Name: predicting in vivo payloads delivery using a blood-brain tumor-barrier in a dish
Uploaded: 2019-04-16T14:30:00
Duration: 13 min 34 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Predicting In Vivo Payloads Delivery using a Blood-brain Tumor-barrier in a Dish at JoVE.com

بتأييد هذه البحوث من المنح المقدمة من المنظمات السرطان الفنلندية، وجين & مؤسسة أركو آتوس، وسيغريد جوسيليوس مؤسسة (بفضل V.L.J.)، ومؤسسة العلوم الوطنية السويسرية (منح المتقدم Postdoc.Mobility لا: P300PB_164732، إلى س. ك.) ومؤسسة أبحاث أوريون (إلى س. ك.)، ومؤسسة النصب التذكاري كويستيلا مود (إلى س. ك.)، وأكاديمية فنلندا (ترفة 2017، منح لا: 314 498). وحدة التصوير بيوميديكوم (هلسنكي) المسلم لتوفير الفحص المجهري التصوير المرافق الأساسية.

<ol>
	<li>Daneman, R., Prat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-brain+barrier.">The blood-brain barrier.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (1), a020412 (2015).</li><li>Quail, D. F., Joyce, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Microenvironmental+Landscape+of+Brain+Tumors.">The Microenvironmental Landscape of Brain Tumors.</a> Cancer Cell. 31 (3), 326-341 (2017).</li><li>Wang, Z., Sun, H., Yakisich, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+the+blood-brain+barrier+for+chemotherapy:+limitations,+challenges+and+rising+problems.">Overcoming the blood-brain barrier for chemotherapy: limitations, challenges and rising problems.</a> Anticancer Agents in Medicinal Chemistry. 14 (8), 1085-1093 (2014).</li><li>Alkins, R. D., Brodersen, P. M., Sodhi, R. N., Hynynen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+drug+delivery+for+boron+neutron+capture+therapy+of+brain+tumors+with+focused+ultrasound.">Enhancing drug delivery for boron neutron capture therapy of brain tumors with focused ultrasound.</a> Neuro Oncology. 15 (9), 1225-1235 (2013).</li><li>Alli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brainstem+blood+brain+barrier+disruption+using+focused+ultrasound:+A+demonstration+of+feasibility+and+enhanced+doxorubicin+delivery.">Brainstem blood brain barrier disruption using focused ultrasound: A demonstration of feasibility and enhanced doxorubicin delivery.</a> Journal of Controlled Release. 281, 29-41 (2018).</li><li>Ashby, L. S., Smith, K. A., Stea, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gliadel+wafer+implantation+combined+with+standard+radiotherapy+and+concurrent+followed+by+adjuvant+temozolomide+for+treatment+of+newly+diagnosed+high-grade+glioma:+a+systematic+literature+review.">Gliadel wafer implantation combined with standard radiotherapy and concurrent followed by adjuvant temozolomide for treatment of newly diagnosed high-grade glioma: a systematic literature review.</a> World Journal of Surgical Oncology. 14 (1), 225 (2016).</li><li>Guishard, A. F., Yakisich, J. S., Azad, N., Iyer, A. K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+gap+in+ongoing+clinical+trials+for+glioma.">Translational gap in ongoing clinical trials for glioma.</a> Journal of Clinical Neurosciences. 47, 28-42 (2018).</li><li>Rahman, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalized+endothelial+cell+lines+for+in+vitro+blood-brain+barrier+models:+A+systematic+review.">Immortalized endothelial cell lines for in vitro blood-brain barrier models: A systematic review.</a> Brain Research. 1642, 532-545 (2016).</li><li>Helms, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+of+the+blood-brain+barrier:+An+overview+of+commonly+used+brain+endothelial+cell+culture+models+and+guidelines+for+their+use.">In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 36 (5), 862-890 (2016).</li><li>Wang, J. D., Khafagy, e. l. -. S., Khanafer, K., Takayama, S., ElSayed, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+Endothelial+Cells,+Pericytes,+and+Astrocytes+into+a+3D+Microfluidic+in+Vitro+Model+of+the+Blood-Brain+Barrier.">Organization of Endothelial Cells, Pericytes, and Astrocytes into a 3D Microfluidic in Vitro Model of the Blood-Brain Barrier.</a> Molecular Pharmaceutics. 13 (3), 895-906 (2016).</li><li>Phan, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier-on-a-chip:+Microphysiological+systems+that+capture+the+complexity+of+the+blood-central+nervous+system+interface.">Blood-brain barrier-on-a-chip: Microphysiological systems that capture the complexity of the blood-central nervous system interface.</a> Experimental Biology and Medicine (Maywood). 242 (17), 1669-1678 (2017).</li><li>Bang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Low+Permeability+Microfluidic+Blood-Brain+Barrier+Platform+with+Direct+Contact+between+Perfusable+Vascular+Network+and+Astrocytes.">A Low Permeability Microfluidic Blood-Brain Barrier Platform with Direct Contact between Perfusable Vascular Network and Astrocytes.</a> Scientific Reports. 7 (1), 8083 (2017).</li><li>Wilhelm, I., Krizbai, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+of+the+blood-brain+barrier+for+the+study+of+drug+delivery+to+the+brain.">In vitro models of the blood-brain barrier for the study of drug delivery to the brain.</a> Molecular Pharmacology. 11 (7), 1949-1963 (2014).</li><li>Campisi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+self-organized+microvascular+model+of+the+human+blood-brain+barrier+with+endothelial+cells,+pericytes+and+astrocytes.">3D self-organized microvascular model of the human blood-brain barrier with endothelial cells, pericytes and astrocytes.</a> Biomaterials. 180, 117-129 (2018).</li><li>Pirsko, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Effect+of+Culture+Media+on+Epithelial+Differentiation+Markers+in+Breast+Cancer+Cell+Lines+MCF7,+MDA-MB-436+and+SkBr3.">An Effect of Culture Media on Epithelial Differentiation Markers in Breast Cancer Cell Lines MCF7, MDA-MB-436 and SkBr3.</a> Medicina (Kaunas). 54 (2), (2018).</li><li>Stebbins, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+and+characterization+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+brain+microvascular+endothelial+cells.">Differentiation and characterization of human pluripotent stem cell-derived brain microvascular endothelial cells.</a> Methods. 101, 93-102 (2016).</li><li>Canfield, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+isogenic+blood-brain+barrier+model+comprising+brain+endothelial+cells,+astrocytes,+and+neurons+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">An isogenic blood-brain barrier model comprising brain endothelial cells, astrocytes, and neurons derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Journal of Neurochemistry. 140 (6), 874-888 (2017).</li><li>Cao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-inducible+factor-1alpha+is+involved+in+isoflurane-induced+blood-brain+barrier+disruption+in+aged+rats+model+of+POCD.">Hypoxia-inducible factor-1alpha is involved in isoflurane-induced blood-brain barrier disruption in aged rats model of POCD.</a> Behavioural Brain Research. 339, 39-46 (2018).</li><li>Abbott, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte-endothelial+interactions+and+blood-brain+barrier+permeability.">Astrocyte-endothelial interactions and blood-brain barrier permeability.</a> Journal of Anatomy. 200 (6), 629-638 (2002).</li><li>Kinnari, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+homing+peptide-functionalized+porous+silicon+nanovectors+for+cancer+therapy.">Tumour homing peptide-functionalized porous silicon nanovectors for cancer therapy.</a> Biomaterials. 34 (36), 9134-9141 (2013).</li><li>Levin, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personalized+medicine+in+neuro-oncology.">Personalized medicine in neuro-oncology.</a> CNS Oncology. 5 (2), 55-58 (2016).</li><li>Weathers, S. S., Gilbert, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+Personalized+Targeted+Therapeutics:+An+Overview.">Toward Personalized Targeted Therapeutics: An Overview.</a> Neurotherapeutics. 14 (2), 256-264 (2017).</li><li>O'Duibhir, E., Carragher, N. O., Pollard, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerating+glioblastoma+drug+discovery:+Convergence+of+patient-derived+models,+genome+editing+and+phenotypic+screening.">Accelerating glioblastoma drug discovery: Convergence of patient-derived models, genome editing and phenotypic screening.</a> Molecular and Cellular Neuroscience. 80, 198-207 (2017).</li><li>Kaya, M., Ahishali, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+permeability+in+barrier+type+of+endothelium+in+brain+using+tracers:+Evans+blue,+sodium+fluorescein,+and+horseradish+peroxidase.">Assessment of permeability in barrier type of endothelium in brain using tracers: Evans blue, sodium fluorescein, and horseradish peroxidase.</a> Methods in Molecular Biology. 763, 369-382 (2011).</li><li>Yang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+two+immortalized+cell+lines,+ECV304+and+bEnd3,+for+in+vitro+permeability+studies+of+blood-brain+barrier.">Identification of two immortalized cell lines, ECV304 and bEnd3, for in vitro permeability studies of blood-brain barrier.</a> PLoS One. 12 (10), e0187017 (2017).</li><li>Blouw, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hypoxic+response+of+tumors+is+dependent+on+their+microenvironment.">The hypoxic response of tumors is dependent on their microenvironment.</a> Cancer Cell. 4 (2), 133-146 (2003).</li><li>Argaw, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte-derived+VEGF-A+drives+blood-brain+barrier+disruption+in+CNS+inflammatory+disease.">Astrocyte-derived VEGF-A drives blood-brain barrier disruption in CNS inflammatory disease.</a> Journal of Clinical Investigation. 122 (7), 2454-2468 (2012).</li><li>Miao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF+increases+paracellular+permeability+in+brain+endothelial+cells+via+upregulation+of+EphA2.">VEGF increases paracellular permeability in brain endothelial cells via upregulation of EphA2.</a> The Anatomical Record (Hoboken). 297 (5), 964-972 (2014).</li><li>Heinolainen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGFR3+Modulates+Vascular+Permeability+by+Controlling+VEGF/VEGFR2+Signaling.">VEGFR3 Modulates Vascular Permeability by Controlling VEGF/VEGFR2 Signaling.</a> Circulation Research. 120 (9), 1414-1425 (2017).</li><li>Claesson-Welsh, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+permeability--the+essentials.">Vascular permeability--the essentials.</a> Upsala Journal of Medical Sciences. 120 (3), 135-143 (2015).</li><li>Adriani, G., Ma, D., Pavesi, A., Goh, E. L., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+the+Blood-Brain+Barrier+in+a+3D+triple+co-culture+microfluidic+system.">Modeling the Blood-Brain Barrier in a 3D triple co-culture microfluidic system.</a> Conference Proceedings - IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. 2015, 338-341 (2015).</li><li>Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hCMEC/D3+cell+line+as+a+model+of+the+human+blood+brain+barrier.">The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier.</a> Fluids and Barriers of the CNS. 10 (1), 16 (2013).</li><li>Paatero, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyses+in+zebrafish+embryos+reveal+that+nanotoxicity+profiles+are+dependent+on+surface-functionalization+controlled+penetrance+of+biological+membranes.">Analyses in zebrafish embryos reveal that nanotoxicity profiles are dependent on surface-functionalization controlled penetrance of biological membranes.</a> Scientific Reports. 7 (1), 8423 (2017).</li><li>Prabhakar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimuli-responsive+hybrid+nanocarriers+developed+by+controllable+integration+of+hyperbranched+PEI+with+mesoporous+silica+nanoparticles+for+sustained+intracellular+siRNA+delivery.">Stimuli-responsive hybrid nanocarriers developed by controllable integration of hyperbranched PEI with mesoporous silica nanoparticles for sustained intracellular siRNA delivery.</a> International Journal of Nanomedicine. 11, 6591-6608 (2016).</li><li>Hyvonen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+target+for+peptide-based+imaging+and+treatment+of+brain+tumors.">Novel target for peptide-based imaging and treatment of brain tumors.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 13 (4), 996-1007 (2014).</li><li>Feng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammary-Derived+Growth+Inhibitor+Targeting+Peptide-Modified+PEG-PLA+Nanoparticles+for+Enhanced+Targeted+Glioblastoma+Therapy.">Mammary-Derived Growth Inhibitor Targeting Peptide-Modified PEG-PLA Nanoparticles for Enhanced Targeted Glioblastoma Therapy.</a> Bioconjugate Chemistry. 26 (8), 1850-1861 (2015).</li><li>Nance, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dense+poly(ethylene+glycol)+coating+improves+penetration+of+large+polymeric+nanoparticles+within+brain+tissue.">A dense poly(ethylene glycol) coating improves penetration of large polymeric nanoparticles within brain tissue.</a> Science Translational Medicine. 4 (149), 149rA119 (2012).</li><li>Berg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+nanoparticle+transport+through+in+vitro+blood-brain+barrier+models.">Quantitative analysis of nanoparticle transport through in vitro blood-brain barrier models.</a> Tissue Barriers. 4 (1), e1143545 (2016).</li><li>Noumbissi, M. E., Galasso, B., Stins, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+vascular+heterogeneity:+implications+for+disease+pathogenesis+and+design+of+in+vitro+blood-brain+barrier+models.">Brain vascular heterogeneity: implications for disease pathogenesis and design of in vitro blood-brain barrier models.</a> Fluids and Barriers of the CNS. 15 (1), 12 (2018).</li><li>Heymans, M., Sevin, E., Gosselet, F., Lundquist, S., Culot, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mimicking+brain+tissue+binding+in+an+in+vitro+model+of+the+blood-brain+barrier+illustrates+differences+between+in+vitro+and+in+vivo+methods+for+assessing+the+rate+of+brain+penetration.">Mimicking brain tissue binding in an in vitro model of the blood-brain barrier illustrates differences between in vitro and in vivo methods for assessing the rate of brain penetration.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 127, 453-461 (2018).</li></ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

ظهور مفهوم تقلب الورم إينتيرباتينت شبابها البحوث المتعلقة بالسرطان شخصية الطب21. هذا التغير أيضا من السمات مميزة للأورام الخبيثة في الجهاز العصبي المركزي. نظراً لعدم إمكانية التنبؤ بالورم، استجابة للعلاج الكيميائي إضافة إلى إيواء أثر بي بي بي لإيصال الأدوية، وتماماً ويشكل تحديات كبيرة في رعاية المرضى22. من أجل تطوير علاجات أكثر فعالية، من الضروري غالباً إلى مكتبات شاشة كبيرة من جزيئات جديدة. لتقييم فعالية انتيتومور وقدرة يؤدي العلاجية الجديدة الوصول إلى موقع الورم، هو أفضل خيار الدراسة السريرية على الخلايا المستمدة من المريض مزروع في فيفو إلى الآلهة المريض موريني. أسباب أخلاقية (مبدأ 3Rs عند استخدام الحيوانات المختبرية) والعملية (المالية والوقت، والإنسان، ومرفق الموارد)، هو تطوير منصة الفحص في المجراة على نطاق واسع غالباً ما تكون غير ممكن، ومن ثم فحوصات يستند إلى الخلية وتظل نموذجا لاختيار23. والسبب الرئيسي لاختيار إنشاء خطوط الخلايا وتجنب الخلايا الأولية تيسير إمكانية تكرار نتائج والحد من استخدام الحيوانات المختبرية، التي هي المصدر الرئيسي لعزله وإقامة ثقافات مورين الأولية. طرق عرض هنا، اعتقادا راسخا أن تمتثل 3Rs، يمكن تجاهل كفاءة جسيمات نانوية من تحقيق السريري كذلك على المعيار لعجزها عن عبور نموذج بتب. كإثبات لمبدأ، نحن تصف هنا النتائج التي تم الحصول عليها أثناء التطوير والتحقق من بتب. كنا قادرين على تأكيد النتائج المختبرية المجراة، على سبيل المثال عند قياس نشر السلبي من 376 دا فلوريسسين الصوديوم.
البروتوكول الواردة في هذه الورقة وصف إعداد خلايا بطانية كوكولتوريد مع أستروسيتيس لتشكل واجهة ورم تشبه حاجز دم في الدماغ في إعداد في المختبر. حالما يتم إنشاء احتكاك بين هذه الأنواع اثنين من الخلية، يسلك طبقة الخلايا البطانية أوجه التشابه مع بي بي بي (مثلاً خلية سطحية تعبير البروتينات مفرق ضيق وذات نفاذية منخفضة نسبيا). من المثير للاهتمام، يبدو أن تقليد بتب مورين لتوفير قيم النفاذية نا-فلوريدا خاصة مماثلة لتلك التي تم الحصول عليها باستخدام الماوس المجراة في BBB نفاذية القياسات24. ولذلك، سيتم ربط أداء يقلد بتب مباشرة باختيار الخلايا المستخدمة لتشكيل الحاجز. خلايا بطانية bEND3 تنشأ من الدماغ ومن المعروف أن النجاح في إقامة حواجز عند كوكولتوريد مع أستروسيتيس25. ومع ذلك، كنا نستخدم astrocytes هيفكو مخلدة26 لتوليد تقليد بتب. نظراً لعدم وجود عامل نقص إيندوسيبلي، لا تنتج هذه astrocytes VEGF-أ، وهو الجوهر في تحقيق الاستقرار لتقليد بتب الموصوفة هنا. وقد حددت astrocytes المغيرون نفاذية BBB، على سبيل المثال عن طريق الإفراج عن فيجف-أ ردا على نيوروينفلاميشن27. تنشيط مستقبلات عامل نمو غشائي الأوعية الدموية (فيجفرس) منظم رئيسي من نفاذية بطانية/الأوعية الدموية في المختبر28 و المجراة في29. ولذلك، تنشيط ملاحق VEGF-ألف في المتوسط VEGFR2 في خلايا بطانية، الذي يدفع الفسفرة أدهيرينس مفرق البروتينات مثل هاء-كادهيرين30. فقدان غشائي خلية-خلية الاتصالات يولد درجة عالية من نفاذية الأوعية الدموية. وبالمثل، كل من الخاصية ميتوجينيك قوية والتكوين غير معروف للأمصال البقري الجنينية المستخدمة في فحوصات الثقافة الخلية يسبب القضايا الرئيسية في الحاجز الاستقرار وفحص إمكانية تكرار نتائج.
الخلايا البطانية البشرية الوريد السري (هوفيكس) تستخدم أحياناً لتشكيل BBB في المختبر31؛ ومع ذلك، تختلف كثيرا من خلايا الدماغ بطانية microvascular، مثل خط الخلية D3 هكميك/32، من حيث التعبير الجيني وتشكيل حاجز خصائص. بيد نفاذية أعلى نسبيا مقارنة القيم التي تم الحصول عليها مع الخلايا HuAR2T نمت وحدها bEND3 كانت تقلص إلى حد كبير من كوكولتورينج لهم مع البشرية astrocytes الأولية. على الرغم من أن خلايا بطانية مطلوبة لتشكل الجدار الخلوي، فمن الواضح أن أستروسيتيس دور لا يقل أهمية لتشكيل بتب وتحقيق الاستقرار.
عندما تم إضافة مجالات الدبقي المستمدة من المريض إلى هذه المعادلة، تقليد بتب الماوس لخص بعض الميزات لتكثيفها مورين، مثل انتشار المخدرات عن طريق المفرج الدماغ واستهداف الخلايا السرطانية. على سبيل المثال، أن يقلد بتب مناقشتها هنا كانت ناجحة في النسخ المتطابق المجراة في السلوك عندما نحن فحص عدة جسيمات نانوية بأقطار مختلفة. لتوضيح ذلك التوازي بين النماذج في المختبر وفي الحية، استخدمنا جسيمات نانوية سيليكات ميسوبوروس هو موضح سابقا33 مع خصائص اختراق الخلية34 مترافق لاستهداف الورم الببتيد قن على بهم surface20. منازل الببتيد استهداف حظيرة لخلايا الورم الغازية عن طريق الربط المحددة لمثبطات النمو المشتقة من الثديية (مدجي). هي عدة أنواع السرطان، بما في ذلك جليوماس، أوفيريكسبريسينج مدجي مقارنة بأنسجة طبيعية35، مما يجعل من مجموعة فعالة جداً استهداف الورم حظيرة قادرة على زيادة إيصال حمولة20. جسيمات نانوية المستخدمة هنا قد ثبت سابقا أن منتشر في المخ حمة (27547955)، وعندما فونكتيوناليزيد مع تاكسول، هذه النانو-الشحنات قد نجحت في الحد من النمو الدبقي في نماذج الإكلينيكية36. إضافة مخلفات البولي إثيلين غليكول (شماعة) على السطح جسيمات نانوية حافظت أيضا على التهمة ثابتة للقيم الإيجابية (حول + 4 mV)، مما يتيح التفاعل الأفضل مع وحدة نيوروفاسكولار37 وأيضا زيادة استقرارها في الدورة الدموية. في البيانات المقدمة، وكان مترافق كاتشين 3 من شماعة ل NP110s، بينما كانت مغطاة NP350s كاتشين 10 من الوتد. ومع ذلك، شماعة زيادة الوزن الجزيئي أيضا أدت إلى زيادة كبيرة في قطر نانوحبيبات، ومن ثم قدراتها المادية لعبور BBB. ولذلك، علينا التحقق ما إذا كان الأبعاد الفيزيائية للجسيمات حالت دون مرورها عبر بتب وعما إذا كانت هذه الملاحظات يمكن أن تكون متطابقة المجراة.
ووفقا للملاحظات التي تم نشرها في السابق، لاحظنا أن NP110s اكسترافاساتيد عن طريق بتب في المختبر وبي بي بي من الفئران تحمل الأورام داخل الجمجمة، بينما NP350s الإبقاء على الجانب لومينال تقليد بتب وفي الأوعية الدموية من الفئران. هذه النتائج مماثلة توحي بقوة أن تنبأ النموذج بتب المجراة في قدرة جسيمات نانوية عبور BBB وتصل إلى الدماغ.
وكثيراً ما تناقش أهمية النماذج الخلوية من بي بي بي، حتى لإيصال المركزية من جسيمات نانوية38. نعرض هنا أن أستروسيتيس الأولية وخلايا بطانية، كلاهما تعتبر أهم الأدوات في المختبر، يمكن الاستعاضة عن الخلايا مخلدة و/أو المتاحة تجارياً، ضمان قابلية أكبر وإمكانية تكرار نتائج. ويمكن تطوير الجيل القادم من يقلد BBB في المختبر بدمج أجهزة موائع جزيئية، السماح للوحدات المشكلة جميل neurovascular تشبه هيكلياً BBB الفعلية12،14. بيد أن هذه النماذج حاليا غير صالحة للفرز الفائق من الجزيئات التي سلمت إلى جليوماس، بسبب القيود التقنية في المتابعة تسليم14. من الصعب حقاً التقاط الفسيولوجية تعقيد BBB في طبق، ويمكن أن تهدد إمكانية عدم وجود بعض مستقبلات/البروتينات، والمعروف أن تبديها BBB، تفسير النتائج. حجة أخرى تتعلق تقلبات كبيرة في التعبير الجيني بين ظروف المجراة في وفي المختبر، وكذلك من خط خلية واحدة إلى آخر، خاصة بالنظر إلى خلايا بطانية. ومع ذلك، يمكن القول أن وحدة neurovascular ليست كيانا موحدا داخل المخ39. توصلت البحوث العلمية في مجال البيولوجيا حقبة إنسانية حيث نظرت الرفق بالحيوان، والمسؤولية الأخلاقية، وتكلفة استخدام حياة الحيوان دائماً قبل تصميم تجربة. ولذلك، لدعم استبدال الحيوانات، عدد متزايد من الدراسات التي أجريت مؤخرا تظهر أن الوعي بالقيود المفروضة على النماذج والاختيار الدقيق للنماذج الخلوية إنشاء الجدار العازل – مع تشديد على أستروسيتيس – تبرر المباراة بين النتائج التي تم الحصول عليها في صحن وفي الحيوان النماذج40. مع المنهجية الموضحة هنا، نحصل على خطوة واحدة أقرب إلى خفض عدد الحيوانات التجريبية المستخدمة لفحص أغراض ترانسسيتوسيس بي بي بي للمداواة المحتملة.

وتتكون وحدة neurovascular الخلايا العصبية، أستروسيتيس وبي بي بي، شكلتها اتصالات معقدة بين بيريسيتيس، أستروسيتيس، وخلايا بطانية والغشاء الطابق السفلي يرتبط تشكيل ميكروفاسكولاتوري الدماغ1. وينظم هذا الجدار الخلوي ضيق يتكون من سفن المستمر، نونفينيستراتيد ناعما حركة الأيونات والجزيئات (بما في ذلك الهرمونات أو المواد الغذائية أو الأدوية) ولكن أيضا تعميم خلايا1. ترانسسيتوسيس المنخفضة لا سيما من خلال BBB الجزيئات عالية الوزن الجزيئي، مثل الأجسام المضادة العلاجية، ويصرف المخدرات، أو نانوكومبوندس، كبير يقيد التقدم في اكتشاف الأدوية للأمراض العصبية، بما في ذلك الخبيث gliomas2. وفي الواقع، تشيموثيرابيس المسلمة شفويا أو عن طريق الوريد تصل إلى حمة الدماغ غالباً في تركيزات منخفضة على نحو كاف للحث على تأثير انتيتومور أو هي ببساطة غير قادر على عبور بتب للوصول إلى الخلايا الورمية3. العديد من الدراسات السريرية والاكلينيكية لم تعالج مسألة الاختراق بتب لكن حاولوا عرقلة بتب عابر، على سبيل المثال باستخدام الموجات فوق الصوتية المركزة4،5، أو التحايل عليه بالمباشرة في الموقع تسليم المخدرات6. ولكن أيا من هذه التقنيات كانت قادرة على التصدي لتوسع الورم لا مفر منه أو الانتكاس. لذلك، عند تطوير العلاجات أنتيجليوما الرواية، ينبغي النظر نشرها من خلال بتب كأحد الجوانب الحاسمة للنجاح في إيصال العوامل العلاجية7.
نظراً لطبيعة التفاعلات الخلية داخل بتب معقدة للغاية، والدراسات المجراة في الحيوانات المختبرية يبدو أن الاختيار الواضح عند دراسة مرور جزيئات من الدم للدماغ. بيد عالية النطاق المجراة في أساليب معقدة نسبيا لإنشاء، وعليه، لا تسمح للفرز الفائق للجزيئات في فترة زمنية معقولة بتكلفة معقولة. بل الأهم من ذلك، الحيوان اختبار قد اتبع المبادئ التوجيهية الأخلاقية 3R يعرف ط) صقل، ثانيا) الحد، وذات الصلة بالسياق الحالي، ثالثا) استبدال عن طريق بروتوكولات بديلة (على سبيل المثال، في طرق المختبر في السيليكون). ولذلك، إعادة بتب في المختبر يظهر كإمكانية مثيرة للاهتمام وجذابة، ولكن كما أنه يشكل مهمة معقدة تحدي القيود المختلفة. العديد من المحاولات لإعادة هذه المقصورة معقد مع الخلايا الأولية مثقف أو خطوط الخلايا من الكلاب البوليسية، الخنزير، وقد نشرت مورين، وحتى البشرية المنشأ (كما استعرضها الرحمن et al.8 و9من قانون هيلمز et al.). وتشمل هذه النماذج ثلاثية الأبعاد موائع جزيئية نظم10، بي بي بي على رقاقة11،12، والجموع من المتغيرات استناداً إلى ثقافات المشارك الكلاسيكية في إدراج النظم. ومع ذلك، نظم موائع جزيئية والرقائق الحالية أما غير مناسبة للمخدرات السريعة، الفائق--التحقق من صحة الدراسات13،14 أو هي حاليا غير متوافق مع دراسات لإيصال الأدوية إلى أورام الدماغ. وباﻹضافة إلى ذلك، استعراض نماذج منشورة 155 استخدام الخلايا الأولية أو الخلايا الجذعية pluripotent إيندوسيبلي (اللجنة التوجيهية) أو خطوط الخلايا التجارية إدراج مثقف شارك في جميع أظهرت اتجاها للتناقض إينتيرستودي في تلك القياسات و/أو استنتاجات8. يمكن أن يرتبط هذا النقص في إمكانية تكرار نتائج اينترلبورتوري مع شروط الثقافة ط) نونورماليزيد، على سبيل المثال مع الطلاء الاختياري مع الغشاء مصفوفة البروتينات في خلية ثقافة السفينة، ثانيا) عدد متزايد من ثقافة فرعية والاستخدام التي تحتوي على مصل وسائط الإعلام، وكلا المحركات الرئيسية للتعديلات الوراثية والمظهرية ل خطوط الخلية15، أو الثالث) صعوبة لتكاثر إعادة التوازن الصحيح بين أستروجليال ومكونات غشائي في طبق. على الرغم من أن استخدام تجاري خلية أو خلايا مخلدة الخطوط لإنشاء نموذج BBB في المختبر تفتقر إلى بعض خصائص مقارنة بنماذج مماثلة فقط استخدام الخلايا الأولية، في وصف الأسلوب نظهر أن الحق في الجمع بين خلايا معارض جداً الأداء مقارنة بنشر دراسات في نماذج أخرى من مرجع16،17. في نهاية المطاف، عدم وجود نموذج قوي واستنساخه لدراسة مرور المركبات العلاجية استهداف أورام الدماغ عن طريق بتب دفعتنا إلى تطوير الأساليب الموصوفة هنا.
نظراً لأن الهدف لاستخدام النموذج التنبؤ المجراة في إيصال جسيمات نانوية في نماذج حيوانية الإكلينيكية، نحن أولاً التحقق من صحة النموذج بتب باستخدام إدراج تحتوي على خلايا بطانية مورين على اتصال astrocytes مورين. وبالإضافة إلى ذلك، نحن أيضا الأمثل نموذج لاستخدام بعض خطوط الخلايا البشرية. تستقر، يتم تحويل الحواجز الخلية للثقافات مع مجالات جليوبلاستوما المستمدة من المريض أو خطوط الخلايا الدبقي التجارية. وبعد ذلك، يمكن تصور بالفحص المجهري [كنفوكل] ترانسسيتوسيس جسيمات نانوية واستهداف خلية الورم وكمياً بجمع العينات على مر الزمن. الأهم من ذلك، النتائج التي تم الحصول عليها باستخدام يقلد بتب يمكن موثوق بها التنبؤ بسلوك جسيمات نانوية المجراة، دعم استخدام مسبقة تقليد بتب التحقق من الصحة السريرية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1761px;" width="1761">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:1761px;">Cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">bEND3</td>
			<td style="width:239px;">ATCC</td>
			<td style="width:273px;">CRL-2299</td>
			<td style="width:961px;">Cultured in: DMEM (1g/L glucose) supplemented with 10% FBS, 5 mL L-glutamine and 5 mL penicillin/streptomycin</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">HIFko immortalized mouse astrocytes</td>
			<td style="width:239px;">Isolated in Dr. Gabriele Bergers Lab</td>
			<td style="width:273px;">https://doi.org/10.1016/S1535-6108(03)00194-6</td>
			<td style="width:961px;">Cultured in: BME-1 supplemented with 5% FBS, 5 mL 1 M HEPES, 5 mL 100 mM sodium pyruvate, 3 g D-glucose and 5 mL penicillin/streptomycin</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">HuAR2T</td>
			<td style="width:239px;">Isolated in Dr. Dagmar Wirth Lab</td>
			<td style="width:273px;">https://doi.org/10.1089/ten.tea.2009.0184</td>
			<td style="width:961px;">Cultured in: EBM-2 with SupplementMix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">normal human primary astrocytes</td>
			<td style="width:239px;">Lonza</td>
			<td style="width:273px;">CC-2565</td>
			<td style="width:961px;">Cultured in: ABM with SingleQuots</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:1761px;">Material and reagents</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100x17mm Dish, Nunclon Delta</td>
			<td style="width:239px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td>150350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">10 mL serological pipet</td>
			<td style="width:239px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:273px;">170361</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">15mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:239px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:273px;">339650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">ABM Basal Medium, 500 mL</td>
			<td style="width:239px;">Lonza</td>
			<td style="width:273px;">CC-3187</td>
			<td>For primary human astrocytes. ABM+: contains all the additives from the supplement mix. ABM-:all the additives except for rhEGF and FBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Accutase Cell Detachment Solution</td>
			<td style="width:239px;">Corning</td>
			<td style="width:273px;">25-058-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">AGM SingleQuots Supplements and Growth Factors</td>
			<td style="width:239px;">Lonza</td>
			<td>CC-4123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">B27 supplement</td>
			<td style="width:239px;">Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>for both GBM + and - medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Basal Medium Eagle</td>
			<td style="width:239px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:273px;">21010046</td>
			<td>BME-1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Corning Costar TC-Treated 6-Well Plates</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:273px;">CLS3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">Corning Transwell polyester membrane cell culture inserts</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:273px;">CLS3452&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">D-glucose</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:273px;">G8270</td>
			<td>dissolve in 50 mL of BME-1 and sterile filter before adding to the medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium/Nutrient F-12 Ham</td>
			<td style="width:239px;">Gibco</td>
			<td>21331-020</td>
			<td>Specific to the culture of the patient-derived spheres isolated in our lab, may vary for other glioma cell lines</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EBM-2 growth Medium SupplementMix</td>
			<td style="width:239px;">PromoCell</td>
			<td style="width:273px;">c-39216</td>
			<td>EBM+: contains all the additives from the supplement mix. EBM-:all the additives except for VEGF-A and FBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Endothelial Basal Medium 2 (EBM-2)</td>
			<td style="width:239px;">PromoCell</td>
			<td style="width:273px;">c-22211</td>
			<td>EBM+: contains all the additives from the supplement mix. EBM-:all the additives except for VEGF-A and FBS</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:288px;">Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin</td>
			<td style="width:239px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:273px;">10500056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Fluorescein sodium salt</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:273px;">F6377</td>
			<td style="width:961px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Greiner CELLSTAR 96 well plates</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:273px;">Greiner 655090</td>
			<td>black polystyrene wells flat bottom (with micro-clear bottom)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">Menzel-Gl&#228;ser 0.9 cm round borosilicate Cover Slips</td>
			<td style="width:239px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:273px;">10313573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">PBS tablets</td>
			<td style="width:239px;">Medicago</td>
			<td>09-9400-100</td>
			<td>one tablet per liter of dH2O, then sterilize the solution by autoclaving</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Poly-D-lysine hydrobromide</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6407&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Recombinant Human EGF</td>
			<td style="width:239px;">Peprotech</td>
			<td style="width:273px;">GMP100-15</td>
			<td>for GBM+ medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.)</td>
			<td style="width:239px;">Peprotech</td>
			<td style="width:273px;">100-18B</td>
			<td>for GBM+ medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Immunofluorescence</td>
			<td style="width:239px;"></td>
			<td style="width:273px;"></td>
			<td style="width:961px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:273px;">158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;width:288px;">24 x 60 mm microscope slide cover glass</td>
			<td style="width:239px;">ORSAtec</td>
			<td style="width:273px;">0224601-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:288px;">AlexaFluor 488 and 594 secondary antibodies</td>
			<td style="width:239px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:273px;"></td>
			<td>dilution: 1/500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Anti-Claudin-5 antibody</td>
			<td style="width:239px;">Abcam</td>
			<td style="width:273px;">ab15106</td>
			<td>dilution: 1/150</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Anti-GFAP antibody clone GF5</td>
			<td style="width:239px;">Abcam</td>
			<td style="width:273px;">ab10062</td>
			<td>dilution: 1/150</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">Anti-Mouse CD31&#160;antibody Clone MEC 13.3</td>
			<td style="width:239px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:273px;">550274</td>
			<td>dilution 1/800</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Anti-SV40 T-antigen antibody</td>
			<td style="width:239px;">Abcam</td>
			<td style="width:273px;">ab16879</td>
			<td>dilution: 1/150</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Anti-Zonula Occludens-1</td>
			<td style="width:239px;">Abcam</td>
			<td style="width:273px;">ab96587</td>
			<td>dilution: 1/200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">DAPI</td>
			<td style="width:239px;">TOCRIS</td>
			<td style="width:273px;">5748</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">Fluoromount Aqueous Mounting Medium&#160;</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:273px;">F4680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">LysoTracker Red DND-99</td>
			<td style="width:239px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:273px;">L7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Animal procedures</td>
			<td style="width:239px;"></td>
			<td style="width:273px;"></td>
			<td style="width:961px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">10 cm curved dissecting scissors</td>
			<td style="width:239px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:273px;">14394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">BD Microlance 25-gauge needles</td>
			<td style="width:239px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:273px;">300600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Fine Forceps (12.5 cm)</td>
			<td style="width:239px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:273px;">503283</td>
			<td>for tissue dissociation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Intramedic Polyethylene tubing PE20</td>
			<td style="width:239px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:273px;">427406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Ketaminol vet 50 mg/mL</td>
			<td style="width:239px;">Intervet</td>
			<td style="width:273px;">Vnr511485</td>
			<td>Ketamine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Mains Powered microdrill</td>
			<td style="width:239px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:273px;">503599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">Menzel-Gl&#228;ser 0.5 cm round borosilicate Cover Slips</td>
			<td style="width:239px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:273px;">11888372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Micro Bulldog clamp</td>
			<td style="width:239px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:273px;">14119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">Physiological saline solution</td>
			<td style="width:239px;">Mustela</td>
			<td style="width:273px;">Sterile single dose vials 20 x 5 mL / 40 x 5 mL - Medical device class</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Rochester-Oschner forceps</td>
			<td style="width:239px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:273px;">501709</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Rompun vet 20 mg/mL</td>
			<td style="width:239px;">Intervet</td>
			<td style="width:273px;">Vnr148999</td>
			<td>Xylazine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Stereotaxic adapter</td>
			<td style="width:239px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:273px;">502063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Sugi Sponge Points</td>
			<td style="width:239px;">Kettenbach</td>
			<td style="width:273px;">31603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Equipment</td>
			<td style="width:239px;"></td>
			<td style="width:273px;"></td>
			<td style="width:961px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">Axio Zoom.V16 fluorescence stereo zoom microscope&#160;</td>
			<td style="width:239px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:273px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">FLUOstar Omega microplate reader</td>
			<td style="width:239px;">BMG Labtech</td>
			<td style="width:273px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">ORCA-Flash 4.0 digital sCMOS camera</td>
			<td style="width:239px;">Hamamatsu Photonics</td>
			<td style="width:273px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Universal 320 tabletop centrifuge&#160;</td>
			<td style="width:239px;">Hettich</td>
			<td style="width:273px;">Cat. No. 1401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">ZEISS LSM 880 with Airyscan confocal microscope</td>
			<td style="width:239px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:273px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

predicting in vivo payloads delivery using a blood-brain tumor-barrier in a dish

انتقائية للغاية في طبيعتها، حاجز الدم في الدماغ (بي بي بي) أمر ضروري للتوازن الدماغ في الظروف الفسيولوجية. ومع ذلك، في سياق الإصابة بأورام الدماغ، انتقائية BBB الجزيئية أيضا الدروع الخلايا الورمية بحظر تسليم تشيموثيرابيس تدار التبرعات محيطيا. تطوير أدوية جديدة (بما في ذلك جسيمات نانوية) استهداف أورام الدماغ الخبيثة مثالي يتطلب استخدام نماذج حيوانية الإكلينيكية لدراسة ترانسسيتوسيس على المخدرات وفعالية انتيتومور. بغية الامتثال لمبدأ 3R (صقل والحد واستبدالها) الحد من عدد الحيوانات المختبرية في الإعداد التجريبي وإجراء الفرز الفائق لمكتبة كبيرة من وكلاء انتيتومور، قمنا بتطوير إنسان في المختبر استنساخه و مورين من تقليد الدم في الدماغ الورم-الجدار (بتب) استخدام الثقافات ذات الطبقات الثلاث خلايا بطانية، أستروسيتيس، ومجالات جليوبلاستوما المستمدة من المريض. لأعلى من قابلية وإمكانية تكرار نتائج، استخدمت خطوط تجارية الخلية أو الخلايا مخلدة في ظروف مصممة خصيصا للسماح بتشكيل حاجز تشبه BBB الفعلية. هنا يصف لنا وضع بروتوكول للحصول على تقليد بتب باستزراع خلايا بطانية على اتصال astrocytes كثافة الخلية المحددة على إدراج. يمكن استخدام هذا تقليد بتب، على سبيل المثال، للقياس الكمي وتصوير [كنفوكل] المرور نانوحبيبات عبر الحواجز بطانية وأستروسيتيك، بالإضافة إلى التقييم لاستهداف خلية الورم داخل الإنزيم نفسه. وعلاوة على ذلك، نحن تظهر أنه يمكن استخدام البيانات التي تم الحصول عليها للتنبؤ بسلوك الجسيمات النانوية في نماذج حيوانية الإكلينيكية. من منظور أوسع نطاقا، هذا النموذج في المختبر يمكن تكييفها لسائر أمراض الأعصاب لتحديد مرور جزيئات علاجية جديدة من خلال BBB و/أو استكمالها مع أورجانويدس الدماغ تقييم الفعالية مباشرة المخدرات.

ويظهر تصوير [كنفوكل] من تقليد بتب مورين التعبير والتعريب الخلوية مفرق ضيق البروتينات زونولا أوككلودينس-1 (زوي-1) وكلودين-5 في bEND3. الاتصالات بين خلايا بطانية و astrocytes وضوح فعل نقل زوي-1 و 5-كلودين غشائي خلية-خلية الاتصالات مقارنة بالزراعات الأحادية bEND3 (الشكل 1). استخدام الفلورة تلطيخ لتصور astrocytes معربا عن توصيني على الدماغ-جانب الغشاء، فمن الممكن مراقبة ودراسة عمليات أستروسيتيك ونهاية-أقدام الاتصال بخلايا بطانية عبر الغشاء (الشكل 1E ). جهات الاتصال astrocyte غشائي خلية معروفة لتعزيز واستقرار تشديد الجدار الخلوي وترتبط مع انخفاض قيم النفاذية BBB19. ووفقا لذلك، لاحظنا انخفاضا كبيرا في نفاذية تقليد بتب الماوس لفلوريدا نا من 27.63 (± 3.45) × 10-6 سم/ثانية في حالة الزراعات الأحادية إلى 6.74 (± 3.01) × 10-6 سم/ثانية عند مثقف يشترك مع نقص إيندوسيبلي عامل ضرب astrocytes (هيفكو) (الجدول 1). HuAR2T مخلدة تشكل الحواجز الخلوية نفاذية عالية (104.92 ± 27.1 x 10-6 سم/ثانية، الجدول 1). مشابهة لطراز مورين، قمنا بقياس نفاذية أقل بكثير من بتب أن نا-فلوريدا، إلا وهي 47.4 (± 14.32) × 10-6 سم/ثانية، عندما كانت الخلايا HuAR2T مثقف يشترك مع astrocytes الأولية البشرية (الجدول 1).
في يقلد بتب مورين والبشرية على السواء، التي يسببها وجود مجالات جليوبلاستوما المستمدة من المريض زيادة طفيفة في قيم النفاذية مقارنة بثقافات المشارك astrocyte خلية غشائي وحدها (الجدول 1). ويلاحظ هذه الظاهرة مع عدة ولكن ليس كل من الدبقي المريض المجال نماذج. قد يكون هذا بسبب فيجف-أ التي تفرزها بعض هذه الخلايا المستمدة من المريض.
لمقارنة قيم النفاذية يقلد بتب في المختبر مع BBB في الحية، نحن تصويرها نشر نا-فلوريدا من خلال نافذة الجمجمة مزروع في الفئران عارية في الوقت الحقيقي. استخدام ستيريوميكروسكوبي الأسفار، ونشر نا-فلوريدا من الشعيرات الدموية الأوعية الدموية المستمدة من الأوعية الدموية بيال الرئيسية سجلت قبل وأثناء وبعد الحقن النظمية للتحقيق (الشكل 2). قياسات للقيم fluorescence التفاضلية من حمة القشرية تعميم الدم والدماغ على مر الزمن سمح لنا لحساب قيم تقريبية نفاذية الماوس عارية's BBB لفلوريدا Na (5.57 ± 2.19 x 10-6 سم/s، الجدول 1).
لتوضيح كيف يمكن استخدام هذا تقليد بتب للتصور لمرور المركبات من الجانب الدم إلى جانب الدماغ، قارنا ترانسسيتوسيس ø 110 شمال البحر الأبيض المتوسط (NP110) و ø 350 نانومتر (NP350) جسيمات نانوية استهداف جليوبلاستوما المستمدة من المريض المجالات. الحصول على نتائج في المختبر ثم تم مقارنة ترانسسيتوسيس المجراة في. في المثال المقدم، جسيمات نانوية المغلفة بالسطح مع استهداف الورم الببتيد قن20 ومحملة بصبغة الفلورسنت (فيتك) لتسهيل التصور. ونحن المسماة الخلايا باستخدام الصبغة الليزوزومية وكونتيرستينيد مع DAPI 24 ساعة بعد إضافة nanoparticles فيتك في الدم-جانب بتب تحاكي واكتسب [كنفوكل] ميكروجرافس على مستويات مختلفة (مثلاً، إلى جانب الدم، الغشاء، الجانب الدماغ، وفي المجالات جليوبلاستوما المريض) (الشكل 3A). إشارة الفلورسنت المرتبطة NP110 كولوكاليزيد مع ليسوسوميس في خلايا بطانية، أستروسيتيس، وورم الخلايا. وبالإضافة إلى ذلك، تم NP110s تم الكشف عنها في الفترات الفاصلة بين الخلايا البطانية و astrocytes، تمر من خلال مسام الغشاء insert (الشكل 3A).
وكان كمياً مرور NP110s عن طريق قياس الأسفار من عينات جمعت من جانب كل من الدم والدماغ. هذه القيم ذات نفاذية كانت مقارنة بتلك التي تحدد لجسيمات نانوية من ø 350 نانومتر (NP350). وتبين النتائج أن NP110 فقط كانت قادرة على عبور يقلد بتب (الشكل 3B). وظل NP350 على جانب الدم من تقليد بتب، مما أدى إلى انخفاض قيم النفاذية لهذه الجسيمات النانوية.
لتسليط الضوء على مدى أهمية يقلد بتب مقارنة النماذج الحية في، تم حقن الفئران عارية عن طريق الوريد مع جسيمات نانوية NP110 أو NP350 مغلفة باستهداف الورم الببتيد قن ومترافق مع الصبغ الأحمر نيون (تريتك) للكشف عن. الأنسجة التي تم جمعها في عدة نقاط زمنية كشفت أن بعد ح 8، وقد اكسترافاساتيد بي بي بي-نفاذية جسيمات نانوية إلى حمة الدماغ، في حين نونبيرميابل تلك التي بقيت في التداول أزيلت أساسا من الدوران الجهازي المجراة. ولذلك جمعت العقول وكمياً عدد جسيمات نانوية كل بوستينجيكتيون ح 8 ملليمتر مربعة. ووفقا للنتائج في المختبر، NP110، ولكن لا NP350 بنجاح اكسترافاساتيد إلى حمة الدماغ (الشكل 3). تصوير عالية التكبير من موقع نانوحبيبات في الدماغ أظهرت أن NP110 البلوتينيوم الموزعة في حمة الدماغ خارج الشعيرات الدموية والمخزن بنجاح إلى الخلايا جليوبلاستوما مزروع (3D الشكل). على الرغم من العارضة الورم نفسه استهداف مجموعة (قن)، NP350 كان غير قادر على اكسترافاساتي في حمة الدماغ واكتشفت فقط داخل الجانب لومينال الدماغ الأوعية الدموية (الشكل 3E)، مماثلة للنتائج التي تم الحصول عليها في المختبر.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59384/59384fig1.jpg"> رقم 1: وصف نموذج الورم-حاجز (بتب) الدم في الدماغ- (أ) التمثيل التخطيطي لمواقع أنواع مختلفة من الخلايا. (ب) توضيح لموضع إدراج على غطاء لوحة 6-جيدا وتقنيات البذر أستروسيتيس على الجانب الدماغ من إدراج'الغشاء s. (ج) رسم توضيحي لوضع لوحة 6-كذلك السماح بانضمام astrocyte. (د) ميكروجرافس الفلورة مفرق ضيق البروتينات زونولا أوككلودينس-1 (الصف العلوي، وزوى--1، الأحمر) وكلاودين-5 (الصف السفلي، الخضراء). تتم مقارنة التعبير البروتين مورين microvascular بطانية خلايا المخ (bEND3) مثقف الجانب الدم من بتب وحدها كأحادية (العمود الأيمن) أو مع مورين astrocytes هيفكو مخلدة (العمود الأيمن). نواة الخلية هي كونتيرستينيد مع DAPI (أزرق). (ه) صورة مجهرية الفلورة لائحة البروتين حمضية فيبريلاري الدبقية (توصيني، الأحمر) في astrocytes هيفكو مثقف إلى جانب الدماغ بتب. صورة عالية التكبير تظهر عمليات astrocyte ونهاية-أقدام (الأسهم) الاتصال بخلايا بطانية عبر الغشاء المسام (اللوحة اليمنى). تم التحقق من هوية astrocytes هيفكو تلطيخ الفلورة الفيروس القردي 40 كبيرة تي للمستضد (SV40 الكبير T، الأخضر) المستخدمة لتخليد للخلايا. خلايا بطانية الإعراب عن توصيني لا تي كبيرة SV40 و، ولذلك يمكن جزئيا ملاحظتها من خلال الشفافية، مقابل الجانب من الغشاء كخلايا الملون DAPI فقط (خطوط متقطعة). نواة الخلية هي كونتيرستينيد مع DAPI (أزرق). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59384/59384fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59384/59384fig2.jpg"> رقم 2: تحديد الماوس نفاذية BBB يعيش إينترافيتال. (أ) إعداد قسطرة الوريد والذيلية القابلة للغرس. (1) الأدوات والمعدات ما يلي: () PE20 الأنبوب البولي إثيلين (ب) هما 25 ز الإبر الملقط (ج) روتشستر-أوتشسنير، والمشبك لدغ (د) صغيرة. تتم إزالة الإبرة (2) 25 ألف ز قبل عدة تورسيونس بعناية باستخدام الملقط و (3) إدراج في الأنبوبة. (4) الجانب الآخر من الأنبوب متصل بآخر ز 25 إبرة. (ب) التوجيه لغرس القسطرة وتحديد المواقع لبث الحل fluorescein الصوديوم عن طريق الوريد ذيل الماوس. المنطقة تحليقا يشير إلى مجال حيث يتم وضع قطره الصمغ cyanoacrylate لتأمين القسطرة. تستخدم للتعامل مع القسطرة المشبك لدغ وإزالتها حالما يتم تأمين القسطرة. (ج) ممثل التصوير والتقدير الكمي أسلوب لتحديد قيم النفاذية فلوريسسين الصوديوم. قبل ضخ الصوديوم-فلوريسسين (العمود الأيمن)، يتم قياس أوتوفلوريسسينسي/الفارغة داخل طقة فائدة (ROI) على الدماغ (مستطيل أعلى اللوحة، الأبيض) ومجالات الأوعية الدموية (أسفل لوحة، أحمر مستطيل). أثناء ضخ الصوديوم-فلوريسسين (العمود الأيمن)، يتم قياس شدة الأسفار في رويس على حد سواء، مما يتيح حساب نفاذية BBB. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59384/59384fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59384/59384fig3.jpg"> الشكل 3: التنبؤ ترانسسيتوسيس إينتراسيريبرال من جسيمات نانوية من خلال BBB المجراة باستخدام نموذج بتب في المختبر. (أ) التمثيل البياني للمقايسة بتب مع الصور [كنفوكل] التمثيلية التي تم الحصول عليها على مختلف المستويات المشار إليها من طراز بتب مورين. جسيمات نانوية 110 نيوتن متر في القطر (NP110) ويضاف إلى فيتك (الأخضر) وأضيفت للدم كانت المسمى الجانب من "الخلايا بتب" مع المسبار الليزوزومية (الملازم-99، الأحمر).  (1) اندوثيليال الخلايا، ترانسسيتوسيس (2) اندوثيليال لجسيمات نانوية من خلال مسام الغشاء (خط متقطع البيضاء)، أستروسيتيس (3)، ويتم تحديد المجالات جليوبلاستوما المريض (4) في الرسم و ميكروجرافس [كنفوكل] المقابلة (يمين). تغليف الليزوزومية من جسيمات نانوية (الأسهم) تقترح ترانسسيتوسيس النشطة من خلال طبقات بتب بطانية وأستروسيتي. (ب) التحديد الكمي نفاذية نانوحبيبات المشار إليها عن طريق بتب في المختبر (n = 6). (ج) التحديد الكمي لكثافة نانوحبيبات المشار إليها في أنسجة المخ الفروع، ح 8 بعد حقن الوريد والذيلية الفئران عارية (n = 3). (د) ميكروجرافس [كنفوكل] يبين التوزيع ø 110 من جسيمات نانوية نانومتر (NP110، أحمر) في أقسام أنسجة الدماغ مورين المسمى مع ماوس المضادة الأجسام المضادة CD31 (أخضر). ويبرز السهم ترانسسيتوسيس نانوحبيبات (اللوحة اليمنى). جسيمات نانوية المتراكمة حول خلايا ورم المخ (الورم، اللوحة اليمنى) سبب الببتيد استهداف حظيرة عرضت على سطحها. ويلاحظ لا صاروخ موجه كبيرة في أنسجة المخ (الدماغ). (ﻫ) [كنفوكل] ميكروجرافس تبين توزيع ø جسيمات نانوية 350 نانومتر (NP350، أحمر) في المقاطع أنسجة الدماغ مورين المسمى بجسم CD31 المضادة ماوس (أخضر). نقطة رؤوس الأسهم إلى NP350s التي تم الاحتفاظ بها في التجويف الأوعية الدموية ولم يتمكنوا من عبور BBB، ربما بسبب قطرها أكبر مقارنة بنواة خلية NP110s. كونتيرستينيد مع DAPI (أزرق). ف < 0.01. فحسبت القيم باستخدام اختبار مان-ويتني U ثنائي الطرف، nonparametric. أشرطة الخطأ تمثل الانحراف المعياري. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59384/59384fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>مورين بتب تقليد</td>
			<td>bEND3</td>
			<td>bEND3 + "هيفكو ك"</td>
			<td>bEND3 + جيجابايت</td>
			<td>bEND3 + هيفكو ك + جيجابايت</td>
			<td>في فيفو</td>
		</tr>
<tr>
<td>نفاذية (10-6 سم/ثانية)</td>
			<td>27.63</td>
			<td>6.74</td>
			<td>26.8</td>
			<td>10.83</td>
			<td>5.57</td>
		</tr>
<tr>
<td>SD (10-6 سم/ثانية)</td>
			<td>3.45</td>
			<td>3.01</td>
			<td>7.99</td>
			<td>2.65</td>
			<td>2.19</td>
		</tr>
<tr>
<td>البشرية بتب تقليد</td>
			<td>HuAR2T</td>
			<td>HuAR2T + اللجنة</td>
			<td>HuAR2T + جيجابايت</td>
			<td>GB + HuAR2T + اللجنة</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>نفاذية (10-6 سم/ثانية)</td>
			<td>104.92</td>
			<td>47.4</td>
			<td>89.08</td>
			<td>48.24</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>SD (10-6 سم/ثانية)</td>
			<td>27.1</td>
			<td>14.32</td>
			<td>10، 21</td>
			<td>13.07</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 1: قيم النفاذية الصوديوم-فلوريسسين (غ-فلوريدا) (بالسنتيمتر في الثانية الواحدة) تحدد في المختبر في أنظمة الثقافة المشتركة المشار إليها والحية في الفئران عارية الرنين. البيانات المستمدة من تجربة ممثل (n = 3 الفئران).

Watch this Scientific Journal Video about Predicting In Vivo Payloads Delivery using a Blood-brain Tumor-barrier in a Dish at JoVE.com

Predicting In Vivo Payloads Delivery using a Blood-brain Tumor-barrier in a Dish

التنبؤ في فيفو حمولات التسليم استخدام ورم-حاجز دم في الدماغ في صحن

المخدرات تستهدف لاورام الجهاز العصبي المركزي يشكل تحديا رئيسيا. هنا يصف لنا وضع بروتوكول لتنتج تقليد في المختبر الدم في الدماغ الورم-الحاجز باستخدام خلايا موريني و/أو البشرية ومناقشة أهميتها بالنسبة للقدرة على التنبؤ بورم في استهداف المجراة في الجهاز العصبي المركزي.

Highly selective by nature, the blood-brain barrier (BBB) is essential for the brain homeostasis in physiological conditions. However, in the context of ...

من أجل تطوير الأدوية والمركبات الجديدة التي تستهدف الأورام في الجهاز العصبي المركزي ، فإن إمكانية الوصول والمرور عبر حاجز الدم في الدماغ أمر بالغ الأهمية. على الرغم من أن السمية الخلوية للمركبات يمكن قياسها بسهولة عن طريق احتضان الخلايا بالجزيئات العلاجية ، إلا أنها لا تخبر أي شيء عن التسليم الفعلي لموقع الورم في الدماغ. لمعالجة هذه المسألة، وضعنا البروتوكول التالي الذي يصف كيفية إعادة إنشاء حاجز ورم الدم في الدماغ في المختبر على طبق.استخدام الخلايا الخالدة من مورين أو أصل بشري يجعل هذا الفحص مرن جدا. ويمكن أيضا أن تحجيم بسهولة تصل إلى الشاشة العشرات من المركبات مع استنساخ عالية. وبالإضافة إلى ذلك، يسمح هذا الأسلوب على حد سواء الكم والتصور من مرور واستهداف قدرة المركبات قبل المضي قدما مع النماذج قبل الظهر.ولذلك، فإن أسلوبنا يستبدل جزئيا نماذج الحيوان باستخدام خطوط الخلية المحددة مسبقا. إدراج الخلايا السرطانية في الدماغ المستمدة من المريض يُقَسَّمُ عدم تجانس المريض، بينما يضمن استخدام الخلايا الخالدة لإنشاء حاجز الدم في الدماغ إمكانية إعادة إنتاج النتائج. بالإجمال, هذا الدم في الدماغ حاجز نموذج يقدم أداة مثيرة للاهتمام حقاً إلى اختبار انتشار المخدرات أو تسليم مركبات المخدرات.العرض التوضيحي المرئي للأسلوب أمر بالغ الأهمية لأن seeding الخلايا في الجانب الآخر من إدراج تتطلب معالجة التي لا يتم وصفها في كثير من الأحيان في بروتوكولات أخرى باستخدام برنامج إعداد مشابهة. على سبيل المثال، الحصول على التصاق الخلايا الفلكية عندما يتم وضع إدراج رأسا على عقب فوائد عالية من التمثيل البصري. تحت غطاء معقمة ثقافة الخلية، وغسل بعناية الخلايا الفلكية مثقف مع خمسة ملليلتر من برنامج تلفزيوني عقيمة.استخدام مضخة فراغ لتجاهل بلطف برنامج تلفزيوني، وإضافة ملليلتر من خلية كاشف تفكك لمدة خمس دقائق لفصل الخلايا. ثم، إضافة 10 ملليلتر من العقيمة كاملة ثقافة الخلايا الفلكية المتوسطة إلى السفينة لمنع نشاط كاشف تفكك الخلية. استخدم ماصة مصلية معقمة لنقل الخلايا المنفصلة من الوعاء إلى أنبوب معقمة 15 ملليلتر.أجهزة الطرد المركزي في 250 مرة ز لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة. وفي الوقت نفسه، حدد إدراج. استخدام ملقط العقيمة لوضع إدراج مع الجانب الدماغ حتى على غطاء لوحة ستة جيدا العقيمة.عندما يكون الطرد المركزي كاملا، بعناية تجاهل supernatant من تعليق الخلية، وإعادة تعليق بيليه استروسيتي في ملليلتر واحد من ABM زائد عن طريق الأنابيب بلطف بيليه على جدار الأنبوب تصل إلى خمس مرات. ثم، عد الخلايا، وضبط كثافة تعليق الخلية إلى 150،000 الخلايا في 400 ميكرولترات من ABM زائد لكل إدراج. ضع تعليق الخلية في منتصف جانب الدماغ من غشاء الإدراج ، والانتشار بعناية باستخدام قوة الشعيرات الدموية مع طرف ماص معقمة.مع الجانب الدماغ من إدراج لا يزال حتى, وضع لوحة ستة جيدا مرة أخرى على إدراج. وضع لوحة وإدراج، مع الجانب الدماغ حتى، في حاضنة في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون للسماح للتصاق الخلية. بعد هذا, العودة إلى لوحة ستة جيدا مرة أخرى إلى موقفها العادي, مع إدراج الآن جانب الدم.إضافة متوسطة، ومتابعة الحضانة كما هو موضح في بروتوكول النص. تحت غطاء معقمة ثقافة الخلية، وغسل بعناية الخلايا البطانية مثقف مع خمسة ملليلتر من برنامج تلفزيوني عقيمة. استخدام مضخة فراغ لتجاهل بلطف برنامج تلفزيوني، وإضافة ملليلتر من خلية كاشف تفكك لمدة خمس دقائق لفصل الخلايا.ثم، إضافة 10 ملليلتر من العقيمة كاملة ثقافة الخلايا البطانية المتوسطة إلى السفينة لمنع نشاط كاشف تفكك الخلية. استخدم ماصة مصلية معقمة لنقل الخلايا المنفصلة من الوعاء إلى أنبوب معقمة 15 ملليلتر. أجهزة الطرد المركزي في 250 مرة ز لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة.بعد هذا، والتخلص من supernatant، وإعادة تعليق بيليه الخلية البطانية في ملليلتر واحد من EBM زائد عن طريق الأنابيب ببطء تعليق الخلية على جدار الأنبوب تصل إلى خمس مرات. عد الخلايا، وضبط كثافة تعليق الخلية إلى 200،000 الخلايا في 2.5 ملليلتر من ثقافة الخلايا البطانية خالية من المصل وعائيا عامل النمو البطانية-A لكل إدراج. استرداد لوحة تحتوي على إدراج.تجاهل بعناية المتوسطة من جانب الدم، واستبدالها مع 2.5 ملليلتر من تعليق الخلايا البطانية. ثم، العودة إلى لوحة الحاضنة، وترك الأمر بين عشية وضحاها للسماح للخلايا البطانية للتمسك الغشاء. في اليوم التالي، وإعداد لوحة ستة جيدا عن طريق نقل ثلاثة ملليلتر من ABM-ناقص قبل الدافئة إلى كل بئر.باستخدام ملقط العقيمة، والتعامل مع إدراج لتجاهل بعناية الوسيطة كاملة endothelial من جانب الدم، ووضع إدراج في لوحة جديدة تحتوي على ABM ناقص. ثم، إضافة 2.5 ملليلتر من EBM-ناقص. اترك التعديلات في الحاضنة مع الحد الأدنى من الاضطراب البدني أو تغير درجة الحرارة لمدة خمسة أيام.في يوم النقل، استبدل الوسيط. للتصوير المناعي، ضع ما يصل إلى أربعة أغطية بوروسيليكات معقمة مستديرة في كل بئر من لوحة سداسية جيدا تحتوي على مليلترين من بولي-د-ليسين. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.وفي الوقت نفسه، استخدم ماصة مصلية معقمة لنقل مجالات الورم بعناية من وعاء ثقافة الخلية إلى أنبوب معقمة 15 ملليلتر. الطرد المركزي في مجالات الورم في 250 مرات ز لمدة ثلاث دقائق. تجاهل supernatant، وبلطف resuspend المجالات في ملليلتر واحد من GBM-ناقص.عد الخلايا، وضبط كثافة الخلية إلى حوالي 10000 مجال أو 100000 خلية لكل ملليلتر من GBM-ناقص. بعد ذلك ، تخلص من البولي - D - ليسين من الآبار ، وشطف الآبار ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني عقيم. بذور كل بئر من لوحة مع ثلاثة ملليلترات من تعليق الورم spheroid، ونقل إدراج مع BBTB تقليد على تعليق الخلايا الورم.احتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون للسماح للدم والجوانب ورم الدماغ من مقايسة أن يأتي إلى التوازن. في اليوم التالي، استبدل وسائل الإعلام في جانب الدم بـ EBM-ناقص مكمّلة بالجزيئات أو الأدوية أو الجسيمات النانوية ذات الأهمية. جمع العينات مع مرور الوقت للحصول على التحديد الكمي المباشر كما سبق وصفه.أولاً، جمع 100 ميكرولترات من المتوسط من جانبي الدم والدماغ من تقليد BBTB، ونقل كل منها إلى لوحة منفصلة مسطحة القاع، سوداء، 96-well لقياسات الفلورس اللاحقة. المقبل, إعداد محلول 50 ميكرومولار من فلوريسين الصوديوم في EBM ناقص, التأكد من إعداد 2.5 ملليلتر في البئر. قبل الدافئة هذا الحل إلى 37 درجة مئوية، واستبدال وسائل الإعلام من جانب الدم من إدراج مع وسائل الإعلام التي تحتوي على هذا الحل الفلوريسين الصوديوم.بدء مؤقت بمجرد استبدال الوسيطة. جمع بعناية 100 ميكرولترات من وسائل الإعلام من الجانبين الدم والدماغ من إدراج في خمس دقائق، 30 دقيقة، 60 دقيقة، و 120 دقيقة. نقل كل عينة إلى آبار منفصلة من لوحة سوداء مناسبة، 96-well.استخدم قارئ لوحة لقياس الفلوريسنس من العينات التي تم جمعها. أولاً، تمييع صبغة الفلورسنت الليسوسوم إلى تركيز العمل المناسب في الوسط الذي تم تسخينه مسبقًا. إضافة هذا إلى الخلايا، واحتضان في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 45 دقيقة.ثم، شطف الخلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني الجليد الباردة. تجاهل برنامج تلفزيوني، وإضافة ثلاثة ملليلتر من الجليد الباردة 4٪ شبه شكلي إلى الآبار و 2.5 ملليلتر إلى إدراج. احتضان على الجليد لمدة 10 دقائق.بعد ذلك، تجاهل شبهformaldehyde، وشطف الخلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني. إزالة برنامج تلفزيوني، و counterstain الخلايا النوى باستخدام محلول DAPI في تركيز النهائي من ميكروغرام واحد لكل ملليلتر في الماء المقطر. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة سبع دقائق.ثم، إزالة DAPI، وغسل الأغشية ثلاث مرات مع الماء المقطر. قطع بعناية الغشاء، وإزالة الماء المقطر، ووضعها على قطرة من المتوسطة تصاعد على شريحة المجهر الزجاجي. إضافة قطرة أخرى من المتوسط تصاعد على الجانب الآخر من الغشاء، وتغطي بعناية مع زجاج غطاء البورسليكات.في هذه الدراسة، كانت الخلايا البطانية تشارك في الثقافة مع الخلايا الفلكية لتشكيل واجهة تشبه حاجز ورم الدم في الدماغ في إعداد المختبر. تصوير Confocal من تقليد مورين BBTB يظهر التعبير والتعريب الخلوي للبروتينات تقاطع ضيق zonula occludens-1 وكلاودن-5 في bEND3. الاتصالات بين الخلايا البطانية والخلايا الفلكية يدفع بوضوح نقل هذين البروتينين إلى الاتصالات من الخلايا إلى الخلية البطانية مقارنة بزراعة أحادية bEND3.باستخدام تلطيخ الفلوروسين المناعية لتصور الخلايا الفلكية المعبرة عن GFAP في جانب الدماغ من الغشاء ، فمن الممكن مراقبة ودراسة العمليات الفلكية ونهاية القدمين الاتصال بالخلايا البطانية من خلال الغشاء. لمقارنة قيم نفاذية BBTB في المختبر يحاكي مع حاجز الدم في الدماغ في المختبر، يتم تصوير انتشار في الوقت الحقيقي من فلوريسين الصوديوم من خلال نافذة الجمجمة المزروعة في الفئران عارية. باستخدام المجهر ستيريو fluorescence، يتم تسجيل انتشار الفلورسين الصوديوم من الشعيرات الدموية الأوعية الدموية المستمدة من الأوعية الدموية الرئيسية البزى قبل وأثناء وبعد الحقن الجهازي للتحقيق.ثم تتم مقارنة transcytosis من الجسيمات النانوية التي تستهدف مجالات الورم الأرومي الدبقي المستمدة من المريض لتوضيح كيف يمكن استخدام هذا محاكاة BBTB لتصور مرور المركبات من جانب الدم إلى جانب الدماغ. تُترجم الإشارة الفلورية المرتبطة بـ NP110 مع الليسوسومات في الخلايا البطانية، والخلايا الفلكية، والخلايا السرطانية. بالإضافة إلى ذلك ، يتم اكتشاف NP110s بين الخلايا البطانية والخلايا الفلكية ، وتمر عبر مسام الغشاء من إدراج.يتم قياس مرور NP110s من خلال قياس الفلوريس من العينات التي تم جمعها من جانب الدم والدماغ على حد سواء، ويتم مقارنة هذه القيم مع تلك الجسيمات النانوية المحددة التي هي 350 نانومتر. كما يمكن أن نرى، فقط NP110s قادرة على عبور محاكاة BBTB، في حين بقي NP350 على جانب الدم، مما أدى إلى انخفاض قيم نفاذية لهذه الجسيمات النانوية. التعامل مع إدراج بعناية، وانتشار بحذر تعليق الخلايا الفلكية على الجانب الدماغ من إدراج دون اتصال مباشر للغشاء.أي ضرر للغشاء سيؤدي إلى تسرب. ويمكن تكييف هذه الطريقة للرد على السؤال المتعلق بتسليم الدماغ للحمولات المدارة على نحو هامشي. باستخدام إدراج مختلفة مع المسام الغشاء أكبر, فمن الممكن أيضا لدراسة البذخ الخلية.يمكن تعديل هذه التقنية باستخدام أنواع مختلفة من الخلايا لمحاكاة الحواجز الخلوية الأخرى. كما أنه يمهد الطريق لإجراء أبحاث أكثر مسؤولية وأخلاقية، تهدف إلى تقليل عدد الحيوانات المختبرية المستخدمة في التحقق من صحة الأدوية المضادة للسرطان. يرجى تذكر أن مادة ما قبلاالدهيد مادة كيميائية سامة جدا وينبغي التعامل معها وفقا لذلك.أيضا، كن حذرا أثناء استخدام مشرط حاد لاستخراج الأغشية من إدراج.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

ال<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; تخيلي ورم القرص نموذج: التصور والكمي للالتعبير الجيني وغزو الورم عن طريق الفسيفساء الوراثية

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

في فيفو تقييم الجيش الشعبي الثوري لدرجة الحموضة، فس2، حالة الأكسدة والاختزال، وتركيزات الفوسفات والجلوتاثيون في "ورم المكروية"

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

Fluorescence Molecular Tomography for In Vivo Imaging of Glioblastoma Xenografts

Fluorescence Molecular Tomography for In Vivo Imaging of Glioblastoma Xenografts

الأسفار التصوير المقطعي الجزيئية للتصوير في فيفو لتكثيفها جليوبلاستوما

Tumorigenicity is the capability of cancer cells to form a tumor mass. A widely used approach to determine if the cells are tumorigenic is by injecting ...

In Vivo Inhibition of MicroRNA to Decrease Tumor Growth in Mice

في تثبيط فيفو من MicroRNA لتقليل نمو الورم في الفئران

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression through their ability to destabilize mRNA and inhibit translation of target mRNAs. An ...

Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs

الجمع بين استخدام الذيل الوريد الانبثاث الاختبارات والوقت الحقيقي في التصوير فيفو لقياس سرطان الثدي الاستعمار المنتشر والعبء في الرئتين

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification ...

In Vivo Targeting of Xenografted Human Cancer Cells with Functionalized Fluorescent Silica Nanoparticles in Zebrafish

في فيفو استهداف الخلايا السرطانية البشرية Xenografted مع وظيفية السيليكا النانوية في حمار وحشي

Developing nanoparticles capable of detecting, targeting, and destroying cancer cells is of great interest in the field of nanomedicine. In vivo animal ...

Using Computer-based Image Analysis to Improve Quantification of Lung Metastasis in the 4T1 Breast Cancer Model

استخدام تحليل الصور القائم على الكمبيوتر لتحسين القياس الكمي لنقائل الرئة في نموذج سرطان الثدي 4T1

Breast cancer is a devastating malignancy, accounting for 40,000 female deaths and 30% of new female cancer diagnoses in the United States in 2019 alone. ...

Patient-Derived Tumor Explants As a "Live" Preclinical Platform for Predicting Drug Resistance in Patients

استئصال الورم المشتق من المريض كمنصة "حية" قبل السريرية للتنبؤ بمقاومة الأدوية لدى المرضى

An understanding of drug resistance and the development of novel strategies to sensitize highly resistant cancers rely on the availability of suitable ...

Evaluation of the In vivo Antitumor Activity of Polyanhydride IL-1&#945; Nanoparticles

Evaluation of the In vivo Antitumor Activity of Polyanhydride IL-1ÃƒÅ½Ã‚Â± Nanoparticles

تقييم النشاط المضاد للأورام في الجسم الحي للجسيمات النانوية Polyanhydride IL-1α

Cytokine therapy is a promising immunotherapeutic strategy that can produce robust antitumor immune responses in cancer patients. The proinflammatory ...

Longitudinal Intravital Imaging Through Clear Silicone Windows

التصوير الطولي داخل الحيوية من خلال نوافذ السيليكون الشفافة

Intravital microscopy (IVM) enables visualization of cell movement, division, and death at single-cell resolution. IVM through surgically inserted imaging ...