Name: hox loci focused crispr/sgrna library screening identifying critical ctcf boundaries
Uploaded: 2019-03-31T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about HOX Loci Focused CRISPR/sgRNA Library Screening Identifying Critical CTCF Boundaries at JoVE.com

Os autores também agradecer Nicholas Cesari para editar o manuscrito. O trabalho foi apoiado por concessões do Instituto Nacional de saúde (S.H., R01DK110108, R01CA204044).

1. CTCF sgRNALibrary projeto usando uma ferramenta on-line
<ol><li>Desenha o sgRNA sítios de ligação CTCF os loci de HOX humano usando a ferramenta de designer perturbação genética plataforma (GPP) (https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design).</li>
	<li>Sintetiza um total de 1.070 sgRNAs consistindo de sgRNAs visando 303 genes alvos aleatórios, 60 controles positivos, 500 controles não-humanos-direcionamento e 207 elementos CTCF ou lncRNA alvejando genes (<strong class="x...

<ol>
	<li>Dixon, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topological+domains+in+mammalian+genomes+identified+by+analysis+of+chromatin+interactions.">Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions.</a> Nature. 485 (7398), 376-380 (2012).</li><li>Cuddapah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+the+insulator+binding+protein+CTCF+in+chromatin+barrier+regions+reveals+demarcation+of+active+and+repressive+domains.">Global analysis of the insulator binding protein CTCF in chromatin barrier regions reveals demarcation of active and repressive domains.</a> Genome research. 19 (1), 24-32 (2009).</li><li>Phillips, J. E., Corces, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF:+master+weaver+of+the+genome.">CTCF: master weaver of the genome.</a> Cell. 137 (7), 1194-1211 (2009).</li><li>Tang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF-Mediated+Human+3D+Genome+Architecture+Reveals+Chromatin+Topology+for+Transcription.">CTCF-Mediated Human 3D Genome Architecture Reveals Chromatin Topology for Transcription.</a> Cell. 163 (7), 1611-1627 (2015).</li><li>Lupianez, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruptions+of+topological+chromatin+domains+cause+pathogenic+rewiring+of+gene-enhancer+interactions.">Disruptions of topological chromatin domains cause pathogenic rewiring of gene-enhancer interactions.</a> Cell. 161 (5), 1012-1025 (2015).</li><li>Dowen, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+cell+identity+genes+occurs+in+insulated+neighborhoods+in+mammalian+chromosomes.">Control of cell identity genes occurs in insulated neighborhoods in mammalian chromosomes.</a> Cell. 159 (2), 374-387 (2014).</li><li>Phillips-Cremins, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architectural+protein+subclasses+shape+3D+organization+of+genomes+during+lineage+commitment.">Architectural protein subclasses shape 3D organization of genomes during lineage commitment.</a> Cell. 153 (6), 1281-1295 (2013).</li><li>Narendra, V., Bulajic, M., Dekker, J., Mazzoni, E. O., Reinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF-mediated+topological+boundaries+during+development+foster+appropriate+gene+regulation.">CTCF-mediated topological boundaries during development foster appropriate gene regulation.</a> Genes &amp; Development. 30 (24), 2657-2662 (2016).</li><li>Narendra, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF+establishes+discrete+functional+chromatin+domains+at+the+Hox+clusters+during+differentiation.">CTCF establishes discrete functional chromatin domains at the Hox clusters during differentiation.</a> Science. 347 (6225), 1017-1021 (2015).</li><li>Deng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HoxBlinc+RNA+Recruits+Set1/MLL+Complexes+to+Activate+Hox+Gene+Expression+Patterns+and+Mesoderm+Lineage+Development.">HoxBlinc RNA Recruits Set1/MLL Complexes to Activate Hox Gene Expression Patterns and Mesoderm Lineage Development.</a> Cell Reports. 14 (1), 103-114 (2016).</li><li>Patel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberrant+TAL1+activation+is+mediated+by+an+interchromosomal+interaction+in+human+T-cell+acute+lymphoblastic+leukemia.">Aberrant TAL1 activation is mediated by an interchromosomal interaction in human T-cell acute lymphoblastic leukemia.</a> Leukemia. 28 (2), 349-361 (2014).</li><li>Luo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF+boundary+remodels+chromatin+domain+and+drives+aberrant+HOX+gene+transcription+in+acute+myeloid+leukemia.">CTCF boundary remodels chromatin domain and drives aberrant HOX gene transcription in acute myeloid leukemia.</a> Blood. 132 (8), 837-848 (2018).</li><li>Dou, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medial+HOXA+genes+demarcate+haematopoietic+stem+cell+fate+during+human+development.">Medial HOXA genes demarcate haematopoietic stem cell fate during human development.</a> Nature Cell Biology. 18 (6), 595-606 (2016).</li><li>Lawrence, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+expression+of+the+Hoxa-9+homeobox+gene+impairs+the+proliferation+and+repopulating+ability+of+hematopoietic+stem+cells.">Loss of expression of the Hoxa-9 homeobox gene impairs the proliferation and repopulating ability of hematopoietic stem cells.</a> Blood. 106 (12), 3988-3994 (2005).</li><li>Deng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=USF1+and+hSET1A+mediated+epigenetic+modifications+regulate+lineage+differentiation+and+HoxB4+transcription.">USF1 and hSET1A mediated epigenetic modifications regulate lineage differentiation and HoxB4 transcription.</a> PLOS Genetics. 9 (6), e1003524 (2013).</li><li>Rawat, V. P., Humphries, R. K., Buske, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+Hox:+the+role+of+ParaHox+genes+in+normal+and+malignant+hematopoiesis.">Beyond Hox: the role of ParaHox genes in normal and malignant hematopoiesis.</a> Blood. 120 (3), 519-527 (2012).</li><li>Alharbi, R. A., Pettengell, R., Pandha, H. S., Morgan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+HOX+genes+in+normal+hematopoiesis+and+acute+leukemia.">The role of HOX genes in normal hematopoiesis and acute leukemia.</a> Leukemia. 27 (5), 1000-1008 (2013).</li><li>Rice, K. L., Licht, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HOX+deregulation+in+acute+myeloid+leukemia.">HOX deregulation in acute myeloid leukemia.</a> Journal of Clinical Investigation. 117 (4), 865-868 (2007).</li><li>Bassett, A. R., Kong, L., Liu, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+CRISPR+library+for+high-throughput+genetic+screening+in+Drosophila+cells.">A genome-wide CRISPR library for high-throughput genetic screening in Drosophila cells.</a> Journal of Genetics and Genomics. 42 (6), 301-309 (2015).</li><li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+deletion+screening+of+human+long+non-coding+RNAs+using+a+paired-guide+RNA+CRISPR-Cas9+library.">Genome-scale deletion screening of human long non-coding RNAs using a paired-guide RNA CRISPR-Cas9 library.</a> Nature Biotechnology. 34 (12), 1279-1286 (2016).</li><li>Kurata, J. S., Lin, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-focused+CRISPR-Cas9+library+screen+reveals+fitness-associated+miRNAs.">MicroRNA-focused CRISPR-Cas9 library screen reveals fitness-associated miRNAs.</a> RNA. 24 (7), 966-981 (2018).</li><li>Collins, C. T., Hess, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+HOXA9+in+leukemia:+dysregulation,+cofactors+and+essential+targets.">Role of HOXA9 in leukemia: dysregulation, cofactors and essential targets.</a> Oncogene. 35 (9), 1090-1098 (2016).</li><li>Kroon, E., Thorsteinsdottir, U., Mayotte, N., Nakamura, T., Sauvageau, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NUP98-HOXA9+expression+in+hemopoietic+stem+cells+induces+chronic+and+acute+myeloid+leukemias+in+mice.">NUP98-HOXA9 expression in hemopoietic stem cells induces chronic and acute myeloid leukemias in mice.</a> The EMBO Journal. 20 (3), 350-361 (2001).</li><li>Koike-Yusa, H., Li, Y., Tan, E. P., Velasco-Herrera Mdel, C., Yusa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+recessive+genetic+screening+in+mammalian+cells+with+a+lentiviral+CRISPR-guide+RNA+library.">Genome-wide recessive genetic screening in mammalian cells with a lentiviral CRISPR-guide RNA library.</a> Nature Biotechnology. 32 (3), 267-273 (2014).</li><li>Shalem, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+CRISPR-Cas9+knockout+screening+in+human+cells.">Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells.</a> Science. 343 (6166), 84-87 (2014).</li><li>Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+screens+in+human+cells+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system.</a> Science. 343 (6166), 80-84 (2014).</li><li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+sgRNAs+facilitate+CRISPR/Cas9-mediated+mouse+genome+targeting.">Dual sgRNAs facilitate CRISPR/Cas9-mediated mouse genome targeting.</a> The FEBS Journal. 281 (7), 1717-1725 (2014).</li><li>Sanjana, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+interrogation+of+functional+elements+in+the+noncoding+genome.">High-resolution interrogation of functional elements in the noncoding genome.</a> Science. 353 (6307), 1545-1549 (2016).</li><li>Rajagopal, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+mapping+of+regulatory+DNA.">High-throughput mapping of regulatory DNA.</a> Nature Biotechnology. 34 (2), 167-174 (2016).</li><li>Korkmaz, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genetic+screens+for+enhancer+elements+in+the+human+genome+using+CRISPR-Cas9.">Functional genetic screens for enhancer elements in the human genome using CRISPR-Cas9.</a> Nature Biotechnology. 34 (2), 192-198 (2016).</li><li>Rezaei, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FMS-Like+Tyrosine+Kinase+3+(FLT3)+and+Nucleophosmin+1+(NPM1)+in+Iranian+Adult+Acute+Myeloid+Leukemia+Patients+with+Normal+Karyotypes:+Mutation+Status+and+Clinical+and+Laboratory+Characteristics.">FMS-Like Tyrosine Kinase 3 (FLT3) and Nucleophosmin 1 (NPM1) in Iranian Adult Acute Myeloid Leukemia Patients with Normal Karyotypes: Mutation Status and Clinical and Laboratory Characteristics.</a> Turkish Journal of Haematology. 34 (4), 300-306 (2017).</li><li>Yaragatti, M., Basilico, C., Dailey, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+active+transcriptional+regulatory+modules+by+the+functional+assay+of+DNA+from+nucleosome-free+regions.">Identification of active transcriptional regulatory modules by the functional assay of DNA from nucleosome-free regions.</a> Genome Research. 18 (6), 930-938 (2008).</li><li>Wilken, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNase+I+hypersensitivity+analysis+of+the+mouse+brain+and+retina+identifies+region-specific+regulatory+elements.">DNase I hypersensitivity analysis of the mouse brain and retina identifies region-specific regulatory elements.</a> Epigenetics Chromatin. 8, 8 (2015).</li><li>Narlikar, L., Ovcharenko, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+regulatory+elements+in+eukaryotic+genomes.">Identifying regulatory elements in eukaryotic genomes.</a> Briefings in Functional Genomics and Proteomics. 8 (4), 215-230 (2009).</li><li>Hnisz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+proto-oncogenes+by+disruption+of+chromosome+neighborhoods.">Activation of proto-oncogenes by disruption of chromosome neighborhoods.</a> Science. 351 (6280), 1454-1458 (2016).</li></ol>

Genes codificantes de proteínas relacionadas com bibliotecas de sgRNA foram aplicadas em um sistema funcional de triagem para identificação de genes e redes, regulação de funções celulares específicas através de sgRNA enriquecimento24,25,26 ,de27,28. Região não-codificante vários relacionados com bibliotecas de sgRNA também foram mostradas em tel...

Recentes estudos de interacção do genoma revelaram que os formulários do genoma nuclear humano estável domínios topologicamente associados (TADs) que são conservados entre as espécies e tipos de células. A organização do genoma em domínios separados facilita e restringe as interações entre elementos reguladores (por exemplo, potenciadores e promotores). O fator de ligação CCCTC (CTCF) liga-se aos limites do TAD e desempenha um papel crítico na restrição de interações de elementos de DNA que estão localizados na vizinha TADs1. Dados de vinculação CTCF amplo do genoma revelaram, no entanto, que embora CTCF principalmente interage com os mesmos DNA-sites em diferentes tipos de células, muitas vezes funciona como uma barreira de cromatina em um site específico no tipo de uma célula, mas não na outra, sugerindo que funções do CTCF juntamente com outras atividades na formação de cromatina limites2. O que permanece desconhecido é se os elementos de contorno (sites de ligação CTCF) estão directamente relacionados com a função biológica do CTCF e como ocorrem esses links. Portanto, nós hypothesize que sítios específicos de ligação CTCF no genoma diretamente regulam a formação de TADs e controlam interações promotor/realçador dentro desses domínios ou entre domínios vizinhos. A conclusão dos humanos e projetos de sequenciamento do genoma do rato e subsequentes análises epigenéticas ter descoberto novas assinaturas genéticas e moleculares do genoma. No entanto, o papel de assinaturas/modificações específicas na regulação gênica e função celular, bem como seu mecanismo molecular (s), ainda tem que ser completamente compreendido.
Várias linhas de evidência suportam que o TADs CTCF-mediada representam cromatina funcional domínios3,4,5. Embora CTCF principalmente interage com os mesmos DNA-sites em diferentes tipos de células, genoma ampla CTCF ChIP-seq dados revelaram que CTCF muitas vezes funciona como uma barreira de cromatina no tipo de uma célula, mas não em outros2. CTCF desempenha um papel essencial durante o desenvolvimento mediando genoma organização4,6,7. Rompimento de limites CTCF prejudicada interações realçador/promotor e expressão do gene, levando à obstrução do desenvolvimento. Isto sugere que a CTCF mediada TADs não são apenas componentes estruturais, mas também unidades regulamentares necessárias para o adequado potenciador ação e gene transcrição5,8,9.
Genes HOX desempenham papéis críticos durante o desenvolvimento embrionário, e eles são temporalmente e espacialmente restritas em seus padrões de expressão. O locus HOXA forma dois TADs estáveis separando genes anteriores e posteriores por um elemento de limite CTCF-associado em hESCs e IMR90 as células1. Relatórios recentes demonstraram que o HoxBlinc, um lncRNA de locus associado HoxB , Medeia a formação do CTCF dirigido Tad e interações realçador/promotor no locus HOXB . Isto leva à ativação do gene HOXB anterior durante ESC compromisso e diferenciação10. Além disso, em loci de genes específicos incluindo o locus HOXA , alteração do CTCF mediada TAD domínios mudados linhagem perfis de expressão de genes específicos e foi associada com o desenvolvimento da doença Estados11,12. A evidência suporta uma função primária para CTCF na coordenação da transcrição do gene e determinar a identidade da célula organizando o genoma em domínios funcionais.
Apesar de seu papel no desenvolvimento embrionário, durante a hematopoiese, genes HOX regulam a função de célula (HS/PC) de haste e progenitoras hematopoiética. Isso é feito controlando o equilíbrio entre a proliferação e diferenciação de10,13,14,15. A expressão dos genes HOX é fortemente regulamentada em toda a especificação e a diferenciação das células hematopoiéticas, com maior expressão em HS / PCs. HOX expressao diminui gradualmente durante o amadurecimento, com seus níveis mais baixos ocorrendo em diferenciados de células hematopoiéticas16. Desregulagem do gene HOX é um mecanismo dominante das transformações leucêmicas por propriedades de auto-renovação e diferenciação de dysregulating levando a transformação leucêmicas17,18HS/PCs. No entanto, o mecanismo de estabelecimento e manutenção normal vs padrões de expressão oncogênica de genes HOX , bem como redes de regulação associadas permanece obscuro.
Rastreio de biblioteca CRISPR-Cas9 sgRNA tem sido amplamente utilizado para interrogar de genes codificantes de proteínas19 como genes bem como não-codificantes, como20 e miRNA lncRNA21 em diferentes espécies. No entanto, o custo para usar a biblioteca de sgRNA CRISPR-Cas9 para identificar novos alvos genômicos permanece elevado, porque o sequenciamento do genoma do elevado-throughput é muitas vezes aplicado para verificar o rastreio de biblioteca de sgRNA. Nosso sistema de rastreio de sgRNA está focada em locus específico do genoma e avalia o direcionamento sgRNAs através de uma etapa de RT-PCR de acordo com a expressão de gene marcador, como HOXA9. Além disso, Sanger sequenciamento confirmou que o sgRNA foi integrado no genoma e mutações Indel pode ser detectado para identificar o sgRNA segmentação local. Através do rastreio genético do CRISPR-Cas9 locus específico, o limite de cromatina de CBS7/9 foi identificado como um regulador fundamental para estabelecer o domínio de cromatina oncogênicos e manter padrões de expressão de gene HOX ectópica na patogênese da LMA 12. o método pode ser amplamente aplicado para identificar não somente a função específica de limite CTCF no desenvolvimento embrionário, a hematopoiese, leukemogenesis, mas também limite CTCF como alvos terapêuticos para futura terapia epigenética.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:689px;" width="689">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Lipofectamine 3000 reagent</td>
			<td style="width:155px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">L3000-008</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Proteinase K</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25530049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Puromycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1113802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stbl3 cells&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>&#160;C737303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEK293T</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MOLM-13</td>
			<td>DSMZ</td>
			<td>ACC 554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">lentiCRISPRv2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>52961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">psPAX2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pGEM&#174;-T Easy Vector Systems&#160;</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A137A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T4 ligase&#160;</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>&#160;M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAquick Gel Extract kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAuick PCR purification kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SingleShot&#8482; SYBR&#174;&#160;Green One-Step Kit</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1725095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">QIAGEN Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td style="width:100px;">12163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">&#160;11965084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI 1640&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal bovine serum (FBS)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">10-082-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin/streptomycin/L-glutamine&#160;</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:100px;">10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lenti-X Concentrator&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Clontech</td>
			<td style="width:100px;">631232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Trypan Blue Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Polybrene</td>
			<td style="width:155px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-134220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Genessee Scientific</td>
			<td>&#160;25-507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">TAE buffer&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>FERB49</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Surveyor&#174; Mutation Detection Kits</td>
			<td style="width:155px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:100px;">706020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Biorad Universal Hood II Gel Doc System</td>
			<td style="width:155px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:100px;">170-8126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Centrifuge 5424 R</td>
			<td style="width:155px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:100px;">5404000138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Digital Dry Baths/Block Heaters</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">88870002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">TSX Series Ultra-Low Freezers</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">TSX40086V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Forma&#8482; Steri-Cult&#8482; CO2&#160;Incubators</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">3308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Herasafe&#8482; KS, Class II Biological Safety Cabinet</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">51022484</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Sorvall&#8482; Legend&#8482; XT/XF Centrifuge Series</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">75004506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Fisherbrand&#8482;&#160;Isotemp&#8482; Water Baths</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">FSGPD02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:263px;">Thermo Scientific&#8482;&#160;Locator&#8482; Plus Rack and Box Systems</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">13-762-353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System</td>
			<td style="width:155px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:100px;">1855195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">MiniAmp&#8482; Thermal Cycler</td>
			<td style="width:155px;">Applied Biosystems technology</td>
			<td style="width:100px;">A37834</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:263px;">Thermo Scientific&#8482;&#160;Owl&#8482; EC300XL2 Compact Power Supply</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">7217581</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:263px;">Thermo Scientific&#8482;&#160;Owl&#8482; EasyCast&#8482; B1 Mini Gel Electrophoresis Systems</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">09-528-178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">VWR&#174; Tube Rotator and Rotisseries</td>
			<td style="width:155px;">VWR International</td>
			<td style="width:100px;">10136-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">VWR&#174; Incubating Mini Shaker</td>
			<td style="width:155px;">VWR International</td>
			<td style="width:100px;">12620-942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Analytical Balance MS104TS/00</td>
			<td style="width:155px;">METTLER TOLEDO</td>
			<td style="width:100px;">30133522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">DS-11 FX and DS-11 FX+ Spectrophotometer</td>
			<td style="width:155px;">DeNovix Inc.</td>
			<td style="width:100px;">DS-11 FX</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hox loci focused crispr/sgrna library screening identifying critical ctcf boundaries

CCCTC-fator obrigatório (CTCF)-mediada estável topologicamente associando domínios (TADs) desempenham um papel crítico na restrição de interações de elementos de DNA que estão localizados na vizinha TADs. CTCF desempenha um papel importante na regulação da expressão espacial e temporal de genes HOX que controlam o desenvolvimento embrionário, modelação do corpo, hematopoiese e leukemogenesis. No entanto, permanece em grande parte desconhecido se e como HOX loci associados CTCF limites regulam a organização da cromatina e expressão dos genes HOX . No actual protocolo, foi gerada uma biblioteca em pool específico sgRNA todos os sítios de ligação CTCF os loci HOXA/B/C/D para examinar os efeitos da rompendo limites de cromatina CTCF-associado em formação TAD e gene Homeótico expressão. Através de CRISPR-Cas9 rastreio genético, o sítio de ligação do CTCF localizado entre genes HOXA7/HOXA9 (CBS7/9) foi identificado como um regulador crítico do domínio de cromatina oncogênica, bem como sendo importantes para a manutenção de uma gravidez ectópica gene HOX padrões de expressão em MLL-rearranjou a leucemia mieloide aguda (LMA). Assim, esta biblioteca sgRNA triagem abordagem fornece novos insights sobre organização de genoma CTCF mediada loci de genes específicos e também fornece uma base para a caracterização funcional dos elementos normativos genéticas anotados, ambos de codificação e não-codificante, durante processos biológicos normais na época do projeto genoma pós humano.

CRISPR-Cas9 tecnologia é uma ferramenta poderosa da pesquisa para estudos de genômicas funcionais. Ele é rapidamente substituindo o gene convencional, técnicas de edição e tem alta utilidade para aplicações de gene com foco todo o genoma e individuais. Aqui, a primeiro individualmente clonado loci específicos CRISPR-Cas9-vestiu sgRNA biblioteca contém 1.070 sgRNAs consistindo de sgRNAs visando 303 genes alvos aleatórios, 60 controles positivos, 500 controles não-humanos-direci...

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HOX Loci Focused CRISPR/sgRNA Library Screening Identifying Critical CTCF Boundaries

Uma biblioteca CRISPR/sgRNA aplicou-se para interrogar os genes codificantes de proteínas. No entanto, a viabilidade de uma biblioteca de sgRNA para descobrir a função de um limite CTCF na regulação gênica permanece inexplorada. Aqui, descrevemos uma biblioteca de sgRNA específico de loci HOX para elucidar a função dos limites CTCF HOX loci.

HOX Loci Focused CRISPR/sgRNA biblioteca rastreio identificando crítico CTCF limites

CCCTC-binding factor (CTCF)-mediated stable topologically associating domains (TADs) play a critical role in constraining interactions of DNA elements ...

Nosso sgRNA agrupado chamado de triagem da biblioteca, é uma poderosa abordagem genética para identificar e avaliar a função biológica dos elementos não codificados em todo o genoma. Esta técnica nos permite examinar o efeito de interromper os locais de ligação associados, limites cromáticos ou outros elementos regulatórios na expressão de genes direcionados. Nossa abordagem pode ser usada para identificar o papel do CTCF, RNAs e enhancers não codificantes de longa duração, na regulação genética HOX no desenvolvimento embrionário precoce, bem como certas leucemias com uma assinatura genética hox aberrante.Inicie este procedimento com o desenho de um sgRNA direcionado aos locais de vinculação CTCF. Clonagem da biblioteca sgRNA na preparação celular, conforme descrito no protocolo de texto. Para embalar o lentivírus, cotransfectam células HEK293 T com 20 microgramas de vetores de biblioteca purificados, 15 microgramas do plasmídeo embalado e 10 microgramas do plasmídeo envelope, por 48 horas antes de colher os vírus.Após 48 horas, colete o vírus supernadante e filtre-o através de uma membrana PVDF de ligação de baixa proteína de 0,45 mícade. Em seguida, concentre o supernatante lentiviral em 50 vezes, usando o concentrador. Aliquot os vírus concentrados e armazene-os em um freezer de menos 80 graus celsius.Trabalhe em poços separados de uma placa de 12 poços para misturar células MOLM13 com várias doses do lentivírus concentrado para seis grupos totais. Imediatamente centrifugar essas misturas a 1000 vezes g por duas horas a 33 graus celsius. Transfira as 12 placas do poço de volta para a incubadora a 37 graus celsius e 5% de dióxido de carbono por quatro horas.Aspire suavemente o supernaente sem perturbar a paleta celular, e suspenda as células transduzidas com RPMI 1640 Médio complementado fresco. Em seguida, transfira as células re-suspensas para frascos T25 e incubar a 37 graus celsius por 48 horas sem puramicina. Após 48 horas dividindo essas células em dois frascos, um grupo experimental tratado com um microliter por mililitro puromicina por cinco dias, e um grupo controle sem tratamento de puramicina por cinco dias.Meça o valor otimizado do MOI para transdução, dividindo o número de células vivas tratadas com puramicina pelo número de células sem tratamento de puramicina. Para transduzir as células com a biblioteca agrupada, infecte 1,5 milhão de células MOLM13 em uma placa de 6 poços com 0,3 MOI de lentivírus agrupado sgRNA em médio. Use as células sem a infecção por lentivírus como controle.Imediatamente centrifufique a placa de seis poços a 1000 vezes g por duas horas a 33 graus celsius para girar as células. Em seguida, transfira as placas de volta para a incubadora a 37 graus celsius em 5% de dióxido de carbono por quatro horas. Aspirar suavemente o supernaente sem perturbar a paleta celular, e suspender re-suspender as células transduzidas com meio fresco.Em seguida, transfira as células para frascos T25 e incubar a 37 graus celsius por 48 horas sem puramicina. Após 48 horas, trate as células com um micrograma por mililitro puromicina por cinco dias. Troque por meio fresco após dois dias e mantenha uma densidade celular ótima.Semente o único clone em 96 placas de poço com métodos de diluição limitantes. Incubar estes clones únicos a 37 graus celsius e 5% de dióxido de carbono. Cultuá-los por 3-4 semanas.Conte as células MOLM13 integradas sgRNA com coloração de solução Trypan Blue de 0,4% e, em seguida, transfira 10.000 células vivas por poço para uma placa PCR de 96 poços. Centrifugar a placa a 1000 vezes g por cinco minutos e, em seguida, remova completamente e descarte o sobrenatante com uma pipeta. Evite perturbar a paleta de celular.Depois de lavar as células como descrito no texto adicione 50 microliters da mistura mestre da lise celular a cada poço. Pipeta para cima e para baixo cinco vezes para suspender a paleta de celular. Incubar a mistura por 10 minutos em temperatura ambiente.Em seguida, transfira a mistura para 37 graus celsius por cinco minutos e, em seguida, 75 graus celsius por mais cinco minutos. Agora adicione um microliter de lise celular aos poços PCR contendo a mistura de reação RT qPCR. Esta mistura inclui os genes marcadores para frente e primer reverso, transcriptase reversa e mix de reação One-Step.Execute a reação de transcrição reversa por 10 minutos a 50 graus celsius seguido de ativação de polimerização, e desnaturação de DNA por um minuto a 95 graus celsius. Execute o RT PCR com 40 ciclos de reação pcr conforme detalhado no protocolo de texto. Verifique os clones de expressão rompidos hoxa9 através do sequenciamento Sanger e execute PCR com DNA de genoma MOLM13, conforme descrito no protocolo de texto.Extrair e purificar os produtos PCR com o kit de purificação PCR. Ligate os produtos PCR purificados no vetor T com tampão de ligadura T4, DNA vetorial T, DNA PCR e ligadura T4. Coloque a mistura de ligadura em uma incubadora a 16 graus celsius durante a noite.Transfira a mistura de ligadura para células competentes DH5 alfa e placa em uma placa de agar antibiótico de ampicillina LB. Incubar as placas durante a noite a 37 graus celsius. Escolha os clones únicos da placa LB e verifique-os por genotipagem e sequenciamento Sanger.Configure o grupo de mistura heteroduplex com 200 nanogramas da referência, e 200 nanogramas de amplicons pcr de teste em um tubo PCR de 0,2 mililitro. Inclua o grupo de mistura homoduplex com apenas 400 nanogramas de amplicons pcr de referência como controle. Incubar separadamente a mistura heteroduplex e homoduplex a 95 graus celsius por cinco minutos em um béquer de um litro cheio com 800 mililitros de água.Em seguida, esfrie as misturas gradualmente até a temperatura ambiente para ressarcer e formar o heteroduplex ou homoduplex. Agora, digera separadamente 400 nanogramas da mistura heteroduplex e homoduplex com um microliter de nuclease de detecção de mutação indel, e dois microliters de tampão de reação nuclease a 42 graus celsius por 60 minutos. Analise as amostras digeridas com eletroforese de gel agarose.O DNA da mistura heteroduplex deve ser cortado em pequenos fragmentos e o DNA homoduplex não deve ser cortado. sgRNA direcionados aos clones positivos MOLM13 foram confirmados com o método RT qPCR, baseado nos níveis de expressão dos genes HOXA9 com a comparação com as células de controle. Dos 528 clones sobreviventes exibidos, 10 clones apresentaram redução de mais de 50% nos níveis de HOXA9.sgRNAs integrados à redução hoxa9, hoxa9 inalterado e hoxa9 aumento de clones, foram ainda confirmados pela amplificação PCR do sgRNA e identificação por sequência Sanger. Seis dos dez clones que mostram uma redução nos níveis de HOXA9 continham sgRNAs visando o site CBS79, conforme determinado pelo sequenciamento de Sanger. Mutações indel de clones positivos sgRNA integrados foram determinadas por genotipagem baseada em PCR e digestão de nuclease.A exclusão heterozigous do local CTCF localizado entre os genes HOXA7 e HOXA9 foi identificada por genotipagem baseada em PCR. Os clones reduzidos de HOXA9 cinco, seis, 28 e 121 exibiram exclusão no local de fronteira cbs79. Resultados semelhantes foram observados para as mutações inde no local CBS79 que foram analisadas pelo ensaio de digestão nuclease.Ao realizar este procedimento, é importante fazer quantidades iguais de heteroduplexos e homoduplexes, a fim de detectar mutações indelédas induzidas pelo SGRNA através do ensaio de digestão nuclease. Nossa abordagem permite a utilização do marcador selecionado, para realizar sequenciamento de próxima geração no gene alvo para descobrir os efeitos do gene na leukemogênese. Em geral, nossa abordagem impede rpc's para o correto funcional e redução de um notável elemento genético irregular durante o processo biológico normal e leukemogenesis no erro do projeto genoma póstumo.

Research

JoVE Journal

Genetics

HOX Loci Focused CRISPR/sgRNA Library Screening Identifying Critical CTCF Boundaries

A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source

Um protocolo Universal para grande escala gRNA biblioteca de produção a partir de qualquer fonte de DNA

The popularity of the CRISPR/Cas9 system for both genome and epigenome engineering stems from its simplicity and adaptability. An effector (the Cas9 ...

Genética

G2-seq: A High Throughput Sequencing-based Technique for Identifying Late Replicating Regions of the Genome

G2-seq: Uma alta taxa de transferência baseada no sequenciamento técnica para identificar a tarde replicando regiões do genoma

Numerous techniques have been developed to follow the progress of DNA replication through the S phase of the cell cycle. Most of these techniques have ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Isolamento do DNA robusto e construção de biblioteca de sequenciamento de alto rendimento para espécimes de herbário

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

Sequenciação de MicroRNA retrospectiva: Biblioteca de DNA complementar preparação protocolo usando amostras de RNA de parafina fixada em formol

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of ...

Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen

Ultralow genoma entrada biblioteca preparação de um único espécime Tardigrade de sequenciamento

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state ...

Bronchoalveolar Lavage Exosomes in Lipopolysaccharide-induced Septic Lung Injury

Exosomes de lavagem broncoalveolar em lesão pulmonar séptico induzidas pelo lipopolissacarídeo

Acute lung injury (ALI) and acute respiratory distress syndrome (ARDS) represent a heterogeneous group of lung diseases which continues to have a high ...

Mating-based Overexpression Library Screening in Yeast

Rastreio de biblioteca superexpressão de acasalamento-baseado no fermento

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool ...

Screening Cotton Genotypes for Reniform Nematode Resistance

Triagem de genótipos de algodão para resistência ao nematódeo reniforme

A rapid non-destructive reniform nematode (Rotylenchulus reniformis) screening protocol is needed for the development of resistant cotton (Gossypium ...

Identifying Mutations by High Resolution Melting in a TILLING Population of Rice

Identificando mutações por derretimento de alta resolução em uma população de lavando de arroz

Target Induced Local Lesions In Genomes (TILLING) is a strategy of reverse genetics for the high-throughput screening of induced mutations. However, the ...

Screening and Identification of RNA Silencing Suppressors from Secreted Effectors of Plant Pathogens

Triagem e Identificação de Supressores de Silenciamento de RNA de agentes secretos de patógenos vegetais

RNA silencing is an evolutionarily conserved, sequence-specific gene regulation mechanism in eukaryotes. Several plant pathogens have evolved proteins ...