Name: hox loci focused crispr/sgrna library screening identifying critical ctcf boundaries
Uploaded: 2019-03-31T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about HOX Loci Focused CRISPR/sgRNA Library Screening Identifying Critical CTCF Boundaries at JoVE.com

Forfatterne takker også Nicholas Cesari for redigering manuskriptet. Arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Institute of Health (SH, R01DK110108, R01CA204044).

1. CTCF sgRNALibrary Design bruke en Online verktøyet
<ol><li>Utforme sgRNA målretting CTCF bindende områder i de menneskelige HOX loci bruke genetisk forstyrrelsene plattform (GPP) designer verktøyet (https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design).</li>
	<li>Syntetisere totalt 1070 sgRNAs bestående av sgRNAs målretting 303 tilfeldig målretting gener, 60 positiv kontroller, 500 ikke menneskelige-målretting kontroller, og 207 CTCF elementer eller lncRNA målretting gener (<st...

<ol>
	<li>Dixon, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topological+domains+in+mammalian+genomes+identified+by+analysis+of+chromatin+interactions.">Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions.</a> Nature. 485 (7398), 376-380 (2012).</li><li>Cuddapah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+the+insulator+binding+protein+CTCF+in+chromatin+barrier+regions+reveals+demarcation+of+active+and+repressive+domains.">Global analysis of the insulator binding protein CTCF in chromatin barrier regions reveals demarcation of active and repressive domains.</a> Genome research. 19 (1), 24-32 (2009).</li><li>Phillips, J. E., Corces, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF:+master+weaver+of+the+genome.">CTCF: master weaver of the genome.</a> Cell. 137 (7), 1194-1211 (2009).</li><li>Tang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF-Mediated+Human+3D+Genome+Architecture+Reveals+Chromatin+Topology+for+Transcription.">CTCF-Mediated Human 3D Genome Architecture Reveals Chromatin Topology for Transcription.</a> Cell. 163 (7), 1611-1627 (2015).</li><li>Lupianez, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruptions+of+topological+chromatin+domains+cause+pathogenic+rewiring+of+gene-enhancer+interactions.">Disruptions of topological chromatin domains cause pathogenic rewiring of gene-enhancer interactions.</a> Cell. 161 (5), 1012-1025 (2015).</li><li>Dowen, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+cell+identity+genes+occurs+in+insulated+neighborhoods+in+mammalian+chromosomes.">Control of cell identity genes occurs in insulated neighborhoods in mammalian chromosomes.</a> Cell. 159 (2), 374-387 (2014).</li><li>Phillips-Cremins, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architectural+protein+subclasses+shape+3D+organization+of+genomes+during+lineage+commitment.">Architectural protein subclasses shape 3D organization of genomes during lineage commitment.</a> Cell. 153 (6), 1281-1295 (2013).</li><li>Narendra, V., Bulajic, M., Dekker, J., Mazzoni, E. O., Reinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF-mediated+topological+boundaries+during+development+foster+appropriate+gene+regulation.">CTCF-mediated topological boundaries during development foster appropriate gene regulation.</a> Genes &amp; Development. 30 (24), 2657-2662 (2016).</li><li>Narendra, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF+establishes+discrete+functional+chromatin+domains+at+the+Hox+clusters+during+differentiation.">CTCF establishes discrete functional chromatin domains at the Hox clusters during differentiation.</a> Science. 347 (6225), 1017-1021 (2015).</li><li>Deng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HoxBlinc+RNA+Recruits+Set1/MLL+Complexes+to+Activate+Hox+Gene+Expression+Patterns+and+Mesoderm+Lineage+Development.">HoxBlinc RNA Recruits Set1/MLL Complexes to Activate Hox Gene Expression Patterns and Mesoderm Lineage Development.</a> Cell Reports. 14 (1), 103-114 (2016).</li><li>Patel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberrant+TAL1+activation+is+mediated+by+an+interchromosomal+interaction+in+human+T-cell+acute+lymphoblastic+leukemia.">Aberrant TAL1 activation is mediated by an interchromosomal interaction in human T-cell acute lymphoblastic leukemia.</a> Leukemia. 28 (2), 349-361 (2014).</li><li>Luo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF+boundary+remodels+chromatin+domain+and+drives+aberrant+HOX+gene+transcription+in+acute+myeloid+leukemia.">CTCF boundary remodels chromatin domain and drives aberrant HOX gene transcription in acute myeloid leukemia.</a> Blood. 132 (8), 837-848 (2018).</li><li>Dou, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medial+HOXA+genes+demarcate+haematopoietic+stem+cell+fate+during+human+development.">Medial HOXA genes demarcate haematopoietic stem cell fate during human development.</a> Nature Cell Biology. 18 (6), 595-606 (2016).</li><li>Lawrence, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+expression+of+the+Hoxa-9+homeobox+gene+impairs+the+proliferation+and+repopulating+ability+of+hematopoietic+stem+cells.">Loss of expression of the Hoxa-9 homeobox gene impairs the proliferation and repopulating ability of hematopoietic stem cells.</a> Blood. 106 (12), 3988-3994 (2005).</li><li>Deng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=USF1+and+hSET1A+mediated+epigenetic+modifications+regulate+lineage+differentiation+and+HoxB4+transcription.">USF1 and hSET1A mediated epigenetic modifications regulate lineage differentiation and HoxB4 transcription.</a> PLOS Genetics. 9 (6), e1003524 (2013).</li><li>Rawat, V. P., Humphries, R. K., Buske, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+Hox:+the+role+of+ParaHox+genes+in+normal+and+malignant+hematopoiesis.">Beyond Hox: the role of ParaHox genes in normal and malignant hematopoiesis.</a> Blood. 120 (3), 519-527 (2012).</li><li>Alharbi, R. A., Pettengell, R., Pandha, H. S., Morgan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+HOX+genes+in+normal+hematopoiesis+and+acute+leukemia.">The role of HOX genes in normal hematopoiesis and acute leukemia.</a> Leukemia. 27 (5), 1000-1008 (2013).</li><li>Rice, K. L., Licht, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HOX+deregulation+in+acute+myeloid+leukemia.">HOX deregulation in acute myeloid leukemia.</a> Journal of Clinical Investigation. 117 (4), 865-868 (2007).</li><li>Bassett, A. R., Kong, L., Liu, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+CRISPR+library+for+high-throughput+genetic+screening+in+Drosophila+cells.">A genome-wide CRISPR library for high-throughput genetic screening in Drosophila cells.</a> Journal of Genetics and Genomics. 42 (6), 301-309 (2015).</li><li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+deletion+screening+of+human+long+non-coding+RNAs+using+a+paired-guide+RNA+CRISPR-Cas9+library.">Genome-scale deletion screening of human long non-coding RNAs using a paired-guide RNA CRISPR-Cas9 library.</a> Nature Biotechnology. 34 (12), 1279-1286 (2016).</li><li>Kurata, J. S., Lin, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-focused+CRISPR-Cas9+library+screen+reveals+fitness-associated+miRNAs.">MicroRNA-focused CRISPR-Cas9 library screen reveals fitness-associated miRNAs.</a> RNA. 24 (7), 966-981 (2018).</li><li>Collins, C. T., Hess, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+HOXA9+in+leukemia:+dysregulation,+cofactors+and+essential+targets.">Role of HOXA9 in leukemia: dysregulation, cofactors and essential targets.</a> Oncogene. 35 (9), 1090-1098 (2016).</li><li>Kroon, E., Thorsteinsdottir, U., Mayotte, N., Nakamura, T., Sauvageau, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NUP98-HOXA9+expression+in+hemopoietic+stem+cells+induces+chronic+and+acute+myeloid+leukemias+in+mice.">NUP98-HOXA9 expression in hemopoietic stem cells induces chronic and acute myeloid leukemias in mice.</a> The EMBO Journal. 20 (3), 350-361 (2001).</li><li>Koike-Yusa, H., Li, Y., Tan, E. P., Velasco-Herrera Mdel, C., Yusa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+recessive+genetic+screening+in+mammalian+cells+with+a+lentiviral+CRISPR-guide+RNA+library.">Genome-wide recessive genetic screening in mammalian cells with a lentiviral CRISPR-guide RNA library.</a> Nature Biotechnology. 32 (3), 267-273 (2014).</li><li>Shalem, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+CRISPR-Cas9+knockout+screening+in+human+cells.">Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells.</a> Science. 343 (6166), 84-87 (2014).</li><li>Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+screens+in+human+cells+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system.</a> Science. 343 (6166), 80-84 (2014).</li><li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+sgRNAs+facilitate+CRISPR/Cas9-mediated+mouse+genome+targeting.">Dual sgRNAs facilitate CRISPR/Cas9-mediated mouse genome targeting.</a> The FEBS Journal. 281 (7), 1717-1725 (2014).</li><li>Sanjana, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+interrogation+of+functional+elements+in+the+noncoding+genome.">High-resolution interrogation of functional elements in the noncoding genome.</a> Science. 353 (6307), 1545-1549 (2016).</li><li>Rajagopal, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+mapping+of+regulatory+DNA.">High-throughput mapping of regulatory DNA.</a> Nature Biotechnology. 34 (2), 167-174 (2016).</li><li>Korkmaz, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genetic+screens+for+enhancer+elements+in+the+human+genome+using+CRISPR-Cas9.">Functional genetic screens for enhancer elements in the human genome using CRISPR-Cas9.</a> Nature Biotechnology. 34 (2), 192-198 (2016).</li><li>Rezaei, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FMS-Like+Tyrosine+Kinase+3+(FLT3)+and+Nucleophosmin+1+(NPM1)+in+Iranian+Adult+Acute+Myeloid+Leukemia+Patients+with+Normal+Karyotypes:+Mutation+Status+and+Clinical+and+Laboratory+Characteristics.">FMS-Like Tyrosine Kinase 3 (FLT3) and Nucleophosmin 1 (NPM1) in Iranian Adult Acute Myeloid Leukemia Patients with Normal Karyotypes: Mutation Status and Clinical and Laboratory Characteristics.</a> Turkish Journal of Haematology. 34 (4), 300-306 (2017).</li><li>Yaragatti, M., Basilico, C., Dailey, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+active+transcriptional+regulatory+modules+by+the+functional+assay+of+DNA+from+nucleosome-free+regions.">Identification of active transcriptional regulatory modules by the functional assay of DNA from nucleosome-free regions.</a> Genome Research. 18 (6), 930-938 (2008).</li><li>Wilken, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNase+I+hypersensitivity+analysis+of+the+mouse+brain+and+retina+identifies+region-specific+regulatory+elements.">DNase I hypersensitivity analysis of the mouse brain and retina identifies region-specific regulatory elements.</a> Epigenetics Chromatin. 8, 8 (2015).</li><li>Narlikar, L., Ovcharenko, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+regulatory+elements+in+eukaryotic+genomes.">Identifying regulatory elements in eukaryotic genomes.</a> Briefings in Functional Genomics and Proteomics. 8 (4), 215-230 (2009).</li><li>Hnisz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+proto-oncogenes+by+disruption+of+chromosome+neighborhoods.">Activation of proto-oncogenes by disruption of chromosome neighborhoods.</a> Science. 351 (6280), 1454-1458 (2016).</li></ol>

Protein-koding genet relatert sgRNA biblioteker er brukt i en funksjonell screening system å identifisere gener og nettverk regulere bestemte cellulære funksjoner gjennom sgRNA berikelse24,25,26 ,27,28. Flere ikke-koding regionen relatert sgRNA biblioteker ble også vist i genet-spesifikke funksjonelle skjermer for distale og proksimale regulere elementer, ...

Genomet samhandling studier viste at skjemaene menneskelige kjernefysiske genom stabil topologisk knytte domener (var TADs) som er bevart i celletyper og arter. Organisasjonen i genomet i separate domener forenkler og begrenser interaksjoner mellom regulatoriske elementer (f.eks enhancers og arrangører). CCCTC-binding faktoren (CTCF) binder til TAD grenser og spiller en avgjørende rolle i egenskapen interaksjoner DNA elementer som finnes i nabolandet var TADs1. Men genom bredt CTCF binding data avslørte at selv om CTCF mest samhandler med samme DNA-områder i ulike celletyper, det ofte fungerer som en chromatin barriere på et bestemt sted i en celle, men ikke i den andre, antyder at CTCF funksjoner sammen med andre aktiviteter i dannelsen av chromatin grenser2. Hva er ukjent er om grensen elementene (CTCF-bindende områder) er direkte knyttet til biologiske funksjonen til CTCF, og hvordan disse koblingene oppstår. Derfor hypothesize vi at bestemte CTCF bindende områder i genomet direkte regulerer dannelsen av var TADs og kontroll promoter/enhancer interaksjoner i disse domenene eller mellom nærliggende domener. Ferdigstillelse av menneskelige og mus genomet sekvensering prosjekter og påfølgende epigenetic analyser har avdekket ny molekylære og genetiske signaturer i genomet. Men rollen signaturer/endringer i genet regulering og cellulære funksjoner, samt deres molekylær mechanism(s), har ennå å bli fullt ut forstått.
Flere linjer med bevis støtter at de CTCF-mediert var TADs representerer funksjonelle chromatin domener3,4,5. Selv om CTCF mest samhandler med samme DNA-områder i ulike celletyper, avdekket genomet bredt CTCF ChIP-seq data at CTCF ofte fungerer som en barriere for chromatin i én celle, men ikke i de andre2. CTCF spiller en viktig rolle under utviklingen av formidling genomet organisasjon4,6,7. Avbrudd i CTCF grenser nedsatt enhancer/arrangøren interaksjoner og genuttrykk, fører til utviklingsmessige blokkering. Dette tyder på at CTCF mediert var TADs ikke bare strukturelle komponenter, men også regulatoriske enheter kreves for riktig enhancer handling og gene transkripsjon5,8,9.
HOX genene spiller avgjørende roller under embryonale utviklingen og de er timelig og romlig begrenset i deres uttrykk mønstre. HOXA locus danner to stabil var TADs skille fremre og bakre gener av et CTCF-assosiert grensen element i både hESCs og IMR90 celler1. Nye rapporter har vist at HoxBlinc, en HoxB locus forbundet lncRNA, formidler dannelsen av CTCF var TADs og enhancer/Promotoren samhandling i HOXB locus. Dette fører til fremre HOXB gene aktivisering under ESC engasjement og differensiering10. Videre på bestemte genet loci inkludert HOXA locus, endring av CTCF mediert TAD domener endret avstamning bestemte genet uttrykket profiler og ble knyttet til utviklingen av sykdom stater11,12. Bevisene støtter en primær funksjon for CTCF i koordinering genet transkripsjon og bestemme cellen identitet ved å organisere genomet i funksjonelle domener.
Til tross for sin rolle i embryonale utviklingen, i hematopoiesis, regulere HOX gener blodkreft stilk og stamfar celle (HS/PC)-funksjonen. Dette gjøres ved å kontrollere balansen mellom spredning og differensiering10,13,14,15. Uttrykket av HOX gener er strengt regulert hele spesifikasjon og differensiering av blodkreft cellene, med høyeste uttrykk i HS / PCer HOX genuttrykk gradvis synker under modning, med sitt laveste nivå forekommer i differensiert blodkreft cellene16. HOX gene feilregulering er en dominerende mekanisme leukemic transformasjon av dysregulating selvtillit fornyelse og atskilling egenskaper HS/stk fører til leukemic transformasjon17,18. Mekanismen for å etablere og opprettholde normale vs kreftfremkallende uttrykk mønstre av HOX gener samt tilhørende forskrifter nettverk er imidlertid uklart.
CRISPR-Cas9 sgRNA bibliotek screening har vært mye brukt til å lage protein-koding gener19 som vel som ikke-koding gener, som lncRNA20 og miRNA21 i forskjellige arter. Imidlertid er kostnaden bruke CRISPR-Cas9 sgRNA biblioteket til å identifisere nye genomisk mål fortsatt høy, fordi høy gjennomstrømming genomet sekvensering er ofte brukt for å kontrollere sgRNA biblioteket screening. Våre sgRNA screening systemet er fokusert på spesifikke genomet loci og evaluerer den målretting sgRNAs gjennom ettrinns RT PCR etter merketråden genet uttrykk, for eksempel HOXA9. I tillegg kan Sanger sekvensering bekreftet at sgRNA ble integrert i genom og Indel mutasjoner oppdages for å identifisere sgRNA målretting området. Gjennom loci-spesifikke CRISPR-Cas9 genetisk screening, har CBS7/9 chromatin grensen blitt identifisert som en viktig regulator for å etablere kreftfremkallende chromatin domene og opprettholde ektopisk HOX gene expression mønstre i AML patogenesen 12. metoden kan bli mye brukt for å identifisere ikke bare bestemt funksjon av CTCF grensen i embryonale utviklingen, hematopoiesis, leukemogenesis, men også CTCF grensen som potensielle terapeutiske mål for fremtidige epigenetic terapi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:689px;" width="689">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Lipofectamine 3000 reagent</td>
			<td style="width:155px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">L3000-008</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Proteinase K</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25530049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Puromycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1113802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stbl3 cells&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>&#160;C737303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEK293T</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MOLM-13</td>
			<td>DSMZ</td>
			<td>ACC 554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">lentiCRISPRv2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>52961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">psPAX2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pGEM&#174;-T Easy Vector Systems&#160;</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A137A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T4 ligase&#160;</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>&#160;M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAquick Gel Extract kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAuick PCR purification kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SingleShot&#8482; SYBR&#174;&#160;Green One-Step Kit</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1725095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">QIAGEN Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td style="width:100px;">12163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">&#160;11965084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI 1640&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal bovine serum (FBS)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">10-082-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin/streptomycin/L-glutamine&#160;</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:100px;">10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lenti-X Concentrator&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Clontech</td>
			<td style="width:100px;">631232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Trypan Blue Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Polybrene</td>
			<td style="width:155px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-134220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Genessee Scientific</td>
			<td>&#160;25-507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">TAE buffer&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>FERB49</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Surveyor&#174; Mutation Detection Kits</td>
			<td style="width:155px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:100px;">706020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Biorad Universal Hood II Gel Doc System</td>
			<td style="width:155px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:100px;">170-8126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Centrifuge 5424 R</td>
			<td style="width:155px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:100px;">5404000138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Digital Dry Baths/Block Heaters</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">88870002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">TSX Series Ultra-Low Freezers</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">TSX40086V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Forma&#8482; Steri-Cult&#8482; CO2&#160;Incubators</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">3308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Herasafe&#8482; KS, Class II Biological Safety Cabinet</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">51022484</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Sorvall&#8482; Legend&#8482; XT/XF Centrifuge Series</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">75004506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Fisherbrand&#8482;&#160;Isotemp&#8482; Water Baths</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">FSGPD02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:263px;">Thermo Scientific&#8482;&#160;Locator&#8482; Plus Rack and Box Systems</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">13-762-353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System</td>
			<td style="width:155px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:100px;">1855195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">MiniAmp&#8482; Thermal Cycler</td>
			<td style="width:155px;">Applied Biosystems technology</td>
			<td style="width:100px;">A37834</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:263px;">Thermo Scientific&#8482;&#160;Owl&#8482; EC300XL2 Compact Power Supply</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">7217581</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:263px;">Thermo Scientific&#8482;&#160;Owl&#8482; EasyCast&#8482; B1 Mini Gel Electrophoresis Systems</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">09-528-178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">VWR&#174; Tube Rotator and Rotisseries</td>
			<td style="width:155px;">VWR International</td>
			<td style="width:100px;">10136-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">VWR&#174; Incubating Mini Shaker</td>
			<td style="width:155px;">VWR International</td>
			<td style="width:100px;">12620-942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Analytical Balance MS104TS/00</td>
			<td style="width:155px;">METTLER TOLEDO</td>
			<td style="width:100px;">30133522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">DS-11 FX and DS-11 FX+ Spectrophotometer</td>
			<td style="width:155px;">DeNovix Inc.</td>
			<td style="width:100px;">DS-11 FX</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hox loci focused crispr/sgrna library screening identifying critical ctcf boundaries

CCCTC-binding faktor (CTCF)-mediert stabil topologisk knytte domener (var TADs) spille en avgjørende rolle i egenskapen interaksjoner DNA elementer som finnes i nabolandet var TADs. CTCF spiller en viktig rolle i å regulere romlige og tidsmessige uttrykk for HOX gener som styrer embryonale utvikling, kropp mønstre, hematopoiesis og leukemogenesis. Men forblir det hovedsakelig ukjent om og hvordan HOX loci forbundet CTCF grenser regulere chromatin organisasjon og HOX genuttrykk. I gjeldende protokollen, er et bestemt sgRNA gruppert bibliotek rettet mot alle CTCF bindende områder i HOXA/B/C/D loci generert for å undersøke effektene av forstyrre CTCF-assosiert chromatin grenser på TAD dannelse og HOX gene uttrykk. Gjennom CRISPR-Cas9 har genetisk screening, CTCF binding området ligger mellom HOXA7/HOXA9 gener (CBS7/9) blitt identifisert som en viktig regulator av kreftfremkallende chromatin domene, samt å være viktig for ektopisk HOX gene uttrykket mønstre i MLL-omorganisert akutt myelogen leukemi (AML). Dermed sgRNA biblioteket screening tilnærming gir ny innsikt i CTCF mediert genomet organisasjon i bestemte genet loci og gir også en basis for funksjonell karakterisering av kommenterte genetisk regulatoriske elementene, både koding og Noncoding, under normal biologiske prosesser i post menneskelige genom prosjektet tid.

CRISPR-Cas9-teknologi er et kraftig søkeverktøy for funksjonell genomisk studier. Det er raskt å erstatte konvensjonelle genet redigering teknikker og har høy verktøy for både genomet-omfattende og personlige gen-fokuserte programmer. Her, første individuelt klonet loci-spesifikke CRISPR-Cas9-plassert sgRNA biblioteket inneholder 1070 sgRNAs bestående av sgRNAs målretting 303 tilfeldig målretting gener, 60 positiv kontroller, 500 ikke menneskelige-målretting kontroller, og 207 ...

Watch this Scientific Journal Video about HOX Loci Focused CRISPR/sgRNA Library Screening Identifying Critical CTCF Boundaries at JoVE.com

HOX Loci Focused CRISPR/sgRNA Library Screening Identifying Critical CTCF Boundaries

En CRISPR/sgRNA bibliotek er utlignet til avhør protein-koding gener. Muligheten for et sgRNA-bibliotek for å avdekke funksjonen til en CTCF grense i genet regulering imidlertid uutforsket. Her beskriver vi et HOX loci bestemte sgRNA bibliotek for å belyse funksjon CTCF grenser i HOX loci.

HOX Loci fokusert CRISPR/sgRNA biblioteket Screening identifisere kritiske CTCF grenser

CCCTC-binding factor (CTCF)-mediated stable topologically associating domains (TADs) play a critical role in constraining interactions of DNA elements ...

Vår samlede sgRNA kalt bibliotekscreening, er en kraftig genetisk tilnærming for å identifisere og evaluere den biologiske funksjonen til ikke-kodingselementene i hele genomet. Denne teknikken tillater oss å undersøke effekten av å forstyrre bindingsstedene som er forbundet, kromatiske grenser eller andre regulatoriske elementer på målrettede generuttrykk. Vår tilnærming kan brukes til å identifisere rollen som CTCF, lange ikke-koding RNA og enhancers, i HOX genregulering i tidlig embryonisk utvikling, samt visse leukemier med en avvikende HOX gensignatur.Start denne prosedyren med utformingen av en sgRNA rettet mot CTCF bindende områder. Kloning av sgRNA-biblioteket i celleforberedelse som beskrevet i tekstprotokollen. For å pakke lentiviruset, cotransfect HEK293 T celler med 20 mikrogram renset bibliotek vektorer, 15 mikrogram av pakket plasmid, og 10 mikrogram av konvolutten plasmid, i 48 timer før høsting virus.Etter 48 timer, samle viruset supernatant og filtrere den gjennom en 0,45 mikron lav-protein bindende PVDF membran. Deretter konsentrerer du lentiviral supernatant med 50 ganger, ved hjelp av konsentratoren. Aliquot konsentrerte virus og lagre dem i en minus 80 grader celsius fryser.Arbeid i separate brønner av en 12 brønnplate for å blande MOLM13-celler med ulike doser av konsentrert lentivirus for seks totale grupper. Sentrifuger umiddelbart disse blandingene ved 1000 ganger g i to timer ved 33 grader celsius. Overfør de 12 brønnplatene tilbake til inkubatoren ved 37 grader celsius og 5% karbondioksid i fire timer.Aspirer forsiktig det overnaturante uten å forstyrre cellepaletten, og re-suspendere de transduserte cellene med frisksupplert RPMI 1640 Medium. Deretter overfører de re-suspenderte cellene til T25 flasker og inkuberer ved 37 grader celsius i 48 timer uten puromycin. Etter 48 timer delte disse cellene i to flasker, en eksperimentell gruppe behandlet med en mikroliter per milliliter puromycin i fem dager, og en kontrollgruppe uten puromycinbehandling i fem dager.Mål den optimaliserte MOI-verdien for transduksjon ved å dele antall levende celler behandlet med puromycin med antall celler uten puromycinbehandling. For å transdusere cellene med det samlede biblioteket, infisere 1,5 millioner MOLM13-celler i en 6-brønnplate med 0,3 MOI sgRNA samlet lentivirus i medium. Bruk cellene uten lentivirusinfeksjon som en kontroll.Sentrifuger umiddelbart de seks brønnplatene ved 1000 ganger g i to timer ved 33 grader celsius for å spinne cellene. Deretter overfører platene tilbake til inkubatoren ved 37 grader celsius i 5% karbondioksid i fire timer. Aspirer forsiktig overnaturant uten å forstyrre cellepaletten, og re-suspendere de transduserte cellene med friskt medium.Deretter overfører cellene til T25 flasker og inkuberer ved 37 grader celsius i 48 timer uten puromycin. Etter 48 timer, behandle cellene med ett mikrogram per milliliter puromycin i fem dager. Bytt for friskt medium etter to dager og opprettholde en optimal celletetthet.Seed enkeltklone i 96 brønnplater med begrensende fortynningsmetoder. Inkuber disse enkeltklone ved 37 grader celsius og 5%karbondioksid. Kultur dem i 3-4 uker.Tell sgRNA integrerte MOLM13-celler med 0,4% Trypan Blue-løsningsfarging og overfør deretter 10 000 levende celler per brønn til en 96-brønns PCR-plate. Sentrifuger platen ved 1000 ganger g i fem minutter, og fjern og kast deretter supernatanten grundig med en pipette. Unngå å forstyrre cellepaletten.Etter å ha vasket cellene som beskrevet i teksten, legg til 50 mikroliter av cellelysemalblandingen til hver brønn. Pipetten opp og ned fem ganger for å suspendere cellepaletten på igjen. Inkuber blandingen i 10 minutter ved romtemperatur.Deretter overfører du blandingen til 37 grader celsius i fem minutter, og deretter 75 grader celsius i ytterligere fem minutter. Legg nå til en mikroliter cellelylat til PCR-brønnene som inneholder RT qPCR-reaksjonsblandingen. Denne blandingen inkluderer markørgenene fremover og omvendt primer, omvendt transkripsjon og One-Step reaksjonsblanding.Kjør omvendt transkripsjonsreaksjon i 10 minutter ved 50 grader celsius etterfulgt av polymeriseringsaktivering, og DNA-denning i ett minutt ved 95 grader celsius. Utfør RT PCR med 40 sykluser med PCR-reaksjon som beskrevet i tekstprotokollen. Kontroller HOXA9 redusert uttrykk kloner gjennom Sanger sekvensering og utføre PCR med MOLM13 genom DNA som beskrevet i tekstprotokollen.Trekk ut og rens PCR-produktene med PCR-rensesettet. Ligate renset PCR produkter i T vektor med T4 ligation buffer, T vektor DNA, PCR DNA og T4 ligase. Plasser ligation blandingen i en inkubator på 16 grader celsius over natten.Overfør ligation blandingen til DH5 alfa kompetente celler og plate på en LB ampicillin antibiotika agar plate. Inkuber platene over natten ved 37 grader celsius. Velg de enkle klonene fra LB-platen og bekreft dem ved genotyping og Sanger-sekvensering.Sett opp heteroduplex blandingsgruppen med 200 nanogrammer av referansen, og 200 nanograms av test PCR amplicons i en 0,2 milliliter PCR rør. Inkluder homoduplex blandingsgruppen med bare 400 nanogram referanse PCR amplicons som en kontroll. Inkuber heteroduplex- og homoduplexblandingen ved 95 grader celsius i fem minutter i et en liters beger fylt med 800 milliliter vann.Deretter avkjøles blandingene gradvis til romtemperatur for å anneal og danne heteroduplex eller homoduplex. Nå fordøyer separat 400 nanogrammer av den glødede heteroduplex- og homoduplexblandingen med en mikroliter indel mutasjonsdeteksjonskjerne, og to mikroliter kjernereaksjonsbuffer ved 42 grader celsius i 60 minutter. Analyser de fordøyde prøvene med agarose gel elektroforese.Heteroduplex blandingen DNA skal kuttes i små fragmenter og homoduplex DNA bør ikke kuttes. sgRNA rettet mot MOLM13 positive kloner ble bekreftet med RT qPCR-metoden, basert på uttrykksnivåene av HOXA9-gener med sammenligningen med kontrollcellene. Av de 528 gjenlevende klonene som ble vist, viste 10 kloner mer enn 50 % reduksjon i HOXA9-nivåer.sgRNAs integrert i HOXA9 redusert, HOXA9 uendret og HOXA9 økte kloner, ble ytterligere bekreftet av PCR forsterkning av sgRNA og identifikasjon av Sanger sekvens. Seks av ti kloner som viste en reduksjon i HOXA9-nivåene inneholdt sgRNAs rettet mot CBS79-området, som bestemt av Sanger-sekvensering. Indelmutasjoner av integrerte sgRNA positive kloner ble bestemt av PCR-basert genotyping og kjernefordøyelse.Den heterozygøse slettingen av CTCF-området mellom HOXA7 og HOXA9-gener ble identifisert ved PCR-basert genotyping. HOXA9-reduserte kloner fem, seks, 28 og 121 utstilt sletting i CBS79 grensen plassering. Lignende resultater ble observert for indelmutasjonene på CBS79-stedet som ble analysert av kjernen fordøyelsesanalyse.Når du utfører denne prosedyren, er det viktig å gjøre like mengder heteroduplexes og homoduplexes for å oppdage sgRNA-induserte indelmutasjoner gjennom kjernen fordøyelsesanalyse. Vår tilnærming gjør det mulig å utnytte den valgte markøren, å utføre neste generasjons sekvensering på målgenet for å oppdage genets effekter på leukemogenese. Samlet vår tilnærming forhindrer RPC for funksjonell korrekt og reduksjon av en kjent genetisk uregelmessige elementer under normal biologisk prosess og leukemogenese i posthum genom prosjektfeil.

Research

JoVE Journal

Genetics

HOX Loci Focused CRISPR/sgRNA Library Screening Identifying Critical CTCF Boundaries

A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source

En universell protokoll for store gRNA biblioteket produksjon fra en DNA-kilde

The popularity of the CRISPR/Cas9 system for both genome and epigenome engineering stems from its simplicity and adaptability. An effector (the Cas9 ...

G2-seq: A High Throughput Sequencing-based Technique for Identifying Late Replicating Regions of the Genome

G2-seq: En høy gjennomstrømning sekvensering-basert teknikk for å identifisere sent replikere regioner i genomet

Numerous techniques have been developed to follow the progress of DNA replication through the S phase of the cell cycle. Most of these techniques have ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Robust DNA isolasjon og høy gjennomstrømming sekvensering biblioteket konstruksjon for Herbarium prøver

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

Retrospektiv MicroRNA sekvensering: Komplementære DNA biblioteket forberedelse protokollen bruker Formalin-fast parafin-embedded RNA prøver

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of ...

Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen

Ultralow inngang genomet sekvensering biblioteket forberedelse fra en enkelt Tardigrade prøven

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state ...

Bronchoalveolar Lavage Exosomes in Lipopolysaccharide-induced Septic Lung Injury

Bronchoalveolar Lavage Exosomes lipopolysakkarid-indusert septisk lungen skade

Acute lung injury (ALI) and acute respiratory distress syndrome (ARDS) represent a heterogeneous group of lung diseases which continues to have a high ...

Mating-based Overexpression Library Screening in Yeast

Parring-baserte overuttrykte biblioteket Screening i gjær

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool ...

Screening Cotton Genotypes for Reniform Nematode Resistance

Screening Cotton genotyper for kantet nematode Resistance

A rapid non-destructive reniform nematode (Rotylenchulus reniformis) screening protocol is needed for the development of resistant cotton (Gossypium ...

Identifying Mutations by High Resolution Melting in a TILLING Population of Rice

Identifisering av mutasjoner ved høy oppløsning smelting i en TILLING befolkning på Rice

Target Induced Local Lesions In Genomes (TILLING) is a strategy of reverse genetics for the high-throughput screening of induced mutations. However, the ...

Screening and Identification of RNA Silencing Suppressors from Secreted Effectors of Plant Pathogens

Screening og identifisering av RNA-dempende suppressorer fra utskillede effektorer av plantepatogener

RNA silencing is an evolutionarily conserved, sequence-specific gene regulation mechanism in eukaryotes. Several plant pathogens have evolved proteins ...