Name: predicting in vivo payloads delivery using a blood-brain tumor-barrier in a dish
Uploaded: 2019-04-16T14:30:00
Duration: 13 min 34 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Predicting In Vivo Payloads Delivery using a Blood-brain Tumor-barrier in a Dish at JoVE.com

Denne forskning blev støttet af tilskud fra den finske kræft organisationer, Jane & Aatos Erkko Foundation, og Sigrid Juselius Foundation (til P.L. og V.L.J.), den schweiziske National Science Foundation (avanceret Postdoc.Mobility giver ingen: P300PB_164732 til S. K.), Orion Research Foundation (til S.K.), Maud Kuistila Memorial Foundation (til S.K.) og Finlands Akademi (TERVA 2017, give no: 314 498). Biomedicum Imaging enhed (Helsinki) er anerkendt for at levere mikroskopi imaging core facilitet.

<ol>
	<li>Daneman, R., Prat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-brain+barrier.">The blood-brain barrier.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (1), a020412 (2015).</li><li>Quail, D. F., Joyce, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Microenvironmental+Landscape+of+Brain+Tumors.">The Microenvironmental Landscape of Brain Tumors.</a> Cancer Cell. 31 (3), 326-341 (2017).</li><li>Wang, Z., Sun, H., Yakisich, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+the+blood-brain+barrier+for+chemotherapy:+limitations,+challenges+and+rising+problems.">Overcoming the blood-brain barrier for chemotherapy: limitations, challenges and rising problems.</a> Anticancer Agents in Medicinal Chemistry. 14 (8), 1085-1093 (2014).</li><li>Alkins, R. D., Brodersen, P. M., Sodhi, R. N., Hynynen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+drug+delivery+for+boron+neutron+capture+therapy+of+brain+tumors+with+focused+ultrasound.">Enhancing drug delivery for boron neutron capture therapy of brain tumors with focused ultrasound.</a> Neuro Oncology. 15 (9), 1225-1235 (2013).</li><li>Alli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brainstem+blood+brain+barrier+disruption+using+focused+ultrasound:+A+demonstration+of+feasibility+and+enhanced+doxorubicin+delivery.">Brainstem blood brain barrier disruption using focused ultrasound: A demonstration of feasibility and enhanced doxorubicin delivery.</a> Journal of Controlled Release. 281, 29-41 (2018).</li><li>Ashby, L. S., Smith, K. A., Stea, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gliadel+wafer+implantation+combined+with+standard+radiotherapy+and+concurrent+followed+by+adjuvant+temozolomide+for+treatment+of+newly+diagnosed+high-grade+glioma:+a+systematic+literature+review.">Gliadel wafer implantation combined with standard radiotherapy and concurrent followed by adjuvant temozolomide for treatment of newly diagnosed high-grade glioma: a systematic literature review.</a> World Journal of Surgical Oncology. 14 (1), 225 (2016).</li><li>Guishard, A. F., Yakisich, J. S., Azad, N., Iyer, A. K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+gap+in+ongoing+clinical+trials+for+glioma.">Translational gap in ongoing clinical trials for glioma.</a> Journal of Clinical Neurosciences. 47, 28-42 (2018).</li><li>Rahman, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalized+endothelial+cell+lines+for+in+vitro+blood-brain+barrier+models:+A+systematic+review.">Immortalized endothelial cell lines for in vitro blood-brain barrier models: A systematic review.</a> Brain Research. 1642, 532-545 (2016).</li><li>Helms, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+of+the+blood-brain+barrier:+An+overview+of+commonly+used+brain+endothelial+cell+culture+models+and+guidelines+for+their+use.">In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 36 (5), 862-890 (2016).</li><li>Wang, J. D., Khafagy, e. l. -. S., Khanafer, K., Takayama, S., ElSayed, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+Endothelial+Cells,+Pericytes,+and+Astrocytes+into+a+3D+Microfluidic+in+Vitro+Model+of+the+Blood-Brain+Barrier.">Organization of Endothelial Cells, Pericytes, and Astrocytes into a 3D Microfluidic in Vitro Model of the Blood-Brain Barrier.</a> Molecular Pharmaceutics. 13 (3), 895-906 (2016).</li><li>Phan, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier-on-a-chip:+Microphysiological+systems+that+capture+the+complexity+of+the+blood-central+nervous+system+interface.">Blood-brain barrier-on-a-chip: Microphysiological systems that capture the complexity of the blood-central nervous system interface.</a> Experimental Biology and Medicine (Maywood). 242 (17), 1669-1678 (2017).</li><li>Bang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Low+Permeability+Microfluidic+Blood-Brain+Barrier+Platform+with+Direct+Contact+between+Perfusable+Vascular+Network+and+Astrocytes.">A Low Permeability Microfluidic Blood-Brain Barrier Platform with Direct Contact between Perfusable Vascular Network and Astrocytes.</a> Scientific Reports. 7 (1), 8083 (2017).</li><li>Wilhelm, I., Krizbai, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+of+the+blood-brain+barrier+for+the+study+of+drug+delivery+to+the+brain.">In vitro models of the blood-brain barrier for the study of drug delivery to the brain.</a> Molecular Pharmacology. 11 (7), 1949-1963 (2014).</li><li>Campisi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+self-organized+microvascular+model+of+the+human+blood-brain+barrier+with+endothelial+cells,+pericytes+and+astrocytes.">3D self-organized microvascular model of the human blood-brain barrier with endothelial cells, pericytes and astrocytes.</a> Biomaterials. 180, 117-129 (2018).</li><li>Pirsko, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Effect+of+Culture+Media+on+Epithelial+Differentiation+Markers+in+Breast+Cancer+Cell+Lines+MCF7,+MDA-MB-436+and+SkBr3.">An Effect of Culture Media on Epithelial Differentiation Markers in Breast Cancer Cell Lines MCF7, MDA-MB-436 and SkBr3.</a> Medicina (Kaunas). 54 (2), (2018).</li><li>Stebbins, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+and+characterization+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+brain+microvascular+endothelial+cells.">Differentiation and characterization of human pluripotent stem cell-derived brain microvascular endothelial cells.</a> Methods. 101, 93-102 (2016).</li><li>Canfield, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+isogenic+blood-brain+barrier+model+comprising+brain+endothelial+cells,+astrocytes,+and+neurons+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">An isogenic blood-brain barrier model comprising brain endothelial cells, astrocytes, and neurons derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Journal of Neurochemistry. 140 (6), 874-888 (2017).</li><li>Cao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-inducible+factor-1alpha+is+involved+in+isoflurane-induced+blood-brain+barrier+disruption+in+aged+rats+model+of+POCD.">Hypoxia-inducible factor-1alpha is involved in isoflurane-induced blood-brain barrier disruption in aged rats model of POCD.</a> Behavioural Brain Research. 339, 39-46 (2018).</li><li>Abbott, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte-endothelial+interactions+and+blood-brain+barrier+permeability.">Astrocyte-endothelial interactions and blood-brain barrier permeability.</a> Journal of Anatomy. 200 (6), 629-638 (2002).</li><li>Kinnari, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+homing+peptide-functionalized+porous+silicon+nanovectors+for+cancer+therapy.">Tumour homing peptide-functionalized porous silicon nanovectors for cancer therapy.</a> Biomaterials. 34 (36), 9134-9141 (2013).</li><li>Levin, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personalized+medicine+in+neuro-oncology.">Personalized medicine in neuro-oncology.</a> CNS Oncology. 5 (2), 55-58 (2016).</li><li>Weathers, S. S., Gilbert, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+Personalized+Targeted+Therapeutics:+An+Overview.">Toward Personalized Targeted Therapeutics: An Overview.</a> Neurotherapeutics. 14 (2), 256-264 (2017).</li><li>O'Duibhir, E., Carragher, N. O., Pollard, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerating+glioblastoma+drug+discovery:+Convergence+of+patient-derived+models,+genome+editing+and+phenotypic+screening.">Accelerating glioblastoma drug discovery: Convergence of patient-derived models, genome editing and phenotypic screening.</a> Molecular and Cellular Neuroscience. 80, 198-207 (2017).</li><li>Kaya, M., Ahishali, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+permeability+in+barrier+type+of+endothelium+in+brain+using+tracers:+Evans+blue,+sodium+fluorescein,+and+horseradish+peroxidase.">Assessment of permeability in barrier type of endothelium in brain using tracers: Evans blue, sodium fluorescein, and horseradish peroxidase.</a> Methods in Molecular Biology. 763, 369-382 (2011).</li><li>Yang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+two+immortalized+cell+lines,+ECV304+and+bEnd3,+for+in+vitro+permeability+studies+of+blood-brain+barrier.">Identification of two immortalized cell lines, ECV304 and bEnd3, for in vitro permeability studies of blood-brain barrier.</a> PLoS One. 12 (10), e0187017 (2017).</li><li>Blouw, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hypoxic+response+of+tumors+is+dependent+on+their+microenvironment.">The hypoxic response of tumors is dependent on their microenvironment.</a> Cancer Cell. 4 (2), 133-146 (2003).</li><li>Argaw, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte-derived+VEGF-A+drives+blood-brain+barrier+disruption+in+CNS+inflammatory+disease.">Astrocyte-derived VEGF-A drives blood-brain barrier disruption in CNS inflammatory disease.</a> Journal of Clinical Investigation. 122 (7), 2454-2468 (2012).</li><li>Miao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF+increases+paracellular+permeability+in+brain+endothelial+cells+via+upregulation+of+EphA2.">VEGF increases paracellular permeability in brain endothelial cells via upregulation of EphA2.</a> The Anatomical Record (Hoboken). 297 (5), 964-972 (2014).</li><li>Heinolainen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGFR3+Modulates+Vascular+Permeability+by+Controlling+VEGF/VEGFR2+Signaling.">VEGFR3 Modulates Vascular Permeability by Controlling VEGF/VEGFR2 Signaling.</a> Circulation Research. 120 (9), 1414-1425 (2017).</li><li>Claesson-Welsh, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+permeability--the+essentials.">Vascular permeability--the essentials.</a> Upsala Journal of Medical Sciences. 120 (3), 135-143 (2015).</li><li>Adriani, G., Ma, D., Pavesi, A., Goh, E. L., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+the+Blood-Brain+Barrier+in+a+3D+triple+co-culture+microfluidic+system.">Modeling the Blood-Brain Barrier in a 3D triple co-culture microfluidic system.</a> Conference Proceedings - IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. 2015, 338-341 (2015).</li><li>Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hCMEC/D3+cell+line+as+a+model+of+the+human+blood+brain+barrier.">The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier.</a> Fluids and Barriers of the CNS. 10 (1), 16 (2013).</li><li>Paatero, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyses+in+zebrafish+embryos+reveal+that+nanotoxicity+profiles+are+dependent+on+surface-functionalization+controlled+penetrance+of+biological+membranes.">Analyses in zebrafish embryos reveal that nanotoxicity profiles are dependent on surface-functionalization controlled penetrance of biological membranes.</a> Scientific Reports. 7 (1), 8423 (2017).</li><li>Prabhakar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimuli-responsive+hybrid+nanocarriers+developed+by+controllable+integration+of+hyperbranched+PEI+with+mesoporous+silica+nanoparticles+for+sustained+intracellular+siRNA+delivery.">Stimuli-responsive hybrid nanocarriers developed by controllable integration of hyperbranched PEI with mesoporous silica nanoparticles for sustained intracellular siRNA delivery.</a> International Journal of Nanomedicine. 11, 6591-6608 (2016).</li><li>Hyvonen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+target+for+peptide-based+imaging+and+treatment+of+brain+tumors.">Novel target for peptide-based imaging and treatment of brain tumors.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 13 (4), 996-1007 (2014).</li><li>Feng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammary-Derived+Growth+Inhibitor+Targeting+Peptide-Modified+PEG-PLA+Nanoparticles+for+Enhanced+Targeted+Glioblastoma+Therapy.">Mammary-Derived Growth Inhibitor Targeting Peptide-Modified PEG-PLA Nanoparticles for Enhanced Targeted Glioblastoma Therapy.</a> Bioconjugate Chemistry. 26 (8), 1850-1861 (2015).</li><li>Nance, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dense+poly(ethylene+glycol)+coating+improves+penetration+of+large+polymeric+nanoparticles+within+brain+tissue.">A dense poly(ethylene glycol) coating improves penetration of large polymeric nanoparticles within brain tissue.</a> Science Translational Medicine. 4 (149), 149rA119 (2012).</li><li>Berg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+nanoparticle+transport+through+in+vitro+blood-brain+barrier+models.">Quantitative analysis of nanoparticle transport through in vitro blood-brain barrier models.</a> Tissue Barriers. 4 (1), e1143545 (2016).</li><li>Noumbissi, M. E., Galasso, B., Stins, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+vascular+heterogeneity:+implications+for+disease+pathogenesis+and+design+of+in+vitro+blood-brain+barrier+models.">Brain vascular heterogeneity: implications for disease pathogenesis and design of in vitro blood-brain barrier models.</a> Fluids and Barriers of the CNS. 15 (1), 12 (2018).</li><li>Heymans, M., Sevin, E., Gosselet, F., Lundquist, S., Culot, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mimicking+brain+tissue+binding+in+an+in+vitro+model+of+the+blood-brain+barrier+illustrates+differences+between+in+vitro+and+in+vivo+methods+for+assessing+the+rate+of+brain+penetration.">Mimicking brain tissue binding in an in vitro model of the blood-brain barrier illustrates differences between in vitro and in vivo methods for assessing the rate of brain penetration.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 127, 453-461 (2018).</li></ol>

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Anledning af begrebet interpatient tumor variabilitet forynget forskning på personlig cancer medicine21. Denne variation er også kendetegnende for centralnervesystemet neoplasmer. På grund af uforudsigeligheden af tumor, reaktion på kemoterapi tilføjer til den levende effekt af BBB for medicinafgivelse, og helt udgør store udfordringer i patientpleje22. For at udvikle mere effektive behandlinger, er det ofte nødvendigt at skærmen store biblioteker af nye molekyler. For at evaluere den antitumor effekt og evne af de nye terapeutiske fører til tumor site, er den bedste løsning den prækliniske undersøgelse på patient-afledte celler implanteret i vivo i murine patient avatarer. På grund af praktiske (finansielle, tid, menneskelige og facilitet ressourcer) og etiske grunde (3R-princippet ved hjælp af forsøgsdyr), er udvikling af sådan en omfattende in vivo screening platform ofte ikke muligt, og derfor de celle-baserede assays forblive en model af valget23. Hovedårsagen til at vælge etableret cellelinjer og undgå primærelementer er at fremme reproducerbarhed og reducere brugen af forsøgsdyr, som er den vigtigste kilde til isolering og etablering af primære murine kulturer. Metoderne præsentere her, kunne fast overholder 3R, effektivt kassere nanopartikler fra en yderligere prækliniske undersøgelser på criterium deres evne til at krydse model BBTB. Som en proof-of-principle beskriver vi her resultaterne under udvikling og validering af BBTB. Vi var i stand til at bekræfte in vitro-resultater in vivo for eksempel Hvornår måling af en 376 Da natrium-fluorescein passiv diffusion.
Den protokol, der er skitseret i dette dokument beskrives forberedelse i endothelial celler cocultured med astrocytter til at danne en blod-hjerne tumor-barriere-lignende interface i en in vitro-setup. Når der etableres en fysisk kontakt mellem disse to celletyper, udstiller i endothelial cellelag ligheder med BBB (f.eks. en celle overflade udtryk for tight junction proteiner og relativt lav permeabilitet). Interessant, syntes de murine BBTB efterligner at give især lignende Na-Fl permeabilitet værdier til dem, der opnås med in vivo musen BBB permeabilitet målinger24. Derfor vil udførelsen af BBTB efterligner direkte knyttet til valget af de celler, der bruges til at danne barrieren. BEND3 endothelial celler stammer fra hjernen og er kendt for at være vellykket i danner barrierer når cocultured med astrocytter25. Men vi har brugt den udødeliggjort HIFko astrocytter26 til at generere BBTB efterligner. På grund af deres manglende hypoxi-inducerbar faktor, disse astrocytter ikke producerer VEGF-A, hvilket er indbegrebet i BBTB efterligner stabilisering beskrevet her. Astrocytter er blevet identificeret som modulatorer af BBB permeabilitet, for eksempel via frigivelse af VEGF-et svar på neuroinflammation27. Aktivering af vaskulær endotel vækstfaktor receptorer (VEGFRs) er et centralt regulator af i endothelial/vaskulær permeabilitet både i vitro28 og in vivo29. Derfor, VEGF-vitamintilskud på mellemlang aktivere VEGFR2 på endotelceller, som inducerer fosforylering af adherens junction proteiner som VE-cadherin30. Tab i endothelial celle-celle kontakter genererer meget gennemtrængelig blodkar. På samme måde, både stærke mitogenic ejendom og ukendt sammensætning af føtal bovin sera anvendes i celle kultur assays forårsage store problemer i barriere stabilisering og assay reproducerbarhed.
Menneskelige umbilical vene endothelial celler (HUVECs) er undertiden bruges til at danne BBB i vitro31; men de væsentligt afviger fra hjernen mikrovaskulære endotelceller, som cellen hCMEC/D3 linje32, genekspression og barriere-dannende egenskaber. Dog relativt højere permeabilitet værdier opnået med de HuAR2T celler dyrkes alene i forhold til bEND3 blev stærkt reduceret ved coculturing dem med menneskelig primær astrocytter. Selv om i endothelial celler er forpligtet til at danne den cellulære væg, er det klart, at astrocytter har en lige så vigtig rolle at spille for BBTB dannelse og stabilisering.
Når patienten-afledte gliom kugler blev føjet til denne ligning, sammenfattet mus BBTB efterligner nogle af funktionerne i murine xenografts, såsom narkotika diffusion gennem hjernen Vaskulaturen og tumor celle målretning. BBTB efterligner drøftet her var for eksempel vellykket i mirroring in vivo adfærd når vi screenet flere nanopartikler med forskellige diametre. For at illustrere parallelitet mellem de in vitro- og in vivo modeller, vi brugte tidligere beskrevne mesoporøse silikat nanopartikler33 med celle-gennemtrængende egenskaber34 konjugeret til tumor-targeting peptid CooP på deres surface20. CooP-targeting peptid hjem til invasiv tumorceller gennem specifikke bindingen til Mamma-afledt vækst-hæmmer (MDGI). Flere kræftformer, herunder gliomer, overekspression MDGI i forhold til de normale væv35, hvilket gør CooP en meget effektiv målretning af tumor gruppe i stand til at øge levering af en nyttelast20. Nanopartikler anvendes her har tidligere vist sig at diffuse i hjernen parenkym (27547955), og når functionalized med Taxol, disse nano-ladninger har haft succes med at reducere gliom vækst i prækliniske modeller36. Tilsætning af polyethylenglycol (PEG) rester på overfladen af nanopartikler også fastholdt deres statisk ladning til positive værdier (omkring + 4 mV), giver bedre interaktion med neurovaskulære enhed37 og også øge deres stabilitet i omløb. I de præsenterede data, var 3 kDa af PIND konjugeret til NP110s, mens NP350s var belagt med 10 kDa af PIND. Imidlertid resulterede steg molekylvægt PIND også i en betydelig stigning i nanopartikel diameter, dermed deres fysiske evner at krydse BBB. Derfor, vi tjekket om de fysiske dimensioner af partiklerne forhindret deres passage gennem BBTB og hvorvidt disse bemærkninger kunne spejles in vivo.
I overensstemmelse med de tidligere offentliggjorte bemærkninger, vi observerede, at NP110s behovet gennem både in vitro-BBTB og BBB af mus forsynet med intrakraniel tumorer, mens NP350s beholdes om det luminale side af BBTB efterligner og i blodkarrene i den mus. Disse lignende resultater tyder stærkt på at BBTB modellen forudsagde nanopartikler til at krydse BBB og nå hjernen in vivo evne.
Relevansen af cellulære modeller af BBB er ofte diskuteret, selv for de centrale levering af nanopartikler38. Vi viser her at primære astrocytter og endotelceller, begge betragtes som de mest relevante in vitro-værktøjer, kan være erstattet af udødeliggjort og/eller kommercielt tilgængelige celler, sikre større skalerbarhed og reproducerbarhed. Den næste generation af in vitro-BBB efterligner kan udvikles ved at indarbejde mikrofluid enheder, så smukt udformet neurovaskulære enheder, der strukturelt ligner de faktiske BBB12,14. Disse modeller er dog i øjeblikket uegnet til high throughput screening af molekyler leveret til gliomer, på grund af tekniske begrænsninger i opfølgningen af levering14. Det er faktisk svært at fange den fysiologiske kompleksiteten af BBB i en skål, og en eventuel mangel nogle receptorer/proteiner, kendt for at være udtrykt ved BBB, kunne kompromittere fortolkningen af resultaterne. Et andet argument vedrører den store variation i genekspression mellem in vivo og in vitro-betingelser, samt fra én cellelinje til en anden, især i betragtning af endothelceller. Det kan imidlertid også hævdes, at den neurovaskulære enhed ikke er en ensartet enhed i hjernen39. Videnskabelig forskning i biologi har nået en human æra hvor den dyrevelfærd, etiske ansvar og omkostningerne ved at bruge animalsk liv er altid anset før du designer et eksperiment. Derfor, for at støtte udskiftning af dyr, et stigende antal af de seneste undersøgelser viser, at bevidstheden om begrænsninger af modeller og omhyggelig udvælgelse af de cellulære modeller til at etablere barrieren — med vægt på astrocytter — garanterer en match mellem resultaterne opnået i et fad og i dyre modeller40. Med den metode, der beskrives her, får vi et skridt tættere på at reducere antallet af forsøgsdyr, der anvendes til screening af BBB transcytosis for potentielle therapeutics.

Den neurovaskulære enhed er sammensat af neuroner, astrocytter og BBB, dannet af indviklede forbindelser mellem pericytes, astrocytter, endotelceller, og den tilknyttede basalmembranen danner hjernen microvasculature1. Denne stramme cellulære væg dannet af kontinuerlig, nonfenestrated fartøjer fint regulerer bevægelse af ioner og molekyler (herunder hormoner, næringsstoffer eller stoffer), men også af cirkulerende celler1. Den specielt lave transcytosis gennem BBB af høj molekylvægt molekyler, som terapeutisk antistoffer, drug konjugater eller nanocompounds, begrænser dramatisk fremskridtene inden for drug discovery for neurologiske sygdomme, herunder maligne gliomer2. Faktisk, oralt eller intravenøst leveret kemoterapier nå hjernen parenkym ofte ved utilstrækkeligt lave koncentrationer til at fremkalde en antitumor effekt eller simpelthen ikke kan krydse BBTB for at nå de neoplastiske celler3. Flere prækliniske og kliniske undersøgelser ikke har behandlet spørgsmålet om BBTB penetration men har forsøgt at forstyrre BBTB forbigående, for eksempel ved hjælp af fokuseret ultralyd4,5, eller at omgå det ved direkte i situ levering af medicin6. Ingen af disse teknikker var imidlertid at modvirke den uundgåelige tumor udvidelse eller tilbagefald. Derfor, når de udvikler nye antiglioma behandlingsformer, diffusion gennem BBTB bør betragtes som en af de afgørende aspekter for den succesrige levering af terapeutiske agenter7.
På grund af den meget komplekse karakter af celle interaktioner inden for BBTB synes in vivo-undersøgelser i forsøgsdyr at være det oplagte valg, når man studerer passagen af molekyler fra blod til hjernen. High-skala in vivo metoder er dog relativt kompliceret at etablere og, derfor, ikke tillader high throughput screening af molekyler i en rimelig tid til en rimelig pris. Endnu vigtigere, har dyreforsøg at følge 3R etiske retningslinje defineres som i) Præciser, ii) reducere og af relevans for den aktuelle kontekst, iii) erstattes af alternative protokoller (f.eks. i vitro/i siliciummangan metoder). Derfor, genskabe den in vitro-BBTB vises som en interessant og attraktiv mulighed, men det udgør også en kompleks opgave udfordret af forskellige begrænsninger. Mange forsøg på at genskabe denne komplekse rum med kulturperler primærelementer eller cellelinjer fra hunde, svin, murine, og selv menneskets oprindelse er offentliggjort (som gennemgået af Rahman et al.8 og Helms et al.9). Disse modeller omfatter tre-dimensionelle mikrofluid systemer10, BBB-on-a-chip11,12, og skarer af varianter baseret på de klassiske Co kulturer i indsætter systemer. Aktuelle mikrofluid og chip systemer er dog enten ikke egnet til hurtig og høj overførselshastighed stof-validering undersøgelser13,14 eller er i øjeblikket uforenelig med undersøgelser af medicinafgivelse til hjernetumorer. Desuden gennemgang af 155 offentliggjort modeller bruger primærelementer, inducerbar pluripotente stamceller (iPSC) eller kommercielle cellelinjer alle Co kulturperler på skær viste en tendens til interstudy forskel i deres målinger og/eller konklusioner8. Denne mangel på sammenlignende reproducerbarhed kunne være korreleret med i) nonnormalized kultur betingelser, for eksempel med den valgfri belægning med basalmembranen matrix proteiner i celle kultur fartøjer, ii) et øget antal subkultur og skik af serum-holdige medier, både store førere af genetiske og fænotypiske ændringer af celle linier15, eller iii) svært at reproducerbar genskabe den rette balance mellem astroglial og endotel komponenter i et fad. Selv om brugen af udødeliggjort celler eller kommercielle celle linjer for at etablere en in vitro-BBB model mangler nogle af egenskaberne i forhold til lignende modeller, der kun bruger primærelementer, i den beskrevne metode viser vi, at den rette kombination af celler udstillinger en meget sammenlignelige resultater til offentliggjort undersøgelser i andre modeller af reference16,17. Til sidst, motiveret manglen på en robust og reproducerbare model at studere passage af terapeutiske forbindelser målretning hjernetumorer gennem BBTB os til at udvikle de metoder, der beskrives her.
Da målet var at bruge modellen til at forudsige in vivo levering af nanopartikler i prækliniske dyremodeller, valideres vi først BBTB modellen ved at udnytte skær murine endothelial celler i kontakt med murine astrocytter. Ud over dette optimeret vi også model for at bruge visse menneskelige cellelinjer. Når stabiliseret, er celle barrierer overført til kulturer med patienten-afledte glioblastom kugler eller kommercielle gliom cellelinjer. Transcytosis af nanopartikler og tumor celle målretning kan derefter visualiseres ved Konfokal mikroskopi og kvantificeres ved indsamling af prøver over tid. Vigtigere, kunne resultater, der opnås ved hjælp af BBTB efterligner pålideligt forudsige funktionsmåden af nanopartikler in vivo, støtter brugen af BBTB efterligne forudgående prækliniske valideringen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1761px;" width="1761">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:1761px;">Cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">bEND3</td>
			<td style="width:239px;">ATCC</td>
			<td style="width:273px;">CRL-2299</td>
			<td style="width:961px;">Cultured in: DMEM (1g/L glucose) supplemented with 10% FBS, 5 mL L-glutamine and 5 mL penicillin/streptomycin</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">HIFko immortalized mouse astrocytes</td>
			<td style="width:239px;">Isolated in Dr. Gabriele Bergers Lab</td>
			<td style="width:273px;">https://doi.org/10.1016/S1535-6108(03)00194-6</td>
			<td style="width:961px;">Cultured in: BME-1 supplemented with 5% FBS, 5 mL 1 M HEPES, 5 mL 100 mM sodium pyruvate, 3 g D-glucose and 5 mL penicillin/streptomycin</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">HuAR2T</td>
			<td style="width:239px;">Isolated in Dr. Dagmar Wirth Lab</td>
			<td style="width:273px;">https://doi.org/10.1089/ten.tea.2009.0184</td>
			<td style="width:961px;">Cultured in: EBM-2 with SupplementMix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">normal human primary astrocytes</td>
			<td style="width:239px;">Lonza</td>
			<td style="width:273px;">CC-2565</td>
			<td style="width:961px;">Cultured in: ABM with SingleQuots</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:1761px;">Material and reagents</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100x17mm Dish, Nunclon Delta</td>
			<td style="width:239px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td>150350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">10 mL serological pipet</td>
			<td style="width:239px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:273px;">170361</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">15mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:239px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:273px;">339650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">ABM Basal Medium, 500 mL</td>
			<td style="width:239px;">Lonza</td>
			<td style="width:273px;">CC-3187</td>
			<td>For primary human astrocytes. ABM+: contains all the additives from the supplement mix. ABM-:all the additives except for rhEGF and FBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Accutase Cell Detachment Solution</td>
			<td style="width:239px;">Corning</td>
			<td style="width:273px;">25-058-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">AGM SingleQuots Supplements and Growth Factors</td>
			<td style="width:239px;">Lonza</td>
			<td>CC-4123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">B27 supplement</td>
			<td style="width:239px;">Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>for both GBM + and - medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Basal Medium Eagle</td>
			<td style="width:239px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:273px;">21010046</td>
			<td>BME-1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Corning Costar TC-Treated 6-Well Plates</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:273px;">CLS3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">Corning Transwell polyester membrane cell culture inserts</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:273px;">CLS3452&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">D-glucose</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:273px;">G8270</td>
			<td>dissolve in 50 mL of BME-1 and sterile filter before adding to the medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium/Nutrient F-12 Ham</td>
			<td style="width:239px;">Gibco</td>
			<td>21331-020</td>
			<td>Specific to the culture of the patient-derived spheres isolated in our lab, may vary for other glioma cell lines</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EBM-2 growth Medium SupplementMix</td>
			<td style="width:239px;">PromoCell</td>
			<td style="width:273px;">c-39216</td>
			<td>EBM+: contains all the additives from the supplement mix. EBM-:all the additives except for VEGF-A and FBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Endothelial Basal Medium 2 (EBM-2)</td>
			<td style="width:239px;">PromoCell</td>
			<td style="width:273px;">c-22211</td>
			<td>EBM+: contains all the additives from the supplement mix. EBM-:all the additives except for VEGF-A and FBS</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:288px;">Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin</td>
			<td style="width:239px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:273px;">10500056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Fluorescein sodium salt</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:273px;">F6377</td>
			<td style="width:961px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Greiner CELLSTAR 96 well plates</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:273px;">Greiner 655090</td>
			<td>black polystyrene wells flat bottom (with micro-clear bottom)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">Menzel-Gl&#228;ser 0.9 cm round borosilicate Cover Slips</td>
			<td style="width:239px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:273px;">10313573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">PBS tablets</td>
			<td style="width:239px;">Medicago</td>
			<td>09-9400-100</td>
			<td>one tablet per liter of dH2O, then sterilize the solution by autoclaving</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Poly-D-lysine hydrobromide</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6407&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Recombinant Human EGF</td>
			<td style="width:239px;">Peprotech</td>
			<td style="width:273px;">GMP100-15</td>
			<td>for GBM+ medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.)</td>
			<td style="width:239px;">Peprotech</td>
			<td style="width:273px;">100-18B</td>
			<td>for GBM+ medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Immunofluorescence</td>
			<td style="width:239px;"></td>
			<td style="width:273px;"></td>
			<td style="width:961px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:273px;">158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;width:288px;">24 x 60 mm microscope slide cover glass</td>
			<td style="width:239px;">ORSAtec</td>
			<td style="width:273px;">0224601-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:288px;">AlexaFluor 488 and 594 secondary antibodies</td>
			<td style="width:239px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:273px;"></td>
			<td>dilution: 1/500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Anti-Claudin-5 antibody</td>
			<td style="width:239px;">Abcam</td>
			<td style="width:273px;">ab15106</td>
			<td>dilution: 1/150</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Anti-GFAP antibody clone GF5</td>
			<td style="width:239px;">Abcam</td>
			<td style="width:273px;">ab10062</td>
			<td>dilution: 1/150</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">Anti-Mouse CD31&#160;antibody Clone MEC 13.3</td>
			<td style="width:239px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:273px;">550274</td>
			<td>dilution 1/800</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Anti-SV40 T-antigen antibody</td>
			<td style="width:239px;">Abcam</td>
			<td style="width:273px;">ab16879</td>
			<td>dilution: 1/150</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Anti-Zonula Occludens-1</td>
			<td style="width:239px;">Abcam</td>
			<td style="width:273px;">ab96587</td>
			<td>dilution: 1/200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">DAPI</td>
			<td style="width:239px;">TOCRIS</td>
			<td style="width:273px;">5748</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">Fluoromount Aqueous Mounting Medium&#160;</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:273px;">F4680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">LysoTracker Red DND-99</td>
			<td style="width:239px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:273px;">L7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Animal procedures</td>
			<td style="width:239px;"></td>
			<td style="width:273px;"></td>
			<td style="width:961px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">10 cm curved dissecting scissors</td>
			<td style="width:239px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:273px;">14394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">BD Microlance 25-gauge needles</td>
			<td style="width:239px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:273px;">300600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Fine Forceps (12.5 cm)</td>
			<td style="width:239px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:273px;">503283</td>
			<td>for tissue dissociation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Intramedic Polyethylene tubing PE20</td>
			<td style="width:239px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:273px;">427406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Ketaminol vet 50 mg/mL</td>
			<td style="width:239px;">Intervet</td>
			<td style="width:273px;">Vnr511485</td>
			<td>Ketamine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Mains Powered microdrill</td>
			<td style="width:239px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:273px;">503599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">Menzel-Gl&#228;ser 0.5 cm round borosilicate Cover Slips</td>
			<td style="width:239px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:273px;">11888372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Micro Bulldog clamp</td>
			<td style="width:239px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:273px;">14119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">Physiological saline solution</td>
			<td style="width:239px;">Mustela</td>
			<td style="width:273px;">Sterile single dose vials 20 x 5 mL / 40 x 5 mL - Medical device class</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Rochester-Oschner forceps</td>
			<td style="width:239px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:273px;">501709</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Rompun vet 20 mg/mL</td>
			<td style="width:239px;">Intervet</td>
			<td style="width:273px;">Vnr148999</td>
			<td>Xylazine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Stereotaxic adapter</td>
			<td style="width:239px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:273px;">502063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Sugi Sponge Points</td>
			<td style="width:239px;">Kettenbach</td>
			<td style="width:273px;">31603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Equipment</td>
			<td style="width:239px;"></td>
			<td style="width:273px;"></td>
			<td style="width:961px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">Axio Zoom.V16 fluorescence stereo zoom microscope&#160;</td>
			<td style="width:239px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:273px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">FLUOstar Omega microplate reader</td>
			<td style="width:239px;">BMG Labtech</td>
			<td style="width:273px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">ORCA-Flash 4.0 digital sCMOS camera</td>
			<td style="width:239px;">Hamamatsu Photonics</td>
			<td style="width:273px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Universal 320 tabletop centrifuge&#160;</td>
			<td style="width:239px;">Hettich</td>
			<td style="width:273px;">Cat. No. 1401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">ZEISS LSM 880 with Airyscan confocal microscope</td>
			<td style="width:239px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:273px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

predicting in vivo payloads delivery using a blood-brain tumor-barrier in a dish

Yderst selektive natur, blod - hjerne barrieren (BBB) er afgørende for hjernen homøostase i fysiologiske forhold. Men i forbindelse med hjernetumorer, BBB molekylære selektivitet også skjolde de neoplastiske celler ved at blokere for leveringen af perifert administreret kemoterapier. Udvikling af nye stoffer (herunder nanopartikler) målretning maligne hjernetumorer ideelt kræver brug af prækliniske dyremodeller for at studere stoffet transcytosis og antitumor virkning. For at overholde princippet om 3R (forfine, begrænse og erstatte) for at reducere antallet af forsøgsdyr i eksperimentel opsætning og udføre high throughput screening af et stort bibliotek af antitumor agenter, udviklede vi en reproducerbar in vitro-menneskelige og murine efterligner af blod-hjerne tumor-barriere (BBTB) ved hjælp af tre-lags kulturer i endothelial celler, astrocytter, og patienten-afledte glioblastom kugler. For større skalerbarhed og reproducerbarhed, har kommercielle cellelinjer eller udødeliggjort celler været anvendt i skræddersyede betingelser for at tillade dannelsen af en barriere, der ligner de faktiske BBB. Her beskriver vi en protokol for at opnå en BBTB efterligner ved dyrkning af endothelceller kontakt med astrocytter ved specifikke celle tætheder på skær. Denne BBTB efterligner kan eksempelvis bruges til kvantificering og konfokal billeddannelse af nanopartikel passage gennem i endothelial og astrocytic barrierer, ud over evaluering af tumor celle målretning inden for den samme analyse. Vi viser desuden, at de opnåede data kan bruges til at forudsige funktionsmåden af nanopartikler i prækliniske dyremodeller. I et bredere perspektiv, denne in vitro model kunne tilpasses til andre neurodegenerative sygdomme til bestemmelse af passage af nye terapeutiske molekyler gennem BBB og/eller suppleres med hjernen organoids direkte evaluere effekten af narkotika.

Konfokal billeddannelse af murine BBTB efterligner viser udtryk og cellulære lokalisering af stram vejkryds proteiner zonula occludens-1 (ZO-1) og claudin-5 i bEND3. Kontakter mellem i endothelial celler og astrocytter induceret klart flytning af ZO-1 og claudin-5 i endothelial celle-celle kontakter i forhold til bEND3 monokulturer (fig. 1 d). Med immunofluorescens farvning for at visualisere GFAP-udtrykker astrocytter på hjernen-side af membranen, er det muligt at observere og studere astrocytic processer og ende-fødder at kontakte i endothelial celler gennem membran (figur 1E ). Astrocyte-endotel celle kontakter er kendt for at fremme og stabilisere stramning af den cellulære barriere og er forbundet med lavere permeabilitet værdier for BBB19. Efter at vi observeret et betydeligt fald i permeabilitet af mus BBTB efterligner for Na-Fl fra 27.63 (± 3,45) x 10-6 cm/s i tilfælde af monokulturer til 6.74 (± 3.01) x 10-6 cm/s når Co kulturperler med hypoxi-inducerbar faktor knock ud (HIFko) astrocytter (tabel 1). Den udødeliggjort HuAR2T danner meget gennemtrængelig cellulære barrierer (104.92 ± 27,1 x 10-6 cm/s, tabel 1). Svarende til den murine model, vi målte betydeligt lavere permeabilitet af BBTB til Na-Fl, nemlig 47.4 (± 14.32) x 10-6 cm/s, når HuAR2T cellerne var Co kulturperler med de menneskelige primære astrocytter (tabel 1).
I både murine og menneskelige BBTB efterligner induceret tilstedeværelsen af patient-afledte glioblastom kugler en svag stigning i permeabilitet værdier i forhold til i endothelial celle-astrocyte Co kulturer alene (tabel 1). Dette fænomen er observeret med flere, men ikke alle af de tålmodige gliom sfære modeller. Dette kan skyldes den VEGF-A, der udskilles af nogle af disse patient-afledte celler.
For at sammenligne permeabilitet værdier af in vitro-BBTB efterligner med in vivo BBB, filmede vi real-time udbredelsen af Na-Fl gennem et kranie vindue implanteret i nøgen mus. Ved hjælp af et fluorescens stereomikroskop, blev Na-Fl diffusion fra blodkar kapillærer fra de vigtigste pial blodkar indspillet før, under og efter systemisk injektion af sonde (figur 2 c). Målinger af differential fluorescens værdier fra den cirkulerende blod og hjerne kortikale parenkym over tid tillod os at beregne de omtrentlige permeabilitet værdier af nøgen musen's BBB for Na-Fl (5,57 ± 2.19 x 10-6 cm/s, Tabel 1).
For at illustrere, hvordan denne BBTB efterligner kan anvendes til visualisering af passage af stoffer fra blodet side til hjernen side, sammenlignede vi transcytosis ø 110 nm (NP110) og ø 350 nm (NP350) nanopartikler målretning patient-afledte glioblastom kugler. Resultater opnået i vitro blev derefter sammenlignet med den in vivo transcytosis. I eksemplet præsenteres nanopartikler var overfladen belagt med tumor-targeting peptid CooP20 og fyldt med den fluorescerende farvestof (FITC) at lette visualisering. Vi mærket celler ved hjælp af den lysosomale farvestof og counterstained med DAPI 24 timer efter tilsætning af FITC nanopartikler i blod-side af BBTB efterligner og erhvervet Konfokal micrographs på forskellige niveauer (f.eks. blod side, membranen, hjernen side, og patienten glioblastom kugler) (figur 3A). Den NP110-associerede fluorescerende signal colocalized med lysosomer i endothelial celler, astrocytter og tumor celler. Derudover NP110s blev opdaget i-mellem i endothelial celler og astrocytter, passerer gennem membranen porerne i Indsæt (figur 3A).
Passage af NP110s var kvantificeres ved at måle fluorescens fra prøver, der opsamlet fra både blod og hjerne side. Disse permeabilitet værdier blev sammenlignet med dem bestemmes for nanopartikler af ø 350 nm (NP350). Resultaterne viser, at kun NP110 var i stand til at krydse BBTB efterligner (figur 3B). NP350 forblev på blod-siden af BBTB efterligner, hvilket resulterede i lavere permeabilitet værdier for disse nanopartikler.
For at understrege relevansen af BBTB efterligner i forhold til in vivo modeller, blev nøgen mus intravenøst injiceret med NP110 eller NP350 nanopartikler belagt med tumor-targeting peptid CooP og konjugeret med rødt fluorescerende farvestof (TRITC) til påvisning. Væv, der opsamlet på flere tidspunkter afslørede, at efter 8 h, BBB-gennemtrængelige nanopartikler har behovet i hjernen parenkym, mens den nonpermeable dem, der opholdt sig i omløb var hovedsagelig ryddet fra systemisk cirkulation in vivo. Derfor, vi har indsamlet hjerner og kvantificeret antallet af nanopartikler pr. kvadrat millimeter 8 h postinjection. I overensstemmelse med den in vitro-resultater, NP110, men ikke NP350, med held behovet i hjernen parenkym (figur 3 c). Høj forstørrelse billeddannelse af nanopartikel placering i hjernen viste at NP110 var ensartet fordelt i hjernen parenkym udenfor Blodkapillærer og med held homed implanterede glioblastom celler (figur 3D). Trods udstiller den samme tumor målretning gruppe (CooP), NP350 var ikke i stand til at extravasate i hjernen parenkym og blev kun påvist i den luminale side af hjernen blodkar (figur 3), svarende til de opnåede in vitro-. resultater
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59384/59384fig1.jpg"> Figur 1: Beskrivelse af modellens blod-hjerne tumor barriere (BBTB). (A) skematisk gengivelse af placeringen af forskellige celletyper. (B) Illustration af Indsæt placeringen på dækslet til 6-godt plade og den såning teknik til astrocytter i hjernen side af Indsæt's membran. (C) Illustration af den 6-godt plade placering tillader astrocyte vedhæftning. (D) immunofluorescens micrographs af stram vejkryds proteiner zonula occludens-1 (ZO-1, øverste række, red) og claudin-5 (nederste række, grønne). Protein udtryk er i forhold til murine hjernen mikrovaskulære endotelceller (bEND3) kulturperler i blod side af BBTB alene som en monokultur (venstre kolonne) eller med murine udødeliggjort HIFko astrocytter (højre kolonne). Cellekerner er counterstained med DAPI (blå). (E) immunofluorescens Mikrograf viser den glial fibrillære sure protein (GFAP, red) i HIFko astrocytter kulturperler på hjernen side af BBTB. Høj forstørrelse billede viser astrocyte processer og ende-fødder (pile) at kontakte i endothelial celler gennem membranen porer (højre panel). HIFko astrocytter identitet blev bekræftet ved immunfluorescens farvning af den simian virus 40 store T antigen (SV40 store T, grøn) bruges til immortalization af celler. Endotelceller express hverken GFAP eller SV40 stort T, og derfor kan være delvist observeret gennem den gennemsigtige, modsatte side af membranen som kun DAPI-farvede celler (stiplet linje). Cellekerner er counterstained med DAPI (blå). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59384/59384fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59384/59384fig2.jpg"> Figur 2: Intravital live bestemmelse af musen BBB permeabilitet. (A) forberedelse af implantabelt caudale vene kateter. (1) værktøj og udstyr, er følgende: (et) en PE20 polyethylen rør (b) to 25 G nåle (c) Rochester-Ochsner pincet, og (d) en lille bulldog klemme. (2) en 25 G kanyle er fjernet af flere torsions ved hjælp af pincet og (3) omhyggeligt indsat i røret. (4) anden siden af røret er tilsluttet en anden 25 G kanyle. (B) vejledning til kateter implantation og placering til at indgyde natrium-fluorescein løsning gennem halen venen på en mus. Kredsede området angiver det område, hvor en dråbe Cyanocrylat lim er placeret til at sikre kateteret. Bulldog klemme bruges til at håndtere kateteret og fjernet når kateteret er sikret. (C) repræsentative imaging og kvantificering metode til at afgøre, natrium-fluorescein permeabilitet værdier. Før natrium-fluorescein infusion (venstre kolonne) måles autofluorescence/blank indenfor en region af interesse (ROI) placeret på hjernen (øverste panel, hvide rektangel) og blodkar områder (nederste panel, røde rektangel). Under natrium-fluorescein infusion (højre kolonne), er fluorescens-intensiteten målt i både ROIs, giver beregningen af BBB permeabilitet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59384/59384fig2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59384/59384fig3.jpg"> Figur 3: forudsigelse af nanopartikler gennem BBB in vivo, in vitro-BBTB modellen intracerebralt transcytosis. (A) grafisk repræsentation af BBTB analysen med repræsentative Konfokal billeder fremstilles på de angivne forskellige niveauer af murine BBTB model. Nanopartikler af 110 nm i diameter (NP110) og konjugeret til FITC (grøn) blev føjet til blodet side af BBTB celler blev mærket med lysosomale sonden (LT-99, red).  (1) Endothelial celler, (2) Endothelial transcytosis af nanopartikler gennem porerne i membran (hvide stiplede linje), (3) astrocytter, og (4) patient glioblastom kugler er identificeret på grafiske og tilsvarende Konfokal micrographs (til højre). Lysosomale indkapsling af nanopartikler (pile) foreslår aktive transcytosis gennem endotel og astrocyte lag af BBTB. (B) kvantificering af de angivne nanopartikel permeabilitet gennem in vitro-BBTB (n = 6). (C) kvantificering af den angivne nanopartikel tæthed i hjernevæv sektioner, 8 h efter caudale vene infusion af nøgen mus (n = 3). (D) Konfokal micrographs viser fordelingen af ø 110 nm nanopartikler (NP110, red) i murine hjernen væv sektioner mærket med en anti-mus CD31 antistof (grøn). Pilen fremhæver nanopartikel transcytosis (venstre panel). Nanopartikler akkumuleret omkring hjernen tumorceller (tumor, højre panel) på grund af den CooP-targeting peptid præsenteret på deres overflade. Ingen betydelig homing er observeret i hjernevæv (hjernen). (E) Konfokal micrographs viser fordelingen af ø 350 nm nanopartikler (NP350, red) i murine hjernen væv sektioner mærket med en anti-mus CD31 antistof (grøn). Pilespidser punkt til den NP350s, der blev bevaret i blodkar lumen og var ude af stand til at krydse BBB, sandsynligvis på grund af deres større diameter sammenlignet med NP110s. cellekerner er counterstained med DAPI (blå). P < 0,01. P-værdier blev beregnet ved hjælp af en to-sidet, ikke-parametrisk Mann-Whitney U test. Fejllinjer udgør standardafvigelsen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59384/59384fig3large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>murine BBTB efterligner</td>
			<td>bEND3</td>
			<td>bEND3 + HIFko som</td>
			<td>bEND3 + GB</td>
			<td>bEND3 + HIFko som + GB</td>
			<td>In vivo</td>
		</tr>
<tr>
<td>Permeabilitet (10-6 cm/s)</td>
			<td>27.63</td>
			<td>6.74</td>
			<td>26,8</td>
			<td>10.83</td>
			<td>5.57</td>
		</tr>
<tr>
<td>SD (10-6 cm/s)</td>
			<td>3,45</td>
			<td>3.01</td>
			<td>7,99</td>
			<td>2,65</td>
			<td>2.19</td>
		</tr>
<tr>
<td>menneskelige BBTB efterligner</td>
			<td>HuAR2T</td>
			<td>HuAR2T + hIAs</td>
			<td>HuAR2T + GB</td>
			<td>HuAR2T + hIAs + GB</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Permeabilitet (10-6 cm/s)</td>
			<td>104.92</td>
			<td>47.4</td>
			<td>89.08</td>
			<td>48.24</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>SD (10-6 cm/s)</td>
			<td>27.1</td>
			<td>14.32</td>
			<td>10,21</td>
			<td>13.07</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: værdier af natrium-fluorescein (Na-Fl) permeabilitet (i centimeter i sekundet) bestemmes in vitro- i de angivne Co kultur systemer og in vivo i NMRI nøgen mus. Data fra en repræsentativ eksperiment (n = 3 mus).

Watch this Scientific Journal Video about Predicting In Vivo Payloads Delivery using a Blood-brain Tumor-barrier in a Dish at JoVE.com

Predicting In Vivo Payloads Delivery using a Blood-brain Tumor-barrier in a Dish

Forudsigelse i Vivo nyttelast levering ved hjælp af en blod-hjerne Tumor barriere i et fad

Drug målretning til centralnervesystemet tumorer er en stor udfordring. Her beskriver vi en protokol for at producere en in vitro-efterligner af blod-hjerne tumor-barrieren ved hjælp af murine og/eller menneskelige celler og diskutere deres relevans for forudsigelighed af centralnervesystemet tumor målretning in vivo.

Highly selective by nature, the blood-brain barrier (BBB) is essential for the brain homeostasis in physiological conditions. However, in the context of ...

For at udvikle nye lægemidler og forbindelser, der er målrettet tumorer i centralnervesystemet, tilgængeligheden og passage gennem blod - hjerne barrieren er meget vigtigt. Selv om cytotoksicitet af forbindelserne let kan måles ved at inkubere cellerne med de terapeutiske molekyler, det ikke rigtig fortælle noget om den faktiske levering til tumor site i hjernen. For at løse dette problem, vi udviklet følgende protokol, der beskriver, hvordan man genskaber blod - hjerne tumor barriere in vitro på en skål.Brugen af udødeliggjorte celler af murin eller menneskelig oprindelse gør denne analyse meget fleksibel. Det kan også nemt skaleres op til skærmen snesevis af forbindelser med høj reproducerbarhed. Desuden giver denne metode mulighed for både kvantificering og visualisering af forbindelsernes passage og målretningsevne, før du fortsætter med prækliniske modeller.Derfor erstatter vores metode delvist dyremodellerne ved hjælp af de forud fastsatte cellelinjer. Inddragelse af patient-afledte hjernetumor celler analyserer patienten heterogenitet, mens brugen af udødeliggjorte celler til at etablere blod - hjerne barrieren sikrer reproducerbarheden af resultaterne. Alt i alt, denne blod - hjerne barriere model tilbyder en virkelig interessant værktøj til at analysere stoffet diffusion eller levering af narkotika køretøjer.Visuel demonstration af metoden er kritisk, fordi såning af cellerne på den modsatte side af indsatsen kræver manipulation, der ikke ofte er beskrevet i andre protokoller ved hjælp af lignende opsætning. For eksempel, at opnå vedhæftning af astrocytter, når indsatsen er placeret på hovedet meget fordele fra visuel repræsentation. Under en steril cellekulturhætte vaskes de dyrkede astrocytter omhyggeligt med fem milliliter steril PBS.Brug en vakuumpumpe til forsigtigt at kassere PBS, og tilsæt to milliliter celle dissociation reagens i fem minutter for at løsne cellerne. Derefter tilsættes 10 milliliter steril komplet astrocytcellekulturmedium til fartøjet for at hæmme aktiviteten af cellegensociationsreagenset. Brug en steril serologisk pipette til at overføre de fritliggende celler fra beholderen til et sterilt 15-milliliterrør.Centrifuge ved 250 gange g i tre minutter ved stuetemperatur. I mellemtiden, der er fastsat skær. Brug sterile kraftbefædre til at placere skær med hjernen side op på låget af en steril seks-brønd plade.Når centrifugeringen er færdig, skal supernatanten forsigtigt kasseres fra cellesuspensionen, og den genopliver astrocytpellet i en milliliter ABM-plus ved forsigtigt at pipettere pellet på rørets væg op til fem gange. Derefter tælle cellerne, og justere celle suspension tæthed til 150, 000 celler i 400 mikroliter AF ABM-plus pr indsætte. Placer cellesuspensionen ind i midten af hjernens side af indsatsens membran, og spred den forsigtigt med kapillær kraft med en steril pipettespids.Når hjernesiden af skærne stadig er oppe, skal du placere den seks-brønds plade tilbage på indsatserne. Placer pladen og skær, med hjernen side op, i en kuvøse ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid for at give mulighed for celle vedhæftning. Herefter vendes den seks-brønds plade tilbage til sin normale position, med skær nu blodsiden op.Tilføj mediet, og fortsæt inkubationen som beskrevet i tekstprotokollen. Under en steril cellekulturhætte vaskes de dyrkede endotelceller omhyggeligt med fem milliliter steril PBS. Brug en vakuumpumpe til forsigtigt at kassere PBS, og tilsæt to milliliter celle dissociation reagens i fem minutter for at løsne cellerne.Derefter tilsættes 10 milliliter steril komplet endotelcellekulturmedium til beholderen for at hæmme aktiviteten af celleafskævningen reagens. Brug en steril serologisk pipette til at overføre de fritliggende celler fra beholderen til et sterilt 15-milliliterrør. Centrifuge ved 250 gange g i tre minutter ved stuetemperatur.Derefter kasseres supernatanten, og opsallende endotelcellepellet i en milliliter EBM-plus ved langsomt at pipettere celleaffjedringen på rørets væg op til fem gange. Tæl cellerne, og juster cellesuspensionstætheden til 200.000 celler i 2,5 milliliter endotelcellekultur uden serum og vaskulær endotelvækstfaktor-A pr. skær. Hent den plade, der indeholder indsatserne.Kassér forsigtigt mediet fra blodsiden, og udskift det med de 2,5 milliliter endotelcellesuspension. Derefter returneres pladen til inkubatoren, og lad den gå over natten over for at lade endotelcellerne holde sig til membranen. Den næste dag, forberede en seks-brønd plade ved at overføre tre milliliter forvarmt ABM-minus til hver brønd.Brug sterile kraftbecer til at håndtere indsatsen for forsigtigt at kassere etdotelheltmediet fra blodsiden, og skært sættes i den nye plade, der indeholder ABM-minus. Derefter tilsættes 2,5 milliliter EBM-minus. Lad indsatsen i rugemaskinen med minimal fysisk forstyrrelse eller temperaturvariation i fem dage.På overførselsdagen skal mediet udskiftes. For immunfluorescens billeddannelse, placere op til fire runde sterile borosilikat coverslips i hver brønd af en seks-brønd plade, der indeholder to milliliter poly-D-lysin. Inkuber ved stuetemperatur i 30 minutter.I mellemtiden skal du bruge en steril serologisk pipette til omhyggeligt at overføre tumorkuglerne fra cellekulturbeholderen til et 15-milliliter sterilt rør. Centrifuge tumor kugler på 250 gange g i tre minutter. Kassér supernatanten, og opslæmm forsigtigt kuglerne i en milliliter GBM-minus.Tæl cellerne, og juster celletætheden til ca. 10.000 kugler eller 100.000 celler pr. milliliter GBM-minus. Dernæst kasseres poly-D-lysin fra brøndene, og skyl brøndene tre gange med steril PBS. Frø hver brønd af pladen med tre milliliter af tumor sfæroid suspension, og overføre skær med BBTB efterligne på tumor celle suspension.Inkubere natten over ved 37 grader Celsius med 5% kuldioxid til at tillade blod og hjernetumor sider af analysen at komme til ligevægt. Den næste dag, erstatte medierne i blodsiden med EBM-minus suppleret med molekyler, narkotika, eller nanopartikler af interesse. Prøverne udtages over tid til direkte kvantificering som tidligere beskrevet.Først indsamle 100 mikroliter af mediet fra både blod og hjerne sider af BBTB efterligne, og overføre hver til en separat fladbundet, sort, 96-brønd plade til efterfølgende fluorescens målinger. Dernæst forberede en 50-mikromolar opløsning af natrium fluorescein i EBM-minus, og sørg for at forberede 2,5 milliliter per brønd. Forvarm denne opløsning til 37 grader Celsius, og erstatte medierne fra blodet side af skær med medier, der indeholder denne natrium fluorescein opløsning.Start en timer, så snart mediet er udskiftet. Opsam omhyggeligt 100 mikroliter af medier fra både blod- og hjernesiderne af skærene på fem minutter, 30 minutter, 60 minutter og 120 minutter. Overfør hver prøve til separate brønde af den relevante sorte, 96-brønd plade.Brug en pladelæser til at kvantificere fluorescensen fra de indsamlede prøver. Fortyndes først lysosomstofstofstoffet til den passende arbejdskoncentration i det forvarmte medium. Tilsæt dette til cellerne, og inkubere ved 37 grader Celsius med 5% kuldioxid i 45 minutter.Skyl derefter cellerne tre gange med iskold PBS. Kassér PBS, og tilsæt tre milliliter iskold 4% paraformaldehyd til brøndene og 2,5 milliliter til indsatsen. Inkuber på is i 10 minutter.Derefter kasseres paraformaldehyd, og cellerne skylles tre gange med PBS. Fjern PBS'en, og modstain i cellekernerne ved hjælp af en DAPI-opløsning ved en endelig koncentration på et mikrogram pr. milliliter i destilleret vand. Inkuber ved stuetemperatur i syv minutter.Fjern derefter DAPI, og vask membranerne tre gange med destilleret vand. Skær forsigtigt membranen, fjern det destilleret vand, og læg det på en dråbe monteringsmedium på et glasmikroskop dias. Tilsæt en anden dråbe montering medium på den anden side af membranen, og omhyggeligt dække det med en borosilikat dække glas.I denne undersøgelse, endotelceller blev co-dyrket med astrocytter til at danne en blod - hjerne tumor barriere-lignende interface i en in vitro setup. Konfokal billeddannelse af murine BBTB efterligne viser udtrykket og cellulære lokalisering af den stramme krydset proteiner zonula okklusister-1 og claudin-5 i bEND3. Kontakterne mellem endotelcellerne og astrocytterne inducerer klart flytningen af disse to proteiner til endotelcelle-til-celle-kontakterne sammenlignet med bEND3 monokulturer.Ved hjælp af immunfluorescens farvning til at visualisere GFAP-udtryk astrocytter på hjernen side af membranen, er det muligt at observere og studere de astrocytiske processer og endefødder kontakte endotelceller gennem membranen. For at sammenligne permeabilitetsværdierne for in vitro BBTB efterligner med in vitro-blod-hjerne-barrieren, afbildes realtidsdiffusionen af natriumfluorescein gennem et kranielt vindue implanteret i nøgne mus. Ved hjælp af et fluorescensstermikroskop registreres natriuminfluoresceinspfusion fra blodkarrenes kapillærer fra de vigtigste pial blodkar før, under og efter systemisk injektion af sonden.Transcytose af nanopartikler, der er målrettet patient-afledte glioblastoma kugler er derefter sammenlignet for at illustrere, hvordan denne BBTB efterligne kan bruges til at visualisere passagen af forbindelser fra blodsiden til hjernesiden. NP110-associeret fluorescerende signal co-lokaliserer med lysosomer i endotelceller, astrocytter, og tumorceller. Desuden påvises NP110s mellem endotelceller og astrocytter, der passerer gennem membranporerne i indsatsen.Passagen af NP110s kvantificeres ved at måle fluorescens fra prøver indsamlet fra både blod- og hjernesiden, og disse værdier sammenlignes med de bestemte nanopartikler, der er 350 nanometer. Som det kan ses, kun NP110s er i stand til at krydse BBTB efterligner, mens NP350 forblev på blodsiden, hvilket resulterer i lavere permeabilitet værdier for disse nanopartikler. Håndter indsatsen med forsigtighed, og spred forsigtigt astrocytcelleaffuspensionen på hjernesiden af indsatsen uden direkte kontakt med membranen.Enhver beskadigelse af membranen vil resultere i lækage. Denne metode kan tilpasses til at besvare spørgsmålet om hjernen levering af perifert administreret nyttelast. Ved at bruge forskellige skær med større membran porer, er det også muligt at studere celle ekstravasation.Denne teknik kan ændres ved hjælp af forskellige celletyper til at efterligne andre cellulære barrierer. Det baner også vejen for en mere ansvarlig og etisk forskning, der har til formål at reducere antallet af laboratoriedyr, der anvendes til anti-cancer drug validering. Husk, at paraformaldehyd er et meget giftigt kemikalie og bør håndteres i overensstemmelse hermed.Også, være forsigtig, mens du bruger en skarp skalpel til at udtrække membraner fra skær.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

Det<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginære Disc Tumor Model: Visualisering og Kvantificering af genekspression og tumorindtrængen Brug Genetic Mosaics

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR vurdering af pH, pO2, Redox Status, og koncentrationen af fosfat og glutathion i Tumor mikromiljø

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

Fluorescence Molecular Tomography for In Vivo Imaging of Glioblastoma Xenografts

Fluorescence Molecular Tomography for In Vivo Imaging of Glioblastoma Xenografts

Fluorescens molekylære tomografi for In Vivo billeddannelse af glioblastom Xenografts

Tumorigenicity is the capability of cancer cells to form a tumor mass. A widely used approach to determine if the cells are tumorigenic is by injecting ...

In Vivo Inhibition of MicroRNA to Decrease Tumor Growth in Mice

In vivo hæmning af MicroRNA at mindske tumor vækst i mus

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression through their ability to destabilize mRNA and inhibit translation of target mRNAs. An ...

Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs

Kombineret brug af hale vene metastase assays og Real-Time in vivo billeddannelse at kvantificere brystkræft metastatisk kolonisering og byrde i lungerne

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification ...

In Vivo Targeting of Xenografted Human Cancer Cells with Functionalized Fluorescent Silica Nanoparticles in Zebrafish

I Vivo Målretning af Xenografted humane kræftceller med funktionaliserede fluorescerende Silica nanopartikler i zebrafisk

Developing nanoparticles capable of detecting, targeting, and destroying cancer cells is of great interest in the field of nanomedicine. In vivo animal ...

Using Computer-based Image Analysis to Improve Quantification of Lung Metastasis in the 4T1 Breast Cancer Model

Brug computer-baseret billedanalyse til at forbedre kvantificeringen af lungemetastase i 4T1 Breast Cancer Model

Breast cancer is a devastating malignancy, accounting for 40,000 female deaths and 30% of new female cancer diagnoses in the United States in 2019 alone. ...

Patient-Derived Tumor Explants As a "Live" Preclinical Platform for Predicting Drug Resistance in Patients

Patient-afledt tumor explants som en "Live" præklinisk platform til forudsigelse af resistens hos patienter

An understanding of drug resistance and the development of novel strategies to sensitize highly resistant cancers rely on the availability of suitable ...

Evaluation of the In vivo Antitumor Activity of Polyanhydride IL-1&#945; Nanoparticles

Evaluation of the In vivo Antitumor Activity of Polyanhydride IL-1ÃƒÅ½Ã‚Â± Nanoparticles

Evaluering af in vivo antitumoraktivitet af polyanhydrid IL-1α nanopartikler

Cytokine therapy is a promising immunotherapeutic strategy that can produce robust antitumor immune responses in cancer patients. The proinflammatory ...

Longitudinal Intravital Imaging Through Clear Silicone Windows

Langsgående intravital billeddannelse gennem klare silikonevinduer

Intravital microscopy (IVM) enables visualization of cell movement, division, and death at single-cell resolution. IVM through surgically inserted imaging ...