Name: predicting in vivo payloads delivery using a blood-brain tumor-barrier in a dish
Uploaded: 2019-04-16T14:30:00
Duration: 13 min 34 s
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这项研究得到了芬兰癌症组织 Jane & Aatos Erkko 基金会和 Sirid Juselius 基金会 (至 p. l. 和 v. l. j.)、瑞士国家科学基金会 (高级博士后. 流动赠款: P300PB_164732, 给 S. 的赠款。)、Orion 研究基金会 (至 s. k.)、Maud Kuistila 纪念基金会 (至 s. k.) 和芬兰科学院 (TERRA, 2017年, 赠款: 314 498)。生物成像单元 (赫尔辛基) 因提供显微镜成像核心设施而获得认可。

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作者没有什么可透露的。

患者间肿瘤变异性概念的兴起, 使个性化癌症医学的研究重新焕发了活力。这种变异性也是中枢神经系统肿瘤的一个特征。由于肿瘤的不可预测性, 对化疗的反应增加了 BBB 对药物输送的庇护作用, 在病人护理中完全构成重大挑战.为了开发更有效的疗法, 通常需要筛选新分子的大库。为了评价新治疗靶点到达肿瘤部位的抗肿瘤效果和能力, 最好的选择是对体内植入小鼠患者化身的患者衍生细胞进行临床前研究。由于实际 (财政、时间、人力和设施资源) 和伦理原因 (使用实验动物时的3Rs 原则), 开发这样一个大规模的体内筛查平台往往是不可能的, 因此, 基于细胞的检测仍然是一个选择23的模型.选择已建立的细胞系和避免原代细胞的主要原因是为了促进可重复性和减少实验室动物的使用, 而实验室动物是分离和建立原生小鼠培养的主要来源。这里介绍的方法, 坚定地符合 3Rs, 可以有效地丢弃纳米颗粒从进一步的临床前调查的标准, 他们无法跨越模型 BBTB。作为一项原则证明, 我们在此描述了在 BBTB 开发和验证过程中获得的结果。我们能够在体内证实体外发现, 例如在测量376钠-荧光素的被动扩散时。
本文概述的协议描述了内皮细胞与星形胶质细胞共聚体形成血脑肿瘤样界面的准备工作。一旦这两种细胞类型之间的物理接触被建立, 内皮细胞层表现出与 BBB 的相似性 (例如, 紧密连接蛋白和相对较低的渗透率的细胞表面表达)。有趣的是, 模仿小鼠 BBTB 的研究似乎提供了与体内小鼠 BBB 渗透率测量24所获得的 Na-Fl 渗透率值特别相似的值.因此, BBTB 模拟的性能将与用来形成屏障的细胞的选择直接相关。BEND3 内皮细胞起源于大脑, 已知在与星形胶质细胞25形成障碍方面是成功的。然而, 我们一直在使用永生 HIFko 星形胶质细胞26生成 BBTB 模拟。由于缺乏低氧诱导因子, 这些星形胶质细胞不会产生 VEGF-A, 这在 BBTB 模拟稳定性中是典型的。星形胶质细胞已被确定为 BBB 通透性的调节剂, 例如通过释放 VEGF-A 以应对神经炎症27。血管内皮生长因子受体 (Vegfr) 的激活是体外28和体内29内皮细胞/血管通透性的关键调节剂.因此, VEGF-A 补充剂在培养基激活 VEGFR2 在内皮细胞上, 诱导磷酸化的粘附结蛋白, 如 ve-钙粘附在30。内皮细胞接触的丧失会产生高度渗透的血管。同样, 细胞培养检测中使用的胎儿牛血清的强有丝分裂特性和未知成分也会在屏障稳定和检测重现性方面引起重大问题。
人脐静脉内皮细胞 (Huvec) 有时被用于在体外形成 BBB 31;然而, 它们与大脑微血管内皮细胞 (如 Hcmece/d3 细胞系32) 在基因表达和障碍形成特性方面存在显著差异。然而, 与单独生长的 HuAR2T 细胞相比, 单独生长的 HuAR2T 细胞获得的渗透率相对较高, 通过将其与人类原发星胶质细胞结合, 大大降低了。虽然内皮细胞被要求形成细胞壁, 很明显, 星形胶质细胞具有同样重要的作用, 发挥 BBTB 形成和稳定。
当患者衍生的胶质瘤球体被添加到这个方程中时, 小鼠 BBTB 模仿重述了小鼠异种移植的一些特征, 如药物通过血管的扩散和肿瘤细胞靶向。例如, 当我们筛选出几种不同直径的纳米粒子时, 这里讨论的 BBTB 模拟成功地反映了体内的行为。为了说明体外模型和体内模型之间的相似性, 我们使用了前面描述的介孔硅酸盐纳米粒子33 , 它具有细胞穿透特性34与肿瘤靶向肽 coop 结合在他们的表面20。针对多肽的目的, 通过对侵入性肿瘤细胞的特异性结合, 与哺乳动物衍生的生长抑制剂 (MDGI) 结合。与正常组织35相比, 包括胶质瘤在内的几种癌症表达过度, 这使得 coop 成为一个非常有效的肿瘤靶向位, 能够增加有效载荷20的传递。这里使用的纳米颗粒以前已被证明扩散到大脑实质 (27547955), 当功能与紫杉醇功能化, 这些纳米货物已成功地减少胶质瘤生长在临床前模型36。在纳米颗粒表面添加聚乙二醇 (PEG) 残基也保持了其对正值 (约 + 4 mV) 的静态电荷, 从而与神经血管单元37有更好的相互作用, 并提高了它们的稳定性在流通。在所提供的数据中, PEG 的 3 kDa 与 Np110 结合在一起, 而 Np35v 被涂上 10 kDa 的 peg。然而, 分子量的聚乙二醇也导致纳米颗粒直径显著增加, 因此它们的物理能力跨越 BBB。因此, 我们检查了粒子的物理尺寸是否阻止了它们通过 BBTB, 以及这些观测是否可以在体内反映出来。
根据先前发表的观察, 我们观察到, Np110 在体外通过 BBTB 和携带颅内肿瘤的小鼠的 BBB 外渗, 而保留在 BBTB 的腔侧的 Np350 则模仿了 BBTB 的边缘和小 鼠。这些类似的结果强烈表明, BBTB 模型预测了纳米粒子在体内穿越 BBB 并到达大脑的能力。
BBB 细胞模型的相关性经常被讨论, 即使是对纳米粒子38的中央传递也是如此。我们在这里表明, 原代星形胶质细胞和内皮细胞, 都被认为是最相关的体外工具, 可以被不朽和/或市售细胞所取代, 确保更大的可扩展性和重现性。下一代的体外 bbb 仿制品可以通过结合微流体装置来开发, 允许形成精美的神经血管单位, 在结构上类似于实际的 bbb12,14。然而, 由于在交付的后续行动中存在技术限制, 这类模型目前不适合对传递给胶质瘤的分子进行高通量筛选14。确实很难捕捉到一道菜中 BBB 的生理复杂性, 而且 BBB 所表达的一些受体蛋白可能缺乏, 这可能会损害对结果的解释。另一个论点是, 体内和体外条件之间, 以及从一个细胞系到另一个细胞系, 特别是考虑内皮细胞, 基因表达的差异很大。然而, 也可以说, 神经血管单位不是大脑内的一个统一的实体39。生物学科学研究已经进入了一个人道的时代, 在设计实验之前, 总是考虑动物的福利、伦理责任和使用动物生命的成本。因此, 为了支持动物的替换, 最近越来越多的研究表明, 认识到模型的局限性, 并仔细选择细胞模型, 以建立障碍--重点是星形胶质细胞--需要在一道菜和动物模型40中获得的结果之间的匹配。通过这里描述的方法, 我们离减少用于筛选 BBB 转细胞增多以进行潜在治疗的实验动物数量又近了一步。

神经血管单元由神经元、星形胶质细胞和 BBB 组成, 由周细胞、星形胶质细胞、内皮细胞和形成大脑微血管的相关基底膜之间的复杂连接形成。这种紧密的细胞壁是由连续的、不形成的血管形成的, 可以很好地调节离子和分子 (包括激素、营养物质或药物) 的运动, 也可以调节循环细胞1的运动.通过高分子量分子 BBB (如治疗抗体、药物结合物或纳米化合物) 的低转 xos化极大地限制了包括恶性在内的神经系统疾病药物发现的进展。胶质瘤2。事实上, 口服或静脉注射的化疗药物到达大脑实质往往在不够低的浓度, 以诱发抗肿瘤作用, 或根本无法通过 BBTB 到达肿瘤细胞3。几项临床前和临床研究没有涉及 bbtb 渗透问题, 但试图暂时破坏 bbtb, 例如使用有重点的超声波4、5,或通过直接原位规避 bbtb。6.然而, 这些技术都无法抵消不可避免的肿瘤扩张或复发。因此, 在开发新型抗胶质瘤疗法时, 应将通过 BBTB 进行扩散视为成功提供治疗药物的关键方面之一.
由于 BBTB 内细胞相互作用的复杂性, 在研究分子从血液到大脑的过程中, 对实验动物进行体内研究似乎是显而易见的选择。然而, 在体内的大规模方法是相对复杂的建立, 因此, 不允许在合理的时间内, 以合理的成本, 对分子进行高通量筛选。更重要的是, 动物试验必须遵循3R 道德准则, 定义为 (i) 完善、(二) 减少, 并与目前情况相关, 三) 以替代议定书取代 (例如, 在 vitroin silico 方法中)。因此, 在体外重现 BBTB 似乎是一种有趣和有吸引力的可能性, 但它也构成了一项复杂的任务, 受到各种限制的挑战。许多试图用来自犬、猪、小鼠甚至人类起源的培养的原代细胞或细胞系重新建立这个复杂的隔间的文章已经出版 (rahman 等人8人和 helms 等人9人回顾了这一尝试)。这些模型包括三维微流体系统10、bbb 在芯片上 11、12和基于刀片系统中经典共培养的大量变种。然而, 目前的微流体和芯片系统要么不适合快速、高通量的药物验证研究13、14 , 要么目前与脑肿瘤药物输送研究不兼容。此外, 对155个已公布的模型使用原代细胞、诱导多能干细胞 (iPSC) 或商业细胞系的评价表明, 它们的测量和结论8存在研究间差异的趋势。这种实验室间重现性的缺乏可能与 (一) 非规范化培养条件有关, 例如细胞培养容器中的基底膜基质蛋白的可选涂层, ii) 亚培养和使用的增加含有血清的培养基, 包括细胞系15的遗传和表型修饰的主要驱动因素, 或 (iii) 在可重现的情况下, 在一道菜中再现了星形胶质和内皮成分之间的正确平衡。尽管使用永生细胞或商业细胞系建立体外 BBB 模型缺乏一些特性相比, 类似的模型, 只使用原代细胞, 我们表明, 正确的组合细胞显示非常可与其他参考模型16、17的已发表研究结果相比较。最终, 缺乏一个强大和可重复的模型来研究治疗化合物通过 BBTB 的通过脑肿瘤促使我们开发这里描述的方法。
由于我们的目标是利用该模型预测临床前动物模型中纳米粒子的体内传递, 我们首先利用含有与小鼠星形胶质细胞接触的含有小鼠内皮细胞的插入物来验证 BBTB 模型。除此之外, 我们还优化了模型, 以使用某些人体细胞系。一旦稳定, 细胞屏障被转移到培养与患者衍生的胶质母细胞瘤球体或商业胶质瘤细胞系。此后, 纳米颗粒的细胞化和肿瘤细胞靶向可以通过共聚焦显微镜观察, 并通过随着时间的推移采集样本进行量化。重要的是, 使用 BBTB 模拟物获得的结果可以可靠地预测纳米粒子在体内的行为, 支持在临床前验证之前使用 BBTB。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1761px;" width="1761">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:1761px;">Cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">bEND3</td>
			<td style="width:239px;">ATCC</td>
			<td style="width:273px;">CRL-2299</td>
			<td style="width:961px;">Cultured in: DMEM (1g/L glucose) supplemented with 10% FBS, 5 mL L-glutamine and 5 mL penicillin/streptomycin</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">HIFko immortalized mouse astrocytes</td>
			<td style="width:239px;">Isolated in Dr. Gabriele Bergers Lab</td>
			<td style="width:273px;">https://doi.org/10.1016/S1535-6108(03)00194-6</td>
			<td style="width:961px;">Cultured in: BME-1 supplemented with 5% FBS, 5 mL 1 M HEPES, 5 mL 100 mM sodium pyruvate, 3 g D-glucose and 5 mL penicillin/streptomycin</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">HuAR2T</td>
			<td style="width:239px;">Isolated in Dr. Dagmar Wirth Lab</td>
			<td style="width:273px;">https://doi.org/10.1089/ten.tea.2009.0184</td>
			<td style="width:961px;">Cultured in: EBM-2 with SupplementMix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">normal human primary astrocytes</td>
			<td style="width:239px;">Lonza</td>
			<td style="width:273px;">CC-2565</td>
			<td style="width:961px;">Cultured in: ABM with SingleQuots</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:1761px;">Material and reagents</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100x17mm Dish, Nunclon Delta</td>
			<td style="width:239px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td>150350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">10 mL serological pipet</td>
			<td style="width:239px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:273px;">170361</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">15mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:239px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:273px;">339650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">ABM Basal Medium, 500 mL</td>
			<td style="width:239px;">Lonza</td>
			<td style="width:273px;">CC-3187</td>
			<td>For primary human astrocytes. ABM+: contains all the additives from the supplement mix. ABM-:all the additives except for rhEGF and FBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Accutase Cell Detachment Solution</td>
			<td style="width:239px;">Corning</td>
			<td style="width:273px;">25-058-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">AGM SingleQuots Supplements and Growth Factors</td>
			<td style="width:239px;">Lonza</td>
			<td>CC-4123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">B27 supplement</td>
			<td style="width:239px;">Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>for both GBM + and - medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Basal Medium Eagle</td>
			<td style="width:239px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:273px;">21010046</td>
			<td>BME-1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Corning Costar TC-Treated 6-Well Plates</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:273px;">CLS3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">Corning Transwell polyester membrane cell culture inserts</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:273px;">CLS3452&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">D-glucose</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:273px;">G8270</td>
			<td>dissolve in 50 mL of BME-1 and sterile filter before adding to the medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium/Nutrient F-12 Ham</td>
			<td style="width:239px;">Gibco</td>
			<td>21331-020</td>
			<td>Specific to the culture of the patient-derived spheres isolated in our lab, may vary for other glioma cell lines</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EBM-2 growth Medium SupplementMix</td>
			<td style="width:239px;">PromoCell</td>
			<td style="width:273px;">c-39216</td>
			<td>EBM+: contains all the additives from the supplement mix. EBM-:all the additives except for VEGF-A and FBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Endothelial Basal Medium 2 (EBM-2)</td>
			<td style="width:239px;">PromoCell</td>
			<td style="width:273px;">c-22211</td>
			<td>EBM+: contains all the additives from the supplement mix. EBM-:all the additives except for VEGF-A and FBS</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:288px;">Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin</td>
			<td style="width:239px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:273px;">10500056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Fluorescein sodium salt</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:273px;">F6377</td>
			<td style="width:961px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Greiner CELLSTAR 96 well plates</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:273px;">Greiner 655090</td>
			<td>black polystyrene wells flat bottom (with micro-clear bottom)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">Menzel-Gl&#228;ser 0.9 cm round borosilicate Cover Slips</td>
			<td style="width:239px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:273px;">10313573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">PBS tablets</td>
			<td style="width:239px;">Medicago</td>
			<td>09-9400-100</td>
			<td>one tablet per liter of dH2O, then sterilize the solution by autoclaving</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Poly-D-lysine hydrobromide</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6407&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Recombinant Human EGF</td>
			<td style="width:239px;">Peprotech</td>
			<td style="width:273px;">GMP100-15</td>
			<td>for GBM+ medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.)</td>
			<td style="width:239px;">Peprotech</td>
			<td style="width:273px;">100-18B</td>
			<td>for GBM+ medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Immunofluorescence</td>
			<td style="width:239px;"></td>
			<td style="width:273px;"></td>
			<td style="width:961px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:273px;">158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;width:288px;">24 x 60 mm microscope slide cover glass</td>
			<td style="width:239px;">ORSAtec</td>
			<td style="width:273px;">0224601-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:288px;">AlexaFluor 488 and 594 secondary antibodies</td>
			<td style="width:239px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:273px;"></td>
			<td>dilution: 1/500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Anti-Claudin-5 antibody</td>
			<td style="width:239px;">Abcam</td>
			<td style="width:273px;">ab15106</td>
			<td>dilution: 1/150</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Anti-GFAP antibody clone GF5</td>
			<td style="width:239px;">Abcam</td>
			<td style="width:273px;">ab10062</td>
			<td>dilution: 1/150</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">Anti-Mouse CD31&#160;antibody Clone MEC 13.3</td>
			<td style="width:239px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:273px;">550274</td>
			<td>dilution 1/800</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Anti-SV40 T-antigen antibody</td>
			<td style="width:239px;">Abcam</td>
			<td style="width:273px;">ab16879</td>
			<td>dilution: 1/150</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Anti-Zonula Occludens-1</td>
			<td style="width:239px;">Abcam</td>
			<td style="width:273px;">ab96587</td>
			<td>dilution: 1/200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">DAPI</td>
			<td style="width:239px;">TOCRIS</td>
			<td style="width:273px;">5748</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">Fluoromount Aqueous Mounting Medium&#160;</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:273px;">F4680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">LysoTracker Red DND-99</td>
			<td style="width:239px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:273px;">L7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Animal procedures</td>
			<td style="width:239px;"></td>
			<td style="width:273px;"></td>
			<td style="width:961px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">10 cm curved dissecting scissors</td>
			<td style="width:239px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:273px;">14394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">BD Microlance 25-gauge needles</td>
			<td style="width:239px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:273px;">300600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Fine Forceps (12.5 cm)</td>
			<td style="width:239px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:273px;">503283</td>
			<td>for tissue dissociation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Intramedic Polyethylene tubing PE20</td>
			<td style="width:239px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:273px;">427406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Ketaminol vet 50 mg/mL</td>
			<td style="width:239px;">Intervet</td>
			<td style="width:273px;">Vnr511485</td>
			<td>Ketamine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Mains Powered microdrill</td>
			<td style="width:239px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:273px;">503599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">Menzel-Gl&#228;ser 0.5 cm round borosilicate Cover Slips</td>
			<td style="width:239px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:273px;">11888372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Micro Bulldog clamp</td>
			<td style="width:239px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:273px;">14119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">Physiological saline solution</td>
			<td style="width:239px;">Mustela</td>
			<td style="width:273px;">Sterile single dose vials 20 x 5 mL / 40 x 5 mL - Medical device class</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Rochester-Oschner forceps</td>
			<td style="width:239px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:273px;">501709</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Rompun vet 20 mg/mL</td>
			<td style="width:239px;">Intervet</td>
			<td style="width:273px;">Vnr148999</td>
			<td>Xylazine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Stereotaxic adapter</td>
			<td style="width:239px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:273px;">502063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Sugi Sponge Points</td>
			<td style="width:239px;">Kettenbach</td>
			<td style="width:273px;">31603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Equipment</td>
			<td style="width:239px;"></td>
			<td style="width:273px;"></td>
			<td style="width:961px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">Axio Zoom.V16 fluorescence stereo zoom microscope&#160;</td>
			<td style="width:239px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:273px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">FLUOstar Omega microplate reader</td>
			<td style="width:239px;">BMG Labtech</td>
			<td style="width:273px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">ORCA-Flash 4.0 digital sCMOS camera</td>
			<td style="width:239px;">Hamamatsu Photonics</td>
			<td style="width:273px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Universal 320 tabletop centrifuge&#160;</td>
			<td style="width:239px;">Hettich</td>
			<td style="width:273px;">Cat. No. 1401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">ZEISS LSM 880 with Airyscan confocal microscope</td>
			<td style="width:239px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:273px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

predicting in vivo payloads delivery using a blood-brain tumor-barrier in a dish

血脑屏障 (BBB) 本质上具有高度选择性, 是生理条件下大脑稳态的关键。然而, 在脑肿瘤的背景下, BBB 的分子选择性也通过阻断外周管理的化疗的传递来保护肿瘤细胞。针对恶性脑瘤的新药 (包括纳米颗粒) 的开发, 理想的情况是需要使用临床前动物模型来研究药物的转染和抗肿瘤效果。为了符合3R 原理 (细化、减少和替换), 减少实验设置中实验室动物的数量, 并对大型抗肿瘤药物库进行高通量筛选, 我们开发了一种可在体外的人和使用内皮细胞、星形胶质细胞和患者衍生的胶质母细胞瘤球体的三层培养物模拟血脑肿瘤屏障 (BBTB)。为了提高可扩展性和重现性, 商业细胞系或不朽细胞已在量身定制的条件下使用, 以便形成类似于实际 BBB 的屏障。在这里, 我们描述了一个方案, 以获得 BBTB 模仿培养内皮细胞与星形胶质细胞在特定的细胞密度在插入物。例如, 这种 BBTB 模拟可用于通过内皮和星形胶质屏障的纳米颗粒通道的定量和共聚焦成像, 以及对同一检测方法中肿瘤细胞靶向的评价。此外, 我们还表明, 所获得的数据可以用来预测临床前动物模型中纳米粒子的行为。从更广泛的角度来看, 这种体外模型可以适应其他神经退行性疾病, 以确定新的治疗分子通过 BBB 和/或补充大脑有机体, 直接评估的疗效药物。

小鼠 BBTB 模拟的共聚焦成像显示了紧结蛋白 zonula 闭塞-1 (ZO-1) 和 claudin-5 在 bEND3 中的表达和细胞定位。与 bEND3 单层培养相比, 内皮细胞和星形胶质细胞之间的接触明显诱导了 ZO-1 和 claudin-5 向内皮细胞触点的迁移 (图 1D)。利用免疫荧光染色来显示血管脑侧的 gfap 表达星形胶质细胞, 可以观察和研究星形胶质细胞的过程以及通过膜与内皮细胞接触的端脚 (图 1E)).星形胶质细胞-内皮细胞接触是众所周知的促进和稳定收紧细胞屏障, 并与较低的渗透率 BBB19。据此, 我们观察到, 在单孔的情况下, 小鼠 BBTB 模拟 Na-Fl 的渗透率大幅下降, 在单孔的情况下, 可大幅下降到 6.74 (±3.01) x 10-6 厘米.因子敲除 (HIFko) 星形胶质细胞 (表 1)。不朽的 HuAR2T 形成了高度渗透的细胞屏障 (104.92±27.1 x 10-6 厘米,表 1).与小鼠模型类似, 当 HUAR2T 细胞与人类原代星形胶质细胞共同培养时, 我们测量到 bbtb 对 Na-Fl 的渗透率明显较低, 即 7.4 (±14.32) x 10-6 厘米 (表 1)。
在小鼠和人类 BBTB 模拟中, 患者衍生的胶质母细胞瘤球体的存在导致的通透性值仅与内皮细胞-星形胶质细胞共培养相比略有增加 (表 1)。这种现象是观察到几个, 但不是所有的病人胶质瘤球体模型。这可能是由于 VEGF-A 是由这些病人衍生的细胞中的一些分泌的。
为了比较体外 BBTB 模拟物与体内 BBB 的渗透率值, 我们通过植入裸鼠的颅内窗口对 Na-Fl 的实时扩散进行了成像。使用荧光立体显微镜, 从主要皮膜血管产生的血管毛细血管的 Na-Fl 扩散记录在探针的全身注射之前、期间和之后 (图 2c)。随着时间的推移, 测量循环血液和脑皮质实质的微分荧光值, 使我们能够计算裸鼠 BBB 对 Na-Fl 的近似渗透率值 (5.57±2.19 x 10-6 厘米, 表 1)。
为了说明这种 BBTB 模拟如何用于可视化化合物从血液侧到大脑一侧的过程, 我们比较了直径为患者衍生的胶质母细胞瘤球体的直径110纳米 (NP110) 和 o 350 nm (NP350)。然后将体外获得的结果与体内转胞结果进行比较。在所介绍的例子中, 纳米颗粒表面涂覆了肿瘤靶向肽 Coop20 , 并加入了荧光染料 (fitc), 以方便可视化。我们用溶酶体染料标记细胞, 并用 DAPA 24h 标记细胞, 在 BBTB 的血液侧添加 fitc 纳米颗粒后, 在不同的水平 (如血液侧、膜、脑侧) 中模拟并获得了共聚焦显微镜,和患者胶质母细胞瘤球体) (图 3 a)。NP110 相关的荧光信号与内皮细胞、星形胶质细胞和肿瘤细胞中的溶酶体共用。此外, 在内皮细胞和星形胶质细胞之间检测到 Np110, 通过插入物的膜孔 (图 3 a)。
通过测量从血液和大脑侧采集的样本中的荧光, 对 Np110 的通道进行了量化。将这些渗透率值与 为 o 350 纳米纳米纳米纳米纳米纳米粒子 (np350) 确定的渗透率值进行了比较。结果表明, 只有 NP110 能够通过 BBTB 模拟 (图 3b)。NP350 保持在 BBTB 模拟的血液侧, 这导致这些纳米颗粒的渗透率较低。
为了突出 BBTB 模拟与体内模型相比的相关性, 裸鼠通过静脉注射 NP110 或 NP350 纳米颗粒, 涂覆肿瘤靶向肽 coop, 并与红色荧光染料 (TRITC) 结合检测。在几个时间点收集的组织显示, 8小时后, bbb 渗透性纳米颗粒已经外露到脑实质, 而留在循环中的非渗透纳米粒子主要从体内的全身循环中清除。因此, 我们收集了大脑, 并量化了注射后每平方毫米8h 纳米粒子的数量。根据体外发现, NP110, 而不是 NP350, 成功外渗到大脑实质 (图 3C)。大脑中纳米粒子位置的高放大成像显示, NP110 在毛细血管外的脑实质中均匀分布, 并成功地归属于植入的胶质母细胞瘤细胞 (图 3D)。尽管 NP350 表现出相同的肿瘤靶向部分 (CooP), 但无法外渗到脑实质中, 只在脑血管的腔侧检测到 (图 3E), 类似于体外获得的结果.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59384/59384fig1.jpg"> 图 1: 血脑肿瘤屏障 (BBTB) 模型的描述.(A) 不同细胞类型位置的示意图表示。(B) 说明插入物在6井板盖上的位置和刀片膜脑侧星形胶质细胞的播种技术.(C) 6 井板放置的说明, 允许星形胶质细胞粘附。(D) 紧密结合蛋白 zonula 闭塞蛋白-1 (zo-1, 上列, 红色) 和 claudin-5 (下排, 绿色) 的免疫荧光显微镜。将蛋白质表达与仅在 BBTB 血侧作为单培养 (左柱) 或小鼠永生化 hifko 星形胶质细胞 (右柱) 培养的小鼠大脑微血管内皮细胞 (bend3) 进行比较。细胞核与 DAPI (蓝色) 进行反染色。(E) 免疫荧光微图显示在 BBTB 脑侧培养的 hifko 星形胶质细胞中的胶质纤维酸性蛋白 (gfap, 红色)。高放大倍率图像显示星形胶质细胞的过程和端脚 (箭头) 通过膜孔 (右面板) 与内皮细胞接触。通过免疫荧光染色, 验证了用于细胞永生化的 simian 病毒40大 T 抗原 (SV40 大t, 绿色) 的 HIFko 星形胶质细胞的身份。内皮细胞既不表达 GFAP, 也不表达 SV40 大 T, 因此, 可以通过膜的透明, 相对的一侧部分观察到, 作为只 dapi 染色的细胞 (虚线)。细胞核与 DAPI (蓝色) 进行反染色。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59384/59384fig1large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59384/59384fig2.jpg"> 图 2:小鼠 BBB 通透性的术期内活度测定.(A) 植入尾静脉导管的制备。(1) 工具和设备如下: (a) pe20 聚乙烯管 (b) 两个 25 g 针 (c) rochester-ochsner 钳, (d) 一个小型斗牛犬钳。(2) 用钳子用几个扭力取出 25 g 针, 并 (3) 小心地插入管中。(4) 管的另一侧连接到另一个 25 g 针。(B) 导管植入的指导和定位, 通过小鼠的尾静脉注入钠-荧光素溶液。圆圈区域表示放置一滴氰基丙烯酸酯胶以固定导管的区域。斗牛犬夹子用于处理导管, 并在导管固定后取出。(C) 确定钠-荧光素渗透率值的代表性成像和定量方法。在钠荧光素输注 (左柱) 之前, 在大脑 (顶板、白色矩形) 和血管区域 (底板、红色矩形) 上的感兴趣区域 (ROI) 范围内测量自荧光空白。在钠荧光素输注 (右柱) 期间, 在两个 Roi 中测量荧光强度, 从而计算 BBB 渗透率。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59384/59384fig2large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59384/59384fig3.jpg"> 图 3: 利用体外 BBTB 模型预测体内 bbb 纳米颗粒的脑内转染.(A) BBTB 检测的图形表示, 并在所示的不同程度的小鼠 BBTB 模型中获得具有代表性的共聚焦图像。在 BBTB 细胞的血液侧添加直径为110纳米 (NP110) 并与 FITC (绿色) 结合的纳米粒子, 用溶酶体探针 (LT-99, 红色) 标记。 (1) 内皮细胞, (2) 纳米粒子通过膜的毛孔 (白色虚线)、(3) 星形胶质细胞和 (4) 患者胶质母细胞瘤球体通过膜的毛孔内细胞化, 并在图形上确定。对应的共聚焦显微图 (右)。纳米颗粒 (箭头) 的溶酶体包封表明通过 BBTB 的内皮细胞和星形胶质细胞层主动转胞。(B) 通过 BBTB 对表明的纳米颗粒渗透性进行体外定量 (n = 6)。(C) 在裸鼠尾静脉输注8小时后, 对脑组织切片中表明的纳米颗粒密度进行定量 (n = 3)。(D) 共聚焦显微镜图, 显示 o 110 纳米纳米粒子 (NP110, 红色) 在贴有抗小鼠 CD31 抗体 (绿色) 标签的小鼠脑组织部分的分布情况。箭头突出显示纳米颗粒的细胞化 (左面板)。纳米粒子在脑瘤细胞 (肿瘤、右面板) 周围积累, 原因是其表面出现了针对 coop 靶向的肽。在脑组织 (大脑) 中没有观察到明显的归巢现象。(E) 共聚焦显微镜显示了在贴有抗小鼠 CD31 抗体 (绿色) 标签的小鼠脑组织部分中的350纳米粒子 (NP350, 红色) 的分布。箭头指向保留在血管腔内并无法穿过 BBB 的 Np35d, 这可能是由于它们的直径比 Np110 更大, 细胞核被 DAPI (蓝色) 反染色。* * P < 0.01。P值是使用双尾、非参数的 Mann-wh仔细 u 测试计算的。误差线表示标准偏差。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59384/59384fig3large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>模仿小鼠 BBTB</td>
			<td>本德3</td>
			<td>bEND3+HIFko</td>
			<td>bEND3+GB</td>
			<td>bEND3+HIFko + GB</td>
			<td>在体内</td>
		</tr>
<tr>
<td>渗透性 (10-6平方米)</td>
			<td>27.63</td>
			<td>6.74</td>
			<td>26。8</td>
			<td>10.83</td>
			<td>5.57</td>
		</tr>
<tr>
<td>SD (10-6平方米)</td>
			<td>3.45</td>
			<td>3.01</td>
			<td>7.99</td>
			<td>2.65</td>
			<td>2.19</td>
		</tr>
<tr>
<td>模仿人类 BBTB</td>
			<td>HuAR2T</td>
			<td>HuAR2T+hIAs</td>
			<td>HuAR2T+GB</td>
			<td>HuAR2T+hIAs+GB</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>渗透性 (10-6平方米)</td>
			<td>104.92</td>
			<td>47。4</td>
			<td>89.08</td>
			<td>48.24</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>SD (10-6平方米)</td>
			<td>27。1</td>
			<td>14.32</td>
			<td>10.21</td>
			<td>13.07</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>表 1: 体外测定的钠荧光素 (Na-Fl) 渗透率 (以厘米/秒为单位) 的数值在指定的共培养系统和体内在 NMRI 裸鼠中一个有代表性的实验数据 (n = 3只老鼠)。

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Predicting In Vivo Payloads Delivery using a Blood-brain Tumor-barrier in a Dish

利用血脑肿瘤屏障在盘中进行活体有效载荷传递预测

针对中枢神经系统肿瘤的药物靶向是一项重大挑战。在这里, 我们描述了一个协议, 以产生一个体外模拟血脑肿瘤屏障使用小鼠和/或人类细胞, 并讨论其与中枢神经系统肿瘤靶向在体内的相关性。

Highly selective by nature, the blood-brain barrier (BBB) is essential for the brain homeostasis in physiological conditions. However, in the context of ...

为了开发针对中枢神经系统肿瘤的新药和化合物，通过血脑屏障的可及性和通过非常重要。虽然可以通过用治疗分子孵化细胞来轻松测量化合物的细胞毒性，但它并不能真正说明实际在大脑中的肿瘤位点传递。为了解决这个问题，我们开发了以下协议，描述如何在菜体外重新创建血脑肿瘤屏障。使用不朽的穆林或人类起源的细胞，使这种测定非常灵活。它还可轻松放大以筛选数十种具有高可重复性化合物。此外，在进行临床前模型之前，该方法还允许对化合物的通过和定位能力进行定量和可视化。因此，我们的方法部分取代了动物模型使用预先建立的细胞系。包括患者衍生的脑肿瘤细胞检测患者的异质性，而使用不朽的细胞建立血脑屏障，确保结果的可重复性。总之，这种血脑屏障模型提供了一个非常有趣的工具，以检测药物扩散或药物车辆的交付。该方法的可视化演示至关重要，因为插入体对对面的单元的种子需要操作，而使用类似设置的其他协议中并不经常描述的操作。例如，当插入物倒置时，获得星核细胞的粘附性，从视觉表示中非常有益。在无菌细胞培养罩下，用五毫升无菌PBS小心清洗培养的星细胞。使用真空泵轻轻丢弃PBS，并添加两毫升细胞分离试剂五分钟以分离细胞。然后，在容器中加入10毫升无菌完整的星细胞培养，以抑制细胞分离试剂的活性。使用无菌血清移液器将分离的细胞从容器转移到无菌的15毫升管。在室温下以250倍g离心3分钟。同时，设置插入件。使用无菌钳子将大脑侧向上的刀片放在无菌六井板的盖子上。离心完成后，小心地从细胞悬浮液中丢弃上经，然后通过轻轻移液管壁上的颗粒五次，将星细胞颗粒重新悬浮在一毫升的 ABM+中。然后，计算细胞数，并将细胞悬浮密度调整为15万个细胞，每插入400微升的反导加。将细胞悬浮液放在插入膜的脑侧中间，用带无菌移液器尖端的毛细管力小心地将其传播。当刀片的脑侧仍然向上时，将六井板放回刀片上。将板和插入，与大脑侧向上，进入孵化器在37摄氏度和5%的二氧化碳，以允许细胞粘附。在此之后，将六井板恢复到其正常位置，插入物现在血侧向上。添加介质，继续如文本协议中概述的孵化。在无菌细胞培养罩下，用五毫升无菌PBS小心清洗培养的内皮细胞。使用真空泵轻轻丢弃PBS，并添加两毫升细胞分离试剂五分钟以分离细胞。然后，在容器中加入10毫升无菌完整的内皮细胞培养，以抑制细胞分离试剂的活性。使用无菌血清移液器将分离的细胞从容器转移到无菌的15毫升管。在室温下以250倍g离心3分钟。在此之后，丢弃上经剂，将内皮细胞颗粒重新悬浮在一毫升EBM+中，缓慢将细胞悬浮液移液在管壁上长达五次。计算细胞，并将细胞悬浮密度调整为20万细胞，在2.5毫升内皮细胞培养中，不含血清和血管内皮生长因子-A每个插入。取回包含刀片的板。小心地从血侧丢弃介质，代之以2.5毫升的内皮细胞悬浮液。然后，将板返回到培养箱，并在夜间离开，让内皮细胞粘附在膜上。第二天，准备一个六井板，将三毫升预热的反导减到每一个井。使用无菌钳子，处理刀片，小心地从血侧丢弃内皮完整介质，并将插入物放入含有 ABM-减号的新板中。然后，添加 2.5 毫升 EBM 减。将刀片留在培养箱中，以最小的物理干扰或温度变化保留五天。在传输当天，更换介质。对于免疫荧光成像，将多达四个圆形无菌硅酸盐盖玻片放入含有两毫升聚D-晶硅氨酸的六孔板的每个孔中。在室温下孵育30分钟。同时，使用无菌血清移液器小心地将肿瘤球体从细胞培养容器转移到15毫升的无菌管中。将肿瘤球体以250倍g离心三分钟。丢弃上一杯，轻轻将球体重新在一毫升的 GBM 减量中重新暂停。计算细胞数，将细胞密度调整为每毫升GBM-减号约10000个球体或10万个细胞。接下来，从井中丢弃聚D-利氨酸，然后用无菌PBS冲洗井三次。用三毫升的肿瘤球状悬浮液播种板的每个井，并将BBTB模拟的插入物转移到肿瘤细胞悬浮液上。在37摄氏度下孵育过夜，用5%的二氧化碳使检测的血液和脑肿瘤两侧达到平衡。第二天，用EBM-减号代替血侧的介质，并辅以感兴趣的分子、药物或纳米粒子。收集样品随着时间的推移直接量化，如前所述。首先，从BBTB模拟的血液和大脑两侧收集100微升的介质，并分别转移到一个单独的平底、黑色、96井板，以便随后进行荧光测量。接下来，在EBM-减号中准备一个50微摩尔氟素钠溶液，确保每井准备2.5毫升。将溶液预热至37摄氏度，用含有这种氟化钠溶液的介质取代刀片的血侧介质。更换介质后，立即开始计时器。在5分钟、30分钟、60分钟和120分钟时，从插入物的血液和大脑两侧仔细收集100微升介质。将每个样品转移到适当的黑色 96 孔板的分离井中。使用板读卡器从采集的样品中量化荧光。首先，在预热介质中稀释利索索姆荧光染料至适当的工作浓度。将此添加到细胞中，在37摄氏度下孵育，用5%的二氧化碳孵育45分钟。然后，用冰冷的PBS冲洗细胞三次。丢弃 PBS，在井中加入三毫升冰冷 4%半甲醛，在刀片中加入 2.5 毫升。在冰上孵育10分钟。在此之后，丢弃甲醛，并用PBS冲洗细胞三次。取出PBS，并使用DAPI溶液在蒸馏水中每毫升1微克的最终浓度对细胞核进行反污。在室温下孵育7分钟。然后，取出DAPI，用蒸馏水洗三次膜。小心地切开膜，取出蒸馏水，并将其放在玻璃显微镜幻灯片上的一滴安装介质上。在膜的另一侧再加入一滴安装介质，并小心地用硅酸盐盖玻璃盖住。在这项研究中，内皮细胞与星形细胞共同培养，在体外设置中形成血脑肿瘤屏障样界面。murine BBTB 模拟的共声成像显示了 bEND3 中紧密结点蛋白分区-1 和克劳丁-5 的表达和细胞定位。与 bEND3 单培养物相比，内皮细胞和星细胞之间的接触显然诱导这两种蛋白质重新定位到内皮细胞对细胞接触。利用免疫荧光染色来可视化膜脑侧的 GFAP 表达星细胞，可以观察和研究通过膜接触内皮细胞的星体过程和末脚。为了将体外BBTB模拟的渗透值与体外血脑屏障进行比较，通过植入裸鼠的颅窗对氟素钠的实时扩散进行成像。使用荧光立体显微镜，在探头系统注射之前、期间和之后，记录从主皮亚尔血管中衍生出的血管毛细血管中荧光素钠。然后比较针对患者衍生胶质母细胞瘤球体的纳米粒子的转囊，以说明 BBTB 模拟如何用于可视化化合物从血侧到大脑侧的传递。NP110相关的荧光信号与内皮细胞、星细胞和肿瘤细胞中的利索体共同位化。此外，NP110在内皮细胞和星细胞之间检测到，通过插入的膜孔隙。NP110的通过通过测量从血液和大脑两侧的样本中采集的荧光进行量化，这些值与350纳米的确定纳米粒子进行比较。可以看到，只有NP110能够穿过BBTB模拟，而NP350留在血液侧，导致这些纳米粒子的渗透率较低。小心处理刀片，并小心地将星细胞悬浮液扩散到刀片的大脑侧，而不直接接触膜。膜的任何损坏都会导致泄漏。这种方法可以适应，以回答大脑传递外围管理的有效载荷的问题。通过使用具有较大膜孔隙的不同插入物，也可以研究细胞外创。可以通过使用不同的细胞类型来模拟其他细胞屏障来修改此技术。它还为更负责任和合乎道德的研究铺平了道路，旨在减少用于抗癌药物验证的实验室动物的数量。请记住，甲醛是一种非常有毒的化学物质，应进行相应的处理。此外，在使用锋利的手术刀从刀片中提取膜时要小心。

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