Name: hox loci focused crispr/sgrna library screening identifying critical ctcf boundaries
Uploaded: 2019-03-31T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about HOX Loci Focused CRISPR/sgRNA Library Screening Identifying Critical CTCF Boundaries at JoVE.com

Авторы также поблагодарить Николая Cesari для редактирования рукопись. Работа была поддержана субсидии от национального института здравоохранения (с.х., R01DK110108, R01CA204044).

1. CTCF sgRNALibrary дизайн с использованием онлайн инструмент
<ol><li>Дизайн sgRNA ориентации сайтов связывания CTCF в человека HOX локусов в конструкторе генетических возмущений платформы (GPP) (https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design).</li>
	<li>Синтезировать в общей сложности 1070 sgRNAs, состоящий из sgRNAs...

<ol>
	<li>Dixon, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topological+domains+in+mammalian+genomes+identified+by+analysis+of+chromatin+interactions.">Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions.</a> Nature. 485 (7398), 376-380 (2012).</li><li>Cuddapah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+the+insulator+binding+protein+CTCF+in+chromatin+barrier+regions+reveals+demarcation+of+active+and+repressive+domains.">Global analysis of the insulator binding protein CTCF in chromatin barrier regions reveals demarcation of active and repressive domains.</a> Genome research. 19 (1), 24-32 (2009).</li><li>Phillips, J. E., Corces, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF:+master+weaver+of+the+genome.">CTCF: master weaver of the genome.</a> Cell. 137 (7), 1194-1211 (2009).</li><li>Tang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF-Mediated+Human+3D+Genome+Architecture+Reveals+Chromatin+Topology+for+Transcription.">CTCF-Mediated Human 3D Genome Architecture Reveals Chromatin Topology for Transcription.</a> Cell. 163 (7), 1611-1627 (2015).</li><li>Lupianez, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruptions+of+topological+chromatin+domains+cause+pathogenic+rewiring+of+gene-enhancer+interactions.">Disruptions of topological chromatin domains cause pathogenic rewiring of gene-enhancer interactions.</a> Cell. 161 (5), 1012-1025 (2015).</li><li>Dowen, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+cell+identity+genes+occurs+in+insulated+neighborhoods+in+mammalian+chromosomes.">Control of cell identity genes occurs in insulated neighborhoods in mammalian chromosomes.</a> Cell. 159 (2), 374-387 (2014).</li><li>Phillips-Cremins, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architectural+protein+subclasses+shape+3D+organization+of+genomes+during+lineage+commitment.">Architectural protein subclasses shape 3D organization of genomes during lineage commitment.</a> Cell. 153 (6), 1281-1295 (2013).</li><li>Narendra, V., Bulajic, M., Dekker, J., Mazzoni, E. O., Reinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF-mediated+topological+boundaries+during+development+foster+appropriate+gene+regulation.">CTCF-mediated topological boundaries during development foster appropriate gene regulation.</a> Genes &amp; Development. 30 (24), 2657-2662 (2016).</li><li>Narendra, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF+establishes+discrete+functional+chromatin+domains+at+the+Hox+clusters+during+differentiation.">CTCF establishes discrete functional chromatin domains at the Hox clusters during differentiation.</a> Science. 347 (6225), 1017-1021 (2015).</li><li>Deng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HoxBlinc+RNA+Recruits+Set1/MLL+Complexes+to+Activate+Hox+Gene+Expression+Patterns+and+Mesoderm+Lineage+Development.">HoxBlinc RNA Recruits Set1/MLL Complexes to Activate Hox Gene Expression Patterns and Mesoderm Lineage Development.</a> Cell Reports. 14 (1), 103-114 (2016).</li><li>Patel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberrant+TAL1+activation+is+mediated+by+an+interchromosomal+interaction+in+human+T-cell+acute+lymphoblastic+leukemia.">Aberrant TAL1 activation is mediated by an interchromosomal interaction in human T-cell acute lymphoblastic leukemia.</a> Leukemia. 28 (2), 349-361 (2014).</li><li>Luo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF+boundary+remodels+chromatin+domain+and+drives+aberrant+HOX+gene+transcription+in+acute+myeloid+leukemia.">CTCF boundary remodels chromatin domain and drives aberrant HOX gene transcription in acute myeloid leukemia.</a> Blood. 132 (8), 837-848 (2018).</li><li>Dou, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medial+HOXA+genes+demarcate+haematopoietic+stem+cell+fate+during+human+development.">Medial HOXA genes demarcate haematopoietic stem cell fate during human development.</a> Nature Cell Biology. 18 (6), 595-606 (2016).</li><li>Lawrence, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+expression+of+the+Hoxa-9+homeobox+gene+impairs+the+proliferation+and+repopulating+ability+of+hematopoietic+stem+cells.">Loss of expression of the Hoxa-9 homeobox gene impairs the proliferation and repopulating ability of hematopoietic stem cells.</a> Blood. 106 (12), 3988-3994 (2005).</li><li>Deng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=USF1+and+hSET1A+mediated+epigenetic+modifications+regulate+lineage+differentiation+and+HoxB4+transcription.">USF1 and hSET1A mediated epigenetic modifications regulate lineage differentiation and HoxB4 transcription.</a> PLOS Genetics. 9 (6), e1003524 (2013).</li><li>Rawat, V. P., Humphries, R. K., Buske, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+Hox:+the+role+of+ParaHox+genes+in+normal+and+malignant+hematopoiesis.">Beyond Hox: the role of ParaHox genes in normal and malignant hematopoiesis.</a> Blood. 120 (3), 519-527 (2012).</li><li>Alharbi, R. A., Pettengell, R., Pandha, H. S., Morgan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+HOX+genes+in+normal+hematopoiesis+and+acute+leukemia.">The role of HOX genes in normal hematopoiesis and acute leukemia.</a> Leukemia. 27 (5), 1000-1008 (2013).</li><li>Rice, K. L., Licht, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HOX+deregulation+in+acute+myeloid+leukemia.">HOX deregulation in acute myeloid leukemia.</a> Journal of Clinical Investigation. 117 (4), 865-868 (2007).</li><li>Bassett, A. R., Kong, L., Liu, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+CRISPR+library+for+high-throughput+genetic+screening+in+Drosophila+cells.">A genome-wide CRISPR library for high-throughput genetic screening in Drosophila cells.</a> Journal of Genetics and Genomics. 42 (6), 301-309 (2015).</li><li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+deletion+screening+of+human+long+non-coding+RNAs+using+a+paired-guide+RNA+CRISPR-Cas9+library.">Genome-scale deletion screening of human long non-coding RNAs using a paired-guide RNA CRISPR-Cas9 library.</a> Nature Biotechnology. 34 (12), 1279-1286 (2016).</li><li>Kurata, J. S., Lin, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-focused+CRISPR-Cas9+library+screen+reveals+fitness-associated+miRNAs.">MicroRNA-focused CRISPR-Cas9 library screen reveals fitness-associated miRNAs.</a> RNA. 24 (7), 966-981 (2018).</li><li>Collins, C. T., Hess, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+HOXA9+in+leukemia:+dysregulation,+cofactors+and+essential+targets.">Role of HOXA9 in leukemia: dysregulation, cofactors and essential targets.</a> Oncogene. 35 (9), 1090-1098 (2016).</li><li>Kroon, E., Thorsteinsdottir, U., Mayotte, N., Nakamura, T., Sauvageau, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NUP98-HOXA9+expression+in+hemopoietic+stem+cells+induces+chronic+and+acute+myeloid+leukemias+in+mice.">NUP98-HOXA9 expression in hemopoietic stem cells induces chronic and acute myeloid leukemias in mice.</a> The EMBO Journal. 20 (3), 350-361 (2001).</li><li>Koike-Yusa, H., Li, Y., Tan, E. P., Velasco-Herrera Mdel, C., Yusa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+recessive+genetic+screening+in+mammalian+cells+with+a+lentiviral+CRISPR-guide+RNA+library.">Genome-wide recessive genetic screening in mammalian cells with a lentiviral CRISPR-guide RNA library.</a> Nature Biotechnology. 32 (3), 267-273 (2014).</li><li>Shalem, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+CRISPR-Cas9+knockout+screening+in+human+cells.">Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells.</a> Science. 343 (6166), 84-87 (2014).</li><li>Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+screens+in+human+cells+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system.</a> Science. 343 (6166), 80-84 (2014).</li><li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+sgRNAs+facilitate+CRISPR/Cas9-mediated+mouse+genome+targeting.">Dual sgRNAs facilitate CRISPR/Cas9-mediated mouse genome targeting.</a> The FEBS Journal. 281 (7), 1717-1725 (2014).</li><li>Sanjana, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+interrogation+of+functional+elements+in+the+noncoding+genome.">High-resolution interrogation of functional elements in the noncoding genome.</a> Science. 353 (6307), 1545-1549 (2016).</li><li>Rajagopal, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+mapping+of+regulatory+DNA.">High-throughput mapping of regulatory DNA.</a> Nature Biotechnology. 34 (2), 167-174 (2016).</li><li>Korkmaz, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genetic+screens+for+enhancer+elements+in+the+human+genome+using+CRISPR-Cas9.">Functional genetic screens for enhancer elements in the human genome using CRISPR-Cas9.</a> Nature Biotechnology. 34 (2), 192-198 (2016).</li><li>Rezaei, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FMS-Like+Tyrosine+Kinase+3+(FLT3)+and+Nucleophosmin+1+(NPM1)+in+Iranian+Adult+Acute+Myeloid+Leukemia+Patients+with+Normal+Karyotypes:+Mutation+Status+and+Clinical+and+Laboratory+Characteristics.">FMS-Like Tyrosine Kinase 3 (FLT3) and Nucleophosmin 1 (NPM1) in Iranian Adult Acute Myeloid Leukemia Patients with Normal Karyotypes: Mutation Status and Clinical and Laboratory Characteristics.</a> Turkish Journal of Haematology. 34 (4), 300-306 (2017).</li><li>Yaragatti, M., Basilico, C., Dailey, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+active+transcriptional+regulatory+modules+by+the+functional+assay+of+DNA+from+nucleosome-free+regions.">Identification of active transcriptional regulatory modules by the functional assay of DNA from nucleosome-free regions.</a> Genome Research. 18 (6), 930-938 (2008).</li><li>Wilken, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNase+I+hypersensitivity+analysis+of+the+mouse+brain+and+retina+identifies+region-specific+regulatory+elements.">DNase I hypersensitivity analysis of the mouse brain and retina identifies region-specific regulatory elements.</a> Epigenetics Chromatin. 8, 8 (2015).</li><li>Narlikar, L., Ovcharenko, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+regulatory+elements+in+eukaryotic+genomes.">Identifying regulatory elements in eukaryotic genomes.</a> Briefings in Functional Genomics and Proteomics. 8 (4), 215-230 (2009).</li><li>Hnisz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+proto-oncogenes+by+disruption+of+chromosome+neighborhoods.">Activation of proto-oncogenes by disruption of chromosome neighborhoods.</a> Science. 351 (6280), 1454-1458 (2016).</li></ol>

Белок кодирование гена, связанные с sgRNA библиотеки были применены в системе функциональной скрининг для выявления генов и сетей регулирования конкретных клеточных функций через sgRNA обогащения24,25,26 ,27,<sup class="xref"...

Недавние исследования взаимодействия генома показали, что форм ядерного генома человека стабильные топологически связывая доменов (ТЗЖ), которые сохраняются в различных видов и типов клеток. Организация генома в отдельные домены облегчает и ограничивает взаимодействие между регуляторных элементов (например, усилители и промоутеров). Коэффициент CCCTC-привязки (CTCF) связывается с TAD границ и играет решающую роль в ограничение взаимодействия элементов ДНК, которые находятся в соседних TADs1. Однако, генома широкий CTCF привязки данных показал, что, хотя CTCF главным образом взаимодействует с же ДНК сайтов в различных типов клеток, он часто функционирует как хроматина барьер на определенном сайте в одну ячейку типа, но не в другом, предлагая что CTCF функции Вместе с другими мероприятиями в формировании хроматина границы2. Что остается неизвестным является ли граничных элементов (CTCF-привязки сайтов) напрямую связаны с биологической функции CTCF, и как эти ссылки встречаются. Таким образом мы предполагаем, что конкретных сайтов связывания CTCF в геноме непосредственно регулировать образование TADs и промоутер/усилитель взаимодействия в рамках этих доменов или между соседними доменами. Завершение проектов секвенирования генома мыши и последующий анализ эпигеномные человека и обнаружили новых молекулярных и генетических подписей генома. Однако роль конкретных подписей/изменения в регулирование гена и клеточную функцию, а также их молекулярные механизмы, еще не в полной мере понять.
Несколько строк доказательства поддержки, что CTCF-опосредованной TADs представляют функциональные хроматина домены3,4,5. Хотя CTCF главным образом взаимодействует с же ДНК сайтов в различных типов клеток, генома широкий CTCF чип seq данные показали, что CTCF часто действует как барьер хроматина в одной ячейке тип, но не в других2. CTCF играет важную роль в процессе разработки путем посредничества генома организации4,6,7. Нарушение границ CTCF нарушениями усилитель/промоутер взаимодействий и экспрессии генов, приводит к закупорке развития. Это свидетельствует о том, что CTCF при посредничестве TADs являются не только структурные компоненты, но и регулирования подразделений, необходимых для надлежащего enhancer действий и Джин транскрипции5,8,9.
Гомеозисные гены играют решающую роль в ходе эмбрионального развития и они височно и пространственно ограничены в их шаблоны выражений. Локус HOXA образует два стабильных TADs разделения генов передней и задней границы CTCF-связанный элемент в ЭСК и IMR90 клетки1. Последние доклады свидетельствуют, что HoxBlinc, HoxB lncRNA Локус связанные, опосредует формирования CTCF направлены TADs и усилитель/промоутер взаимодействий в локусе HOXB . Это приводит к передней HOXB генов активации во время ESC приверженность и дифференциации10. Кроме того в определенных генов локусов, включая HOXA локус, переоборудование CTCF опосредованной TAD доменов изменил линии конкретный ген выражение профили и был связан с развитием болезни государства11,12. Доказательства поддерживает основную функцию CTCF в координации транскрипции гена и определения личности клетки путем организации генома в функциональных областях.
Несмотря на свою роль в развитии эмбриона, кроветворения HOX гены регулируют функции кроветворных стволовых и прогениторных клеток (HS/PC). Это делается путем контроля баланса между пролиферации и дифференцировки10,13,14,15. Экспрессии Гомеозисных генов жестко регулируется в спецификации и дифференциации кроветворных клеток, с высшим выражением в HS / экспрессии шт. Гомеозисных генов постепенно уменьшается во время созревания, с ее низким уровнем происходящие в дифференцированной гемопоэтические клетки16. Регуляции генов HOX является доминирующей механизмом лейкозных трансформации свойствами самообновления и дифференциации dysregulating HS/ПК, ведущих к лейкозных преобразования17,18. Однако механизм установления и поддержания нормальной против онкогенных выражение модели Гомеозисных генов, а также связанные с ними нормативных сети остается неясным.
ТРИФОСФАТЫ-Cas9 sgRNA библиотека скрининг широко использовался допросить белка кодирование генов19 как гены, также как не кодирования, например lncRNA20 и Мирна21 в разных видов. Однако стоимость использования библиотеки ТРИФОСФАТЫ-Cas9 sgRNA для выявления новых геномных целей остается высокой, потому что высок объём генома часто применяется для проверки проверки библиотеки sgRNA. Наши sgRNA скрининг системы сосредоточена на конкретных генома локусов и оценивает таргетинга sgRNAs через Одношаговая RT-PCR согласно маркер экспрессии генов, например HOXA9. Кроме того Сэнгер, секвенирование подтвердил, что sgRNA была интегрирована в геноме и Indel мутации могут быть обнаружены для определения ориентации сайта sgRNA. Посредством конкретных локусов ТРИФОСФАТЫ-Cas9 генетический скрининг, границы хроматина CBS7/9 была определена в качестве критического регулятор для создания домена онкогенных хроматина и поддержания внематочная HOX картин выражения гена в патогенезе бод 12. метод может широко применяется для определения не только конкретные функции CTCF границы в эмбриональное развитие, кроветворения, leukemogenesis, но и CTCF границы как потенциальных терапевтических целей для будущих эпигеномные терапии.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:689px;" width="689">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Lipofectamine 3000 reagent</td>
			<td style="width:155px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">L3000-008</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Proteinase K</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25530049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Puromycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1113802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stbl3 cells&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>&#160;C737303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEK293T</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MOLM-13</td>
			<td>DSMZ</td>
			<td>ACC 554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">lentiCRISPRv2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>52961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">psPAX2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pGEM&#174;-T Easy Vector Systems&#160;</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A137A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T4 ligase&#160;</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>&#160;M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAquick Gel Extract kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAuick PCR purification kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SingleShot&#8482; SYBR&#174;&#160;Green One-Step Kit</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1725095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">QIAGEN Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td style="width:100px;">12163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">&#160;11965084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI 1640&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal bovine serum (FBS)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">10-082-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin/streptomycin/L-glutamine&#160;</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:100px;">10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lenti-X Concentrator&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Clontech</td>
			<td style="width:100px;">631232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Trypan Blue Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Polybrene</td>
			<td style="width:155px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-134220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Genessee Scientific</td>
			<td>&#160;25-507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">TAE buffer&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>FERB49</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Surveyor&#174; Mutation Detection Kits</td>
			<td style="width:155px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:100px;">706020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Biorad Universal Hood II Gel Doc System</td>
			<td style="width:155px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:100px;">170-8126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Centrifuge 5424 R</td>
			<td style="width:155px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:100px;">5404000138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Digital Dry Baths/Block Heaters</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">88870002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">TSX Series Ultra-Low Freezers</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">TSX40086V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Forma&#8482; Steri-Cult&#8482; CO2&#160;Incubators</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">3308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Herasafe&#8482; KS, Class II Biological Safety Cabinet</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">51022484</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Sorvall&#8482; Legend&#8482; XT/XF Centrifuge Series</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">75004506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Fisherbrand&#8482;&#160;Isotemp&#8482; Water Baths</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">FSGPD02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:263px;">Thermo Scientific&#8482;&#160;Locator&#8482; Plus Rack and Box Systems</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">13-762-353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System</td>
			<td style="width:155px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:100px;">1855195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">MiniAmp&#8482; Thermal Cycler</td>
			<td style="width:155px;">Applied Biosystems technology</td>
			<td style="width:100px;">A37834</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:263px;">Thermo Scientific&#8482;&#160;Owl&#8482; EC300XL2 Compact Power Supply</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">7217581</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:263px;">Thermo Scientific&#8482;&#160;Owl&#8482; EasyCast&#8482; B1 Mini Gel Electrophoresis Systems</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">09-528-178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">VWR&#174; Tube Rotator and Rotisseries</td>
			<td style="width:155px;">VWR International</td>
			<td style="width:100px;">10136-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">VWR&#174; Incubating Mini Shaker</td>
			<td style="width:155px;">VWR International</td>
			<td style="width:100px;">12620-942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Analytical Balance MS104TS/00</td>
			<td style="width:155px;">METTLER TOLEDO</td>
			<td style="width:100px;">30133522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">DS-11 FX and DS-11 FX+ Spectrophotometer</td>
			<td style="width:155px;">DeNovix Inc.</td>
			<td style="width:100px;">DS-11 FX</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hox loci focused crispr/sgrna library screening identifying critical ctcf boundaries

Фактор CCCTC-привязки (CTCF)-опосредованной, стабильной, топологически связывания доменов (ТЗЖ) играют важную роль в ограничение взаимодействия элементов ДНК, которые находятся в соседних TADs. CTCF играет важную роль в регулировании пространственных и временных выражение Гомеозисных генов, которые контролируют эмбрионального развития, патронирования тела, кроветворения и leukemogenesis. Однако остается неизвестным, ли и как HOX локусов связанные CTCF границы регулирования организации хроматина и экспрессии Гомеозисных генов. В текущем протоколе конкретные sgRNA пула библиотека ориентации всех сайтов связывания CTCF в HOXA/B/C/D локусов был создан для изучения последствий нарушения границ связанного CTCF хроматина на TAD формирования и Гомеозисные гены выражение. Через ТРИФОСФАТЫ-Cas9 генетический скрининг, сайт связывания CTCF, расположенный между HOXA7/HOXA9 генов (CBS7/9) были определены как критические регулятор онкогенных хроматина домена, а также имеет важное значение для поддержания внематочная Гомеозисные гены шаблоны выражений в переставить MLL острый миелоидный лейкоз (ОМЛ). Таким образом, эта библиотека sgRNA, скрининг подход обеспечивает новые идеи в CTCF при посредничестве Организации генома в определенных генных локусов и также обеспечивает основу для функциональных характеристик аннотированный генетических нормативных элементов, как кодирование и ««некодирующей, во время обычных биологических процессов в эпоху пост человеческого генома проекта.

ТРИФОСФАТЫ-Cas9 технология является мощным исследовательского инструмента для функциональных геномных исследований. Он быстро заменить обычные генов, изменения методов и имеет высокую полезность для генома широкий и отдельных приложений, ориентированных на ген. Здес...

Watch this Scientific Journal Video about HOX Loci Focused CRISPR/sgRNA Library Screening Identifying Critical CTCF Boundaries at JoVE.com

HOX Loci Focused CRISPR/sgRNA Library Screening Identifying Critical CTCF Boundaries

Библиотеку ТРИФОСФАТЫ/sgRNA был применен для допроса белка кодирование генов. Однако возможности библиотеки sgRNA раскрыть функцию CTCF границы в регуляции генов остается неизведанной. Здесь мы описываем библиотеки конкретных sgRNA Гомеозисных локусов для выяснения функцию CTCF границ в Гомеозисных локусов.

Гомеозисные Локусов Focused ТРИФОСФАТЫ/sgRNA библиотека скрининга выявление критических CTCF границы

CCCTC-binding factor (CTCF)-mediated stable topologically associating domains (TADs) play a critical role in constraining interactions of DNA elements ...

Наша объединились sgRNA называется библиотека скрининга, является мощным генетическим подходом для выявления и оценки биологической функции некодирующих элементов по всему геному. Этот метод позволяет нам изучить влияние нарушения связывающих участков, связанных, хроматических границ или других нормативных элементов на целевое выражение генов. Наш подход может быть использован для определения роли CTCF, длинных некодирующих РНК и усилителей, в регуляции генов HOX в раннем эмбриональном развитии, а также некоторых лейкемий с аномальной подписью гена HOX.Начните эту процедуру с разработки sgRNA ориентации CTCF обязательных сайтов. Клонирование библиотеки sgRNA при подготовке клеток, как описано в текстовом протоколе. Для упаковки лентивируса, cotransfect HEK293 Т-клеток с 20 микрограммами очищенных векторов библиотеки, 15 микрограммов упакованной плазмиды, и 10 микрограммов плазмиды конверта, в течение 48 часов до сбора вирусов.Через 48 часов соберите супернатант вируса и процберите его через мембрану PVDF с низким содержанием белка мощностью 0,45 микрона. Затем сконцентрировать лентивирусный супернатант в 50 раз, используя концентратор. Aliquot концентрированных вирусов и хранить их в минус 80 градусов по Цельсию морозильник.Работа в отдельных скважинах 12 пластины скважины для смешивания клеток MOLM13 с различными дозами концентрированного лентивируса для шести общих групп. Немедленно центрифуга эти смеси на 1000 раз g в течение двух часов при 33 градусах по Цельсию. Передача 12 пластин хорошо обратно в инкубатор при 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа в течение четырех часов.Аккуратно аспирировать супернатант, не нарушая клеточной палитры, и вновь приостановить трансдуцированных клеток со свежими дополнены RPMI 1640 Medium. Затем перенесите повторно приостановленные клетки в колбы T25 и инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение 48 часов без пуромицина. После 48 часов разделить эти клетки на две колбы, экспериментальная группа лечение с одним микролитером на миллилитр пуромицин в течение пяти дней, и контрольная группа без лечения пуромицина в течение пяти дней.Измерьте оптимизированное значение МВД для трансдукции, разделив количество живых клеток, обработанных пуромицином, на количество клеток без лечения пуромицином. Чтобы вывести клетки из сгустиной библиотеки, заразить 1,5 миллиона клеток MOLM13 в 6 хорошо пластины с 0,3 MOI sgRNA объединили лентивирус в среде. Используйте клетки без лентивирусной инфекции в качестве контроля.Немедленно центрифуга шесть пластин хорошо при 1000 раз g в течение двух часов при 33 градусах по Цельсию, чтобы spinfect клеток. Затем перенесите пластины обратно в инкубатор при 37 градусах по Цельсию в 5%углекислом газе в течение четырех часов. Аккуратно аспирировать супернатант, не нарушая клеточной палитры, и вновь приостановить трансдуцированных клеток со свежей средой.Затем перенесите клетки в колбы Т25 и инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение 48 часов без пуромицина. После 48 часов, лечить клетки с одним микрограммом на миллилитр пуромицин в течение пяти дней. Обмен на свежую среду через два дня и поддержание оптимальной плотности клеток.Семя одного клона в 96 хорошо пластин с ограничением методов разбавления. Инкубировать эти одного клона на 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа. Культура их в течение 3-4 недель.Подсчитайте sgRNA интегрированные клетки MOLM13 с 0.4%Trypan Голубое окрашивание раствора и после этого перенесите 10.000 живых клеток в наилучшим образом к плите 96 наилучшим образом PCR. Центрифуга пластины в 1000 раз г в течение пяти минут, а затем тщательно удалить и отказаться от супернатанта с пипеткой. Избегайте нарушений клеточной палитры.После мытья клеток, как описано в тексте добавить 50 микролитров клеток лиза мастер смеси к каждому хорошо. Pipette вверх и вниз пять раз, чтобы вновь приостановить палитру клеток. Инкубировать смесь в течение 10 минут при комнатной температуре.Затем перенесите смесь до 37 градусов по Цельсию в течение пяти минут, а затем 75 градусов по Цельсию в течение дополнительных пяти минут. Теперь добавьте один микролитр лизата клетки к скважинам ПЦР, содержащим смесь реакции RT qPCR. Эта смесь включает в себя маркер генов вперед и обратной грунтовка, обратная транскриптаза и одношаговая смесь реакции.Вы запустите обратную реакцию транскрипции в течение 10 минут при 50 градусах по Цельсию с последующим активацией полимеризации и ДНК-денатурации в течение одной минуты при 95 градусах по Цельсию. Выполните RT PCR с 40 циклами реакции ПЦР, как описано в текстовом протоколе. Проверить HOXA9 снижение экспрессии клонов через Сэнгер секвенирования и выполнять ПЦР с ДНК генома MOLM13, как описано в текстовом протоколе.Извлекайте и очищать продукты ПЦР с помощью комплекта для очистки ПЦР. Ligate очищенных продуктов ПЦР в вектор T с буфером перевязки T4, T вектор ДНК, ПЦР ДНК и T4 лигазы. Поместите перевязку смесь в инкубатор при 16 градусов по Цельсию в одночасье.Передача перевязки смесь в DH5 альфа компетентных клеток и пластины на LB ампициллин антибиотик агар пластины. Инкубировать пластины на ночь при 37 градусах по Цельсию. Выберите одиночные клоны от плиты LB и проверите их genotyping и секвенированием Sanger.Настройка группы смеси гететеродуплекса с 200 нанограммами эталона и 200 нанограммами испытательных ПЦР ампликонов в 0,2 миллилитровой ПЦР-трубке. Включите homoduplex смесь группы только 400 нанограммов ссылки ПЦР ампликонов в качестве контроля. Отдельно инкубировать гетеродуплексную и гомодуплексную смесь при 95 градусах по Цельсию в течение пяти минут в стакане за один литр, наполненном 800 миллилитров воды.Затем постепенно охладить смеси до комнатной температуры до аннеальной и сформировать гетеродуплекс или гомодуплекс. Теперь отдельно усваивается 400 нанограммов анеродюмерной гетеродуплексной и гомодуплексной смеси с одним микролитером ядра обнаружения инделявов и двумя микролитров буфера реакции нуклеазы при 42 градусах цельсия в течение 60 минут. Проанализируйте переваренные образцы с помощью электрофорезов агарозного геля.ДНК гетеродуплексной смеси должна быть разрезана на мелкие фрагменты, а ДНК гомодуплекса не должна быть разрезана. sgRNA ориентации MOLM13 положительные клоны были подтверждены методом RT qPCR, на основе уровня экспрессии генов HOXA9 с сравнением с контрольных клеток. Из 528 сохранившихся клонов, показанных на экране, 10 клонов продемонстрировали более чем 50%-ное снижение уровня HOXA9.sgRNAs интегрированы в HOXA9 уменьшены, HOXA9 неизменным и HOXA9 увеличение клонов, были дополнительно подтверждены ПЦР усиление sgRNA и идентификации по последовательности Sanger. Шесть из десяти клонов, показывающих снижение уровня HOXA9, содержали sgRNAs, нацеленные на сайт CBS79, как это определено секвенированием Sanger. Индал мутации интегрированных sgRNA положительных клонов были определены на основе ПЦР генотипирования и нуклеазы пищеварения.Гетерозиготное удаление участка CTCF, расположенного между генами HOXA7 и HOXA9, было выявлено с помощью генотипирования на основе ПЦР. HOXA9-уменьшенные клоны 5, 6, 28 и 121 exhibited deletion в месте граници CBS79. Аналогичные результаты наблюдались для indel мутаций в CBS79 сайт, которые были проанализированы нуклеазы пищеварения анализа.При выполнении этой процедуры, важно сделать равное количество гетеродуплексов и гомодуплексов для того, чтобы обнаружить sgRNA-индуцированной инделя мутаций через анализ пищеварения нуклеазы. Наш подход позволяет использовать выбранный маркер, проводить секвенирование нового поколения на целевом гене, чтобы обнаружить влияние гена на лейкемогенез. В целом наш подход предотвращает RPC для функциональной коррекции и сокращения отмеченных генетических нерегулярных элементов во время нормального биологического процесса и лейкемогенеза в посмертной ошибке проекта генома.

Research

JoVE Journal

Genetics

HOX Loci Focused CRISPR/sgRNA Library Screening Identifying Critical CTCF Boundaries

A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source

Универсальный протокол для крупномасштабных gRNA библиотека производства из любого источника ДНК

The popularity of the CRISPR/Cas9 system for both genome and epigenome engineering stems from its simplicity and adaptability. An effector (the Cas9 ...

G2-seq: A High Throughput Sequencing-based Technique for Identifying Late Replicating Regions of the Genome

G2-seq: Высокая пропускная способность на основе последовательности техника для выявления поздно репликации областей генома

Numerous techniques have been developed to follow the progress of DNA replication through the S phase of the cell cycle. Most of these techniques have ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Надежные ДНК изоляции и высокопроизводительного секвенирования строительство библиотеки для образцов гербария

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

Ретроспективное микроРНК последовательности: Комплементарной ДНК библиотеки подготовка протокол с помощью образцов формалин Исправлена парафин врезанных РНК

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of ...

Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen

Сверхнизкое ввода геном последовательность подготовки библиотеки от Tardigrade единичная

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state ...

Bronchoalveolar Lavage Exosomes in Lipopolysaccharide-induced Septic Lung Injury

Бронхоальвеолярный лаваж Exosomes в Липополисахарид индуцированной септик легких травм

Acute lung injury (ALI) and acute respiratory distress syndrome (ARDS) represent a heterogeneous group of lung diseases which continues to have a high ...

Mating-based Overexpression Library Screening in Yeast

На основе спаривания гиперэкспрессия библиотека скрининга в дрожжи

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool ...

Screening Cotton Genotypes for Reniform Nematode Resistance

Скрининг Хлопковых Генотипов для Сопротивления Нематод Рениформ

A rapid non-destructive reniform nematode (Rotylenchulus reniformis) screening protocol is needed for the development of resistant cotton (Gossypium ...

Identifying Mutations by High Resolution Melting in a TILLING Population of Rice

Выявление мутаций путем таяния высокого разрешения в TILLING населения риса

Target Induced Local Lesions In Genomes (TILLING) is a strategy of reverse genetics for the high-throughput screening of induced mutations. However, the ...

Screening and Identification of RNA Silencing Suppressors from Secreted Effectors of Plant Pathogens

Скрининг и идентификация РНК Silencing супрессоров от секретных эффектов растительных патогенов

RNA silencing is an evolutionarily conserved, sequence-specific gene regulation mechanism in eukaryotes. Several plant pathogens have evolved proteins ...