Name: hox loci focused crispr/sgrna library screening identifying critical ctcf boundaries
Uploaded: 2019-03-31T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about HOX Loci Focused CRISPR/sgRNA Library Screening Identifying Critical CTCF Boundaries at JoVE.com

Los autores también agradecen a Nicholas Cesari para editar el manuscrito. El trabajo fue financiado por becas del Instituto Nacional de salud (S.H., R01DK110108, R01CA204044).

1. CTCF sgRNALibrary diseño de una herramienta en línea
<ol><li>Diseño de lo sgRNA dirigidos a sitios de unión de CTCF en los loci HOX humanos usando la herramienta diseñador de la plataforma (GPP) de la perturbación genética (https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design).</li>
	<li>Sintetizar un total de 1.070 sgRNAs de sgRNAs a 303 al azar genes de segmentación, 60 controles positivos, controles objetivos de humanos no 500 y 207 CTCF elementos o lncRNA dirigidos a genes (...

<ol>
	<li>Dixon, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topological+domains+in+mammalian+genomes+identified+by+analysis+of+chromatin+interactions.">Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions.</a> Nature. 485 (7398), 376-380 (2012).</li><li>Cuddapah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+the+insulator+binding+protein+CTCF+in+chromatin+barrier+regions+reveals+demarcation+of+active+and+repressive+domains.">Global analysis of the insulator binding protein CTCF in chromatin barrier regions reveals demarcation of active and repressive domains.</a> Genome research. 19 (1), 24-32 (2009).</li><li>Phillips, J. E., Corces, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF:+master+weaver+of+the+genome.">CTCF: master weaver of the genome.</a> Cell. 137 (7), 1194-1211 (2009).</li><li>Tang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF-Mediated+Human+3D+Genome+Architecture+Reveals+Chromatin+Topology+for+Transcription.">CTCF-Mediated Human 3D Genome Architecture Reveals Chromatin Topology for Transcription.</a> Cell. 163 (7), 1611-1627 (2015).</li><li>Lupianez, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruptions+of+topological+chromatin+domains+cause+pathogenic+rewiring+of+gene-enhancer+interactions.">Disruptions of topological chromatin domains cause pathogenic rewiring of gene-enhancer interactions.</a> Cell. 161 (5), 1012-1025 (2015).</li><li>Dowen, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+cell+identity+genes+occurs+in+insulated+neighborhoods+in+mammalian+chromosomes.">Control of cell identity genes occurs in insulated neighborhoods in mammalian chromosomes.</a> Cell. 159 (2), 374-387 (2014).</li><li>Phillips-Cremins, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architectural+protein+subclasses+shape+3D+organization+of+genomes+during+lineage+commitment.">Architectural protein subclasses shape 3D organization of genomes during lineage commitment.</a> Cell. 153 (6), 1281-1295 (2013).</li><li>Narendra, V., Bulajic, M., Dekker, J., Mazzoni, E. O., Reinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF-mediated+topological+boundaries+during+development+foster+appropriate+gene+regulation.">CTCF-mediated topological boundaries during development foster appropriate gene regulation.</a> Genes &amp; Development. 30 (24), 2657-2662 (2016).</li><li>Narendra, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF+establishes+discrete+functional+chromatin+domains+at+the+Hox+clusters+during+differentiation.">CTCF establishes discrete functional chromatin domains at the Hox clusters during differentiation.</a> Science. 347 (6225), 1017-1021 (2015).</li><li>Deng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HoxBlinc+RNA+Recruits+Set1/MLL+Complexes+to+Activate+Hox+Gene+Expression+Patterns+and+Mesoderm+Lineage+Development.">HoxBlinc RNA Recruits Set1/MLL Complexes to Activate Hox Gene Expression Patterns and Mesoderm Lineage Development.</a> Cell Reports. 14 (1), 103-114 (2016).</li><li>Patel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberrant+TAL1+activation+is+mediated+by+an+interchromosomal+interaction+in+human+T-cell+acute+lymphoblastic+leukemia.">Aberrant TAL1 activation is mediated by an interchromosomal interaction in human T-cell acute lymphoblastic leukemia.</a> Leukemia. 28 (2), 349-361 (2014).</li><li>Luo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF+boundary+remodels+chromatin+domain+and+drives+aberrant+HOX+gene+transcription+in+acute+myeloid+leukemia.">CTCF boundary remodels chromatin domain and drives aberrant HOX gene transcription in acute myeloid leukemia.</a> Blood. 132 (8), 837-848 (2018).</li><li>Dou, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medial+HOXA+genes+demarcate+haematopoietic+stem+cell+fate+during+human+development.">Medial HOXA genes demarcate haematopoietic stem cell fate during human development.</a> Nature Cell Biology. 18 (6), 595-606 (2016).</li><li>Lawrence, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+expression+of+the+Hoxa-9+homeobox+gene+impairs+the+proliferation+and+repopulating+ability+of+hematopoietic+stem+cells.">Loss of expression of the Hoxa-9 homeobox gene impairs the proliferation and repopulating ability of hematopoietic stem cells.</a> Blood. 106 (12), 3988-3994 (2005).</li><li>Deng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=USF1+and+hSET1A+mediated+epigenetic+modifications+regulate+lineage+differentiation+and+HoxB4+transcription.">USF1 and hSET1A mediated epigenetic modifications regulate lineage differentiation and HoxB4 transcription.</a> PLOS Genetics. 9 (6), e1003524 (2013).</li><li>Rawat, V. P., Humphries, R. K., Buske, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+Hox:+the+role+of+ParaHox+genes+in+normal+and+malignant+hematopoiesis.">Beyond Hox: the role of ParaHox genes in normal and malignant hematopoiesis.</a> Blood. 120 (3), 519-527 (2012).</li><li>Alharbi, R. A., Pettengell, R., Pandha, H. S., Morgan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+HOX+genes+in+normal+hematopoiesis+and+acute+leukemia.">The role of HOX genes in normal hematopoiesis and acute leukemia.</a> Leukemia. 27 (5), 1000-1008 (2013).</li><li>Rice, K. L., Licht, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HOX+deregulation+in+acute+myeloid+leukemia.">HOX deregulation in acute myeloid leukemia.</a> Journal of Clinical Investigation. 117 (4), 865-868 (2007).</li><li>Bassett, A. R., Kong, L., Liu, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+CRISPR+library+for+high-throughput+genetic+screening+in+Drosophila+cells.">A genome-wide CRISPR library for high-throughput genetic screening in Drosophila cells.</a> Journal of Genetics and Genomics. 42 (6), 301-309 (2015).</li><li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+deletion+screening+of+human+long+non-coding+RNAs+using+a+paired-guide+RNA+CRISPR-Cas9+library.">Genome-scale deletion screening of human long non-coding RNAs using a paired-guide RNA CRISPR-Cas9 library.</a> Nature Biotechnology. 34 (12), 1279-1286 (2016).</li><li>Kurata, J. S., Lin, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-focused+CRISPR-Cas9+library+screen+reveals+fitness-associated+miRNAs.">MicroRNA-focused CRISPR-Cas9 library screen reveals fitness-associated miRNAs.</a> RNA. 24 (7), 966-981 (2018).</li><li>Collins, C. T., Hess, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+HOXA9+in+leukemia:+dysregulation,+cofactors+and+essential+targets.">Role of HOXA9 in leukemia: dysregulation, cofactors and essential targets.</a> Oncogene. 35 (9), 1090-1098 (2016).</li><li>Kroon, E., Thorsteinsdottir, U., Mayotte, N., Nakamura, T., Sauvageau, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NUP98-HOXA9+expression+in+hemopoietic+stem+cells+induces+chronic+and+acute+myeloid+leukemias+in+mice.">NUP98-HOXA9 expression in hemopoietic stem cells induces chronic and acute myeloid leukemias in mice.</a> The EMBO Journal. 20 (3), 350-361 (2001).</li><li>Koike-Yusa, H., Li, Y., Tan, E. P., Velasco-Herrera Mdel, C., Yusa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+recessive+genetic+screening+in+mammalian+cells+with+a+lentiviral+CRISPR-guide+RNA+library.">Genome-wide recessive genetic screening in mammalian cells with a lentiviral CRISPR-guide RNA library.</a> Nature Biotechnology. 32 (3), 267-273 (2014).</li><li>Shalem, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+CRISPR-Cas9+knockout+screening+in+human+cells.">Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells.</a> Science. 343 (6166), 84-87 (2014).</li><li>Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+screens+in+human+cells+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system.</a> Science. 343 (6166), 80-84 (2014).</li><li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+sgRNAs+facilitate+CRISPR/Cas9-mediated+mouse+genome+targeting.">Dual sgRNAs facilitate CRISPR/Cas9-mediated mouse genome targeting.</a> The FEBS Journal. 281 (7), 1717-1725 (2014).</li><li>Sanjana, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+interrogation+of+functional+elements+in+the+noncoding+genome.">High-resolution interrogation of functional elements in the noncoding genome.</a> Science. 353 (6307), 1545-1549 (2016).</li><li>Rajagopal, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+mapping+of+regulatory+DNA.">High-throughput mapping of regulatory DNA.</a> Nature Biotechnology. 34 (2), 167-174 (2016).</li><li>Korkmaz, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genetic+screens+for+enhancer+elements+in+the+human+genome+using+CRISPR-Cas9.">Functional genetic screens for enhancer elements in the human genome using CRISPR-Cas9.</a> Nature Biotechnology. 34 (2), 192-198 (2016).</li><li>Rezaei, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FMS-Like+Tyrosine+Kinase+3+(FLT3)+and+Nucleophosmin+1+(NPM1)+in+Iranian+Adult+Acute+Myeloid+Leukemia+Patients+with+Normal+Karyotypes:+Mutation+Status+and+Clinical+and+Laboratory+Characteristics.">FMS-Like Tyrosine Kinase 3 (FLT3) and Nucleophosmin 1 (NPM1) in Iranian Adult Acute Myeloid Leukemia Patients with Normal Karyotypes: Mutation Status and Clinical and Laboratory Characteristics.</a> Turkish Journal of Haematology. 34 (4), 300-306 (2017).</li><li>Yaragatti, M., Basilico, C., Dailey, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+active+transcriptional+regulatory+modules+by+the+functional+assay+of+DNA+from+nucleosome-free+regions.">Identification of active transcriptional regulatory modules by the functional assay of DNA from nucleosome-free regions.</a> Genome Research. 18 (6), 930-938 (2008).</li><li>Wilken, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNase+I+hypersensitivity+analysis+of+the+mouse+brain+and+retina+identifies+region-specific+regulatory+elements.">DNase I hypersensitivity analysis of the mouse brain and retina identifies region-specific regulatory elements.</a> Epigenetics Chromatin. 8, 8 (2015).</li><li>Narlikar, L., Ovcharenko, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+regulatory+elements+in+eukaryotic+genomes.">Identifying regulatory elements in eukaryotic genomes.</a> Briefings in Functional Genomics and Proteomics. 8 (4), 215-230 (2009).</li><li>Hnisz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+proto-oncogenes+by+disruption+of+chromosome+neighborhoods.">Activation of proto-oncogenes by disruption of chromosome neighborhoods.</a> Science. 351 (6280), 1454-1458 (2016).</li></ol>

Gen codificante de proteínas relacionadas con bibliotecas sgRNA se han aplicado en un sistema de evaluación funcional para identificar genes y redes de regulación de funciones celulares específicas sgRNA enriquecimiento24,25,26 ,27,28. Región no codificante varias relacionadas con sgRNA bibliotecas también fueron demostradas en pantallas funcionales esp...

Estudios recientes de interacción genoma revelaron que las formas del genoma nuclear humano estable dominios topológicamente asociaba (TADs) que se conservan a través de especies y tipos celulares. La organización del genoma en dominios separados facilita y restringe las interacciones entre elementos reguladores (por ejemplo, promotores y potenciadores). El factor de Unión CCCTC (CTCF) se une a límites TAD y juega un papel fundamental en las interacciones vinculantes de elementos de ADN que se encuentran en el vecino TADs1. Sin embargo, los datos de Unión CTCF amplia del genoma revelaron que aunque CTCF interactúa principalmente con los mismos sitios de ADN en diferentes tipos celulares, a menudo funciona como una barrera de la cromatina en un sitio específico en una celda tipo pero no en el otro, lo que sugiere que las funciones CTCF junto con otras actividades en la formación de cromatina límites2. Lo que se desconoce es si los elementos de frontera (sitios de unión a CTCF) están directamente relacionados con la función biológica de CTCF y cómo se producen estos enlaces. Por lo tanto, presumimos que sitios específicos de unión de CTCF en el genoma directamente regulan la formación de TADs y controlan las interacciones promotor/enhancer dentro de estos dominios o entre los dominios vecinos. La terminación de los humanos y proyectos de secuenciación de genoma de ratón y posterior análisis epigenéticos han descubierto nuevas firmas moleculares y genéticas del genoma. Sin embargo, el papel de las firmas/modificaciones específicas en la regulación de genes y función celular, así como sus mecanismos moleculares, han de entenderse completamente.
Múltiples líneas de evidencia apoyan que el TADs CTCF-mediada representa cromatina funcional de dominios3,4,5. Aunque CTCF interactúa principalmente con los mismos sitios de ADN en diferentes tipos celulares, datos del CTCF ChIP-seq amplia genoma revelaron que CTCF a menudo funciona como una barrera de cromatina en tipo de una célula pero no en los otros2. CTCF juega un papel esencial durante el desarrollo por mediación de genoma organización4,6,7. Alteración de límites CTCF deteriorado interacciones reforzador/promotor y expresión génica, llevando a la obstrucción del desarrollo. Esto sugiere que el CTCF mediado TADs no sólo son componentes estructurales, sino también unidades regulatorias necesarias para reforzador adecuado acción y gene transcripción5,8,9.
Genes HOX desempeñan papeles importantes durante el desarrollo embrionario y se limitan temporal y espacial en sus patrones de expresión. El locus HOXA forma dos TADs estables separación de genes anteriores y posteriores, por un elemento límite asociado de CTCF en hESCs y IMR90 las células1. Informes recientes demuestran que HoxBlinc, un HoxB locus asociado lncRNA, interviene en la formación de CTCF dirigido TADs e interacciones reforzador/promotor en el locus HOXB . Esto conduce a la activación de gen HOXB anterior durante el compromiso y la diferenciación de ESC10. Además, en lugares geométricos del gene específicos incluyendo el lugar geométrico HOXA , alteración de CTCF mediada por perfiles de expresión de gen específico de linaje TAD dominios cambiados y se asoció con el desarrollo de la enfermedad los Estados11,12. La evidencia apoya una función primaria de CTCF en coordinación de transcripción genética y determinar la identidad de la célula mediante la organización del genoma en dominios funcionales.
A pesar de su papel en el desarrollo embrionario, durante la hematopoyesis, genes HOX regulan función hematopoyética de la célula (capítulo/PC) del vástago y del progenitor. Esto se hace controlando el equilibrio entre la proliferación y diferenciación10,13,14,15. La expresión de genes HOX se regula firmemente a lo largo de la especificación y diferenciación de células hematopoyéticas, con la más alta expresión en HS / Uds. HOX genes disminuyen gradualmente durante la maduración, con sus niveles más bajos que ocurre en había distinguido células hematopoyéticas16. Dysregulation del gene HOX es un mecanismo dominante de la transformación leucémica por propiedades de auto renovación y diferenciación de dysregulating de HS/PCs a transformación leucémica17,18. Sin embargo, el mecanismo de establecer y mantener normal frente a patrones de la expresión oncogénica de genes HOX como redes de regulación asociadas sigue siendo confuso.
Proyección de biblioteca CRISPR Cas9 sgRNA ha sido ampliamente utilizado para interrogar la proteína-codificación genes19 como bien como no codificantes de genes, como lncRNA20 y miRNA21 en diferentes especies. Sin embargo, el costo de usar la biblioteca de sgRNA CRISPR Cas9 para identificar nuevas dianas genómicas sigue siendo alto, porque la secuencia del genoma de alto rendimiento se aplica a menudo para comprobar la proyección de la biblioteca de sgRNA. Nuestro sgRNA sistema se centra en los loci del genoma específicas y evalúa los objetivos sgRNAs a través de RT-PCR de un paso según la expresión del gen marcador, como HOXA9. Además, puede detectarse Sanger secuenciación confirmó que los sgRNA fue integrado en el genoma y las mutaciones Indel identificar lo sgRNA a sitio. A través de la investigación genética de CRISPR Cas9 loci específicos, el límite de la cromatina CBS7/9 ha sido identificado como un regulador crítico para establecer dominio de cromatina oncogénico y mantener patrones de expresión de gene HOX ectópicos en patogenesia AML 12. el método puede ser ampliamente aplicado para identificar no sólo la función específica de límite de CTCF en desarrollo embrionario, la hematopoyesis, leukemogenesis, pero también límite CTCF como potenciales dianas terapéuticas para la futura terapia epigenética.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:689px;" width="689">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Lipofectamine 3000 reagent</td>
			<td style="width:155px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">L3000-008</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Proteinase K</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25530049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Puromycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1113802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stbl3 cells&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>&#160;C737303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEK293T</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MOLM-13</td>
			<td>DSMZ</td>
			<td>ACC 554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">lentiCRISPRv2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>52961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">psPAX2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pGEM&#174;-T Easy Vector Systems&#160;</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A137A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T4 ligase&#160;</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>&#160;M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAquick Gel Extract kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAuick PCR purification kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SingleShot&#8482; SYBR&#174;&#160;Green One-Step Kit</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1725095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">QIAGEN Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td style="width:100px;">12163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">&#160;11965084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI 1640&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal bovine serum (FBS)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">10-082-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin/streptomycin/L-glutamine&#160;</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:100px;">10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lenti-X Concentrator&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Clontech</td>
			<td style="width:100px;">631232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Trypan Blue Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Polybrene</td>
			<td style="width:155px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-134220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Genessee Scientific</td>
			<td>&#160;25-507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">TAE buffer&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>FERB49</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Surveyor&#174; Mutation Detection Kits</td>
			<td style="width:155px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:100px;">706020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Biorad Universal Hood II Gel Doc System</td>
			<td style="width:155px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:100px;">170-8126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Centrifuge 5424 R</td>
			<td style="width:155px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:100px;">5404000138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Digital Dry Baths/Block Heaters</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">88870002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">TSX Series Ultra-Low Freezers</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">TSX40086V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Forma&#8482; Steri-Cult&#8482; CO2&#160;Incubators</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">3308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Herasafe&#8482; KS, Class II Biological Safety Cabinet</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">51022484</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Sorvall&#8482; Legend&#8482; XT/XF Centrifuge Series</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">75004506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Fisherbrand&#8482;&#160;Isotemp&#8482; Water Baths</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">FSGPD02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:263px;">Thermo Scientific&#8482;&#160;Locator&#8482; Plus Rack and Box Systems</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">13-762-353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System</td>
			<td style="width:155px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:100px;">1855195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">MiniAmp&#8482; Thermal Cycler</td>
			<td style="width:155px;">Applied Biosystems technology</td>
			<td style="width:100px;">A37834</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:263px;">Thermo Scientific&#8482;&#160;Owl&#8482; EC300XL2 Compact Power Supply</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">7217581</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:263px;">Thermo Scientific&#8482;&#160;Owl&#8482; EasyCast&#8482; B1 Mini Gel Electrophoresis Systems</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">09-528-178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">VWR&#174; Tube Rotator and Rotisseries</td>
			<td style="width:155px;">VWR International</td>
			<td style="width:100px;">10136-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">VWR&#174; Incubating Mini Shaker</td>
			<td style="width:155px;">VWR International</td>
			<td style="width:100px;">12620-942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Analytical Balance MS104TS/00</td>
			<td style="width:155px;">METTLER TOLEDO</td>
			<td style="width:100px;">30133522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">DS-11 FX and DS-11 FX+ Spectrophotometer</td>
			<td style="width:155px;">DeNovix Inc.</td>
			<td style="width:100px;">DS-11 FX</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hox loci focused crispr/sgrna library screening identifying critical ctcf boundaries

Factor de Unión CCCTC (CTCF)-mediado estable topológicamente asociar dominios (TADs) juegan un papel crítico en las interacciones vinculantes de elementos de ADN que se encuentran en la vecina TADs. CTCF juega un papel importante en la regulación de la expresión espacial y temporal de los genes HOX que controlan el desarrollo embrionario, modelar cuerpo, hematopoyesis y leukemogenesis. Sin embargo, sigue siendo en gran parte desconocido si y cómo HOX loci asociados CTCF límites regulan la organización de la cromatina y expresión de genes HOX . En el protocolo actual, se ha generado una biblioteca los sgRNA específicos dirigidos a los sitios de unión de CTCF en los loci HOXA/B/C/D para examinar los efectos de alterar límites de cromatina asociada de CTCF en formación TAD y gene HOX expresión. A través de CRISPR Cas9 screening genético, el sitio de unión de CTCF entre los genes HOXA7/HOXA9 (CBS7/9) ha sido identificado como un regulador crítico de dominio de cromatina oncogénicos, como importante para el mantenimiento de genes HOX ectópico patrones de expresión en leucemia mieloide aguda (AML) reordenado MLL. Así, esta biblioteca sgRNA proyección enfoque proporciona nuevas penetraciones en CTCF mediada por genoma organización en loci gen específico y también proporciona una base para la caracterización funcional de los elementos reguladoras genéticos anotados, tanto de codificación y cubierta, durante los procesos biológicos normales en la época del proyecto genoma humano posterior.

CRISPR Cas9 tecnología es una herramienta potente para los estudios de genómica funcional. Está rápidamente reemplazando genes convencionales técnicas de edición y tiene gran utilidad para aplicaciones gene-centrado de genoma e individuales. Aquí, la primera individual clonados loci específicos CRISPR Cas9 de v. sgRNA biblioteca contiene 1.070 sgRNAs de sgRNAs a 303 al azar genes de segmentación, 60 controles positivos, controles objetivos de humanos no 500 y 207 CTCF elementos o...

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HOX Loci Focused CRISPR/sgRNA Library Screening Identifying Critical CTCF Boundaries

Una biblioteca CRISPR/sgRNA ha sido aplicada a interrogar a genes de la proteína-codificación. Sin embargo, la factibilidad de una biblioteca sgRNA para descubrir la función de un límite CTCF en Regulación génica sigue siendo inexplorada. Aquí, describimos una biblioteca de sgRNA específicos HOX loci para aclarar la función de los límites CTCF en loci HOX .

HOX Loci enfocado CRISPR/sgRNA biblioteca proyección identificación crítica CTCF límites

CCCTC-binding factor (CTCF)-mediated stable topologically associating domains (TADs) play a critical role in constraining interactions of DNA elements ...

Nuestro sgRNA agrupado llamado el cribado de la biblioteca, es un poderoso enfoque genético para identificar y evaluar la función biológica de los elementos no codificantes en todo el genoma. Esta técnica nos permite examinar el efecto de alterar los sitios de unión asociados, límites cromáticos u otros elementos reguladores en la expresión de genes específicos. Nuestro enfoque se puede utilizar para identificar el papel del CTCF, los ARN y potenciadores no codificantes largos, en la regulación del gen HOX en el desarrollo embrionario temprano, así como ciertas leucemias con una firma aberrante del gen HOX.Comience este procedimiento con el diseño de un sgRNA dirigido a sitios de enlace CTCF. Clonación de la biblioteca sgRNA en preparación de celdas como se describe en el protocolo de texto. Para empaquetar el lentivirus, cotransfectas células T HEK293 con 20 microgramos de vectores de biblioteca purificados, 15 microgramos del plásmido envasado y 10 microgramos del plásmido de la envolvente, durante 48 horas antes de la cosecha de los virus.Después de 48 horas, recoger el sobrenadante del virus y filtrarlo a través de una membrana PVDF de baja unión a proteínas de 0,45 micras. A continuación, concentrar el sobrenadante lentiviral por 50 veces, utilizando el concentrador. Aliquot los virus concentrados y almacenarlos en un congelador de menos 80 grados centígrados.Trabajar en pozos separados de una placa de 12 pozos para mezclar células MOLM13 con varias dosis del lentivirus concentrado para seis grupos totales. Centrifugar inmediatamente estas mezclas a 1000 veces g durante dos horas a 33 grados centígrados. Transfiera las 12 placas de pozo a la incubadora a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante cuatro horas.Aspirar suavemente el sobrenadante sin alterar la paleta de celdas, y volver a suspender las células transducidas con RPMI 1640 Medium suplementado fresco. Luego transfiera las células re-suspendidas a matraces T25 e incubar a 37 grados centígrados durante 48 horas sin puromicina. Después de 48 horas dividir estas células en dos matraces, un grupo experimental tratado con un microlitro por mililitro de puromicina durante cinco días, y un grupo de control sin tratamiento con puromicina durante cinco días.Mida el valor de MOI optimizado para la transducción dividiendo el número de células vivas tratadas con puromicina por el número de células sin tratamiento con puromicina. Para transducir las células con la biblioteca agrupada, infecte 1,5 millones de células MOLM13 en una placa de 6 pozos con 0,3 MOI de lentivirus agrupado de sgRNA en medio. Utilice las células sin la infección por lentivirus como control.Centrifugar inmediatamente la placa de seis pozos a 1000 veces g durante dos horas a 33 grados centígrados para espinofecar las células. Luego, transfiera las placas de vuelta a la incubadora a 37 grados centígrados en un 5% de dióxido de carbono durante cuatro horas. Aspirar suavemente el sobrenadante sin alterar la paleta de celdas y volver a suspender las células transducidas con un medio fresco.Luego, transfiera las células a los matraces T25 e incubar a 37 grados centígrados durante 48 horas sin puromicina. Después de 48 horas, tratar las células con un microgramo por mililitro de puromicina durante cinco días. Intercambie por medio fresco después de dos días y mantenga una densidad celular óptima.Semilla el clon único en 96 placas de pozo con métodos de dilución limitadores. Incubar estos clones individuales a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Cultivarlos durante 3-4 semanas.Cuente las células MOLM13 integradas sgRNA con una tinción de solución 0.4%Trypan Blue y luego transfiera 10.000 células vivas por pozo a una placa PCR de 96 pozos. Centrifugar la placa a 1000 veces g durante cinco minutos y luego retirar y desechar completamente el sobrenadante con una pipeta. Evite alterar la paleta de celdas.Después de lavar las células como se describe en el texto añadir 50 microlitros de la mezcla maestra de la lysis celular a cada pozo. Pipetear hacia arriba y hacia abajo cinco veces para volver a suspender la paleta de celdas. Incubar la mezcla durante 10 minutos a temperatura ambiente.Luego, transfiera la mezcla a 37 grados centígrados durante cinco minutos, y luego 75 grados centígrados durante cinco minutos adicionales. Ahora agregue un microlitro de izado celular a los pozos de PCR que contienen la mezcla de reacción RT qPCR. Esta mezcla incluye los genes marcadores hacia adelante y hacia atrás, la transcriptasa inversa y la mezcla de reacción de un solo paso.Ejecute la reacción de transcripción inversa durante 10 minutos a 50 grados centígrados seguido de la activación de la polimerización y la desnaturalización del ADN durante un minuto a 95 grados centígrados. Realice RT PCR con 40 ciclos de reacción PCR como se detalla en el protocolo de texto. Verifique los clones de expresión disminuido HOXA9 a través de la secuenciación de Sanger y realice PCR con ADN genómico MOLM13 como se describe en el protocolo de texto.Extraiga y purifique los productos PCR con el kit de purificación de PCR. Ligar los productos de PCR purificados en el vector T con tampón de ligadura T4, ADN vectorial T, ADN PCR y ligasa T4. Coloque la mezcla de ligadura en una incubadora a 16 grados centígrados durante la noche.Transfiera la mezcla de ligadura en células y placas alfa competentes DH5 sobre una placa de agar antibiótico de ampicilina LB. Incubar las placas durante la noche a 37 grados centígrados. Elija los clones individuales de la placa LB y verifiquelos mediante genotipado y secuenciación de Sanger.Configure el grupo de mezclas heteroduplex con 200 nanogramos de la referencia y 200 nanogramos de amplificadores PCR de prueba en un tubo PCR de 0,2 mililitros. Incluya el grupo de mezcla homoduplex con sólo 400 nanogramos de amplificador pcR de referencia como control. Incubar por separado la mezcla heteroduplexa y homoduplex a 95 grados centígrados durante cinco minutos en un vaso de precipitados de un litro lleno de 800 mililitros de agua.Luego, enfríe las mezclas gradualmente a temperatura ambiente para recocido y formar el heteroduplex u homoduplex. Ahora, digiere por separado 400 nanogramos de la mezcla heteroduplex y homoduplex recocido con un microlitro de nucleasa de detección de mutaciones ineléditas, y dos microlitros de tampón de reacción de nucleasa a 42 grados centígrados durante 60 minutos. Analizar las muestras digeridas con electroforesis de gel de agarosa.El ADN de la mezcla heteroduplex debe cortarse en pequeños fragmentos y no se debe cortar el ADN homoduplex. sgRNA dirigido a clones positivos MOLM13 se confirmó con el método RT qPCR, basado en los niveles de expresión de los genes HOXA9 con la comparación con las células de control. De los 528 clones supervivientes proyectados, 10 clones mostraron más del 50% de reducción en los niveles de HOXA9.los sgRNA integrados en los clones reducidos HOXA9, HOXA9 sin cambios y el aumento de HOXA9, fueron confirmados además por la amplificación de PCR del SGRNA y la identificación por secuencia de Sanger. Seis de cada diez clones que mostraban una reducción en los niveles de HOXA9 contenían sgRNAs dirigidos al sitio CBS79, según lo determinado por la secuenciación de Sanger. Las mutaciones indel de clones positivos de sgRNA integrados se determinaron mediante genotipado basado en PCR y digestión de nucleasas.La eliminación heterocigota del sitio CTCF ubicado entre los genes HOXA7 y HOXA9 se identificó mediante genotipado basado en PCR. Los clones con reducción de HOXA9 de cinco, seis, 28 y 121 mostraron eliminación en la ubicación límite de CBS79. Se observaron resultados similares para las mutaciones indel en el sitio CBS79 que fueron analizadas por el ensayo de digestión de nucleasa.Al realizar este procedimiento, es importante hacer cantidades iguales de heteroduplexos y homoduplexos para detectar mutaciones indeledas inducidas por sgRNA a través del ensayo de digestión de nucleasa. Nuestro enfoque permite la utilización del marcador seleccionado, para llevar a cabo la secuenciación de próxima generación en el gen objetivo para descubrir los efectos del gen en la leukemogénesis. En general, nuestro enfoque previene los RPC para la corrección funcional y la reducción de un elemento genético irregular observado durante el proceso biológico normal y la leukemogénesis en el error del proyecto del genoma póstumo.

Research

JoVE Journal

Genetics

HOX Loci Focused CRISPR/sgRNA Library Screening Identifying Critical CTCF Boundaries

A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source

Un protocolo Universal para la gRNA a gran escala de producción de la biblioteca de cualquier fuente de ADN

The popularity of the CRISPR/Cas9 system for both genome and epigenome engineering stems from its simplicity and adaptability. An effector (the Cas9 ...

Investigación

Genética

G2-seq: A High Throughput Sequencing-based Technique for Identifying Late Replicating Regions of the Genome

G2-seq: Una alto rendimiento basado en la secuencia técnica para identificar replicación tardía de regiones del genoma

Numerous techniques have been developed to follow the progress of DNA replication through the S phase of the cell cycle. Most of these techniques have ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Robusto de ADN y la secuenciación de alto rendimiento biblioteca construcción de especímenes de herbario

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

La secuencia retrospectiva MicroRNA: ADN complementario biblioteca preparación protocolo utilizando a muestras de ARN de parafina-encajado formalina-fijo

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of ...

Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen

Ultra bajo entrada genoma secuencia biblioteca elaboración de un solo espécimen Tardigrade

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state ...

Bronchoalveolar Lavage Exosomes in Lipopolysaccharide-induced Septic Lung Injury

Lavado broncoalveolar exosomas en lesión pulmonar séptica inducida por lipopolisacárido

Acute lung injury (ALI) and acute respiratory distress syndrome (ARDS) represent a heterogeneous group of lung diseases which continues to have a high ...

Mating-based Overexpression Library Screening in Yeast

Proyección de biblioteca sobreexpresión basado en apareamiento en levaduras

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool ...

Screening Cotton Genotypes for Reniform Nematode Resistance

Selección de genotipos de algodón para la resistencia de los nematodos reniformes

A rapid non-destructive reniform nematode (Rotylenchulus reniformis) screening protocol is needed for the development of resistant cotton (Gossypium ...

Identifying Mutations by High Resolution Melting in a TILLING Population of Rice

Identificación de mutaciones por fusión de alta resolución en una población de arroz

Target Induced Local Lesions In Genomes (TILLING) is a strategy of reverse genetics for the high-throughput screening of induced mutations. However, the ...

Screening and Identification of RNA Silencing Suppressors from Secreted Effectors of Plant Pathogens

Detección e identificación de supresores de silenciamiento de ARN de efectos secretos de patógenos vegetales

RNA silencing is an evolutionarily conserved, sequence-specific gene regulation mechanism in eukaryotes. Several plant pathogens have evolved proteins ...