताजा पूरक आरपीएमआई 1640 माध्यम के साथ ट्रांसड्यूडेड कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। फिर फिर से निलंबित कोशिकाओं को टी-25 फ्लास्क में स्थानांतरित करें और प्यूरोमाइसिन के बिना 48 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। 48 घंटे के बाद इन कोशिकाओं को दो फ्लास्क में विभाजित किया गया, एक प्रायोगिक समूह जिसे पांच दिनों के लिए एक माइक्रोलीटर प्रति मिलीलीटर प्यूरोमाइसिन के साथ इलाज किया जाता है, और पांच दिनों के लिए प्यूरोमाइसिन उपचार के बिना एक नियंत्रण समूह।प्यूरोमाइसिन उपचार के बिना कोशिकाओं की संख्या द्वारा प्यूोमाइसिन के साथ इलाज लाइव कोशिकाओं की संख्या को विभाजित करके ट्रांसडक्शन के लिए अनुकूलित एमओआई मूल्य को मापें। पूल्ड लाइब्रेरी के साथ कोशिकाओं को स्थानांतरित करने के लिए, मध्यम में sgRNA पूल्ड लेंटीवायरस के 0.3 एमओआई के साथ 6 अच्छी तरह से प्लेट में 1.5 मिलियन MOLM13 कोशिकाओं को संक्रमित करें। नियंत्रण के रूप में लेंटीवायरस संक्रमण के बिना कोशिकाओं का उपयोग करें।कोशिकाओं को स्पिनफेक्ट करने के लिए तुरंत 1000 बार जी पर छह अच्छी तरह से प्लेट को 33 डिग्री सेल्सियस पर दो घंटे के लिए अपकेंद्री करें। फिर, प्लेटों को चार घंटे के लिए 5% कार्बन डाइऑक्साइड में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में वापस स्थानांतरित करें। सेल पैलेट को परेशान किए बिना धीरे-धीरे सुपरनेट को एस्पिरेट करें, और ताजा माध्यम के साथ ट्रांसड्यूडेड कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।फिर कोशिकाओं को टी-25 फ्लैक्स में स्थानांतरित करें और बिना प्यूरोमाइसिन के 48 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इन्क्यूबेट करें। 48 घंटे के बाद कोशिकाओं का इलाज पांच दिनों तक एक माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर प्यूरोमाइसिन के साथ करें। दो दिनों के बाद ताजा माध्यम के लिए विनिमय और एक इष्टतम सेल घनत्व बनाए रखने।कमजोर पड़ने के तरीकों को सीमित करने के साथ 96 अच्छी तरह से प्लेटों में एकल क्लोन बीज। इन सिंगल क्लोन को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% कार्बन डाइऑक्साइड पर इनक्यूबेट करें। उन्हें 3-4 सप्ताह के लिए संस्कृति।0.4% ट्राइपैन ब्लू सॉल्यूशन धुंधला के साथ SgRNA एकीकृत MOLM13 कोशिकाओं की गणना करें और फिर 96 अच्छी तरह से पीसीआर प्लेट में 10, 000 लाइव कोशिकाओं को अच्छी तरह से स्थानांतरित करें। पांच मिनट के लिए 1000 बार जी पर प्लेट को सेंट्रलाइज करें और फिर सुपरनेट को पिपेट से अच्छी तरह से हटा दें और त्याग दें। सेल पैलेट को परेशान करने से बचें।पाठ में वर्णित कोशिकाओं को धोने के बाद प्रत्येक अच्छी तरह से सेल लाइसिस मास्टर मिश्रण के 50 माइक्रोलीटर जोड़ें। सेल पैलेट को फिर से निलंबित करने के लिए पांच बार ऊपर और नीचे पिपेट करें। कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए मिश्रण इनक्यूबेट।फिर, मिश्रण को पांच मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस तक स्थानांतरित करें, और फिर अतिरिक्त पांच मिनट के लिए 75 डिग्री सेल्सियस। अब पीसीआर कुओं में सेल लिएट का एक माइक्रोलीटर डालें जिसमें आरटी क्यूपीसीआर रिएक्शन मिक्स होता है। इस मिक्स में मार्कर जीन फॉरवर्ड और रिवर्स प्राइमर, रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज और वन-स्टेप रिएक्शन मिक्स शामिल हैं ।50 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन प्रतिक्रिया चलाने के बाद बहुलीकरण सक्रियण, और डीएनए-denaturation 95 डिग्री सेल्सियस पर एक मिनट के लिए। पाठ प्रोटोकॉल में विस्तृत के रूप में पीसीआर प्रतिक्रिया के 40 चक्रों के साथ आरटी पीसीआर प्रदर्शन करें। सेंगर अनुक्रमण के माध्यम से HOXA9 कम अभिव्यक्ति क्लोन सत्यापित करें और पाठ प्रोटोकॉल में वर्णित MOLM13 जीनोम डीएनए के साथ पीसीआर प्रदर्शन करें।पीसीआर शुद्धिकरण किट के साथ पीसीआर उत्पादों को निकालें और शुद्ध करें। टी 4 लिगेशन बफर, टी वेक्टर डीएनए, पीसीआर डीएनए और टी 4 लिगाज़ के साथ टी वेक्टर में शुद्ध पीसीआर उत्पादों को लिगेट करें। लिगेशन मिक्स को रात 16 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में रखें।लिगेशन मिक्स को डीएच5 अल्फा सक्षम कोशिकाओं और प्लेट में एलबी एम्पिसिलिन एंटीबायोटिक एगर प्लेट पर स्थानांतरित करें। रात भर प्लेटों को ३७ डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किया । एलबी प्लेट से सिंगल क्लोन चुनें और जेनोटाइपिंग और सेंगर सीक्वेंसिंग द्वारा उन्हें सत्यापित करें।संदर्भ के 200 नैनोग्राम के साथ हेट्रोडुपलेक्स मिश्रण समूह की स्थापना की, और 0.2 मिलीलीटर पीसीआर ट्यूब में 200 नैनोग्राम टेस्ट पीसीआर एम्प्लिकोन्स। नियंत्रण के रूप में संदर्भ पीसीआर एम्प्लिकॉन के केवल 400 नैनोग्राम के साथ होमोडुपेक्स मिश्रण समूह को शामिल करें। 800 मिलीलीटर पानी से भरे एक लीटर बीकर में पांच मिनट के लिए हेट्रोडुपेक्स और होमोडुलेक्स मिश्रण को अलग से 95 डिग्री सेल्सियस पर अलग से इनक्यूबेट करें।फिर, मिश्रण को धीरे-धीरे कमरे के तापमान को एनील में ठंडा करें और हेट्रोडुपेक्स या होमोडुलेक्स बनाएं। अब, अलग से एनील्ड हेटेरोडुपेक्स और होमोड्यूप्लेक्स मिश्रण के 400 नैनोग्राम को इनडेल म्यूटेशन डिटेक्शन न्यूक्लियज़ के एक माइक्रोलीटर के साथ और न्यूक्लियस रिएक्शन बफर के दो माइक्रोलीटर को 60 मिनट के लिए 42 डिग्री सेल्सियस पर अलग से पचाते हैं। एगर उठे जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस के साथ पचा नमूनों का विश्लेषण करें।हेट्रोडुलेक्स मिश्रण डीएनए को छोटे टुकड़ों में काटा जाना चाहिए और होमोड्यूप्लेक्स डीएनए को नहीं काटना चाहिए। MOLM13 सकारात्मक क्लोन को लक्षित sgRNA नियंत्रण कोशिकाओं के साथ तुलना के साथ HOXA9 जीन की अभिव्यक्ति के स्तर के आधार पर, आरटी qPCR विधि के साथ पुष्टि की गई । जांच किए गए 528 जीवित क्लोनों में से, 10 क्लोन ने HOXA9 के स्तर में 50% से अधिक की कमी का प्रदर्शन किया।HOXA9 कम, HOXA9 अपरिवर्तित और HOXA9 में एकीकृत sgRNAs, आगे SgRNA के पीसीआर प्रवर्धन और Sanger अनुक्रम द्वारा पहचान द्वारा पुष्टि की गई । दस क्लोन HOXA9 के स्तर में कमी दिखा के छह CBS79 साइट को लक्षित sgRNAs निहित, के रूप में Sanger अनुक्रमण द्वारा निर्धारित किया गया । एकीकृत एसजीआरएनए पॉजिटिव क्लोन के इंडेल म्यूटेशन पीसीआर आधारित जेनोटीपिंग और नाभिक पाचन द्वारा निर्धारित किए गए थे।HOXA7 और HOXA9 जीन के बीच स्थित सीटीसीएफ साइट के विषम विलोपन की पहचान पीसीआर आधारित जीनोटाइपिंग द्वारा की गई थी । HOXA9-घटी क्लोन पांच, छह, 28 और १२१ CBS79 सीमा स्थान में हटाने का प्रदर्शन किया । इसी तरह के परिणाम CBS79 साइट है कि नाभिक पाचन परख द्वारा विश्लेषण किया गया में इनडेल म्यूटेशन के लिए मनाया गया ।इस प्रक्रिया को करते समय, नाभिक पाचन परख के माध्यम से sgRNA-प्रेरित इनडेल म्यूटेशन का पता लगाने के लिए विषमदुपेक्स और होमोडुलेक्स की बराबर मात्रा बनाना महत्वपूर्ण है। हमारा दृष्टिकोण चयनित मार्कर के उपयोग को सक्षम बनाता है, ताकि ल्यूकेमोजेनेसिस पर जीन के प्रभावों की खोज करने के लिए लक्ष्य जीन पर अगली पीढ़ी के अनुक्रमण को पूरा किया जा सके । कुल मिलाकर हमारा दृष्टिकोण सामान्य जैविक प्रक्रिया के दौरान एक विख्यात आनुवंशिक अनियमित तत्वों के कार्यात्मक सही और कमी के लिए आरपीसी को रोकता है और मरणोपरांत जीनोम परियोजना त्रुटि में ल्यूकेमोजेनेसिस।

Research

JoVE Journal

Genetics

HOX Loci Focused CRISPR/sgRNA Library Screening Identifying Critical CTCF Boundaries

A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source

किसी भी डीएनए स्रोत से बड़े पैमाने पर gRNA पुस्तकालय उत्पादन के लिए एक सार्वभौमिक प्रोटोकॉल

The popularity of the CRISPR/Cas9 system for both genome and epigenome engineering stems from its simplicity and adaptability. An effector (the Cas9 ...

G2-seq: A High Throughput Sequencing-based Technique for Identifying Late Replicating Regions of the Genome

G2-seq: जीनोम के देर से नकल क्षेत्रों की पहचान करने के लिए एक उच्च प्रवाह अनुक्रमण आधारित तकनीक

Numerous techniques have been developed to follow the progress of DNA replication through the S phase of the cell cycle. Most of these techniques have ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

वानस्पतिक नमूनों के लिए मजबूत डीएनए अलगाव और उच्च प्रवाह अनुक्रमण पुस्तकालय निर्माण

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

पूर्वव्यापी MicroRNA अनुक्रमण: पूरक डीएनए लाइब्रेरी तैयारी प्रोटोकॉल का उपयोग Formalin-फिक्स्ड आयल-एंबेडेड आरएनए नमूनों

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of ...

Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen

एक एकल Tardigrade नमूना से Ultralow इनपुट जीनोम अनुक्रमण पुस्तकालय तैयारी

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state ...

Bronchoalveolar Lavage Exosomes in Lipopolysaccharide-induced Septic Lung Injury

Bronchoalveolar लेवेज Exosomes Lipopolysaccharide-प्रेरित सेप्टिक फेफड़ों में चोट

Acute lung injury (ALI) and acute respiratory distress syndrome (ARDS) represent a heterogeneous group of lung diseases which continues to have a high ...

Mating-based Overexpression Library Screening in Yeast

सहवास आधारित खमीर में एक्सप्रेस पुस्तकालय स्क्रीनिंग

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool ...

Screening Cotton Genotypes for Reniform Nematode Resistance

रेनीफॉर्म नेमाटोड प्रतिरोध के लिए स्क्रीनिंग कपास जेनोटाइप्स

A rapid non-destructive reniform nematode (Rotylenchulus reniformis) screening protocol is needed for the development of resistant cotton (Gossypium ...

Identifying Mutations by High Resolution Melting in a TILLING Population of Rice

चावल की एक लिंग आबादी में पिघल उच्च संकल्प द्वारा उत्परिवर्तनों की पहचान

Target Induced Local Lesions In Genomes (TILLING) is a strategy of reverse genetics for the high-throughput screening of induced mutations. However, the ...

Screening and Identification of RNA Silencing Suppressors from Secreted Effectors of Plant Pathogens

पौधे रोगजनकों के स्रावित प्रभावकों से आरएनए को बंद करने वाले दमनकर्ताओं की स्क्रीनिंग और पहचान

RNA silencing is an evolutionarily conserved, sequence-specific gene regulation mechanism in eukaryotes. Several plant pathogens have evolved proteins ...