Name: hox loci focused crispr/sgrna library screening identifying critical ctcf boundaries
Uploaded: 2019-03-31T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about HOX Loci Focused CRISPR/sgRNA Library Screening Identifying Critical CTCF Boundaries at JoVE.com

Yazarlar ayrıca el yazması düzenleme için Nicholas Cesari teşekkür ederiz. İş Ulusal Sağlık Enstitüsü (S.H., R01DK110108, R01CA204044) gelen hibe tarafından desteklenmiştir.

1. CTCF sgRNALibrary Online bir araç kullanarak tasarım
<ol><li>CTCF bağlayıcı siteleri içinde genetik pertürbasyon platformu (GPP) tasarımcı araç (https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design) kullanarak insan HOX loci hedefleme sgRNA tasarım.</li>
	<li>1.070 sgRNAs 303 rasgele hedefleme genler, 60 olumlu denetimleri, insan hedefleme-500 kontrol eder ve 207 CTCF öğeleri veya lncRNA genler (şekil 1, Tablo 1) Hedefleme hed...

<ol>
	<li>Dixon, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topological+domains+in+mammalian+genomes+identified+by+analysis+of+chromatin+interactions.">Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions.</a> Nature. 485 (7398), 376-380 (2012).</li><li>Cuddapah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+the+insulator+binding+protein+CTCF+in+chromatin+barrier+regions+reveals+demarcation+of+active+and+repressive+domains.">Global analysis of the insulator binding protein CTCF in chromatin barrier regions reveals demarcation of active and repressive domains.</a> Genome research. 19 (1), 24-32 (2009).</li><li>Phillips, J. E., Corces, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF:+master+weaver+of+the+genome.">CTCF: master weaver of the genome.</a> Cell. 137 (7), 1194-1211 (2009).</li><li>Tang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF-Mediated+Human+3D+Genome+Architecture+Reveals+Chromatin+Topology+for+Transcription.">CTCF-Mediated Human 3D Genome Architecture Reveals Chromatin Topology for Transcription.</a> Cell. 163 (7), 1611-1627 (2015).</li><li>Lupianez, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruptions+of+topological+chromatin+domains+cause+pathogenic+rewiring+of+gene-enhancer+interactions.">Disruptions of topological chromatin domains cause pathogenic rewiring of gene-enhancer interactions.</a> Cell. 161 (5), 1012-1025 (2015).</li><li>Dowen, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+cell+identity+genes+occurs+in+insulated+neighborhoods+in+mammalian+chromosomes.">Control of cell identity genes occurs in insulated neighborhoods in mammalian chromosomes.</a> Cell. 159 (2), 374-387 (2014).</li><li>Phillips-Cremins, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architectural+protein+subclasses+shape+3D+organization+of+genomes+during+lineage+commitment.">Architectural protein subclasses shape 3D organization of genomes during lineage commitment.</a> Cell. 153 (6), 1281-1295 (2013).</li><li>Narendra, V., Bulajic, M., Dekker, J., Mazzoni, E. O., Reinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF-mediated+topological+boundaries+during+development+foster+appropriate+gene+regulation.">CTCF-mediated topological boundaries during development foster appropriate gene regulation.</a> Genes &amp; Development. 30 (24), 2657-2662 (2016).</li><li>Narendra, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF+establishes+discrete+functional+chromatin+domains+at+the+Hox+clusters+during+differentiation.">CTCF establishes discrete functional chromatin domains at the Hox clusters during differentiation.</a> Science. 347 (6225), 1017-1021 (2015).</li><li>Deng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HoxBlinc+RNA+Recruits+Set1/MLL+Complexes+to+Activate+Hox+Gene+Expression+Patterns+and+Mesoderm+Lineage+Development.">HoxBlinc RNA Recruits Set1/MLL Complexes to Activate Hox Gene Expression Patterns and Mesoderm Lineage Development.</a> Cell Reports. 14 (1), 103-114 (2016).</li><li>Patel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberrant+TAL1+activation+is+mediated+by+an+interchromosomal+interaction+in+human+T-cell+acute+lymphoblastic+leukemia.">Aberrant TAL1 activation is mediated by an interchromosomal interaction in human T-cell acute lymphoblastic leukemia.</a> Leukemia. 28 (2), 349-361 (2014).</li><li>Luo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF+boundary+remodels+chromatin+domain+and+drives+aberrant+HOX+gene+transcription+in+acute+myeloid+leukemia.">CTCF boundary remodels chromatin domain and drives aberrant HOX gene transcription in acute myeloid leukemia.</a> Blood. 132 (8), 837-848 (2018).</li><li>Dou, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medial+HOXA+genes+demarcate+haematopoietic+stem+cell+fate+during+human+development.">Medial HOXA genes demarcate haematopoietic stem cell fate during human development.</a> Nature Cell Biology. 18 (6), 595-606 (2016).</li><li>Lawrence, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+expression+of+the+Hoxa-9+homeobox+gene+impairs+the+proliferation+and+repopulating+ability+of+hematopoietic+stem+cells.">Loss of expression of the Hoxa-9 homeobox gene impairs the proliferation and repopulating ability of hematopoietic stem cells.</a> Blood. 106 (12), 3988-3994 (2005).</li><li>Deng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=USF1+and+hSET1A+mediated+epigenetic+modifications+regulate+lineage+differentiation+and+HoxB4+transcription.">USF1 and hSET1A mediated epigenetic modifications regulate lineage differentiation and HoxB4 transcription.</a> PLOS Genetics. 9 (6), e1003524 (2013).</li><li>Rawat, V. P., Humphries, R. K., Buske, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+Hox:+the+role+of+ParaHox+genes+in+normal+and+malignant+hematopoiesis.">Beyond Hox: the role of ParaHox genes in normal and malignant hematopoiesis.</a> Blood. 120 (3), 519-527 (2012).</li><li>Alharbi, R. A., Pettengell, R., Pandha, H. S., Morgan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+HOX+genes+in+normal+hematopoiesis+and+acute+leukemia.">The role of HOX genes in normal hematopoiesis and acute leukemia.</a> Leukemia. 27 (5), 1000-1008 (2013).</li><li>Rice, K. L., Licht, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HOX+deregulation+in+acute+myeloid+leukemia.">HOX deregulation in acute myeloid leukemia.</a> Journal of Clinical Investigation. 117 (4), 865-868 (2007).</li><li>Bassett, A. R., Kong, L., Liu, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+CRISPR+library+for+high-throughput+genetic+screening+in+Drosophila+cells.">A genome-wide CRISPR library for high-throughput genetic screening in Drosophila cells.</a> Journal of Genetics and Genomics. 42 (6), 301-309 (2015).</li><li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+deletion+screening+of+human+long+non-coding+RNAs+using+a+paired-guide+RNA+CRISPR-Cas9+library.">Genome-scale deletion screening of human long non-coding RNAs using a paired-guide RNA CRISPR-Cas9 library.</a> Nature Biotechnology. 34 (12), 1279-1286 (2016).</li><li>Kurata, J. S., Lin, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-focused+CRISPR-Cas9+library+screen+reveals+fitness-associated+miRNAs.">MicroRNA-focused CRISPR-Cas9 library screen reveals fitness-associated miRNAs.</a> RNA. 24 (7), 966-981 (2018).</li><li>Collins, C. T., Hess, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+HOXA9+in+leukemia:+dysregulation,+cofactors+and+essential+targets.">Role of HOXA9 in leukemia: dysregulation, cofactors and essential targets.</a> Oncogene. 35 (9), 1090-1098 (2016).</li><li>Kroon, E., Thorsteinsdottir, U., Mayotte, N., Nakamura, T., Sauvageau, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NUP98-HOXA9+expression+in+hemopoietic+stem+cells+induces+chronic+and+acute+myeloid+leukemias+in+mice.">NUP98-HOXA9 expression in hemopoietic stem cells induces chronic and acute myeloid leukemias in mice.</a> The EMBO Journal. 20 (3), 350-361 (2001).</li><li>Koike-Yusa, H., Li, Y., Tan, E. P., Velasco-Herrera Mdel, C., Yusa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+recessive+genetic+screening+in+mammalian+cells+with+a+lentiviral+CRISPR-guide+RNA+library.">Genome-wide recessive genetic screening in mammalian cells with a lentiviral CRISPR-guide RNA library.</a> Nature Biotechnology. 32 (3), 267-273 (2014).</li><li>Shalem, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+CRISPR-Cas9+knockout+screening+in+human+cells.">Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells.</a> Science. 343 (6166), 84-87 (2014).</li><li>Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+screens+in+human+cells+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system.</a> Science. 343 (6166), 80-84 (2014).</li><li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+sgRNAs+facilitate+CRISPR/Cas9-mediated+mouse+genome+targeting.">Dual sgRNAs facilitate CRISPR/Cas9-mediated mouse genome targeting.</a> The FEBS Journal. 281 (7), 1717-1725 (2014).</li><li>Sanjana, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+interrogation+of+functional+elements+in+the+noncoding+genome.">High-resolution interrogation of functional elements in the noncoding genome.</a> Science. 353 (6307), 1545-1549 (2016).</li><li>Rajagopal, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+mapping+of+regulatory+DNA.">High-throughput mapping of regulatory DNA.</a> Nature Biotechnology. 34 (2), 167-174 (2016).</li><li>Korkmaz, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genetic+screens+for+enhancer+elements+in+the+human+genome+using+CRISPR-Cas9.">Functional genetic screens for enhancer elements in the human genome using CRISPR-Cas9.</a> Nature Biotechnology. 34 (2), 192-198 (2016).</li><li>Rezaei, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FMS-Like+Tyrosine+Kinase+3+(FLT3)+and+Nucleophosmin+1+(NPM1)+in+Iranian+Adult+Acute+Myeloid+Leukemia+Patients+with+Normal+Karyotypes:+Mutation+Status+and+Clinical+and+Laboratory+Characteristics.">FMS-Like Tyrosine Kinase 3 (FLT3) and Nucleophosmin 1 (NPM1) in Iranian Adult Acute Myeloid Leukemia Patients with Normal Karyotypes: Mutation Status and Clinical and Laboratory Characteristics.</a> Turkish Journal of Haematology. 34 (4), 300-306 (2017).</li><li>Yaragatti, M., Basilico, C., Dailey, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+active+transcriptional+regulatory+modules+by+the+functional+assay+of+DNA+from+nucleosome-free+regions.">Identification of active transcriptional regulatory modules by the functional assay of DNA from nucleosome-free regions.</a> Genome Research. 18 (6), 930-938 (2008).</li><li>Wilken, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNase+I+hypersensitivity+analysis+of+the+mouse+brain+and+retina+identifies+region-specific+regulatory+elements.">DNase I hypersensitivity analysis of the mouse brain and retina identifies region-specific regulatory elements.</a> Epigenetics Chromatin. 8, 8 (2015).</li><li>Narlikar, L., Ovcharenko, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+regulatory+elements+in+eukaryotic+genomes.">Identifying regulatory elements in eukaryotic genomes.</a> Briefings in Functional Genomics and Proteomics. 8 (4), 215-230 (2009).</li><li>Hnisz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+proto-oncogenes+by+disruption+of+chromosome+neighborhoods.">Activation of proto-oncogenes by disruption of chromosome neighborhoods.</a> Science. 351 (6280), 1454-1458 (2016).</li></ol>

SgRNA kütüphaneler genler ve ağ sgRNA zenginleştirme24,25,26 aracılığıyla belirli hücresel işlevleri düzenleyen tanımlamak için bir işlev tarama sistemi uygulanmış olan protein kodlayıcı gen ile ilgili ,27,28. SgRNA kütüphaneler gene özgü işlevsel ekranları distal ve proksimal elemanları, BCL11A, Tdgf1a ve ilaç dire...

Son genom etkileşim çalışmaları insan nükleer genom formları hücre tipleri ve türler arasında korunmuş topolojik ilişkilendirirken etki (TADs) kararlı saptandı. Ayrı etki alanları içine genom organizasyonu kolaylaştırır ve düzenleyici elemanlarının (örneğin, arttırıcılar ve rehberleri) arasındaki etkileşimler kısıtlar. CCCTC bağlayıcı faktör (CTCF) TAD sınırları bağlar ve komşu TADs1içinde bulunan DNA öğeleri kısıtlayan etkileşimleri kritik bir rol oynar. Ancak, her ne kadar CTCF çoğunlukla farklı hücre tipleri aynı DNA Siteler'de etkileşim, bu kez bir hücre tipi ama diğer telkin içinde belirli bir sitenin bir Kromatin bariyer olarak çalışmasını genom geniş CTCF veri bağlama ortaya o CTCF işlevleri Kromatin sınırları2oluşumunda diğer faaliyetleri ile birlikte. Ne bilinmemektedir olsun sınır elemanları (CTCF-bağlayıcı siteleri) doğrudan CTCF biyolojik işleve bağlı olan ve nasıl bu bağlantıları ortaya olduğunu. Bu nedenle, belirli CTCF bağlayıcı siteleri genom içinde doğrudan TADs oluşumunu düzenleyen ve organizatörü/artırıcı etkileşimleri bu etki alanlarında veya komşu etki alanları arasında denetlemek öngörmekteyiz. İnsan ve fare genom sıralama projeleri ve sonraki epigenetik analizleri, genom kopyası yeni moleküler ve genetik imzaları ortaya çıkardı. Ancak, belirli imzaları/değişiklikler gen düzenlemesi ve hücresel işlev, hem de onların moleküler mechanism(s) rolü var. henüz tam olarak anlaşılması
CTCF-aracılı TADs fonksiyonel Kromatin etki alanları3,4,5temsil kanıt birden çok satırı destekler. Her ne kadar CTCF çoğunlukla farklı hücre tipleri aynı DNA Siteler'de etkileşim, genom geniş CTCF ChIP-seq veri CTCF bir Kromatin engel bir hücre tipi ama diğer2kez görür saptandı. CTCF genom organizasyonu4,6,7arabuluculuk tarafından geliştirme aşamasında önemli bir rol oynar. CTCF sınırları bozulma engelliler artırıcı/organizatörü etkileşimleri ve gelişimsel tıkanıklık için önde gelen Gen ekspresyonu. Bu CTCF TADs aracılı öneriyor sadece yapısal bileşenleri, aynı zamanda uygun artırıcı eylem ve gen transkripsiyonu5,8,9için gerekli yasal birimleri vardır.
HOX genleri embriyonik gelişim sırasında kritik rol oynarlar ve onlar onların ifade desenleri geçici ve dağınık şekilde kısıtlanır. HOXA locus hESCs ve IMR90 hücreleri1bir sınır CTCF ilişkili öğe anterior ve posteiror genler ayıran iki kararlı TADs oluşturur. Son raporlar gösterdi HoxBlinc, bir HoxB ilişkili locus lncRNA CTCF oluşumu aracılık eder TADs ve HOXB odağı etkileşimlerde artırıcı/organizatörü yönetti. Bu ön HOXB gen etkinleştirme sırasında ESC bağlılık ve farklılaşma10yol açar. Ayrıca, belirli bir gen loci HOXA odağı da dahil olmak üzere, CTCF İLETİMLERİNİZE TAD değişti etki alanları lineage belirli bir gen ifade profilleri aracılı ve hastalık Birleşik11,12gelişimi ile ilişkili. Kanıt CTCF gen transkripsiyonu koordine ve işlevsel etki alanlarına genom organize ederek hücre kimliğini belirlemek için birincil işlevini destekler.
Embriyonik gelişim sırasında hematopoiesis, rolü rağmen hematopoetik kök ve progenitör hücre (HS/PC) işlevi HOX genleri düzenler. Bu10,13,14,15yayılması ve farklılaşma arasındaki dengeyi kontrol ederek yapılır. Ifade HOX genleri sıkıca belirtimi ve hematopoetik hücrelerin en yüksek HS ifadede farklılaşma boyunca düzenlenir / PCs. HOX gen ekspresyonu yavaş yavaş azalır, en düşük fiyat seviyeleri ile olgunlaşma sırasında gerçekleşen hematopoetik hücrelerin16farklı. HOX gen bozukluk HS/PC'lerin lösemik dönüştürme17,-18önde gelen dysregulating kendini yenileme ve farklılaşma özelliklerine göre lösemik dönüşümünün baskın bir mekanizmadır. Ancak, kurulması ve normal oncogenic ifade desenleri HOX genleri hem de ilişkili düzenleyici ağları vs koruma mekanizması belirsizdir.
CRISPR-Cas9 sgRNA Kütüphane tarama protein kodlayıcı genlerin19 lncRNA20 ve miRNA21 farklı türler gibi de kadar kodlamayan genler olarak sorguya çekmek için yaygın olarak kullanılmış. Ancak, yüksek üretilen iş genom sıralama sgRNA Kütüphane tarama doğrulamak için sık sık uygulandığından CRISPR-Cas9 sgRNA Kütüphane yeni genomik hedefler belirlemek için maliyeti yüksek, kalır. Bizim sgRNA eleme sistemi belirli genom loci üzerinde odaklanmıştır ve hedefleme sgRNAs aracılığıyla tek adımlı RT-PCR marker gen ekspresyonu HOXA9gibi göre değerlendirir. Ayrıca, sıralama sgRNA genom ve Indel mutasyonlar entegre edildi doğruladı Sanger site hedefleme sgRNA tanımlamak için tespit edilebilir. Loci özgü CRISPR Cas9 genetik tarama yoluyla, CBS7/9 Kromatin sınır oncogenic Kromatin etki alanı oluşturmaktan ve bakımını yapmaktan Ektopik HOX gen ifade desenleri AML patogenezinde önemli bir düzenleyici olarak belirlenmiştir 12. yöntemi gelecekteki epigenetik terapi için potansiyel terapötik hedef olarak embriyonik geliştirme, hematopoiesis, leukemogenesis, aynı zamanda CTCF sınır CTCF sınır sadece belirli işlevini tanımlamak için yaygın olarak uygulanabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:689px;" width="689">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Lipofectamine 3000 reagent</td>
			<td style="width:155px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">L3000-008</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Proteinase K</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25530049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Puromycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1113802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stbl3 cells&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>&#160;C737303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEK293T</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MOLM-13</td>
			<td>DSMZ</td>
			<td>ACC 554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">lentiCRISPRv2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>52961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">psPAX2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pGEM&#174;-T Easy Vector Systems&#160;</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A137A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T4 ligase&#160;</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>&#160;M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAquick Gel Extract kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAuick PCR purification kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SingleShot&#8482; SYBR&#174;&#160;Green One-Step Kit</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1725095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">QIAGEN Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td style="width:100px;">12163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">&#160;11965084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI 1640&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal bovine serum (FBS)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">10-082-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin/streptomycin/L-glutamine&#160;</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:100px;">10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lenti-X Concentrator&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Clontech</td>
			<td style="width:100px;">631232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Trypan Blue Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Polybrene</td>
			<td style="width:155px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-134220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Genessee Scientific</td>
			<td>&#160;25-507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">TAE buffer&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>FERB49</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Surveyor&#174; Mutation Detection Kits</td>
			<td style="width:155px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:100px;">706020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Biorad Universal Hood II Gel Doc System</td>
			<td style="width:155px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:100px;">170-8126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Centrifuge 5424 R</td>
			<td style="width:155px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:100px;">5404000138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Digital Dry Baths/Block Heaters</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">88870002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">TSX Series Ultra-Low Freezers</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">TSX40086V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Forma&#8482; Steri-Cult&#8482; CO2&#160;Incubators</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">3308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Herasafe&#8482; KS, Class II Biological Safety Cabinet</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">51022484</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Sorvall&#8482; Legend&#8482; XT/XF Centrifuge Series</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">75004506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Fisherbrand&#8482;&#160;Isotemp&#8482; Water Baths</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">FSGPD02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:263px;">Thermo Scientific&#8482;&#160;Locator&#8482; Plus Rack and Box Systems</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">13-762-353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System</td>
			<td style="width:155px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:100px;">1855195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">MiniAmp&#8482; Thermal Cycler</td>
			<td style="width:155px;">Applied Biosystems technology</td>
			<td style="width:100px;">A37834</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:263px;">Thermo Scientific&#8482;&#160;Owl&#8482; EC300XL2 Compact Power Supply</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">7217581</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:263px;">Thermo Scientific&#8482;&#160;Owl&#8482; EasyCast&#8482; B1 Mini Gel Electrophoresis Systems</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:100px;">09-528-178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">VWR&#174; Tube Rotator and Rotisseries</td>
			<td style="width:155px;">VWR International</td>
			<td style="width:100px;">10136-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">VWR&#174; Incubating Mini Shaker</td>
			<td style="width:155px;">VWR International</td>
			<td style="width:100px;">12620-942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Analytical Balance MS104TS/00</td>
			<td style="width:155px;">METTLER TOLEDO</td>
			<td style="width:100px;">30133522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">DS-11 FX and DS-11 FX+ Spectrophotometer</td>
			<td style="width:155px;">DeNovix Inc.</td>
			<td style="width:100px;">DS-11 FX</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hox loci focused crispr/sgrna library screening identifying critical ctcf boundaries

CCCTC bağlayıcı faktör (CTCF)-aracılı istikrarlı topolojik etki alanlarını ilişkilendirme (TADs) oynamak önemli bir rol TADs komşu bulunan DNA öğeleri kısıtlayan etkileşimleri. CTCF embriyonik geliştirme, vücut desenlendirme, hematopoiesis ve leukemogenesis kontrol HOX genleri kayma ve zamansal ifade düzenlenmesinde önemli bir rol oynar. Ancak, olup olmadığını ve nasıl Kromatin organizasyon ve HOX gen ekspresyonu HOX ilişkili loci CTCF sınırları düzenleyen büyük ölçüde bilinmeyen kalır. Geçerli protokol TAD oluşumu ve HOX gen CTCF ilişkili Kromatin sınırlarına engellemeden etkilerini incelemek için tüm CTCF bağlama HOXA/B/C/D loci Siteler'de hedefleme belirli sgRNA havuza alınan Kütüphane oluşturuldu ifade. CRISPR-Cas9 ile genetik tarama, HOXA7/HOXA9 genler (CBS7/9) arasında bulunan CTCF bağlama sitesinde kritik bir regülatör oncogenic Kromatin etki alanı, hem de Ektopik HOX gen korumak için önemli olarak belirlenmiştir MLL yeniden düzenlenmiş Akut Miyeloid Lösemi (AML) ifade desenleri. Böylece, bu sgRNA Kütüphane yaklaşım eleme içinde belirli bir gen loci aracılı CTCF genom örgüt yeni anlayışlar sağlar ve aynı zamanda her iki kodlama metin notlu genetik düzenleyici elemanlarının fonksiyonel karakterizasyonu için bir temel sağlar ve kodlamayan, sonrası İnsan Genom Projesi dönemde normal biyolojik süreçler sırasında.

CRISPR-Cas9 teknoloji fonksiyonel genomik çalışmalar için bir güçlü araştırma araçtır. Bu düzenleme teknikleri geleneksel gen hızla değiştirme ve genom genelinde hem bireysel gen odaklı uygulamaları için yüksek faydalı vardır. Burada, ilk tek tek klonlanmış loci özgü CRISPR Cas9 dizilmiş sgRNA kitaplığı 1.070 sgRNAs 303 rasgele hedefleme genler, 60 olumlu denetimleri, insan hedefleme-500 kontrol eder ve 207 CTCF öğeleri veya lncRNA hedefleyen sgRNAs oluşan ...

Watch this Scientific Journal Video about HOX Loci Focused CRISPR/sgRNA Library Screening Identifying Critical CTCF Boundaries at JoVE.com

HOX Loci Focused CRISPR/sgRNA Library Screening Identifying Critical CTCF Boundaries

CRISPR/sgRNA Kütüphane protein kodlayıcı genlerin sorguya için uygulanmıştır. Ancak, işlev bir CTCF sınır gen düzenlemesi içinde ortaya çıkarmak için bir sgRNA kitaplığı fizibilite keşfedilmemiş kalır. Burada, CTCF sınırları içinde HOX loci fonksiyon aydınlatmak için HOX loci belirli sgRNA Kütüphane açıklayın.

HOX Loci odaklı CRISPR/sgRNA Kütüphane eleme tanımlayan kritik CTCF sınırları

CCCTC-binding factor (CTCF)-mediated stable topologically associating domains (TADs) play a critical role in constraining interactions of DNA elements ...

Kütüphane taraması adı verilen birleştirilmiş sgRNA'mız, genom boyunca kodlamayan elementlerin biyolojik işlevini belirlemek ve değerlendirmek için güçlü bir genetik yaklaşımdır. Bu teknik, ilişkili bağlayıcı bölgeleri, kromatik sınırları veya diğer düzenleyici unsurların hedeflenen genlerin ekspresyonu üzerindeki etkisini incelememize olanak sağlar. Yaklaşımımız, erken embriyonik gelişimde HOX gen regülasyonunda CTCF, uzun kodlamayan RNA'lar ve arttırıcıların ve anormal HOX gen imzası olan bazı lösemilerin rolünü belirlemek için kullanılabilir.CtCF bağlama sitelerini hedefleyen bir sgRNA tasarımı ile bu yordamı başlatın. Metin protokolünde açıklandığı gibi hücre hazırlama da sgRNA kitaplığı klonlama. Lentivirüs paketi için, kotransfect HEK293 T hücreleri saflaştırılmış kütüphane vektörleri 20 mikrogram, paketlenmiş plazmid 15 mikrogram ve zarf plazmid 10 mikrogram, 48 saat boyunca virüsler hasat önce.48 saat sonra, virüs supernatant toplamak ve 0.45 mikron düşük protein bağlayıcı PVDF membran ile filtre. Daha sonra, konsantre kullanarak, 50 kat lentiviral supernatant konsantre. Aliquot konsantre virüsler ve eksi 80 santigrat derece dondurucuda saklayın.MOLM13 hücrelerini toplam altı grup için konsantre lentivirus'un çeşitli dozlarıyla karıştırmak için 12 kuyu plakasının ayrı kuyularında çalışın. Hemen 33 santigrat derece iki saat boyunca 1000 kez g bu karışımları santrifüj. 12 kuyu plakasını 4 saat boyunca 37 santigrat derecede ve %5 karbondioksitle kuvöze aktarın.Hücre paletini bozmadan süpernatant'ı hafifçe aspire edin ve taze takviyeli RPMI 1640 Medium ile transdükre edilmiş hücreleri yeniden askıya alın. Daha sonra yeniden askıya alınan hücreleri T25 şişelerine aktarın ve puromisin olmadan 48 saat boyunca 37 derecede kuluçkaya yatırın. 48 saat sonra iki şişeye bu hücreleri bölünmüş, beş gün boyunca mililitre püromisin başına bir mikrolitre ile tedavi deneysel bir grup, ve beş gün boyunca puromisin tedavisi olmayan bir kontrol grubu.Puromisin tedavisi yapılan canlı hücre sayısını puromisin tedavisi olmayan hücre sayısına bölerek transdüksiyon için optimize edilmiş MOI değerini ölçün. Havuzlu kütüphane ile hücreleri iletin, orta sgRNA havuzlu lentivirus 0.3 MOI ile 6 kuyu plaka içinde 1.5 milyon MOLM13 hücreleri enfekte. Bir kontrol olarak lentivirus enfeksiyonu olmadan hücreleri kullanın.Hücreleri enfekte etmek için 1000 kez g'de altı kuyu plakasını 33 derecede iki saat santrifüj edin. Daha sonra, plakaları 4 saat boyunca %5 karbondioksitle 37 derecedek kuvöze aktarın. Hücre paletini bozmadan süpernatant'ı hafifçe aspire edin ve transekten hücreleri taze ortamla yeniden askıya alın.Daha sonra hücreleri T25 şişelerine aktarın ve puromisin olmadan 48 saat boyunca 37 derecede kuluçkaya yatırın. 48 saat sonra, beş gün boyunca mililitre püromisin başına bir mikrogram ile hücreleri tedavi. İki gün sonra taze ortam değişimi ve optimum hücre yoğunluğunu koruyun.Limitli seyreltme yöntemleri ile 96 iyi plakalar tek klon tohum. Bu tek klonu 37 santigrat derece ve %5 karbondioksitle kuluçkaya yatırın. Kültür 3-4 hafta boyunca.SgRNA entegre MOLM13 hücrelerini %0,4 Trypan Blue çözeltisi boyama ile sayın ve daha sonra kuyu başına 10.000 canlı hücreyi 96 iyi pcr plakaya aktarın. Plakayı 1000 kez g'de beş dakika santrifüj edin ve ardından bir pipetle süpernatantı iyice çıkarın ve atın. Hücre paletini rahatsız etmekten kaçının.Metinde açıklandığı gibi hücreleri yıkadıktan sonra her kuyuya hücre lisis ana karışımının 50 mikrolitreekleyin. Pipet hücre paletini yeniden askıya almak için beş kez yukarı ve aşağı. Karışımı oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatırın.Sonra, karışımı 5 dakika boyunca 37 dereceye, sonra da 5 dakika daha 75 santigrat dereceye aktarın. Rt qPCR reaksiyon karışımını içeren PCR kuyularına bir mikrolitre hücre lisatekleyin. Bu karışım ileri ve ters astar, ters transkriptaz ve Tek Adım reaksiyon karışımı marker genleri içerir.Ters transkripsiyon reaksiyonunu 50 santigrat derecede 10 dakika çalıştırın ve ardından polimerizasyon aktivasyonu ve 95 santigrat derecede bir dakika DNA denatürasyonu. Metin protokolünde ayrıntılı olarak belirtildiği gibi 40 döngü PCR reaksiyonu ile RT PCR gerçekleştirin. HOXA9'un sanger dizilimi yoluyla ekspresyon klonlarını azalttığını doğrulayın ve metin protokolünde açıklandığı gibi MOLM13 genom DNA'sı ile PCR yapın.PCR arıtma kiti ile PCR ürünlerini ayıklayın ve arındırın. Arınmış PCR ürünlerini T4 ligasyon tamponu, T vektör DNA'sı, PCR DNA'sı ve T4 ligaz ile T vektörüne dönüştürün. Ligasyon karışımını bir gecede 16 derecede bir kuvöze yerleştirin.Bir LB ampillin antibiyotik agar plaka üzerinde DH5 alfa yetkili hücreleri ve plaka içine ligasyon karışımı aktarın. Tabakları bir gecede 37 derecede kuluçkaya yatırın. LB plakasından tek klonları seçin ve genotipleme ve Sanger sıralama ile doğrulayın.Referans 200 nanogram ve 0,2 mililitre PCR tüp test PCR amplicons 200 nanogram ile heteroduplex karışım grubu ayarlayın. Kontrol olarak sadece 400 nanogram referans PCR amplicons ile homoduplex karışım grubunu ekleyin. Ayrıca 800 mililitre su ile dolu bir litre likte heteroduplex ve homoduplex karışımı 95 santigrat derecede beş dakika kuluçkaya yatırın.Daha sonra karışımları oda sıcaklığına kadar yavaş yavaş soğutarak heteroduplex veya homoduplex'i oluşturabilirsiniz. Şimdi, bir mikrolitre indel mutasyonu algılama nükleazı ile anneleştirilmiş heteroduplex ve homoduplex karışımın 400 nanogramını ve 60 dakika boyunca 42 derecede iki mikrolitre nükleaz reaksiyon tamponu sindirin. Sindirilmiş örnekleri agarose jel elektroforezile analiz edin.Heteroduplex karışım DNA'sı küçük parçalar halinde kesilmeli ve homoduplex DNA kesilmemelidir. MOLM13 pozitif klonları hedefleyen sgRNA, KONTROL HÜCRELERI ile karşılaştırıldığında HOXA9 genlerinin ekspresyon düzeylerine göre RT qPCR yöntemi ile doğrulandı. Hayatta kalan 528 klondan 10'u HOXA9 seviyelerinde %50'den fazla azalma gösterdi.hoxa9 azaltılmış entegre sgRNAs, HOXA9 değişmeden ve HOXA9 artmış klonlar, daha fazla sgRNA PCR amplifikasyon ve Sanger dizisi ile kimlik tarafından doğrulandı. HOXA9 seviyelerinde azalma gösteren on klondan altısı, Sanger dizilimi tarafından belirlenen CBS79 bölgesini hedef alan sgRNA'lar içeriyordu. Entegre sgRNA pozitif klonların indel mutasyonları PCR tabanlı genotipleme ve nükleaz sindirimi ile belirlendi.HOXA7 ve HOXA9 genleri arasında bulunan CTCF sitesinin heterozigot delemesi PCR tabanlı genotipleme ile saptandı. HOXA9-azalmış klonlar beş, altı, 28 ve 121 CBS79 sınır konumunda silme sergiledi. Benzer sonuçlar, nükleaz sindirim tahkikatları ile analiz edilen CBS79 yerindeki indel mutasyonları için de gözlenmiştir.Bu işlemi gerçekleştirirken, nükleaz sindirim istinat yoluyla sgRNA kaynaklı indel mutasyonları tespit etmek için heteroduplexes ve homoduplexes eşit miktarda yapmak önemlidir. Yaklaşımımız, seçilen işaretleyicinin kullanılmasını, genin lökemogenez üzerindeki etkilerini keşfetmek için hedef gen üzerinde yeni nesil sıralama yapılmasını sağlar. Genel yaklaşımımız, normal biyolojik süreç sırasında dikkat çeken genetik düzensiz elementlerin fonksiyonel olarak doğru lanmasını ve azaltılmasını ve ölümünden sonra genom proje hatasında lökemogenezi nin azaltılmasını önler.

Research

JoVE Journal

Genetics

HOX Loci Focused CRISPR/sgRNA Library Screening Identifying Critical CTCF Boundaries

A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source

Büyük ölçekli gRNA Kütüphane üretim herhangi bir DNA kaynaktan için evrensel bir iletişim kuralı

The popularity of the CRISPR/Cas9 system for both genome and epigenome engineering stems from its simplicity and adaptability. An effector (the Cas9 ...

G2-seq: A High Throughput Sequencing-based Technique for Identifying Late Replicating Regions of the Genome

G2-seq: geç genom bölgelerinde çoğaltma tanımlamak için bir yüksek işlem hacmi-dayandırılmış tekniği

Numerous techniques have been developed to follow the progress of DNA replication through the S phase of the cell cycle. Most of these techniques have ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Sağlam DNA izolasyon ve yüksek işlem hacmi sıralama kitaplığı inşaat sulak numuneler için

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

Retrospektif mikroRNA sıralama: Parafin gömülü RNA Formalin sabit örnekler kullanarak Tamamlayıcı DNA Kütüphane hazırlık Protokolü

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of ...

Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen

Ultralow giriş genom Kütüphane hazırlık bir tek Tardigrade örnekten sıralama

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state ...

Bronchoalveolar Lavage Exosomes in Lipopolysaccharide-induced Septic Lung Injury

Bronchoalveolar lavaj Exosomes septik akciğer Lipopolysaccharide kaynaklı yaralanmalarında

Acute lung injury (ALI) and acute respiratory distress syndrome (ARDS) represent a heterogeneous group of lung diseases which continues to have a high ...

Mating-based Overexpression Library Screening in Yeast

Maya Overexpression çiftleşme tabanlı Kütüphane tarama

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool ...

Screening Cotton Genotypes for Reniform Nematode Resistance

Reniform Nematode direnci için pamuk Genotürleri eleme

A rapid non-destructive reniform nematode (Rotylenchulus reniformis) screening protocol is needed for the development of resistant cotton (Gossypium ...

Identifying Mutations by High Resolution Melting in a TILLING Population of Rice

Pirinç Bir TILLING Popülasyonyüksek Çözünürlükte Erime mutasyonları belirlenmesi

Target Induced Local Lesions In Genomes (TILLING) is a strategy of reverse genetics for the high-throughput screening of induced mutations. However, the ...

Screening and Identification of RNA Silencing Suppressors from Secreted Effectors of Plant Pathogens

Bitki Patojenlerinin Gizli Efektörlerinden RNA Susturucu Baskılayıcıların Taranması ve Tanımlanması

RNA silencing is an evolutionarily conserved, sequence-specific gene regulation mechanism in eukaryotes. Several plant pathogens have evolved proteins ...