Name: hox loci focused crispr/sgrna library screening identifying critical ctcf boundaries
Uploaded: 2019-03-31T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about HOX Loci Focused CRISPR/sgRNA Library Screening Identifying Critical CTCF Boundaries at JoVE.com

Författarna också tacka Nicholas Cesari för redigering manuskriptet. Arbetet har finansierats genom bidrag från National Institute of Health (S.H., R01DK110108, R01CA204044).

1. SAP sgRNALibrary Design med hjälp av ett onlineverktyg
<ol><li>Design den sgRNA inriktning SAP bindningsställen i de mänskliga HOX loci med hjälp av genetisk störning plattform (GPP) designer verktyget (https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design).</li>
	<li>Syntetisera sammanlagt 1 070 sgRNAs bestående av sgRNAs inriktning 303 slumpmässiga inriktning gener, 60 positiva kontroller, 500 icke-mänskliga-targeting kontroller, och 207 SAP element eller lncRNA inriktning gene...

<ol>
	<li>Dixon, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topological+domains+in+mammalian+genomes+identified+by+analysis+of+chromatin+interactions.">Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions.</a> Nature. 485 (7398), 376-380 (2012).</li><li>Cuddapah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+the+insulator+binding+protein+CTCF+in+chromatin+barrier+regions+reveals+demarcation+of+active+and+repressive+domains.">Global analysis of the insulator binding protein CTCF in chromatin barrier regions reveals demarcation of active and repressive domains.</a> Genome research. 19 (1), 24-32 (2009).</li><li>Phillips, J. E., Corces, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF:+master+weaver+of+the+genome.">CTCF: master weaver of the genome.</a> Cell. 137 (7), 1194-1211 (2009).</li><li>Tang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF-Mediated+Human+3D+Genome+Architecture+Reveals+Chromatin+Topology+for+Transcription.">CTCF-Mediated Human 3D Genome Architecture Reveals Chromatin Topology for Transcription.</a> Cell. 163 (7), 1611-1627 (2015).</li><li>Lupianez, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruptions+of+topological+chromatin+domains+cause+pathogenic+rewiring+of+gene-enhancer+interactions.">Disruptions of topological chromatin domains cause pathogenic rewiring of gene-enhancer interactions.</a> Cell. 161 (5), 1012-1025 (2015).</li><li>Dowen, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+cell+identity+genes+occurs+in+insulated+neighborhoods+in+mammalian+chromosomes.">Control of cell identity genes occurs in insulated neighborhoods in mammalian chromosomes.</a> Cell. 159 (2), 374-387 (2014).</li><li>Phillips-Cremins, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architectural+protein+subclasses+shape+3D+organization+of+genomes+during+lineage+commitment.">Architectural protein subclasses shape 3D organization of genomes during lineage commitment.</a> Cell. 153 (6), 1281-1295 (2013).</li><li>Narendra, V., Bulajic, M., Dekker, J., Mazzoni, E. O., Reinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF-mediated+topological+boundaries+during+development+foster+appropriate+gene+regulation.">CTCF-mediated topological boundaries during development foster appropriate gene regulation.</a> Genes &amp; Development. 30 (24), 2657-2662 (2016).</li><li>Narendra, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF+establishes+discrete+functional+chromatin+domains+at+the+Hox+clusters+during+differentiation.">CTCF establishes discrete functional chromatin domains at the Hox clusters during differentiation.</a> Science. 347 (6225), 1017-1021 (2015).</li><li>Deng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HoxBlinc+RNA+Recruits+Set1/MLL+Complexes+to+Activate+Hox+Gene+Expression+Patterns+and+Mesoderm+Lineage+Development.">HoxBlinc RNA Recruits Set1/MLL Complexes to Activate Hox Gene Expression Patterns and Mesoderm Lineage Development.</a> Cell Reports. 14 (1), 103-114 (2016).</li><li>Patel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberrant+TAL1+activation+is+mediated+by+an+interchromosomal+interaction+in+human+T-cell+acute+lymphoblastic+leukemia.">Aberrant TAL1 activation is mediated by an interchromosomal interaction in human T-cell acute lymphoblastic leukemia.</a> Leukemia. 28 (2), 349-361 (2014).</li><li>Luo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF+boundary+remodels+chromatin+domain+and+drives+aberrant+HOX+gene+transcription+in+acute+myeloid+leukemia.">CTCF boundary remodels chromatin domain and drives aberrant HOX gene transcription in acute myeloid leukemia.</a> Blood. 132 (8), 837-848 (2018).</li><li>Dou, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medial+HOXA+genes+demarcate+haematopoietic+stem+cell+fate+during+human+development.">Medial HOXA genes demarcate haematopoietic stem cell fate during human development.</a> Nature Cell Biology. 18 (6), 595-606 (2016).</li><li>Lawrence, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+expression+of+the+Hoxa-9+homeobox+gene+impairs+the+proliferation+and+repopulating+ability+of+hematopoietic+stem+cells.">Loss of expression of the Hoxa-9 homeobox gene impairs the proliferation and repopulating ability of hematopoietic stem cells.</a> Blood. 106 (12), 3988-3994 (2005).</li><li>Deng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=USF1+and+hSET1A+mediated+epigenetic+modifications+regulate+lineage+differentiation+and+HoxB4+transcription.">USF1 and hSET1A mediated epigenetic modifications regulate lineage differentiation and HoxB4 transcription.</a> PLOS Genetics. 9 (6), e1003524 (2013).</li><li>Rawat, V. P., Humphries, R. K., Buske, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+Hox:+the+role+of+ParaHox+genes+in+normal+and+malignant+hematopoiesis.">Beyond Hox: the role of ParaHox genes in normal and malignant hematopoiesis.</a> Blood. 120 (3), 519-527 (2012).</li><li>Alharbi, R. A., Pettengell, R., Pandha, H. S., Morgan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+HOX+genes+in+normal+hematopoiesis+and+acute+leukemia.">The role of HOX genes in normal hematopoiesis and acute leukemia.</a> Leukemia. 27 (5), 1000-1008 (2013).</li><li>Rice, K. L., Licht, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HOX+deregulation+in+acute+myeloid+leukemia.">HOX deregulation in acute myeloid leukemia.</a> Journal of Clinical Investigation. 117 (4), 865-868 (2007).</li><li>Bassett, A. R., Kong, L., Liu, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+CRISPR+library+for+high-throughput+genetic+screening+in+Drosophila+cells.">A genome-wide CRISPR library for high-throughput genetic screening in Drosophila cells.</a> Journal of Genetics and Genomics. 42 (6), 301-309 (2015).</li><li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+deletion+screening+of+human+long+non-coding+RNAs+using+a+paired-guide+RNA+CRISPR-Cas9+library.">Genome-scale deletion screening of human long non-coding RNAs using a paired-guide RNA CRISPR-Cas9 library.</a> Nature Biotechnology. 34 (12), 1279-1286 (2016).</li><li>Kurata, J. S., Lin, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-focused+CRISPR-Cas9+library+screen+reveals+fitness-associated+miRNAs.">MicroRNA-focused CRISPR-Cas9 library screen reveals fitness-associated miRNAs.</a> RNA. 24 (7), 966-981 (2018).</li><li>Collins, C. T., Hess, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+HOXA9+in+leukemia:+dysregulation,+cofactors+and+essential+targets.">Role of HOXA9 in leukemia: dysregulation, cofactors and essential targets.</a> Oncogene. 35 (9), 1090-1098 (2016).</li><li>Kroon, E., Thorsteinsdottir, U., Mayotte, N., Nakamura, T., Sauvageau, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NUP98-HOXA9+expression+in+hemopoietic+stem+cells+induces+chronic+and+acute+myeloid+leukemias+in+mice.">NUP98-HOXA9 expression in hemopoietic stem cells induces chronic and acute myeloid leukemias in mice.</a> The EMBO Journal. 20 (3), 350-361 (2001).</li><li>Koike-Yusa, H., Li, Y., Tan, E. P., Velasco-Herrera Mdel, C., Yusa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+recessive+genetic+screening+in+mammalian+cells+with+a+lentiviral+CRISPR-guide+RNA+library.">Genome-wide recessive genetic screening in mammalian cells with a lentiviral CRISPR-guide RNA library.</a> Nature Biotechnology. 32 (3), 267-273 (2014).</li><li>Shalem, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+CRISPR-Cas9+knockout+screening+in+human+cells.">Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells.</a> Science. 343 (6166), 84-87 (2014).</li><li>Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+screens+in+human+cells+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system.</a> Science. 343 (6166), 80-84 (2014).</li><li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+sgRNAs+facilitate+CRISPR/Cas9-mediated+mouse+genome+targeting.">Dual sgRNAs facilitate CRISPR/Cas9-mediated mouse genome targeting.</a> The FEBS Journal. 281 (7), 1717-1725 (2014).</li><li>Sanjana, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+interrogation+of+functional+elements+in+the+noncoding+genome.">High-resolution interrogation of functional elements in the noncoding genome.</a> Science. 353 (6307), 1545-1549 (2016).</li><li>Rajagopal, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+mapping+of+regulatory+DNA.">High-throughput mapping of regulatory DNA.</a> Nature Biotechnology. 34 (2), 167-174 (2016).</li><li>Korkmaz, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genetic+screens+for+enhancer+elements+in+the+human+genome+using+CRISPR-Cas9.">Functional genetic screens for enhancer elements in the human genome using CRISPR-Cas9.</a> Nature Biotechnology. 34 (2), 192-198 (2016).</li><li>Rezaei, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FMS-Like+Tyrosine+Kinase+3+(FLT3)+and+Nucleophosmin+1+(NPM1)+in+Iranian+Adult+Acute+Myeloid+Leukemia+Patients+with+Normal+Karyotypes:+Mutation+Status+and+Clinical+and+Laboratory+Characteristics.">FMS-Like Tyrosine Kinase 3 (FLT3) and Nucleophosmin 1 (NPM1) in Iranian Adult Acute Myeloid Leukemia Patients with Normal Karyotypes: Mutation Status and Clinical and Laboratory Characteristics.</a> Turkish Journal of Haematology. 34 (4), 300-306 (2017).</li><li>Yaragatti, M., Basilico, C., Dailey, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+active+transcriptional+regulatory+modules+by+the+functional+assay+of+DNA+from+nucleosome-free+regions.">Identification of active transcriptional regulatory modules by the functional assay of DNA from nucleosome-free regions.</a> Genome Research. 18 (6), 930-938 (2008).</li><li>Wilken, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNase+I+hypersensitivity+analysis+of+the+mouse+brain+and+retina+identifies+region-specific+regulatory+elements.">DNase I hypersensitivity analysis of the mouse brain and retina identifies region-specific regulatory elements.</a> Epigenetics Chromatin. 8, 8 (2015).</li><li>Narlikar, L., Ovcharenko, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+regulatory+elements+in+eukaryotic+genomes.">Identifying regulatory elements in eukaryotic genomes.</a> Briefings in Functional Genomics and Proteomics. 8 (4), 215-230 (2009).</li><li>Hnisz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+proto-oncogenes+by+disruption+of+chromosome+neighborhoods.">Activation of proto-oncogenes by disruption of chromosome neighborhoods.</a> Science. 351 (6280), 1454-1458 (2016).</li></ol>

Protein-kodning gen relaterade sgRNA bibliotek har tillämpat en funktionell screening system för att identifiera gener och nätverk som reglerar specifika cellulära funktioner genom sgRNA anrikning24,25,26 ,27,28. Flera icke-kodande regionen relaterade sgRNA bibliotek visades också i gen-specifika funktionella skärmar för distala och proximala reglerar ...

Senaste genomet interaktionsstudier visade att formulären nukleära humangenomet stabil topologically förbindande domäner (TADs) som bevaras över celltyper och arter. Organisationen av genomet in i separata domäner underlättar och begränsar interaktioner mellan reglerande element (t.ex. förstärkare och initiativtagare). Den CCCTC-bindande faktorn (SAP) binder till TAD gränser och spelar en avgörande roll i Begränsningsaspekten interaktioner av DNA-element som finns i angränsande TADs1. Genome wide SAP bindande data visade dock att även om SAP interagerar mest med samma DNA-platser i olika celltyper, fungerar det ofta som en kromatin barriär på en specifik plats i en celltyp men inte det andra, vilket tyder på att SAP-funktioner tillsammans med andra aktiviteter i bildandet av kromatin gränser2. Vad förblir okänd är huruvida gränsen elementen (SAP-bindande platser) är direkt kopplade till den biologiska funktionen av SAP, och hur dessa länkar inträffa. Därför hypotes vi att specifika SAP bindningsställen i genomet direkt reglerar bildandet av TADs och kontroll Promotorn/förstärkare interaktioner inom dessa domäner eller mellan närliggande domäner. Slutförandet av den mänskliga och mus genomet sekvensering projekt och efterföljande epigenetiska analyser har upptäckt nya molekylära och genetiska signaturer av genomet. Rollen av särskilda signaturer eller ändringar i genreglering och cellulär funktion, samt deras molekylära mekanismerna, har dock ännu inte förstås fullt.
Flera rader av bevis som stöder att de SAP-medierad TADs utgör funktionella kromatin domäner3,4,5. Även om SAP interagerar mest med samma DNA-platser i olika celltyper, visade genome bred SAP ChIP-seq data att SAP ofta fungerar som en barriär av kromatin i en celltyp men inte i de andra2. SAP spelar en viktig roll under utvecklingen av medla genome organisation4,6,7. Störningar av SAP gränser nedsatt förstärkare/arrangören interaktioner och genuttryck, leder till utvecklingsmässiga blockering. Detta tyder på att SAP medierad TADs är inte bara strukturella komponenter, men också rättsliga enheter som krävs för korrekt enhancer action och gen transkription5,8,9.
HOX gener spelar viktiga roller under fosterutvecklingen och de är temporally och rumsligt begränsade i deras uttrycksmönster. Det HOXA locus bildar två stabila TADs avskilja främre och bakre gener av en SAP-associerade gränsen element i både hESCs och IMR90 celler1. Senaste rapporter visat att HoxBlinc, en HoxB locus associerade lncRNA, förmedlar bildandet av SAP riktad TADs och förstärkare/arrangören interaktioner i det HOXB locus. Detta leder till främre HOXB gen aktivering under ESC engagemang och differentiering10. Dessutom på specifik gen loci inklusive det HOXA -locus, ändring av SAP medierad TAD domäner ändras härstamning specifik gen uttryck profiler och var förknippad med utvecklingen av sjukdomen har11,12. Bevis som stöder en primär funktion för SAP samordna transkription av gener och att fastställa cellidentiteten genom att organisera genomet i funktionella domäner.
Trots dess roll i embryonala utvecklingen, under blodbildning, reglera HOX gener hematopoetiska stamceller och stamceller cell (HS/PC)-funktion. Detta görs genom att kontrollera balansen mellan proliferation och differentiering10,13,14,15. Uttrycket av HOX gener är hårt reglerad i hela specifikationen och differentiering av hematopoetiska celler, med högsta uttryck i HS / PCs. HOX genuttryck minskar gradvis under mognad, med dess lägsta nivåer förekommer i differentierade hematopoetiska celler16. HOX gener Dysreglering är en dominerande mekanismen av leukemiska transformation genom dysregulating självförnyelse och differentiering egenskaper HS/St leder till leukemiska omvandling17,18. Mekanismen för att etablera och upprätthålla normal vs. onkogena uttrycksmönster HOX gener samt associerade regleringsnät är dock fortfarande oklart.
CRISPR-Cas9 sgRNA bibliotek screening har använts att förhöra protein-kodande gener19 som väl som icke-kodande gener, såsom lncRNA20 och miRNA21 i olika arter. Kostnaden för att använda CRISPR-Cas9 sgRNA biblioteket för att identifiera nya genomiska mål kvarstår dock hög, eftersom hög genomströmning Genomsekvensering används ofta för att kontrollera sgRNA bibliotek screening. Våra sgRNA screening system är fokuserad på de specifika genomet loci och utvärderar den inriktning sgRNAs genom one-step RT-PCR enligt det markör genuttrycket, såsom HOXA9. Dessutom kan Sanger sekvensering bekräftade att sgRNA integrerades i genomet och ditsatta mutationer upptäckas för att identifiera den sgRNA inriktning webbplats. Genom lokus-specifika CRISPR-Cas9 genetisk screening, har CBS7/9 kromatin gränsen identifierats som en kritisk regulator för att etablera onkogena kromatin domän och upprätthålla ektopisk HOX gen uttrycksmönster i AML patogenes 12. metoden kan tillämpas allmänt för att identifiera inte bara specifika funktionen av SAP gräns i embryonal utveckling, blodbildning, leukemogenesis, men också SAP gräns som potentiella terapeutiska mål för framtida epigenetiska terapi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:689px;" width="689">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Lipofectamine 3000 reagent</td>
			<td style="width:155px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">L3000-008</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Proteinase K</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25530049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Puromycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1113802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stbl3 cells&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>&#160;C737303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEK293T</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MOLM-13</td>
			<td>DSMZ</td>
			<td>ACC 554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">lentiCRISPRv2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>52961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">psPAX2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pGEM&#174;-T Easy Vector Systems&#160;</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A137A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T4 ligase&#160;</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>&#160;M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAquick Gel Extract kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAuick PCR purification kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SingleShot&#8482; SYBR&#174;&#160;Green One-Step Kit</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1725095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">QIAGEN Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td style="width:100px;">12163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">&#160;11965084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI 1640&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal bovine serum (FBS)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">10-082-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin/streptomycin/L-glutamine&#160;</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:100px;">10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lenti-X Concentrator&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Clontech</td>
			<td style="width:100px;">631232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Trypan Blue Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Polybrene</td>
			<td style="width:155px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-134220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Genessee Scientific</td>
			<td>&#160;25-507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">TAE buffer&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>FERB49</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Surveyor&#174; Mutation Detection Kits</td>
			<td style="width:155px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:100px;">706020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Biorad Universal Hood II Gel Doc System</td>
			<td style="width:155px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:100px;">170-8126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Centrifuge 5424 R</td>
			<td style="width:155px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:100px;">5404000138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Digital Dry Baths/Block Heaters</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">88870002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">TSX Series Ultra-Low Freezers</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">TSX40086V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Forma&#8482; Steri-Cult&#8482; CO2&#160;Incubators</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">3308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Herasafe&#8482; KS, Class II Biological Safety Cabinet</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">51022484</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Sorvall&#8482; Legend&#8482; XT/XF Centrifuge Series</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">75004506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Fisherbrand&#8482;&#160;Isotemp&#8482; Water Baths</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">FSGPD02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:263px;">Thermo Scientific&#8482;&#160;Locator&#8482; Plus Rack and Box Systems</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">13-762-353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System</td>
			<td style="width:155px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:100px;">1855195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">MiniAmp&#8482; Thermal Cycler</td>
			<td style="width:155px;">Applied Biosystems technology</td>
			<td style="width:100px;">A37834</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:263px;">Thermo Scientific&#8482;&#160;Owl&#8482; EC300XL2 Compact Power Supply</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">7217581</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:263px;">Thermo Scientific&#8482;&#160;Owl&#8482; EasyCast&#8482; B1 Mini Gel Electrophoresis Systems</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">09-528-178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">VWR&#174; Tube Rotator and Rotisseries</td>
			<td style="width:155px;">VWR International</td>
			<td style="width:100px;">10136-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">VWR&#174; Incubating Mini Shaker</td>
			<td style="width:155px;">VWR International</td>
			<td style="width:100px;">12620-942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Analytical Balance MS104TS/00</td>
			<td style="width:155px;">METTLER TOLEDO</td>
			<td style="width:100px;">30133522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">DS-11 FX and DS-11 FX+ Spectrophotometer</td>
			<td style="width:155px;">DeNovix Inc.</td>
			<td style="width:100px;">DS-11 FX</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hox loci focused crispr/sgrna library screening identifying critical ctcf boundaries

CCCTC-bindande faktor (SAP)-medierad stabil topologically associera domäner (TADs) spelar en avgörande roll i Begränsningsaspekten interaktioner av DNA-element som finns i angränsande TADs. SAP spelar en viktig roll i regleringen av det rumsliga och tidsmässiga uttrycket för HOX gener som styr Embryonalutvecklingen, kroppen mallning, blodbildning och leukemogenesis. Det är dock fortfarande till stor del okända huruvida och hur HOX loci associerade SAP gränser reglera kromatin organisation och HOX genuttryck. I det nuvarande protokollet, har en specifik sgRNA poolade bibliotek inriktning alla SAP bindningsställen i de HOXA/B/C/D -lokus genererats för att undersöka effekterna av störa SAP-associerade kromatin gränser på TAD bildandet och HOX gener uttryck. Genom CRISPR-Cas9 har genetisk screening, SAP bindande platsen ligger mellan HOXA7/HOXA9 gener (CBS7/9) identifierats som en kritisk regulator av onkogena kromatin domän, som är viktiga för att upprätthålla ektopisk HOX gener uttrycksmönster i MLL-omordnats akut myeloisk leukemi (AML). Således, detta sgRNA bibliotek screening strategi ger nya insikter i SAP medierad genome organisation i specifik gen loci och ger också en grund för funktionell karakterisering av de kommenterad genetiska regulatoriska element, både kodning och icke-kodande, under normala biologiska processer i den efter mänskliga genomet projektet eran.

CRISPR-Cas9-teknik är en kraftfull forskningsverktyg för funktionella genetiska studier. Det ersätter snabbt konventionella gen redigering tekniker och har hög verktyg för både genome-wide och individuell gen-inriktade program. Här, första individuellt klonade loci-specifika CRISPR-Cas9-klädd sgRNA biblioteket innehåller 1 070 sgRNAs bestående av sgRNAs inriktning 303 slumpmässiga inriktning gener, 60 positiva kontroller, 500 icke-mänskliga-targeting kontroller, och 207 SAP e...

Watch this Scientific Journal Video about HOX Loci Focused CRISPR/sgRNA Library Screening Identifying Critical CTCF Boundaries at JoVE.com

HOX Loci Focused CRISPR/sgRNA Library Screening Identifying Critical CTCF Boundaries

CRISPR/sgRNA bibliotek har tillämpats på förhör protein-kodande gener. Genomförbarheten av ett sgRNA-bibliotek för att avslöja funktionen av en SAP gräns i genreglering är dock fortfarande outforskat. Här beskriver vi ett HOX loci specifika sgRNA bibliotek för att belysa funktionen av SAP gränser i HOX loci.

HOX Loci fokuserad CRISPR/sgRNA bibliotek Screening identifiera kritiska SAP gränser

CCCTC-binding factor (CTCF)-mediated stable topologically associating domains (TADs) play a critical role in constraining interactions of DNA elements ...

Vår poolade sgRNA kallas biblioteket screening, är en kraftfull genetisk metod för att identifiera och utvärdera den biologiska funktionen av icke-kodning element i hela arvsmassan. Denna teknik gör det möjligt för oss att undersöka effekten av att störa de bindningsställen som är associerade, kromatiska gränser eller andra reglerande element på riktade gener uttryck. Vårt tillvägagångssätt kan användas för att identifiera rollen av CTCF, långa icke-kodande RNAs och förstärkare, i HOX genreglering i tidiga embryonala utveckling, samt vissa leukemier med en avvikande HOX gen signatur.Börja den här proceduren med utformningen av en sgRNA inriktning CTCF bindningsställen. Kloning av sgRNA-biblioteket vid cellberedning enligt beskrivningen i textprotokollet. För att förpacka lentiviruset, cotransfect HEK293 T-celler med 20 mikrogram renat biblioteksvektorer, 15 mikrogram av den förpackade plasmiden och 10 mikrogram av kuvertplasmiden, i 48 timmar innan de skördar virusen.Efter 48 timmar, samla in viruset supernatant och filtrera den genom en 0,45 mikron låg-protein bindande PVDF membran. Därefter koncentrerar du den lentivirala supernatanten med 50 gånger, med hjälp av koncentratorn. Aliquot de koncentrerade virus och lagra dem i en minus 80 grader celsius frys.Arbeta i separata brunnar av en 12 brunnsplatta för att blanda MOLM13-celler med olika doser av det koncentrerade lentiviruset för sex totala grupper. Omedelbart centrifugera dessa blandningar vid 1000 gånger g i två timmar vid 33 grader celsius. Överför de 12 brunnsplattorna tillbaka till inkubatorn vid 37 grader celsius och 5%koldioxid i fyra timmar.Försiktigt aspirera supernatanten utan att störa cellpaletten, och åter upphäva de transduced cellerna med färska kompletterade RPMI 1640 Medium. Överför sedan de åter upphängda cellerna till T25-kolvar och inkubera i 37 grader celsius i 48 timmar utan puromycin. Efter 48 timmar delade dessa celler upp dessa celler i två kolvar, en experimentell grupp som behandlats med en mikroliter per milliliter puromycin i fem dagar, och en kontrollgrupp utan puromycinbehandling i fem dagar.Mät det optimerade MOI-värdet för transduktion genom att dividera antalet levande celler som behandlas med puromycin med antalet celler utan puromycinbehandling. För att transduce cellerna med poolade biblioteket, infektera 1,5 miljoner MOLM13 celler i en 6 brunnsplatta med 0,3 MOI av sgRNA poolade lentivirus i medium. Använd cellerna utan lentivirusinfektionen som en kontroll.Omedelbart centrifug de sex väl plattan vid 1000 gånger g i två timmar vid 33 grader celsius för att spinfect cellerna. Sedan, överför plattorna tillbaka till inkubatorn vid 37 grader celsius i 5%koldioxid i fyra timmar. Försiktigt aspirera supernatant utan att störa cellpaletten, och åter upphäva de transduced cellerna med färskt medium.Sedan överföra cellerna till T25 kolvar och inkubera vid 37 grader celsius i 48 timmar utan puromycin. Efter 48 timmar, behandla cellerna med ett mikrogram per milliliter puromycin i fem dagar. Byt mot färskt medium efter två dagar och upprätthålla en optimal celltäthet.Utsäde den enda klon i 96 brunnsplattor med begränsande utspädningsmetoder. Inkubera dessa enda klon vid 37 grader celsius och 5%koldioxid. Kultur dem för 3-4 veckor.Räkna de sgRNA integrerade MOLM13-cellerna med 0,4%Trypan Blue-lösningsfärgning och överför sedan 10, 000 levande celler per brunn till en 96 väl PCR-platta. Centrifugera plattan vid 1000 gånger g i fem minuter och avlägsna sedan noggrant och kassera supernatanten med en pipett. Undvik att störa cellpaletten.Efter tvättning cellerna som beskrivs i texten lägga 50 mikroliter av cellen lysis master mix till varje brunn. Pipett upp och ner fem gånger för att åter upphäva cellpaletten. Inkubera blandningen i 10 minuter i rumstemperatur.Överför sedan blandningen till 37 grader celsius i fem minuter, och sedan 75 grader celsius i ytterligare fem minuter. Lägg nu till en mikroliter cell lysate till PCR brunnar som innehåller RT qPCR reaktion mix. Denna mix omfattar markörgenerna framåt och omvänd primer, omvänd transkriptas och One-Step reaktion mix.Kör den omvända transkriptionsreaktionen i 10 minuter vid 50 grader celsius följt av polymeriseringsaktivering och DNA-denaturering i en minut vid 95 grader celsius. Utför RT PCR med 40 cykler PCR-reaktion som detaljerad i textprotokollet. Verifiera HOXA9 minskade uttryck kloner genom Sanger sekvensering och utföra PCR med MOLM13 genomet-DNA som beskrivs i textprotokollet.Extrahera och rena PCR-produkterna med PCR-reningssatsen. Ligate de renade PCR-produkterna in i den T-vektorn med T4 ligationbuffert, T-vektorNDNA, PCR-DNA och T4 ligase. Placera ligeringsmixen i en inkubator vid 16 grader celsius över natten.Överför ligering mix i DH5 alfa kompetenta celler och platta på en LB ampicillin antibiotikum agar platta. Inkubera plattorna över natten vid 37 grader celsius. Plocka de enda klonerna från LB-plattan och verifiera dem genom genotypning och Sanger-sekvensering.Ställ in den heteroduplex blandningsgruppen med 200 nanogram av referensen, och 200 nanogram test PCR-amplikoner i ett 0,2 milliliter PCR-rör. Inkludera blandningsgruppen homoduplex med endast 400 nanogram referens-PCR-amplikoner som en kontroll. Inkubera separat heteroduplex- och homoduplexblandningen vid 95 grader celsius i fem minuter i en enlitsbägare fylld med 800 milliliter vatten.Sedan, kyla ner blandningarna gradvis till rumstemperatur till glödg och bilda heteroduplex eller homoduplex. Nu, separat smälta 400 nanogram av glödgad heteroduplex och homoduplex blandning med en microliter av indel mutation upptäckt nuclease, och två microliters av nuclease reaktion buffert vid 42 grader celsius i 60 minuter. Analysera de rötade proverna med agarosgelelektrofores.Den heteroduplex blandning DNA bör skäras i små fragment och homoduplex DNA bör inte skäras. sgRNA inriktning MOLM13 positiva kloner bekräftades med RT qPCR metoden, baserat på uttrycksnivåerna för HOXA9 gener med jämförelsen med kontroll cellerna. Av de 528 överlevande klonerna som screenades visade 10 kloner ut mer än 50 %-reduktion i HOXA9-nivåerna.sgRNAs integreras i HOXA9 minskas, HOXA9 oförändrad och HOXA9 ökade kloner, bekräftades ytterligare av PCR förstärkning av sgRNA och identifiering av Sanger sekvens. Sex av tio kloner som visade en minskning av HOXA9-nivåerna innehöll sgRNAs som var inriktade på CBS79-webbplatsen, vilket fastställdes av Sanger-sekvensering. Indel mutationer av integrerade sgRNA positiva kloner fastställdes av PCR-baserade genotypning och nuclease matsmältningen.Den heterozygous borttagning av CTCF-webbplatsen som ligger mellan HOXA7 och HOXA9 gener identifierades av PCR-baserade genotypning. HOXA9-minskade kloner fem, sex, 28 och 121 uppvisade strykning i CBS79 gränsen plats. Liknande resultat observerades för indel mutationer i CBS79 webbplats som analyserades av analysen nuclease digestion.När du utför detta förfarande, det är viktigt att göra lika stora mängder heteroduplexes och homoduplexes för att upptäcka sgRNA-inducerad indel mutationer genom nuclease digestion analysen. Vårt tillvägagångssätt möjliggör utnyttjande av den valda markören, att genomföra nästa generations sekvensering på målgenen för att upptäcka genens effekter på leukemogenesis. Övergripande vår strategi förhindrar RPC: s för funktionella korrekt och minskning av en noterade genetiska oregelbundna element under normal biologisk process och leukemogenesis i postumt genom projektet fel.

Research

JoVE Journal

Genetics

HOX Loci Focused CRISPR/sgRNA Library Screening Identifying Critical CTCF Boundaries

A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source

Ett universellt protokoll för storskaliga gärna biblioteket produktion från någon DNA-källa

The popularity of the CRISPR/Cas9 system for both genome and epigenome engineering stems from its simplicity and adaptability. An effector (the Cas9 ...

G2-seq: A High Throughput Sequencing-based Technique for Identifying Late Replicating Regions of the Genome

G2-seq: En hög genomströmning sekvensering-baserad teknik för att identifiera sent replikera regioner i genomet

Numerous techniques have been developed to follow the progress of DNA replication through the S phase of the cell cycle. Most of these techniques have ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Robust DNA isolering och hög genomströmning sekvensering bibliotek konstruktion för herbarieexemplar

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

Retrospektiv mikroRNA sekvensering: Kompletterande DNA bibliotek förberedelse protokoll använder Formalin-fast Paraffin-inbäddat RNA exemplar

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of ...

Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen

Ultralåga ingående Genome Sequencing bibliotek förberedelse från enda Tardigrade prov

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state ...

Bronchoalveolar Lavage Exosomes in Lipopolysaccharide-induced Septic Lung Injury

Bronkoalveolär Lavage Exosomes i lipopolysackarid-inducerad septisk lungskada

Acute lung injury (ALI) and acute respiratory distress syndrome (ARDS) represent a heterogeneous group of lung diseases which continues to have a high ...

Mating-based Overexpression Library Screening in Yeast

Parning-baserade överuttryck bibliotek Screening i jäst

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool ...

Screening Cotton Genotypes for Reniform Nematode Resistance

Screening av bomull genotyper för reniform Nematodresistens

A rapid non-destructive reniform nematode (Rotylenchulus reniformis) screening protocol is needed for the development of resistant cotton (Gossypium ...

Identifying Mutations by High Resolution Melting in a TILLING Population of Rice

Identifiera mutationer genom högupplöst smältning i en TILLING population av ris

Target Induced Local Lesions In Genomes (TILLING) is a strategy of reverse genetics for the high-throughput screening of induced mutations. However, the ...

Screening and Identification of RNA Silencing Suppressors from Secreted Effectors of Plant Pathogens

Screening och identifiering av RNA-ljuddämpningssuppressorer från utsöndrade effektdämpare av växtpatogener

RNA silencing is an evolutionarily conserved, sequence-specific gene regulation mechanism in eukaryotes. Several plant pathogens have evolved proteins ...