Name: hox loci focused crispr/sgrna library screening identifying critical ctcf boundaries
Uploaded: 2019-03-31T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about HOX Loci Focused CRISPR/sgRNA Library Screening Identifying Critical CTCF Boundaries at JoVE.com

Gli autori ringraziano anche Nicholas Cesari per il manoscritto di editing. Il lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal National Institute of Health (S.H., R01DK110108, R01CA204044).

1. CTCF sgRNALibrary Design utilizzando uno strumento Online
<ol><li>Progettare il sgRNA targeting siti di legame di CTCF nei loci HOX umani utilizzando lo strumento di progettazione genetica perturbazione piattaforma (GPP) (https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design).</li>
	<li>Sintetizzare un totale di 1.070 sgRNAs composto sgRNAs targeting 303 geni targeting casuale, 60 controlli positivi, 500 controlli non-Human Target e 207 elementi CTCF o lncRNA targeting geni (<strong clas...

<ol>
	<li>Dixon, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topological+domains+in+mammalian+genomes+identified+by+analysis+of+chromatin+interactions.">Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions.</a> Nature. 485 (7398), 376-380 (2012).</li><li>Cuddapah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+the+insulator+binding+protein+CTCF+in+chromatin+barrier+regions+reveals+demarcation+of+active+and+repressive+domains.">Global analysis of the insulator binding protein CTCF in chromatin barrier regions reveals demarcation of active and repressive domains.</a> Genome research. 19 (1), 24-32 (2009).</li><li>Phillips, J. E., Corces, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF:+master+weaver+of+the+genome.">CTCF: master weaver of the genome.</a> Cell. 137 (7), 1194-1211 (2009).</li><li>Tang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF-Mediated+Human+3D+Genome+Architecture+Reveals+Chromatin+Topology+for+Transcription.">CTCF-Mediated Human 3D Genome Architecture Reveals Chromatin Topology for Transcription.</a> Cell. 163 (7), 1611-1627 (2015).</li><li>Lupianez, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruptions+of+topological+chromatin+domains+cause+pathogenic+rewiring+of+gene-enhancer+interactions.">Disruptions of topological chromatin domains cause pathogenic rewiring of gene-enhancer interactions.</a> Cell. 161 (5), 1012-1025 (2015).</li><li>Dowen, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+cell+identity+genes+occurs+in+insulated+neighborhoods+in+mammalian+chromosomes.">Control of cell identity genes occurs in insulated neighborhoods in mammalian chromosomes.</a> Cell. 159 (2), 374-387 (2014).</li><li>Phillips-Cremins, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architectural+protein+subclasses+shape+3D+organization+of+genomes+during+lineage+commitment.">Architectural protein subclasses shape 3D organization of genomes during lineage commitment.</a> Cell. 153 (6), 1281-1295 (2013).</li><li>Narendra, V., Bulajic, M., Dekker, J., Mazzoni, E. O., Reinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF-mediated+topological+boundaries+during+development+foster+appropriate+gene+regulation.">CTCF-mediated topological boundaries during development foster appropriate gene regulation.</a> Genes &amp; Development. 30 (24), 2657-2662 (2016).</li><li>Narendra, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF+establishes+discrete+functional+chromatin+domains+at+the+Hox+clusters+during+differentiation.">CTCF establishes discrete functional chromatin domains at the Hox clusters during differentiation.</a> Science. 347 (6225), 1017-1021 (2015).</li><li>Deng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HoxBlinc+RNA+Recruits+Set1/MLL+Complexes+to+Activate+Hox+Gene+Expression+Patterns+and+Mesoderm+Lineage+Development.">HoxBlinc RNA Recruits Set1/MLL Complexes to Activate Hox Gene Expression Patterns and Mesoderm Lineage Development.</a> Cell Reports. 14 (1), 103-114 (2016).</li><li>Patel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberrant+TAL1+activation+is+mediated+by+an+interchromosomal+interaction+in+human+T-cell+acute+lymphoblastic+leukemia.">Aberrant TAL1 activation is mediated by an interchromosomal interaction in human T-cell acute lymphoblastic leukemia.</a> Leukemia. 28 (2), 349-361 (2014).</li><li>Luo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF+boundary+remodels+chromatin+domain+and+drives+aberrant+HOX+gene+transcription+in+acute+myeloid+leukemia.">CTCF boundary remodels chromatin domain and drives aberrant HOX gene transcription in acute myeloid leukemia.</a> Blood. 132 (8), 837-848 (2018).</li><li>Dou, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medial+HOXA+genes+demarcate+haematopoietic+stem+cell+fate+during+human+development.">Medial HOXA genes demarcate haematopoietic stem cell fate during human development.</a> Nature Cell Biology. 18 (6), 595-606 (2016).</li><li>Lawrence, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+expression+of+the+Hoxa-9+homeobox+gene+impairs+the+proliferation+and+repopulating+ability+of+hematopoietic+stem+cells.">Loss of expression of the Hoxa-9 homeobox gene impairs the proliferation and repopulating ability of hematopoietic stem cells.</a> Blood. 106 (12), 3988-3994 (2005).</li><li>Deng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=USF1+and+hSET1A+mediated+epigenetic+modifications+regulate+lineage+differentiation+and+HoxB4+transcription.">USF1 and hSET1A mediated epigenetic modifications regulate lineage differentiation and HoxB4 transcription.</a> PLOS Genetics. 9 (6), e1003524 (2013).</li><li>Rawat, V. P., Humphries, R. K., Buske, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+Hox:+the+role+of+ParaHox+genes+in+normal+and+malignant+hematopoiesis.">Beyond Hox: the role of ParaHox genes in normal and malignant hematopoiesis.</a> Blood. 120 (3), 519-527 (2012).</li><li>Alharbi, R. A., Pettengell, R., Pandha, H. S., Morgan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+HOX+genes+in+normal+hematopoiesis+and+acute+leukemia.">The role of HOX genes in normal hematopoiesis and acute leukemia.</a> Leukemia. 27 (5), 1000-1008 (2013).</li><li>Rice, K. L., Licht, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HOX+deregulation+in+acute+myeloid+leukemia.">HOX deregulation in acute myeloid leukemia.</a> Journal of Clinical Investigation. 117 (4), 865-868 (2007).</li><li>Bassett, A. R., Kong, L., Liu, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+CRISPR+library+for+high-throughput+genetic+screening+in+Drosophila+cells.">A genome-wide CRISPR library for high-throughput genetic screening in Drosophila cells.</a> Journal of Genetics and Genomics. 42 (6), 301-309 (2015).</li><li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+deletion+screening+of+human+long+non-coding+RNAs+using+a+paired-guide+RNA+CRISPR-Cas9+library.">Genome-scale deletion screening of human long non-coding RNAs using a paired-guide RNA CRISPR-Cas9 library.</a> Nature Biotechnology. 34 (12), 1279-1286 (2016).</li><li>Kurata, J. S., Lin, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-focused+CRISPR-Cas9+library+screen+reveals+fitness-associated+miRNAs.">MicroRNA-focused CRISPR-Cas9 library screen reveals fitness-associated miRNAs.</a> RNA. 24 (7), 966-981 (2018).</li><li>Collins, C. T., Hess, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+HOXA9+in+leukemia:+dysregulation,+cofactors+and+essential+targets.">Role of HOXA9 in leukemia: dysregulation, cofactors and essential targets.</a> Oncogene. 35 (9), 1090-1098 (2016).</li><li>Kroon, E., Thorsteinsdottir, U., Mayotte, N., Nakamura, T., Sauvageau, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NUP98-HOXA9+expression+in+hemopoietic+stem+cells+induces+chronic+and+acute+myeloid+leukemias+in+mice.">NUP98-HOXA9 expression in hemopoietic stem cells induces chronic and acute myeloid leukemias in mice.</a> The EMBO Journal. 20 (3), 350-361 (2001).</li><li>Koike-Yusa, H., Li, Y., Tan, E. P., Velasco-Herrera Mdel, C., Yusa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+recessive+genetic+screening+in+mammalian+cells+with+a+lentiviral+CRISPR-guide+RNA+library.">Genome-wide recessive genetic screening in mammalian cells with a lentiviral CRISPR-guide RNA library.</a> Nature Biotechnology. 32 (3), 267-273 (2014).</li><li>Shalem, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+CRISPR-Cas9+knockout+screening+in+human+cells.">Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells.</a> Science. 343 (6166), 84-87 (2014).</li><li>Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+screens+in+human+cells+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system.</a> Science. 343 (6166), 80-84 (2014).</li><li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+sgRNAs+facilitate+CRISPR/Cas9-mediated+mouse+genome+targeting.">Dual sgRNAs facilitate CRISPR/Cas9-mediated mouse genome targeting.</a> The FEBS Journal. 281 (7), 1717-1725 (2014).</li><li>Sanjana, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+interrogation+of+functional+elements+in+the+noncoding+genome.">High-resolution interrogation of functional elements in the noncoding genome.</a> Science. 353 (6307), 1545-1549 (2016).</li><li>Rajagopal, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+mapping+of+regulatory+DNA.">High-throughput mapping of regulatory DNA.</a> Nature Biotechnology. 34 (2), 167-174 (2016).</li><li>Korkmaz, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genetic+screens+for+enhancer+elements+in+the+human+genome+using+CRISPR-Cas9.">Functional genetic screens for enhancer elements in the human genome using CRISPR-Cas9.</a> Nature Biotechnology. 34 (2), 192-198 (2016).</li><li>Rezaei, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FMS-Like+Tyrosine+Kinase+3+(FLT3)+and+Nucleophosmin+1+(NPM1)+in+Iranian+Adult+Acute+Myeloid+Leukemia+Patients+with+Normal+Karyotypes:+Mutation+Status+and+Clinical+and+Laboratory+Characteristics.">FMS-Like Tyrosine Kinase 3 (FLT3) and Nucleophosmin 1 (NPM1) in Iranian Adult Acute Myeloid Leukemia Patients with Normal Karyotypes: Mutation Status and Clinical and Laboratory Characteristics.</a> Turkish Journal of Haematology. 34 (4), 300-306 (2017).</li><li>Yaragatti, M., Basilico, C., Dailey, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+active+transcriptional+regulatory+modules+by+the+functional+assay+of+DNA+from+nucleosome-free+regions.">Identification of active transcriptional regulatory modules by the functional assay of DNA from nucleosome-free regions.</a> Genome Research. 18 (6), 930-938 (2008).</li><li>Wilken, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNase+I+hypersensitivity+analysis+of+the+mouse+brain+and+retina+identifies+region-specific+regulatory+elements.">DNase I hypersensitivity analysis of the mouse brain and retina identifies region-specific regulatory elements.</a> Epigenetics Chromatin. 8, 8 (2015).</li><li>Narlikar, L., Ovcharenko, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+regulatory+elements+in+eukaryotic+genomes.">Identifying regulatory elements in eukaryotic genomes.</a> Briefings in Functional Genomics and Proteomics. 8 (4), 215-230 (2009).</li><li>Hnisz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+proto-oncogenes+by+disruption+of+chromosome+neighborhoods.">Activation of proto-oncogenes by disruption of chromosome neighborhoods.</a> Science. 351 (6280), 1454-1458 (2016).</li></ol>

Proteina-codificazione gene relativo sgRNA librerie sono state applicate in un sistema di screening funzionale all'identificazione di geni e i networks che regolano specifiche funzioni cellulari attraverso sgRNA arricchimento24,25,26 ,27,28. Regione non codificante diversi correlati sgRNA librerie inoltre sono state indicate nelle schermate funzionale gene-sp...

Recenti studi di interazione tra genoma ha rivelato che le forme di genoma nucleare stabili topologicamente associando domini (TADs) che sono conservati attraverso specie e tipi di cellule. L'organizzazione del genoma in domini distinti facilita e limita le interazioni tra elementi normativi (ad es., esaltatori e promotori). Il fattore di CCCTC-associazione (CTCF) si lega ai limiti di TAD e svolge un ruolo critico in costrittive interazioni degli elementi di DNA che si trovano nella vicina TADs1. Tuttavia, il genoma vasta CTCF associazione dati hanno rivelato che sebbene CTCF interagisce principalmente con gli stessi siti di DNA in diversi tipi cellulari, spesso funziona come una barriera di cromatina presso un sito specifico in una cella tipo ma non in altro, suggerendo che funzioni CTCF insieme ad altre attività nella formazione della cromatina confini2. Ciò che rimane sconosciuto è se gli elementi di contorno (siti di legame per CTCF) sono direttamente collegati alla funzione biologica di CTCF, e come questi collegamenti si verificano. Quindi, supponiamo che specifici siti di legame di CTCF nel genoma direttamente regolano la formazione di TADs e controllano le interazioni promoter/enhancer all'interno di questi domini o tra domini limitrofi. Il completamento dei umani e successive analisi epigenetiche e progetti di sequenziamento del genoma di topo hanno scoperto nuove firme genetiche e molecolari del genoma. Tuttavia, il ruolo di firme/modifiche specifiche nella regolazione genica e la funzione cellulare, come pure i loro meccanismi molecolari, devono ancora essere pienamente compreso.
Linee multiple di prova sostengono che il TADs CTCF-mediata rappresenta funzionale della cromatina domini3,4,5. Anche se CTCF interagisce principalmente con gli stessi siti di DNA in diversi tipi cellulari, dati CTCF ChIP-seq ampi del genoma ha rivelato che CTCF spesso funziona come una barriera di cromatina in una cella tipo ma non negli altri2. CTCF svolge un ruolo essenziale durante lo sviluppo di mediazione genoma organizzazione4,6,7. Rottura dei confini CTCF alterata enhancer/promotore interazioni ed espressione genica, che conduce al bloccaggio inerente allo sviluppo. Ciò suggerisce che CTCF mediata TADs sono non solo componenti strutturali, ma anche unità normativo necessario per enhancer corretta azione e gene trascrizione5,8,9.
Geni HOX giocano un ruolo critico nello sviluppo embrionale e sono temporalmente e spazialmente limitate nel loro pattern di espressione. Il locus HOXA forma due TADs stabile che separa geni anteriori e posteriori da un elemento di contorno CTCF-collegata in hESCs e IMR90 cellule1. I rapporti recenti hanno dimostrato che HoxBlinc, un HoxB locus associato lncRNA, media la formazione di CTCF diretto TADs e interazioni enhancer/promotore in luogo del HOXB . Questo porta alla attivazione del gene HOXB anteriore durante ESC impegno e differenziazione10. Inoltre, ai loci genici specifici compreso il luogo HOXA , alterazione di CTCF mediata profili di espressione genica specifici di TAD domini ha cambiato la sua stirpe ed è stata associata con lo sviluppo della malattia stati11,12. La prova sostiene una funzione primaria per CTCF nella trascrizione genica di coordinamento e nella determinazione della microcella organizzando il genoma in domini funzionali.
Nonostante il suo ruolo nello sviluppo embrionale, durante l'ematopoiesi, geni HOX regolano la funzione delle cellule (HS/PC) ematopoietica staminali e progenitrici. Questo viene fatto controllando l'equilibrio tra proliferazione e differenziazione10,13,14,15. L'espressione dei geni HOX è strettamente regolata in tutta la specifica e la differenziazione delle cellule ematopoietiche, con massima espressione in HS / espressione genica pz. HOX gradualmente diminuisce durante la maturazione, con i suoi livelli più bassi che si verificano differenziato cellule ematopoietiche16. Disregolazione genica HOX è un meccanismo dominante di trasformazione leucemica di proprietà di auto-rinnovamento e differenziazione disregolando di HS/PCs che conduce alla trasformazione leucemica17,18. Tuttavia, il meccanismo di stabilire e mantenere la normale vs modelli di espressione oncogena di geni HOX , nonché reti di regolazione associati rimane poco chiaro.
Lo screening CRISPR-Cas9 sgRNA biblioteca è stato ampiamente usato per interrogare di geni codificanti per proteine19 come bene come geni non codificanti, come lncRNA20 e miRNA21 in specie diverse. Tuttavia, il costo per utilizzare la libreria di sgRNA CRISPR-Cas9 per identificare nuovi bersagli genomici rimane alto, perché il sequenziamento del genoma ad alta velocità è spesso applicato per verificare la proiezione di libreria sgRNA. Nostro sgRNA sistema di screening è focalizzata sul loci specifici genoma e valuta la sgRNAs targeting attraverso One-step RT-PCR secondo l'espressione del gene marcatore, ad esempio HOXA9. Inoltre, Sanger sequenziamento ha confermato che il sgRNA è stato integrato nel genoma le mutazioni Indel può essere rilevata per identificare il sgRNA targeting per sito. Attraverso lo screening genetico loci specifici CRISPR-Cas9, il confine di cromatina CBS7/9 è stato identificato come un regolatore fondamentale per stabilire il dominio della cromatina oncogeno e mantenere ectopico pattern di espressione genica HOX nella patogenesi dell'AML 12. il metodo può essere ampiamente applicato per identificare non solo la funzione specifica di confine CTCF in sviluppo embrionale, ematopoiesi, leukemogenesis, ma anche limite di CTCF come potenziali bersagli terapeutici per la futura terapia epigenetica.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:689px;" width="689">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Lipofectamine 3000 reagent</td>
			<td style="width:155px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">L3000-008</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Proteinase K</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25530049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Puromycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1113802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stbl3 cells&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>&#160;C737303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEK293T</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MOLM-13</td>
			<td>DSMZ</td>
			<td>ACC 554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">lentiCRISPRv2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>52961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">psPAX2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pGEM&#174;-T Easy Vector Systems&#160;</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A137A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T4 ligase&#160;</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>&#160;M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAquick Gel Extract kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAuick PCR purification kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SingleShot&#8482; SYBR&#174;&#160;Green One-Step Kit</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1725095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">QIAGEN Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td style="width:100px;">12163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">&#160;11965084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI 1640&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal bovine serum (FBS)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">10-082-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin/streptomycin/L-glutamine&#160;</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:100px;">10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lenti-X Concentrator&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Clontech</td>
			<td style="width:100px;">631232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Trypan Blue Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Polybrene</td>
			<td style="width:155px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-134220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Genessee Scientific</td>
			<td>&#160;25-507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">TAE buffer&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>FERB49</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Surveyor&#174; Mutation Detection Kits</td>
			<td style="width:155px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:100px;">706020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Biorad Universal Hood II Gel Doc System</td>
			<td style="width:155px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:100px;">170-8126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Centrifuge 5424 R</td>
			<td style="width:155px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:100px;">5404000138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Digital Dry Baths/Block Heaters</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">88870002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">TSX Series Ultra-Low Freezers</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">TSX40086V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Forma&#8482; Steri-Cult&#8482; CO2&#160;Incubators</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">3308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Herasafe&#8482; KS, Class II Biological Safety Cabinet</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">51022484</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Sorvall&#8482; Legend&#8482; XT/XF Centrifuge Series</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">75004506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Fisherbrand&#8482;&#160;Isotemp&#8482; Water Baths</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">FSGPD02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:263px;">Thermo Scientific&#8482;&#160;Locator&#8482; Plus Rack and Box Systems</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">13-762-353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System</td>
			<td style="width:155px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:100px;">1855195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">MiniAmp&#8482; Thermal Cycler</td>
			<td style="width:155px;">Applied Biosystems technology</td>
			<td style="width:100px;">A37834</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:263px;">Thermo Scientific&#8482;&#160;Owl&#8482; EC300XL2 Compact Power Supply</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">7217581</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:263px;">Thermo Scientific&#8482;&#160;Owl&#8482; EasyCast&#8482; B1 Mini Gel Electrophoresis Systems</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">09-528-178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">VWR&#174; Tube Rotator and Rotisseries</td>
			<td style="width:155px;">VWR International</td>
			<td style="width:100px;">10136-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">VWR&#174; Incubating Mini Shaker</td>
			<td style="width:155px;">VWR International</td>
			<td style="width:100px;">12620-942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Analytical Balance MS104TS/00</td>
			<td style="width:155px;">METTLER TOLEDO</td>
			<td style="width:100px;">30133522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">DS-11 FX and DS-11 FX+ Spectrophotometer</td>
			<td style="width:155px;">DeNovix Inc.</td>
			<td style="width:100px;">DS-11 FX</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hox loci focused crispr/sgrna library screening identifying critical ctcf boundaries

CCCTC-associazione fattore (CTCF)-mediata stabile topologicamente associando i domini (TADs) svolgono un ruolo critico in costrittive interazioni degli elementi di DNA che si trovano nella vicina TADs. CTCF svolge un ruolo importante nel regolare l'espressione spaziale e temporale dei geni HOX che controllano lo sviluppo embrionale, patterning di corpo, ematopoiesi e leukemogenesis. Tuttavia, rimane in gran parte sconosciuto se e come i confini HOX loci associati CTCF regolano organizzazione della cromatina ed espressione genica HOX . Nel protocollo attuale, una libreria in pool specifico sgRNA targeting per tutti i siti di legame di CTCF nei loci HOXA/B/C/D è stata generata per esaminare gli effetti di turbare i confini di cromatina CTCF-collegata sulla formazione di TAD e gene HOX espressione. Attraverso CRISPR-Cas9 screening genetico, il sito di legame di CTCF situato tra geni HOXA7/HOXA9 (CBS7/9) è stato identificato come un regolatore critico del dominio della cromatina oncogeno, oltre ad essere importante per mantenere un gene HOX ectopico modelli di espressione in MLL-riorganizzate leucemia mieloide acuta (AML). Così, questa libreria sgRNA approccio di screening fornisce nuove conoscenze sulla organizzazione di genoma CTCF mediata in loci genici specifici e inoltre fornisce una base per la caratterizzazione funzionale degli elementi normativi genetici con annotazioni, entrambi di codifica e non codificante, durante i normali processi biologici in epoca di progetto genoma post-umano.

La tecnologia CRISPR-Cas9 è un potente strumento di ricerca per gli studi di genomici funzionali. Si sta rapidamente sostituendo il gene convenzionali tecniche di editing ed ha alta utilità per applicazioni orientate al gene genoma e individuali. Qui, la prima individualmente clonato loci specifici CRISPR-Cas9-schierati sgRNA libreria contiene 1.070 sgRNAs composto sgRNAs targeting 303 geni targeting casuale, 60 controlli positivi, 500 controlli non-Human Target e 207 elementi CTCF o ln...

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HOX Loci Focused CRISPR/sgRNA Library Screening Identifying Critical CTCF Boundaries

Una libreria CRISPR/sgRNA è stata applicata a interrogare i geni di proteina-codificazione. Tuttavia, la fattibilità di una libreria di sgRNA per scoprire la funzione di un confine CTCF nella regolazione genica rimane inesplorata. Qui, descriviamo una raccolta di specifiche sgRNA loci HOX per delucidare la funzione dei confini CTCF in loci HOX .

HOX Loci Focused CRISPR/sgRNA biblioteca Screening identificazione critico CTCF confini

CCCTC-binding factor (CTCF)-mediated stable topologically associating domains (TADs) play a critical role in constraining interactions of DNA elements ...

Il nostro sgRNA in pool chiamato screening della biblioteca, è un potente approccio genetico per identificare e valutare la funzione biologica degli elementi non di rivestimento in tutto il genoma. Questa tecnica ci consente di esaminare l'effetto di interrompere i siti di legame associati, i confini cromatici o altri elementi regolatori sull'espressione dei geni mirati. Il nostro approccio può essere utilizzato per identificare il ruolo del CTCF, gli RNA e gli esaltatori lunghi non codificanti, nella regolazione genica HOX nello sviluppo embrionale precoce, così come alcune leucemie con una firma genica HOX aberrante.Iniziare questa procedura con la progettazione di uno sgRNA destinato ai siti di associazione CTCF. Clonazione della libreria sgRNA nella preparazione delle celle come descritto nel protocollo di testo. Per confezionare il lentivirus, cotrasfetto cellule HEK293 T con 20 microgrammi di vettori di libreria purificata, 15 microgrammi del plasmide confezionato e 10 microgrammi del plasmide dell'involucro, per 48 ore prima di raccogliere i virus.Dopo 48 ore, raccogliere il supernatante virus e filtrarlo attraverso una membrana PVDF legante a basso contenuto proteico da 0,45 micron. Quindi, concentrare il supernatante lentivirale di 50 volte, usando il concentratore. Aliquota i virus concentrati e conservali in un congelatore meno 80 gradi Celsius.Lavorare in pozzi separati di una piastra di 12 pozza di pozzo per mescolare cellule MOLM13 con varie dosi del lentivirus concentrato per sei gruppi totali. Centrifugare immediatamente queste miscele a 1000 volte g per due ore a 33 gradi celsius. Trasferire le 12 piastre del pozzo nell'incubatrice a 37 gradi celsius e il 5% di anidride carbonica per quattro ore.Aspirare delicatamente il supernatante senza disturbare la tavolozza delle celle e sospendere nuovamente le celle trasdute con RPMI 1640 Medium fresco integrato. Quindi trasferire le cellule ri-sospese su matracci T25 e incubare a 37 gradi celsius per 48 ore senza puromicina. Dopo 48 ore dividere queste cellule in due contenitori, un gruppo sperimentale trattato con un microlitro per millilitro puromicina per cinque giorni e un gruppo di controllo senza puromicina trattamento per cinque giorni.Misurare il valore MOI ottimizzato per la trasduzione dividendo il numero di cellule vive trattate con puromicina per il numero di cellule senza trattamento con puromicina. Per trasdurre le cellule con la libreria in pool, infettare 1,5 milioni di cellule MOLM13 in una piastra di 6 pozzi con 0,3 MOI di lentivirus in pool di sgRNA in mezzo. Utilizzare le cellule senza l'infezione da lentivirus come controllo.Centrifugare immediatamente la piastra dei sei pozzi a 1000 volte g per due ore a 33 gradi celsius per spinfect le cellule. Quindi, trasferire le piastre nell'incubatrice a 37 gradi celsius in anidride carbonica al 5% per quattro ore. Aspirare delicatamente il supernatante senza disturbare la tavolozza delle celle e sospendere di nuovo le cellule trasdute con mezzo fresco.Quindi, trasferire le cellule in matracci T25 e incubare a 37 gradi Celsius per 48 ore senza puromicina. Dopo 48 ore, trattare le cellule con un microgrammo per millilitro puromicina per cinque giorni. Scambiare con mezzo fresco dopo due giorni e mantenere una densità cellulare ottimale.Seminare il singolo clone in 96 piastre di pozzo con metodi di diluizione limitanti. Incubare questo singolo clone a 37 gradi celsius e 5% di anidride carbonica. Culturali per 3-4 settimane.Contare le celle MOLM13 integrate di sgRNA con colorazione della soluzione Trypan Blue allo 0,4% e quindi trasferire 10.000 cellule vive per pozzo su una piastra PCR da 96 po '. Centrifugare la piastra a 1000 volte g per cinque minuti e quindi rimuovere e scartare accuratamente il supernatante con una pipetta. Evitare di disturbare la tavolozza delle celle.Dopo aver lavato le cellule come descritto nel testo aggiungere 50 microlitri del mix master di lisi cellulare ad ogni pozzo. Pipetta su e giù cinque volte per sospendere di nuovo la tavolozza delle celle. Incubare il mix per 10 minuti a temperatura ambiente.Quindi, trasferire la miscela a 37 gradi Celsius per cinque minuti, quindi 75 gradi Celsius per altri cinque minuti. Ora aggiungete un microlitro di lisato cellulare ai pozzi PCR contenenti la miscela di reazione RT qPCR. Questo mix include i geni marcatori primer avanti e indietro, transcriptasi inversa e mix di reazione one-step.Eseguire la reazione di trascrizione inversa per 10 minuti a 50 gradi Celsius seguita dall'attivazione della polimerizzazione e dalla denaturazione del DNA per un minuto a 95 gradi celsius. Eseguire RT PCR con 40 cicli di reazione PCR come descritto nel protocollo di testo. Verificare che HOXA9 abbia ridotto i cloni di espressione tramite il sequenziamento Sanger ed eseguire PCR con IL DNA del genoma MOLM13 come descritto nel protocollo di testo.Estrarre e purificare i prodotti PCR con il kit di purificazione PCR. Legare i prodotti PCR purificati nel vettore T con tampone di legazione T4, DNA vettoriale T, DNA PCR e ligasi T4. Posizionare il mix di legatura in un incubatore a 16 gradi celsius durante la notte.Trasferire il mix di legatura in cellule e piastre DH5 alpha competenti su una piastra di agar antibiotico di ampicillina LB. Incubare le piastre durante la notte a 37 gradi Celsius. Scegli i singoli cloni dalla piastra LB e verificali genotipiando e sequenziando Sanger.Impostare il gruppo di miscele eteroduplex con 200 nanogrammi del riferimento e 200 nanogrammi di ampliconi PCR di prova in un tubo PCR da 0,2 millilitri. Includere il gruppo di miscele omoduplex con solo 400 nanogrammi di ampliconi PCR di riferimento come controllo. Incubare separatamente la miscela eteroduplex e omoduplex a 95 gradi celsius per cinque minuti in un bicchiere da un litro riempito con 800 millilitri di acqua.Quindi, raffreddare gradualmente le miscele a temperatura ambiente per ricottura e formare l'eteroduplex o l'omoduplex. Ora, digerire separatamente 400 nanogrammi della miscela eteroduplex e omoduplex ricotta con un microlitro di nucleasi di rilevamento delle mutazioni indelebili e due microlitri di tampone di reazione della nucleasi a 42 gradi celsius per 60 minuti. Analizzare i campioni digeriti con elettroforesi del gel di agarosio.Il DNA della miscela eteroduplex deve essere tagliato in piccoli frammenti e il DNA omoduplex non deve essere tagliato. sgRNA mirato a cloni positivi MOLM13 sono stati confermati con il metodo RT qPCR, basato sui livelli di espressione dei geni HOXA9 con il confronto con le cellule di controllo. Dei 528 cloni sopravvissuti proiettati, 10 cloni hanno mostrato una riduzione di oltre il 50% dei livelli HOXA9.gli sgRNA integrati nell'HOXA9 ridotti, HOXA9 invariati e HOXA9 cloni aumentati, sono stati ulteriormente confermati dall'amplificazione PCR dello sgRNA e dall'identificazione con la sequenza Sanger. Sei dei dieci cloni che mostravano una riduzione dei livelli di HOXA9 contenevano sgRNA destinati al sito CBS79, come determinato dal sequenziamento di Sanger. Le mutazioni indelebili dei cloni positivi dello sgRNA integrato sono state determinate dalla genotipizzazione basata sulla PCR e dalla digestione della nucleasi.La cancellazione eterozigote del sito CTCF situato tra i geni HOXA7 e HOXA9 è stata identificata dal genotipizzazione basato su PCR. I cloni ridotti da HOXA9 cinque, sei, 28 e 121 hanno mostrato la cancellazione nella posizione limite cbs79. Risultati simili sono stati osservati per le mutazioni indelebili nel sito CBS79 che sono state analizzate dal saggio di digestione della nucleasi.Quando si esegue questa procedura, è importante fare uguali quantità di eteroduplexes e omoduplex al fine di rilevare mutazioni indeleli indotte da sgRNA attraverso il saggio di digestione della nucleasi. Il nostro approccio consente l'utilizzo del marcatore selezionato, per effettuare il sequenziamento di nuova generazione sul gene bersaglio per scoprire gli effetti del gene sulla leucemogenesi. Nel complesso il nostro approccio previene le RPC per il corretto funzionale e la riduzione di un noto elementi genetici irregolari durante il normale processo biologico e la leucemogenesi nell'errore del progetto genoma postumo.

Research

JoVE Journal

Genetics

HOX Loci Focused CRISPR/sgRNA Library Screening Identifying Critical CTCF Boundaries

A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source

Un protocollo universale per gRNA su larga scala produzione di libreria da qualsiasi fonte di DNA

The popularity of the CRISPR/Cas9 system for both genome and epigenome engineering stems from its simplicity and adaptability. An effector (the Cas9 ...

Ricerca

Genetica

G2-seq: A High Throughput Sequencing-based Technique for Identifying Late Replicating Regions of the Genome

G2-seq: Un'elevato Throughput sequenziamento-base tecnica per identificare replica ritardata regioni del genoma

Numerous techniques have been developed to follow the progress of DNA replication through the S phase of the cell cycle. Most of these techniques have ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Isolamento del DNA robusto e costruzione della libreria High-throughput sequenziamento per campioni di erbario

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Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

Sequenziamento di MicroRNA retrospettiva: Protocollo di preparazione libreria DNA complementare utilizzando campioni di RNA di paraffina-incastonato formalina-fisso

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of ...

Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen

Bassissimo ingresso il sequenziamento del genoma libreria preparazione da un singolo esemplare di Tardigrade

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state ...

Bronchoalveolar Lavage Exosomes in Lipopolysaccharide-induced Septic Lung Injury

Il lavaggio broncoalveolare esosomi in lesioni polmonari settici Lipopolysaccharide indotta

Acute lung injury (ALI) and acute respiratory distress syndrome (ARDS) represent a heterogeneous group of lung diseases which continues to have a high ...

Mating-based Overexpression Library Screening in Yeast

Sovraespressione di accoppiamento-based Library Screening in lievito

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool ...

Screening Cotton Genotypes for Reniform Nematode Resistance

Screening dei genotipi del cotone per la Resistenza ai Nematode Reniforme

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