Name: hox loci focused crispr/sgrna library screening identifying critical ctcf boundaries
Uploaded: 2019-03-31T14:00:00
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著者はまた原稿を編集のニコラス セザーリを感謝します。仕事は、国立衛生研究所 (s. h.、R01DK110108、R01CA204044) からの助成金によって支えられました。

1. CTCF sgRNALibrary オンライン ツールを使用して設計
<ol><li>遺伝的摂動プラットフォーム (GPP) デザイナー ツール (https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design) を使用して人間のHOX遺伝子の CTCF 結合部位をターゲット sgRNA をデザインします。</li>
	<li>303 ランダム ターゲット遺伝子、60 のポジティブ コントロール、500 の非人間ターゲット コントロール 207 CTCF 要素または lncRNA (...

<ol>
	<li>Dixon, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topological+domains+in+mammalian+genomes+identified+by+analysis+of+chromatin+interactions.">Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions.</a> Nature. 485 (7398), 376-380 (2012).</li><li>Cuddapah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+the+insulator+binding+protein+CTCF+in+chromatin+barrier+regions+reveals+demarcation+of+active+and+repressive+domains.">Global analysis of the insulator binding protein CTCF in chromatin barrier regions reveals demarcation of active and repressive domains.</a> Genome research. 19 (1), 24-32 (2009).</li><li>Phillips, J. E., Corces, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF:+master+weaver+of+the+genome.">CTCF: master weaver of the genome.</a> Cell. 137 (7), 1194-1211 (2009).</li><li>Tang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF-Mediated+Human+3D+Genome+Architecture+Reveals+Chromatin+Topology+for+Transcription.">CTCF-Mediated Human 3D Genome Architecture Reveals Chromatin Topology for Transcription.</a> Cell. 163 (7), 1611-1627 (2015).</li><li>Lupianez, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruptions+of+topological+chromatin+domains+cause+pathogenic+rewiring+of+gene-enhancer+interactions.">Disruptions of topological chromatin domains cause pathogenic rewiring of gene-enhancer interactions.</a> Cell. 161 (5), 1012-1025 (2015).</li><li>Dowen, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+cell+identity+genes+occurs+in+insulated+neighborhoods+in+mammalian+chromosomes.">Control of cell identity genes occurs in insulated neighborhoods in mammalian chromosomes.</a> Cell. 159 (2), 374-387 (2014).</li><li>Phillips-Cremins, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architectural+protein+subclasses+shape+3D+organization+of+genomes+during+lineage+commitment.">Architectural protein subclasses shape 3D organization of genomes during lineage commitment.</a> Cell. 153 (6), 1281-1295 (2013).</li><li>Narendra, V., Bulajic, M., Dekker, J., Mazzoni, E. O., Reinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF-mediated+topological+boundaries+during+development+foster+appropriate+gene+regulation.">CTCF-mediated topological boundaries during development foster appropriate gene regulation.</a> Genes &amp; Development. 30 (24), 2657-2662 (2016).</li><li>Narendra, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF+establishes+discrete+functional+chromatin+domains+at+the+Hox+clusters+during+differentiation.">CTCF establishes discrete functional chromatin domains at the Hox clusters during differentiation.</a> Science. 347 (6225), 1017-1021 (2015).</li><li>Deng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HoxBlinc+RNA+Recruits+Set1/MLL+Complexes+to+Activate+Hox+Gene+Expression+Patterns+and+Mesoderm+Lineage+Development.">HoxBlinc RNA Recruits Set1/MLL Complexes to Activate Hox Gene Expression Patterns and Mesoderm Lineage Development.</a> Cell Reports. 14 (1), 103-114 (2016).</li><li>Patel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberrant+TAL1+activation+is+mediated+by+an+interchromosomal+interaction+in+human+T-cell+acute+lymphoblastic+leukemia.">Aberrant TAL1 activation is mediated by an interchromosomal interaction in human T-cell acute lymphoblastic leukemia.</a> Leukemia. 28 (2), 349-361 (2014).</li><li>Luo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF+boundary+remodels+chromatin+domain+and+drives+aberrant+HOX+gene+transcription+in+acute+myeloid+leukemia.">CTCF boundary remodels chromatin domain and drives aberrant HOX gene transcription in acute myeloid leukemia.</a> Blood. 132 (8), 837-848 (2018).</li><li>Dou, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medial+HOXA+genes+demarcate+haematopoietic+stem+cell+fate+during+human+development.">Medial HOXA genes demarcate haematopoietic stem cell fate during human development.</a> Nature Cell Biology. 18 (6), 595-606 (2016).</li><li>Lawrence, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+expression+of+the+Hoxa-9+homeobox+gene+impairs+the+proliferation+and+repopulating+ability+of+hematopoietic+stem+cells.">Loss of expression of the Hoxa-9 homeobox gene impairs the proliferation and repopulating ability of hematopoietic stem cells.</a> Blood. 106 (12), 3988-3994 (2005).</li><li>Deng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=USF1+and+hSET1A+mediated+epigenetic+modifications+regulate+lineage+differentiation+and+HoxB4+transcription.">USF1 and hSET1A mediated epigenetic modifications regulate lineage differentiation and HoxB4 transcription.</a> PLOS Genetics. 9 (6), e1003524 (2013).</li><li>Rawat, V. P., Humphries, R. K., Buske, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+Hox:+the+role+of+ParaHox+genes+in+normal+and+malignant+hematopoiesis.">Beyond Hox: the role of ParaHox genes in normal and malignant hematopoiesis.</a> Blood. 120 (3), 519-527 (2012).</li><li>Alharbi, R. A., Pettengell, R., Pandha, H. S., Morgan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+HOX+genes+in+normal+hematopoiesis+and+acute+leukemia.">The role of HOX genes in normal hematopoiesis and acute leukemia.</a> Leukemia. 27 (5), 1000-1008 (2013).</li><li>Rice, K. L., Licht, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HOX+deregulation+in+acute+myeloid+leukemia.">HOX deregulation in acute myeloid leukemia.</a> Journal of Clinical Investigation. 117 (4), 865-868 (2007).</li><li>Bassett, A. R., Kong, L., Liu, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+CRISPR+library+for+high-throughput+genetic+screening+in+Drosophila+cells.">A genome-wide CRISPR library for high-throughput genetic screening in Drosophila cells.</a> Journal of Genetics and Genomics. 42 (6), 301-309 (2015).</li><li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+deletion+screening+of+human+long+non-coding+RNAs+using+a+paired-guide+RNA+CRISPR-Cas9+library.">Genome-scale deletion screening of human long non-coding RNAs using a paired-guide RNA CRISPR-Cas9 library.</a> Nature Biotechnology. 34 (12), 1279-1286 (2016).</li><li>Kurata, J. S., Lin, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-focused+CRISPR-Cas9+library+screen+reveals+fitness-associated+miRNAs.">MicroRNA-focused CRISPR-Cas9 library screen reveals fitness-associated miRNAs.</a> RNA. 24 (7), 966-981 (2018).</li><li>Collins, C. T., Hess, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+HOXA9+in+leukemia:+dysregulation,+cofactors+and+essential+targets.">Role of HOXA9 in leukemia: dysregulation, cofactors and essential targets.</a> Oncogene. 35 (9), 1090-1098 (2016).</li><li>Kroon, E., Thorsteinsdottir, U., Mayotte, N., Nakamura, T., Sauvageau, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NUP98-HOXA9+expression+in+hemopoietic+stem+cells+induces+chronic+and+acute+myeloid+leukemias+in+mice.">NUP98-HOXA9 expression in hemopoietic stem cells induces chronic and acute myeloid leukemias in mice.</a> The EMBO Journal. 20 (3), 350-361 (2001).</li><li>Koike-Yusa, H., Li, Y., Tan, E. P., Velasco-Herrera Mdel, C., Yusa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+recessive+genetic+screening+in+mammalian+cells+with+a+lentiviral+CRISPR-guide+RNA+library.">Genome-wide recessive genetic screening in mammalian cells with a lentiviral CRISPR-guide RNA library.</a> Nature Biotechnology. 32 (3), 267-273 (2014).</li><li>Shalem, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+CRISPR-Cas9+knockout+screening+in+human+cells.">Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells.</a> Science. 343 (6166), 84-87 (2014).</li><li>Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+screens+in+human+cells+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system.</a> Science. 343 (6166), 80-84 (2014).</li><li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+sgRNAs+facilitate+CRISPR/Cas9-mediated+mouse+genome+targeting.">Dual sgRNAs facilitate CRISPR/Cas9-mediated mouse genome targeting.</a> The FEBS Journal. 281 (7), 1717-1725 (2014).</li><li>Sanjana, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+interrogation+of+functional+elements+in+the+noncoding+genome.">High-resolution interrogation of functional elements in the noncoding genome.</a> Science. 353 (6307), 1545-1549 (2016).</li><li>Rajagopal, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+mapping+of+regulatory+DNA.">High-throughput mapping of regulatory DNA.</a> Nature Biotechnology. 34 (2), 167-174 (2016).</li><li>Korkmaz, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genetic+screens+for+enhancer+elements+in+the+human+genome+using+CRISPR-Cas9.">Functional genetic screens for enhancer elements in the human genome using CRISPR-Cas9.</a> Nature Biotechnology. 34 (2), 192-198 (2016).</li><li>Rezaei, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FMS-Like+Tyrosine+Kinase+3+(FLT3)+and+Nucleophosmin+1+(NPM1)+in+Iranian+Adult+Acute+Myeloid+Leukemia+Patients+with+Normal+Karyotypes:+Mutation+Status+and+Clinical+and+Laboratory+Characteristics.">FMS-Like Tyrosine Kinase 3 (FLT3) and Nucleophosmin 1 (NPM1) in Iranian Adult Acute Myeloid Leukemia Patients with Normal Karyotypes: Mutation Status and Clinical and Laboratory Characteristics.</a> Turkish Journal of Haematology. 34 (4), 300-306 (2017).</li><li>Yaragatti, M., Basilico, C., Dailey, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+active+transcriptional+regulatory+modules+by+the+functional+assay+of+DNA+from+nucleosome-free+regions.">Identification of active transcriptional regulatory modules by the functional assay of DNA from nucleosome-free regions.</a> Genome Research. 18 (6), 930-938 (2008).</li><li>Wilken, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNase+I+hypersensitivity+analysis+of+the+mouse+brain+and+retina+identifies+region-specific+regulatory+elements.">DNase I hypersensitivity analysis of the mouse brain and retina identifies region-specific regulatory elements.</a> Epigenetics Chromatin. 8, 8 (2015).</li><li>Narlikar, L., Ovcharenko, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+regulatory+elements+in+eukaryotic+genomes.">Identifying regulatory elements in eukaryotic genomes.</a> Briefings in Functional Genomics and Proteomics. 8 (4), 215-230 (2009).</li><li>Hnisz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+proto-oncogenes+by+disruption+of+chromosome+neighborhoods.">Activation of proto-oncogenes by disruption of chromosome neighborhoods.</a> Science. 351 (6280), 1454-1458 (2016).</li></ol>

蛋白質コーディングの遺伝子は、遺伝子と sgRNA 濃縮24,25,26 を通じて特定の細胞機能を調節するネットワークを識別するための機能的スクリーニング システム sgRNA ライブラリを適用されている関連、27,28。いくつかの非コーディングの地域関連 sgRNA ライブラリは、また?...

最近のゲノムの相互作用の研究では、細胞の種類と種の間で保存されているトポロジとして関連付けるドメイン (TADs) を人間の核ゲノム フォームに安定を明らかにしました。ゲノムの組織を別ドメインは容易、規制要素 (例えば、エンハンサーやプロモーター) 間の相互作用を制限します。CCCTC 結合因子 (CTCF) 少しの境界に、近隣 TADs1である DNA 要素の制約の相互作用に重要な役割を果たしています。ただし、ゲノム広い CTCF のデータ バインディングは、CTCF とほとんど同じ DNA サイトを異なる種類の細胞でやり取りが多くの場合として機能する他の示唆ではなく 1 つのセル型で特定のサイトでのクロマチン障壁を明らかにしたその CTCF 関数クロマチンの境界2の形成の他の活動。かどうか境界要素 (CTCF 結合部位) に直結する、CTCF の生物学的機能と、これらのリンクが発生する方法は不明のまま。したがって、我々 はゲノムの特定の CTCF 結合サイトは直接 TADs の形成を調節して制御プロモーター/エンハンサー相互作用ドメイン内または隣接ドメイン間と仮定します。人間とマウスのゲノム プロジェクト以降のエピジェネティクス解析の完了は、ゲノムの分子および遺伝の新しい署名を発見されています。しかし、遺伝子細胞の機能とその分子機構、特定の署名/変更の役割はまだ完全に理解するのにあります。
証拠の複数のラインをサポート CTCF を介した TADs はクロマチン機能ドメイン3,4,5を表します。CTCF とほとんど同じ DNA サイトを異なる種類の細胞でやり取り、ゲノム広い CTCF チップ seq データが判明 CTCF しばしば他の2ではなく 1 つのセル型でクロマチン バリアとして機能しています。CTCF はゲノム組織4,6,7を仲介することにより開発時に重要な役割を果たしています。CTCF 境界の中断障害エンハンサー/プロモーターの相互作用および遺伝子発現、発達的閉塞に 。TADs を CTCF に関与が示唆された構造のコンポーネントだけでなく、適切なエンハンサー アクションと遺伝子転写5,8,9に必要な規制の単位が。
HOX遺伝子は萌芽期の開発の間に重要な役割を果たす、彼らが時間的、空間的制限されてその発現パターン。HOXA軌跡 hESCs と IMR90 セル1の CTCF 関連付けられた境界要素で前部と後部の遺伝子を分離する 2 つの安定した TADs を形成します。最近のレポートは示したHoxBlinc、 HoxB軌跡関連付けられている lncRNA が CTCF の形成を仲介する TADs およびHOXB軌跡のプロモーター/エンハンサー相互作用を監督します。これは ESC のコミットメントと分化の10の間に前部HOXB遺伝子の活性化に します。さらに、 HOXAの軌跡を含む特定の遺伝子座、CTCF の変質は少しドメイン変更系統特異的遺伝子発現プロファイルを介したし、疾患状態11,12の開発に関連付けられていた。証拠は、遺伝子転写の調整と機能ドメインにゲノムを組織することによって細胞のアイデンティティを決定する CTCF の主な機能をサポートします。
HOX遺伝子は, 造血巣の中に萌芽期の開発に於いての役割にもかかわらず造血幹・前駆細胞 (HS/PC) の機能を調節します。これは、増殖・分化10,13,14,15の間のバランスを制御することによって行われます。HOX遺伝子の発現が仕様と HS の最高の表現で、造血細胞の分化の中で堅く調整される pc HOX遺伝子発現は徐々 にその最も低いレベルの成熟に伴う減少/造血細胞16を区別で発生しています。HOX遺伝子の調節不全は、HS/pc 白血病変換17,18につながる dysregulating の自己複製と分化プロパティによる白血病変換の支配的なメカニズムです。ただし、確立と関連規制の網と同様、 HOX遺伝子の発癌性発現パターンと通常を維持のメカニズムは不明のまま。
CRISPR Cas9 sgRNA ライブラリ スクリーニングは、lncRNA20 miRNA21種なども、非コーディングの遺伝子と蛋白質のコーディングの遺伝子19を尋問する広く使用されています。ただし、新しいゲノム標的を識別する CRISPR Cas9 sgRNA ライブラリを使用するためのコストは、高スループット ゲノム sgRNA ライブラリ スクリーニングに応用する頻繁ので高、まま。スクリーニング システム私たちの sgRNA は特定ゲノム遺伝子に焦点を当てたし、 HOXA9などのマーカー遺伝子の発現によるとワンステップ RT-PCR をターゲット sgRNAs を評価します。さらに、サイトをターゲット sgRNA を識別するためにサンガー シーケンス確認、sgRNA はゲノムと塩基変異に統合されたことを検出できます。軌跡固有 CRISPR Cas9 の遺伝学的スクリーニングを通じて CBS7/9 クロマチン境界は発癌性クロマチン ドメインを確立し、急性骨髄性白血病の病因における異所性のHOX遺伝子の発現パターンを維持するための重要な調節因子として同定されています。12. メソッドは、将来のエピジェネティック療法の潜在的な治療上のターゲットとして CTCF 萌芽期の開発、造血、白血病がまた CTCF 境界の境界だけでなく特定の機能を識別するために広く適用できます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:689px;" width="689">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Lipofectamine 3000 reagent</td>
			<td style="width:155px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">L3000-008</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Proteinase K</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25530049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Puromycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1113802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stbl3 cells&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>&#160;C737303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEK293T</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MOLM-13</td>
			<td>DSMZ</td>
			<td>ACC 554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">lentiCRISPRv2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>52961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">psPAX2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pGEM&#174;-T Easy Vector Systems&#160;</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A137A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T4 ligase&#160;</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>&#160;M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAquick Gel Extract kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAuick PCR purification kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SingleShot&#8482; SYBR&#174;&#160;Green One-Step Kit</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1725095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">QIAGEN Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td style="width:100px;">12163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">&#160;11965084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI 1640&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal bovine serum (FBS)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">10-082-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin/streptomycin/L-glutamine&#160;</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:100px;">10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lenti-X Concentrator&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Clontech</td>
			<td style="width:100px;">631232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Trypan Blue Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Polybrene</td>
			<td style="width:155px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-134220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Genessee Scientific</td>
			<td>&#160;25-507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">TAE buffer&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>FERB49</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Surveyor&#174; Mutation Detection Kits</td>
			<td style="width:155px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:100px;">706020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Biorad Universal Hood II Gel Doc System</td>
			<td style="width:155px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:100px;">170-8126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Centrifuge 5424 R</td>
			<td style="width:155px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:100px;">5404000138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Digital Dry Baths/Block Heaters</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">88870002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">TSX Series Ultra-Low Freezers</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">TSX40086V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Forma&#8482; Steri-Cult&#8482; CO2&#160;Incubators</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">3308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Herasafe&#8482; KS, Class II Biological Safety Cabinet</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">51022484</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Sorvall&#8482; Legend&#8482; XT/XF Centrifuge Series</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">75004506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Fisherbrand&#8482;&#160;Isotemp&#8482; Water Baths</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">FSGPD02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:263px;">Thermo Scientific&#8482;&#160;Locator&#8482; Plus Rack and Box Systems</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">13-762-353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System</td>
			<td style="width:155px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:100px;">1855195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">MiniAmp&#8482; Thermal Cycler</td>
			<td style="width:155px;">Applied Biosystems technology</td>
			<td style="width:100px;">A37834</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:263px;">Thermo Scientific&#8482;&#160;Owl&#8482; EC300XL2 Compact Power Supply</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">7217581</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:263px;">Thermo Scientific&#8482;&#160;Owl&#8482; EasyCast&#8482; B1 Mini Gel Electrophoresis Systems</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">09-528-178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">VWR&#174; Tube Rotator and Rotisseries</td>
			<td style="width:155px;">VWR International</td>
			<td style="width:100px;">10136-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">VWR&#174; Incubating Mini Shaker</td>
			<td style="width:155px;">VWR International</td>
			<td style="width:100px;">12620-942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Analytical Balance MS104TS/00</td>
			<td style="width:155px;">METTLER TOLEDO</td>
			<td style="width:100px;">30133522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">DS-11 FX and DS-11 FX+ Spectrophotometer</td>
			<td style="width:155px;">DeNovix Inc.</td>
			<td style="width:100px;">DS-11 FX</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hox loci focused crispr/sgrna library screening identifying critical ctcf boundaries

CCCTC 結合因子 (CTCF)-仲介された安定した位相ドメインを関連付ける (TADs) 近隣 TADs のある DNA 要素の制約の相互作用で重要な役割を果たします。CTCF は、胚や体のパターン形成、造血、白血病を制御するHOX遺伝子発現の時空の調節に重要な役割を果たしています。しかし、それはHOX遺伝子の関連付けられている CTCF 境界クロマチン構造およびHOXの遺伝子発現を調節する方法かどうか、主として未知に残る。現在のプロトコルで少し形成とHOX遺伝子のクロマチンの CTCF 関連付けられた境界を中断することの効果を検討するHOXA/B/C/D座すべて CTCF 結合部位をターゲット特定 sgRNA プールされたライブラリが生成されました。式です。CRISPR Cas9 を介して遺伝学的スクリーニング、 HOXA7/HOXA9遺伝子 (CBS7/9) の間にある CTCF 結合部位は、 HOX遺伝子の異所性の維持のために重要であることと同様、発癌性クロマチン ドメインの重要な調節因子として同定されています。MLL 再配置の急性骨髄性白血病 (AML) の発現パターン。したがって、スクリーニングのアプローチこの sgRNA ライブラリの特定遺伝子座における媒介 CTCF ゲノム構成に新しい洞察力を提供し、また両方のコーディング、注釈付きの遺伝的規制要素の機能特性の基礎を提供し、ポスト人間ゲノム プロジェクト時代の正常な生物学的プロセスの間に、非翻訳。

CRISPR Cas9 技術機能ゲノム研究のための強力な研究ツールです。編集技術従来の遺伝子の交換は急速に、ゲノム全体と個々 の遺伝子に焦点を当てたアプリケーションの高いユーティリティです。ここでは、最初個別に複製された軌跡固有 CRISPR 配列 Cas9 sgRNA ライブラリに含まれる sgRNAs 303 ランダム ターゲット遺伝子、60 のポジティブ コントロール、500 の非人間ターゲ?...

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HOX Loci Focused CRISPR/sgRNA Library Screening Identifying Critical CTCF Boundaries

CRISPR/sgRNA ライブラリは、蛋白質コーディングの遺伝子を尋問に適用されています。ただし、CTCF 境界の遺伝子発現制御の機能を明らかにするための sgRNA ライブラリの可能性は未踏のままになります。ここでは、 HOX遺伝子座の CTCF 境界の働きを解明するHOX遺伝子特定 sgRNA ライブラリをについて説明します。

HOX軌跡 Focused CRISPR/sgRNA ライブラリ スクリーニングを識別する重要な CTCF の境界

CCCTC-binding factor (CTCF)-mediated stable topologically associating domains (TADs) play a critical role in constraining interactions of DNA elements ...

ライブラリースクリーニングと呼ばれる当社のプールsgRNAは、ゲノム全体の非コード要素の生物学的機能を同定し、評価するための強力な遺伝的アプローチです。この技術により、関連する結合部位、色彩境界、または他の調節要素が標的遺伝子発現に及ぼす影響を調べることができます。我々のアプローチは、CTCF、長い非コードRNAおよびエンハンサーの役割を同定するために使用することができ、初期胚発生におけるHOX遺伝子調節におけるならびに異常なHOX遺伝子シグネチャを有する特定の白血病である。CTCF結合部位を標的とするsgRNAの設計からこの手順を開始する。テキストプロトコルに記載されているように細胞調製におけるsgRNAライブラリーのクローニング。レンチウイルスをパッケージ化するために、コトランスフェクトHEK293 T細胞は、精製されたライブラリーベクター20マイクログラム、パッケージ化されたプラスミドの15マイクログラム、およびエンベローププラスミドの10マイクログラムを含み、ウイルスを収穫する前に48時間培養した。48時間後、ウイルス上清を収集し、0.45ミクロンの低タンパク質結合PVDF膜を介してそれをフィルタリングします。次に、レンチウイルス上清を濃縮器を用いて50倍に濃縮する。濃縮ウイルスをアリコートし、マイナス80度の冷凍庫に保存します。12ウェルプレートの別々のウェルで作業し、MOLM13細胞と濃縮レンチウイルスの様々な用量を6つの合計グループに混合します。これらの混合物を摂氏33度で2時間1000倍にして直ちに遠心する。12のウェルプレートを摂氏37度でインキュベーターに戻し、5%の二酸化炭素を4時間移します。細胞パレットを乱さずに上清を優しく吸引し、新鮮な補充RPMI 1640培地でトランスデューセド細胞を再中断する。その後、再懸濁した細胞をT25フラスコに移し、ピューロマイシンなしで48時間摂氏37度でインキュベートする。48時間後にこれらの細胞を2つのフラスコに分割した後、5日間1ミリリットルのピューロマイシンで1マイクロリットルで処理した実験群と、5日間のピューロマイシン処理を行わない対照群を用いた。プロマイシン処理を行った生細胞数を、ピューロマイシン処理のない細胞数で割って、トランスダクションに対する最適化されたMOI値を測定します。プールされたライブラリーを使用して細胞をトランスデュースするには、培地中のsgRNAプールレンチウイルスの0.3 MOIで6ウェルプレートに150万MOLM13細胞を感染させる。レンチウイルス感染のない細胞をコントロールとして使用してください。すぐに6つのウェルプレートを1000倍gで33°Cで2時間遠心分離し、細胞をスプステッとして感染させる。その後、プレートを5%の二酸化炭素で摂氏37度でインキュベーターに4時間戻します。細胞パレットを乱さずに優しく上清を吸引し、新鮮な培地でトランスデューセを再中断する。その後、細胞をT25フラスコに移し、ピューロマイシンなしで48時間摂氏37度でインキュベートする。48時間後、5日間、1ミリリットルのピューロマイシン当たり1マイクログラムで細胞を処理します。2日後に新鮮な培地と交換し、最適な細胞密度を維持します。希釈法を制限して、単一クローンを96ウェルプレートにシードします。これらの単一クローンを摂氏37度と5%の二酸化炭素でインキュベートする。3-4週間培養します。0.4%トリパンブルー溶液染色でSGRNA統合MOLM13細胞を数え、その後、96ウェルPCRプレートにウェルあたり10,000個の生きた細胞を移します。プレートを1000回gで5分間遠心し、ピペットで上清を十分に取り除いて捨てます。セルパレットを乱さないようにします。テキストに記載されているように細胞を洗浄した後、各ウェルに細胞ライシスマスターミックスの50マイクロリットルを追加します。ピペットを上下に5回、セルパレットを再中断します。ミックスを室温で10分間インキュベートします。その後、混合物を摂氏37度に5分間、さらに5分間摂氏75度に移します。次に、RT qPCR反応ミックスを含むPCRウェルに細胞ライセートの1マイクロリットルを加えます。このミックスには、前方および逆プライマー、逆転写酵素およびワンステップ反応ミックスのマーカー遺伝子が含まれる。逆転写反応を摂氏50度で10分間実行し、続いて重合活性化を行い、95°Cで1分間DNA変性を行います。テキストプロトコルで詳述されているようにPCR反応の40サイクルでRT PCRを実行します。テキストプロトコルに記載されているように、サンガーシーケンシングを通じてHOXA9の発現クローンの減少を確認し、MOLM13ゲノムDNAを用いてPCRを行います。PCR精製キットで PCR 製品を抽出し、精製します。精製PCR産物をT4ライゲーションバッファー、TベクターDNA、PCR DNAおよびT4リガーゼを用いてTベクターにリゲートします。ライゲーションミックスを一晩摂氏16度のインキュベーターに入れます。ライゲーションミックスをDH5アルファのコンピテントセルに移し、LBアンピシリン抗生物質寒天板にプレートを入れ替えます。プレートを摂氏37度で一晩インキュベートします。LBプレートから単一のクローンを選び、ジェノタイピングとサンガーシーケンシングで検証します。200ナノグラムのリファレンスを持つヘテロデュプレックス混合物群を、0.2ミリリットルPCRチューブに200ナノグラムのPCRアンプリコンをテストします。400ナノグラムの参照PCRアンプリコンのみをコントロールとして含むホモデュプレックス混合基を含める。別に800ミリリットルの水で満たされた1リットルのビーカーで摂氏95度でヘテロデュプレックスとホモデュプレックス混合物を5分間インキュベートします。次いで、混合物を徐々に室温まで冷却してアニールし、ヘテロデュプレックスまたはホモデュプレックスを形成する。さて、アニールヘテロデュプレックスとホモデュプレックス混合物の400ナノグラムをインデル変異検出ヌクレアーゼの1マイクロリットル、60分間摂氏42度で2マイクロリットルのヌクレアーゼ反応バッファーを別々に消化する。消化されたサンプルをアガロースゲル電気泳動で分析します。ヘテロデュプレックス混合物DNAは小さな断片に切断されるべきであり、ホモデュプレックスDNAは切断されるべきではない。MOLM13陽性クローンを標的とするsgRNAは、コントロール細胞との比較を用いたHOXA9遺伝子の発現レベルに基づいて、RT qPCR法で確認された。スクリーニングされた528の生き残ったクローンのうち、10クローンはHOXA9レベルで50%以上の減少を示した。HOXA9に統合されたsgRNAは、クローンを変更せずにHOXA9を増加させたが、さらにサンガー配列によるsgRNAのPCR増幅および同定によって確認された。HOXA9レベルの減少を示す10クローンのうち6個は、サンガーシーケンシングによって決定されるように、CBS79サイトを標的とするsgRNAを含んでいた。統合sgRNA陽性クローンのインデル突然変異は、PCRベースのジェノタイピングおよびヌクレアーゼ消化によって決定された。HOXA7とHOXA9遺伝子の間に位置するCTCF部位のヘテロ接合性欠失を、PCRベースの遺伝子型生成によって同定した。HOXA9減少クローン5、6、28および121は、CBS79境界位置に欠失を示した。同様の結果は、ヌクレアーゼ消化アッセイによって分析されたCBS79部位のインデル突然変異について観察された。この手順を実行する場合、ヌクレアーゼ消化アッセイを通じてsgRNA誘発インデル突然変異を検出するために、同量のヘテロ二重鎖とホモデュプレックスを等量にすることが重要です。我々のアプローチは、選択したマーカーの利用を可能にし、標的遺伝子に対する次世代シーケンシングを行い、白血病発生に対する遺伝子の影響を発見する。全体的に我々のアプローチは、正常な生物学的プロセス中の機能的正しい、および指摘された遺伝的不規則元素の減少と死後のゲノムプロジェクトエラーにおける白血病を防ぐ。

Research

JoVE Journal

Genetics

HOX Loci Focused CRISPR/sgRNA Library Screening Identifying Critical CTCF Boundaries

A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source

大規模な gRNA ライブラリ生産 DNA の任意のソースからの普遍的なプロトコル

The popularity of the CRISPR/Cas9 system for both genome and epigenome engineering stems from its simplicity and adaptability. An effector (the Cas9 ...

G2-seq: A High Throughput Sequencing-based Technique for Identifying Late Replicating Regions of the Genome

G2-seq: 高スループット シーケンス ベースを識別する方法後半ゲノムの領域を複製します。

Numerous techniques have been developed to follow the progress of DNA replication through the S phase of the cell cycle. Most of these techniques have ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

堅牢な DNA の隔離および標本の高スループット シーケンス ライブラリーの構築

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

ホルマリン固定パラフィン包埋 RNA 試料を用いた回顧マイクロ Rna シーケンス: 相補的な DNA ライブラリの準備のプロトコル

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of ...

Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen

超低入力ヒトゲノム単一 Tardigrade の標本からのライブラリの準備

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state ...

Bronchoalveolar Lavage Exosomes in Lipopolysaccharide-induced Septic Lung Injury

リポポリサッカライド投与による敗血症性肺損傷における気管支肺胞洗浄エクソソーム

Acute lung injury (ALI) and acute respiratory distress syndrome (ARDS) represent a heterogeneous group of lung diseases which continues to have a high ...

Mating-based Overexpression Library Screening in Yeast

酵母の過剰発現の交尾ベース ライブラリ スクリーニング

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool ...

Screening Cotton Genotypes for Reniform Nematode Resistance

レニフォーム線虫抵抗に対する綿のジェノタイプのスクリーニング

A rapid non-destructive reniform nematode (Rotylenchulus reniformis) screening protocol is needed for the development of resistant cotton (Gossypium ...

Identifying Mutations by High Resolution Melting in a TILLING Population of Rice

米の耕作集団における高解像度溶融による変異の同定

Target Induced Local Lesions In Genomes (TILLING) is a strategy of reverse genetics for the high-throughput screening of induced mutations. However, the ...

Screening and Identification of RNA Silencing Suppressors from Secreted Effectors of Plant Pathogens

植物病原体の分泌されたエフェクターからのRNAサイレンシング抑制剤のスクリーニングと同定

RNA silencing is an evolutionarily conserved, sequence-specific gene regulation mechanism in eukaryotes. Several plant pathogens have evolved proteins ...

HOX軌跡 Focused CRISPR/sgRNA ライブラリ スクリーニングを識別する重要な CTCF の境界

HOX軌跡 Focused CRISPR/sgRNA ライブラリスクリーニングを識別する重要な CTCF の境界