Name: predicting in vivo payloads delivery using a blood-brain tumor-barrier in a dish
Uploaded: 2019-04-16T14:30:00
Duration: 13 min 34 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Predicting In Vivo Payloads Delivery using a Blood-brain Tumor-barrier in a Dish at JoVE.com

מחקר זה נתמך על ידי מענקים הארגונים סרטן פינית, ג'יין & Aatos Erkko קרן, סיגריד Juselius קרן (פ. ל ו- V.L.J.), הקרן הלאומית למדע שוויצרי (Postdoc.Mobility מתקדם הענק לא: P300PB_164732, ל S. ק') קרן מחקר אוריון (ל. ס. ק), קרן ההנצחה Kuistila מוד (ל. ס. ק), האקדמיה של פינלנד (TERVA 2017, גרנט לא: 314 498). יחידת דימות (הלסינקי) Biomedicum הוא הודה למתן את מיקרוסקופ הדמיה מתקן הליבה.

<ol>
	<li>Daneman, R., Prat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-brain+barrier.">The blood-brain barrier.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (1), a020412 (2015).</li><li>Quail, D. F., Joyce, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Microenvironmental+Landscape+of+Brain+Tumors.">The Microenvironmental Landscape of Brain Tumors.</a> Cancer Cell. 31 (3), 326-341 (2017).</li><li>Wang, Z., Sun, H., Yakisich, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+the+blood-brain+barrier+for+chemotherapy:+limitations,+challenges+and+rising+problems.">Overcoming the blood-brain barrier for chemotherapy: limitations, challenges and rising problems.</a> Anticancer Agents in Medicinal Chemistry. 14 (8), 1085-1093 (2014).</li><li>Alkins, R. D., Brodersen, P. M., Sodhi, R. N., Hynynen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+drug+delivery+for+boron+neutron+capture+therapy+of+brain+tumors+with+focused+ultrasound.">Enhancing drug delivery for boron neutron capture therapy of brain tumors with focused ultrasound.</a> Neuro Oncology. 15 (9), 1225-1235 (2013).</li><li>Alli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brainstem+blood+brain+barrier+disruption+using+focused+ultrasound:+A+demonstration+of+feasibility+and+enhanced+doxorubicin+delivery.">Brainstem blood brain barrier disruption using focused ultrasound: A demonstration of feasibility and enhanced doxorubicin delivery.</a> Journal of Controlled Release. 281, 29-41 (2018).</li><li>Ashby, L. S., Smith, K. A., Stea, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gliadel+wafer+implantation+combined+with+standard+radiotherapy+and+concurrent+followed+by+adjuvant+temozolomide+for+treatment+of+newly+diagnosed+high-grade+glioma:+a+systematic+literature+review.">Gliadel wafer implantation combined with standard radiotherapy and concurrent followed by adjuvant temozolomide for treatment of newly diagnosed high-grade glioma: a systematic literature review.</a> World Journal of Surgical Oncology. 14 (1), 225 (2016).</li><li>Guishard, A. F., Yakisich, J. S., Azad, N., Iyer, A. K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+gap+in+ongoing+clinical+trials+for+glioma.">Translational gap in ongoing clinical trials for glioma.</a> Journal of Clinical Neurosciences. 47, 28-42 (2018).</li><li>Rahman, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalized+endothelial+cell+lines+for+in+vitro+blood-brain+barrier+models:+A+systematic+review.">Immortalized endothelial cell lines for in vitro blood-brain barrier models: A systematic review.</a> Brain Research. 1642, 532-545 (2016).</li><li>Helms, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+of+the+blood-brain+barrier:+An+overview+of+commonly+used+brain+endothelial+cell+culture+models+and+guidelines+for+their+use.">In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 36 (5), 862-890 (2016).</li><li>Wang, J. D., Khafagy, e. l. -. S., Khanafer, K., Takayama, S., ElSayed, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+Endothelial+Cells,+Pericytes,+and+Astrocytes+into+a+3D+Microfluidic+in+Vitro+Model+of+the+Blood-Brain+Barrier.">Organization of Endothelial Cells, Pericytes, and Astrocytes into a 3D Microfluidic in Vitro Model of the Blood-Brain Barrier.</a> Molecular Pharmaceutics. 13 (3), 895-906 (2016).</li><li>Phan, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier-on-a-chip:+Microphysiological+systems+that+capture+the+complexity+of+the+blood-central+nervous+system+interface.">Blood-brain barrier-on-a-chip: Microphysiological systems that capture the complexity of the blood-central nervous system interface.</a> Experimental Biology and Medicine (Maywood). 242 (17), 1669-1678 (2017).</li><li>Bang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Low+Permeability+Microfluidic+Blood-Brain+Barrier+Platform+with+Direct+Contact+between+Perfusable+Vascular+Network+and+Astrocytes.">A Low Permeability Microfluidic Blood-Brain Barrier Platform with Direct Contact between Perfusable Vascular Network and Astrocytes.</a> Scientific Reports. 7 (1), 8083 (2017).</li><li>Wilhelm, I., Krizbai, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+of+the+blood-brain+barrier+for+the+study+of+drug+delivery+to+the+brain.">In vitro models of the blood-brain barrier for the study of drug delivery to the brain.</a> Molecular Pharmacology. 11 (7), 1949-1963 (2014).</li><li>Campisi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+self-organized+microvascular+model+of+the+human+blood-brain+barrier+with+endothelial+cells,+pericytes+and+astrocytes.">3D self-organized microvascular model of the human blood-brain barrier with endothelial cells, pericytes and astrocytes.</a> Biomaterials. 180, 117-129 (2018).</li><li>Pirsko, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Effect+of+Culture+Media+on+Epithelial+Differentiation+Markers+in+Breast+Cancer+Cell+Lines+MCF7,+MDA-MB-436+and+SkBr3.">An Effect of Culture Media on Epithelial Differentiation Markers in Breast Cancer Cell Lines MCF7, MDA-MB-436 and SkBr3.</a> Medicina (Kaunas). 54 (2), (2018).</li><li>Stebbins, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+and+characterization+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+brain+microvascular+endothelial+cells.">Differentiation and characterization of human pluripotent stem cell-derived brain microvascular endothelial cells.</a> Methods. 101, 93-102 (2016).</li><li>Canfield, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+isogenic+blood-brain+barrier+model+comprising+brain+endothelial+cells,+astrocytes,+and+neurons+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">An isogenic blood-brain barrier model comprising brain endothelial cells, astrocytes, and neurons derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Journal of Neurochemistry. 140 (6), 874-888 (2017).</li><li>Cao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-inducible+factor-1alpha+is+involved+in+isoflurane-induced+blood-brain+barrier+disruption+in+aged+rats+model+of+POCD.">Hypoxia-inducible factor-1alpha is involved in isoflurane-induced blood-brain barrier disruption in aged rats model of POCD.</a> Behavioural Brain Research. 339, 39-46 (2018).</li><li>Abbott, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte-endothelial+interactions+and+blood-brain+barrier+permeability.">Astrocyte-endothelial interactions and blood-brain barrier permeability.</a> Journal of Anatomy. 200 (6), 629-638 (2002).</li><li>Kinnari, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+homing+peptide-functionalized+porous+silicon+nanovectors+for+cancer+therapy.">Tumour homing peptide-functionalized porous silicon nanovectors for cancer therapy.</a> Biomaterials. 34 (36), 9134-9141 (2013).</li><li>Levin, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personalized+medicine+in+neuro-oncology.">Personalized medicine in neuro-oncology.</a> CNS Oncology. 5 (2), 55-58 (2016).</li><li>Weathers, S. S., Gilbert, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+Personalized+Targeted+Therapeutics:+An+Overview.">Toward Personalized Targeted Therapeutics: An Overview.</a> Neurotherapeutics. 14 (2), 256-264 (2017).</li><li>O'Duibhir, E., Carragher, N. O., Pollard, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerating+glioblastoma+drug+discovery:+Convergence+of+patient-derived+models,+genome+editing+and+phenotypic+screening.">Accelerating glioblastoma drug discovery: Convergence of patient-derived models, genome editing and phenotypic screening.</a> Molecular and Cellular Neuroscience. 80, 198-207 (2017).</li><li>Kaya, M., Ahishali, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+permeability+in+barrier+type+of+endothelium+in+brain+using+tracers:+Evans+blue,+sodium+fluorescein,+and+horseradish+peroxidase.">Assessment of permeability in barrier type of endothelium in brain using tracers: Evans blue, sodium fluorescein, and horseradish peroxidase.</a> Methods in Molecular Biology. 763, 369-382 (2011).</li><li>Yang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+two+immortalized+cell+lines,+ECV304+and+bEnd3,+for+in+vitro+permeability+studies+of+blood-brain+barrier.">Identification of two immortalized cell lines, ECV304 and bEnd3, for in vitro permeability studies of blood-brain barrier.</a> PLoS One. 12 (10), e0187017 (2017).</li><li>Blouw, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hypoxic+response+of+tumors+is+dependent+on+their+microenvironment.">The hypoxic response of tumors is dependent on their microenvironment.</a> Cancer Cell. 4 (2), 133-146 (2003).</li><li>Argaw, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte-derived+VEGF-A+drives+blood-brain+barrier+disruption+in+CNS+inflammatory+disease.">Astrocyte-derived VEGF-A drives blood-brain barrier disruption in CNS inflammatory disease.</a> Journal of Clinical Investigation. 122 (7), 2454-2468 (2012).</li><li>Miao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF+increases+paracellular+permeability+in+brain+endothelial+cells+via+upregulation+of+EphA2.">VEGF increases paracellular permeability in brain endothelial cells via upregulation of EphA2.</a> The Anatomical Record (Hoboken). 297 (5), 964-972 (2014).</li><li>Heinolainen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGFR3+Modulates+Vascular+Permeability+by+Controlling+VEGF/VEGFR2+Signaling.">VEGFR3 Modulates Vascular Permeability by Controlling VEGF/VEGFR2 Signaling.</a> Circulation Research. 120 (9), 1414-1425 (2017).</li><li>Claesson-Welsh, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+permeability--the+essentials.">Vascular permeability--the essentials.</a> Upsala Journal of Medical Sciences. 120 (3), 135-143 (2015).</li><li>Adriani, G., Ma, D., Pavesi, A., Goh, E. L., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+the+Blood-Brain+Barrier+in+a+3D+triple+co-culture+microfluidic+system.">Modeling the Blood-Brain Barrier in a 3D triple co-culture microfluidic system.</a> Conference Proceedings - IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. 2015, 338-341 (2015).</li><li>Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hCMEC/D3+cell+line+as+a+model+of+the+human+blood+brain+barrier.">The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier.</a> Fluids and Barriers of the CNS. 10 (1), 16 (2013).</li><li>Paatero, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyses+in+zebrafish+embryos+reveal+that+nanotoxicity+profiles+are+dependent+on+surface-functionalization+controlled+penetrance+of+biological+membranes.">Analyses in zebrafish embryos reveal that nanotoxicity profiles are dependent on surface-functionalization controlled penetrance of biological membranes.</a> Scientific Reports. 7 (1), 8423 (2017).</li><li>Prabhakar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimuli-responsive+hybrid+nanocarriers+developed+by+controllable+integration+of+hyperbranched+PEI+with+mesoporous+silica+nanoparticles+for+sustained+intracellular+siRNA+delivery.">Stimuli-responsive hybrid nanocarriers developed by controllable integration of hyperbranched PEI with mesoporous silica nanoparticles for sustained intracellular siRNA delivery.</a> International Journal of Nanomedicine. 11, 6591-6608 (2016).</li><li>Hyvonen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+target+for+peptide-based+imaging+and+treatment+of+brain+tumors.">Novel target for peptide-based imaging and treatment of brain tumors.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 13 (4), 996-1007 (2014).</li><li>Feng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammary-Derived+Growth+Inhibitor+Targeting+Peptide-Modified+PEG-PLA+Nanoparticles+for+Enhanced+Targeted+Glioblastoma+Therapy.">Mammary-Derived Growth Inhibitor Targeting Peptide-Modified PEG-PLA Nanoparticles for Enhanced Targeted Glioblastoma Therapy.</a> Bioconjugate Chemistry. 26 (8), 1850-1861 (2015).</li><li>Nance, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dense+poly(ethylene+glycol)+coating+improves+penetration+of+large+polymeric+nanoparticles+within+brain+tissue.">A dense poly(ethylene glycol) coating improves penetration of large polymeric nanoparticles within brain tissue.</a> Science Translational Medicine. 4 (149), 149rA119 (2012).</li><li>Berg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+nanoparticle+transport+through+in+vitro+blood-brain+barrier+models.">Quantitative analysis of nanoparticle transport through in vitro blood-brain barrier models.</a> Tissue Barriers. 4 (1), e1143545 (2016).</li><li>Noumbissi, M. E., Galasso, B., Stins, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+vascular+heterogeneity:+implications+for+disease+pathogenesis+and+design+of+in+vitro+blood-brain+barrier+models.">Brain vascular heterogeneity: implications for disease pathogenesis and design of in vitro blood-brain barrier models.</a> Fluids and Barriers of the CNS. 15 (1), 12 (2018).</li><li>Heymans, M., Sevin, E., Gosselet, F., Lundquist, S., Culot, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mimicking+brain+tissue+binding+in+an+in+vitro+model+of+the+blood-brain+barrier+illustrates+differences+between+in+vitro+and+in+vivo+methods+for+assessing+the+rate+of+brain+penetration.">Mimicking brain tissue binding in an in vitro model of the blood-brain barrier illustrates differences between in vitro and in vivo methods for assessing the rate of brain penetration.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 127, 453-461 (2018).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

עלייתו של המושג השתנות הגידול interpatient נעורי את המחקר על סרטן אישית רפואה21. ההשתנות מהווה סימן היכר של מערכת העצבים המרכזית neoplasms. בשל הוודאות של הגידול, בתגובה כימותרפיה מוסיף השפעת BBB למשלוח סמים sheltering, ומהווה לגמרי האתגרים העיקריים בחולה22. כדי לפתח טיפולים יעילים יותר, יש לעיתים קרובות צורך ספריות מסך גדול של מולקולות חדשות. כדי להעריך את היעילות antitumor והיכולת של ההפניות טיפולית חדשה כדי להגיע לאתר הגידול, האפשרות הטובה ביותר היא מחקר קליני בתאי נגזר החולה מושתל ויוו לתוך מאתר avatars החולה. בשל מעשי (, זמן, אנושי, ולא מתקן משאבים כספיים) סיבות אתיות (3Rs העיקרון בעת שימוש חיות מעבדה), התפתחות כזו פלטפורמה ההקרנה ויוו בקנה מידה גדול הוא לעתים קרובות לא אפשרי, ומכאן גם את מבחני מבוססת-תא נשארים מודל של הבחירה23. הסיבה העיקרית לבחירת הוקמה שורות תאים, הימנעות ראשי התאים היא להקל את הפארמצבטית ולצמצם את השימוש של חיות מעבדה, אשר הם המקור העיקרי של בידוד והקמת תרבויות מאתר ראשי. השיטות מציגים כאן, ציות בחוזקה 3Rs, יכול ביעילות להתעלם חלקיקים מן נוסף פרה חקירה על criterium של היכולת לחצות את מודל BBTB. בתור הוכחה-של-עיקרון, נתאר כאן שהתקבל במהלך פיתוח, אימות של BBTB הממצאים. הצלחנו לאשר ממצאים במבחנה ויוו, למשל כאשר מדידת פעפוע פסיבי של נתרן-fluorescein Da 376.
פרוטוקול המתוארים במאמר זה מתאר את הכנת תאי אנדותל cocultured עם האסטרוציטים כדי ליצור ממשק דמויי גידול מחסום דם-מוח לפי התקנה במבחנה. לאחר איש קשר פיזי בין סוגי תאים שני אלה הוא הוקם, השכבה תא אנדותל מוצגים קווי דמיון עם BBB (למשל, תא השטח ביטוי של חלבונים צומת חזק, חדירות נמוכה יחסית). מעניין, החיקוי BBTB מאתר נראה לספק ערכי חדירות Na-Fl במיוחד דומים לאלו שהושגו עם העכבר ויוו BBB-חדירות-מידות-24. לכן, הביצועים של מחקה BBTB תקושר ישירות על הבחירה של התאים השתמשו בידיות המכשול. תאי אנדותל bEND3 מקורן במוח, ידועים כדי להיות מוצלחת ויוצרים מחסומים כאשר cocultured האסטרוציטים25. עם זאת, אנחנו כבר משתמש האסטרוציטים HIFko immortalized26 ליצירת לחקות את BBTB. בשל חוסר פקטור היפוקסיה-inducible שלהם, אלה האסטרוציטים אינם מייצרים VEGF-A, שהוא התגלמות בייצוב של החיקוי BBTB המתוארים כאן. האסטרוציטים זוהו מאפננים של החדירות BBB, למשל דרך שחרורו של VEGF-A בתגובה neuroinflammation27. הפעלה של קולטני צמיחה אנדותל כלי הדם (VEGFRs) היא מווסת מפתח של החדירות אנדותל/כלי הדם הן חוץ גופית28 והן ויוו29. לכן, VEGF-A תוספי במדיום להפעיל את VEGFR2 על תאי אנדותל, אשר גורם זירחון של חלבונים צומת adherens כגון VE-קדהרין30. האובדן של תאי אנדותל-תא אנשי קשר יוצר כלי הדם חדיר מאוד. באופן דומה, המאפיין mitogenic חזקה והן הרכב לא ידוע של sera שור העובר המשמשים את מבחני תרבות תא לגרום הנושאים העיקריים הפארמצבטית מייצב ואת וזמינותו מכשול ההפרדה.
הוא יפתור תאי אנדותל (HUVECs) משמשות לעתים בצורה BBB חוץ גופית31; עם זאת, הם באופן משמעותי שונים מתאי המוח microvascular אנדותל, כגון התא hCMEC/D3 קו32, במונחים של ביטוי גנים ויוצרים מחסום מאפיינים. עם זאת, החדירות גבוהים יחסית הערכים שהתקבלו עם תאי HuAR2T גדל לבד לעומת bEND3 היו מאוד מופחת מאת coculturing אותם עם האנושי האסטרוציטים העיקרי. למרות תאי אנדותל נדרשים כדי ליצור הקיר הסלולר, ברור שיש האסטרוציטים תפקיד לא פחות חשוב כדי להפוך את היווצרות BBTB מייצב.
כאשר החולה-derived glioma הספירות נוספו המשוואה הזו, החיקוי BBTB העכבר recapitulated כמה מן התכונות של מאתר xenografts, כגון תרופות פעפוע דרך להערכת את המוח ואת הגידול תא הפגיעה המכוונת. מחקה BBTB שנדונו כאן היו, למשל, מוצלח שיקוף ההתנהגות ויוו כאשר הוקרנו מספר חלקיקים עם קטרים שונים. כדי להמחיש את ההקבלה בין הדגמים במבחנה, ויוו, השתמשנו mesoporous שתואר לעיל סיליקט חלקיקים33 עם חודר לתא מאפיינים34 מצומדת כדי פפטיד פילוח הגידול קופ על שלהם surface20. פילוח קופ פפטיד הבתים תאים גידול פולשני דרך האיגוד ספציפית לחומר המדכא החלב נגזר צמיחה (MDGI). סרטן מספר, כולל gliomas, הן overexpressing MDGI לעומת את הרקמות35, מה שהופך קופ moiety פילוח הגידול יעילה מאוד מסוגל להגדיל את מסירת המטען20. חלקיקים המשמש כאן בעבר הוכחו לפזר אל parenchyma המוח (27547955), כאשר functionalized עם טקסול, הננו-מטענים אלה הוכתרו בהפחתת גידול glioma במודלים פרה36. התוספת של שאריות פוליאתילן גליקול (PEG) על פני השטח של חלקיקים נשמר גם תשלום סטטי שלהם ערכים חיוביים (סביב + 4 mV), המאפשר אינטראקציה טובה יותר עם יחידת נוירו-וסקולריים37 וגם להגדיל את היציבות שלהם במחזור. הנתונים שהוצגו, kDa 3 של פג היה מצומדת כדי NP110s, בעוד NP350s היו מצופים kDa 10 של פג. עם זאת, גדל משקל מולקולרי פג גם הביא לעליה משמעותית הקוטר ננו-חלקיק, ומכאן יכולותיו הפיזיות שלהם לעבור BBB. לכן, בדקנו אם הממדים הפיזיים של חלקיקי מנעו מעבר שלהם דרך BBTB, אם תצפיות אלה יכול להיות שיקוף ויוו.
לפי תצפיות שפורסמו בעבר, הבחנו כי NP110s extravasated דרך BBTB את המבחנה והן BBB של עכברים הנושאת גידולים תוך גולגולתי, בעוד NP350s שמרו על הצד luminal של החיקוי BBTB, בכלי הדם של עכברים. אלה תוצאות דומות ממליצים כי המודל BBTB ניבא את היכולת ויוו של חלקיקים חוצה BBB ולהגיע המוח.
הרלוונטיות של דגמי הסלולר של BBB נדון פעמים רבות, אפילו למסירה המרכזי של חלקיקים38. אנו מראים פה כי האסטרוציטים העיקרי ותאי אנדותל, שניהם נחשב כלי במבחנה הרלוונטי ביותר, יכול להיות מוחלף על ידי תאים מונצח ו/או זמינים מסחרית, מדרגיות רבה יותר של הפארמצבטית. ניתן לפתח את הדור הבא של מחקה-BBB במבחנה על-ידי שילוב המכשירים microfluidic, המאפשר יחידות בנוי להפליא נוירו-וסקולריים הדומות מבחינה מבנית בפועל BBB12,14. עם זאת, מודלים כאלה הזדהמו כעת להקרנה תפוקה גבוהה של מולקולות נמסר gliomas, עקב מגבלות טכניות ההמשך של משלוח14. זה אכן קשה ללכוד את המורכבות הפיזיולוגית של BBB בקערה, היעדר רצפטורים/חלבונים מסוימים, הידועים לבוא לידי ביטוי על ידי BBB, אפשרי עלול לסכן את הפרשנות של התוצאות. טיעון נוסף נוגע ההשתנות נהדר בביטוי הגנים בין ויוו ותנאי במבחנה, כמו גם משורת מתא אחד למשנהו, במיוחד בהתחשב תאי אנדותל. עם זאת, זה יכול להיות גרס כי יחידת נוירו-וסקולריים אינה ישות אחידה בתוך המוח39. המחקר המדעי בביולוגיה הגיע עידן אנושי שבו את רווחת אחריות מוסרית, העלות של שימוש בבעלי חיים חיים תמיד נחשבים לפני תכנון הניסוי. לכן, כדי לתמוך ההחלפה של בעלי חיים, מספר גדל והולך של מחקרים שנעשו לאחרונה מראים כי המודעות של המגבלות של הדגמים ומבחר בזהירות דגמי הסלולר להקים מכשול ההפרדה – עם דגש על האסטרוציטים — צו התאמה בין התוצאות שהושגו בקערה, של בעל חיים מודלים40. עם המתודולוגיה המתוארת כאן, אנחנו מקבלים צעד אחד קרוב יותר כדי להפחית את מספר חיות ניסוי המשמש לסינון למטרות של BBB transcytosis עבור פוטנציאל הרפוי.

יחידת נוירו-וסקולריים מורכב נוירונים האסטרוציטים, BBB, שהוקמה על ידי חיבורים מסובכים בין pericytes, האסטרוציטים, תאי אנדותל קרום המרתף המשויך ויוצרים את המוח microvasculature1. הקיר הסלולר צר שנוצר על ידי כלי רציף, nonfenestrated דק מסדיר את התנועה של יונים ומולקולות (כולל הורמונים, חומרים מזינים או תרופות), אלא גם של מחזורי תאים1. Transcytosis נמוך בעיקר דרך BBB של מולקולות גבוהה משקל מולקולרי, כגון נוגדנים טיפולית, סמים conjugates או nanocompounds, מגביל באופן דרמטי את ההתקדמות גילוי תרופות למחלות נוירולוגיות, כולל ממאיר gliomas2. אכן, דרך הפה או דרך הווריד ונמסרו chemotherapies להגיע parenchyma המוח בדרך כלל בריכוזים נמוכים כראוי כדי ליצור אפקט antitumor או בכלל לא יכול לחצות את BBTB כדי להגיע את התאים אמצעים3. מספר מחקרים קליניות לא התמודדו עם הבעיה של BBTB חדירה אבל ניסו לשבש את BBTB transiently, למשל על-ידי שימוש סאונד ממוקד4,5, או לעקוף אותו על ידי ישירה בחיי עיר משלוח של סמים6. עם זאת, אף אחת משיטות אלה הצליחו לנטרל את התפשטות הגידול הבלתי נמנע או נסיגה. לכן, בעת פיתוח טיפולים antiglioma, פעפוע דרך BBTB צריכה להיחשב אחד ההיבטים הקריטיים עבור שילוח מוצלח של סוכני טיפולית7.
בשל אופיו מאוד מורכב של אינטראקציות תא בתוך BBTB, אין ויוו מחקרים בחיות מעבדה נראה הבחירה הברורה כשלומדים את המעבר של מולקולות מן הדם אל המוח. עם זאת, שיטות ויוו גבוהה-סולם מורכבים יחסית כדי להקים ו, לכן, אל תאפשר ההקרנה תפוקה גבוהה של מולקולות בתוך זמן סביר במחיר סביר. . וחשוב מכך, ניסויים בבעלי חיים חייב לעקוב אחר המנחה אתית 3R כהגדרתו i) מקד, ii) להפחית ולהחליף, רלוונטיות להקשר הנוכחי, השלישי) פרוטוקולים אלטרנטיביים (למשל, בשיטות חוץ גופית/ב silico). לכן, יצירה מחדש של BBTB במבחנה מופיעה אפשרות מעניינת ומושכת, אך הוא מהווה גם משימה מורכבת על ידי מגבלות שונות. רבים מנסה ליצור מחדש את התא מורכבת עם תאים בתרבית הראשי או שורות תאים של כלב, חזירי, מאתר, ומקור בכלל אנושית פורסמו (כפי שנסקרו על ידי רחמן ואח8 ו הלמס ואח9). מודלים אלה כוללים מערכות תלת מימדי microfluidic10,11,BBB-על-שבב12, ומוסיף שהתקהלו משתנים בהתבסס על תרבויות קלאסית שיתוף מערכות. עם זאת, מערכות microfluidic ו שבב הנוכחי הם או לא מתאים מהירה, תפוקה גבוהה סמים-אימות מחקרים13,14 או נמצאים כיום עולה בקנה אחד עם מחקרים של משלוח סמים. גידולים במוח. בנוסף, הסקירה של 155 מודלים שפורסמו באמצעות ראשי תאים, תאי גזע inducible pluripotent (iPSC) או שורות תאים מסחרי מוסיף תרבותי משותף על כל הראו מגמה interstudy חוסר התיאום שלהם מדידות ו/או מסקנות8. חוסר הפארמצבטית interlaboratory יכול בקורלציה עם תרבות nonnormalized i) תנאים, למשל עם הציפוי אופציונלי עם קרום המרתף חלבונים מטריקס בתוך הכלי התרבות תאים, ii) מספר רב יותר של תת-תרבות ושימוש של סרום המכיל במדיה, שני המנועים העיקריים של שינויים גנטיים, פנוטיפי של שורות תאים15או השלישי) הקושי reproducibly לשחזר את האיזון הנכון בין astroglial לבין רכיבים אנדותל בקערה. למרות השימוש מונצחים תאים או תא מסחרי קווים להקים מודל BBB במבחנה חסרה כמה תכונות לעומת דגמים דומים המשתמשים רק ראשי תאים, בשיטה המתוארת אנו מראים כי השילוב הנכון של תאים המוצגים מאוד ביצועים דומים ל פרסם מחקרים במודלים אחרים של הפניה16,17. בסופו של דבר, העדר מודל לשחזור ועמיד ללמוד את המעבר של תרכובות טיפולית מיקוד גידולים במוח דרך BBTB המניע אותנו לפתח בשיטות המתוארות כאן.
שכן המטרה היא להשתמש במודל לחזות את המסירה ויוו של חלקיקים במודלים של בעלי חיים פרה, אנחנו לאמת תחילה המודל BBTB על-ידי ניצול מוסיף המכיל תאי אנדותל מאתר בקשר עם האסטרוציטים מאתר. בנוסף לכך, אנחנו גם אופטימיזציה המודל לשימוש מסוים שורות תאים אנושיים. לאחר מתייצב, המחסומים תא מועברים לתרבויות עם גליובלסטומה נגזר החולה הספירות או שורות תאים glioma מסחרי. לאחר מכן, transcytosis של חלקיקים והיעדים תא הגידול יכול להיות דמיינו ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית, לכמת על ידי איסוף דגימות לאורך זמן. חשוב, התוצאות המתקבלות באמצעות מחקה את BBTB הצליח בצורה אמינה לחזות ההתנהגות של חלקיקים ויוו, התומך בשימוש המנזר מחקים BBTB האימות פרה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1761px;" width="1761">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:1761px;">Cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">bEND3</td>
			<td style="width:239px;">ATCC</td>
			<td style="width:273px;">CRL-2299</td>
			<td style="width:961px;">Cultured in: DMEM (1g/L glucose) supplemented with 10% FBS, 5 mL L-glutamine and 5 mL penicillin/streptomycin</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">HIFko immortalized mouse astrocytes</td>
			<td style="width:239px;">Isolated in Dr. Gabriele Bergers Lab</td>
			<td style="width:273px;">https://doi.org/10.1016/S1535-6108(03)00194-6</td>
			<td style="width:961px;">Cultured in: BME-1 supplemented with 5% FBS, 5 mL 1 M HEPES, 5 mL 100 mM sodium pyruvate, 3 g D-glucose and 5 mL penicillin/streptomycin</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">HuAR2T</td>
			<td style="width:239px;">Isolated in Dr. Dagmar Wirth Lab</td>
			<td style="width:273px;">https://doi.org/10.1089/ten.tea.2009.0184</td>
			<td style="width:961px;">Cultured in: EBM-2 with SupplementMix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">normal human primary astrocytes</td>
			<td style="width:239px;">Lonza</td>
			<td style="width:273px;">CC-2565</td>
			<td style="width:961px;">Cultured in: ABM with SingleQuots</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:1761px;">Material and reagents</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100x17mm Dish, Nunclon Delta</td>
			<td style="width:239px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td>150350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">10 mL serological pipet</td>
			<td style="width:239px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:273px;">170361</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">15mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:239px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:273px;">339650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">ABM Basal Medium, 500 mL</td>
			<td style="width:239px;">Lonza</td>
			<td style="width:273px;">CC-3187</td>
			<td>For primary human astrocytes. ABM+: contains all the additives from the supplement mix. ABM-:all the additives except for rhEGF and FBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Accutase Cell Detachment Solution</td>
			<td style="width:239px;">Corning</td>
			<td style="width:273px;">25-058-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">AGM SingleQuots Supplements and Growth Factors</td>
			<td style="width:239px;">Lonza</td>
			<td>CC-4123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">B27 supplement</td>
			<td style="width:239px;">Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>for both GBM + and - medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Basal Medium Eagle</td>
			<td style="width:239px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:273px;">21010046</td>
			<td>BME-1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Corning Costar TC-Treated 6-Well Plates</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:273px;">CLS3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">Corning Transwell polyester membrane cell culture inserts</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:273px;">CLS3452&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">D-glucose</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:273px;">G8270</td>
			<td>dissolve in 50 mL of BME-1 and sterile filter before adding to the medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium/Nutrient F-12 Ham</td>
			<td style="width:239px;">Gibco</td>
			<td>21331-020</td>
			<td>Specific to the culture of the patient-derived spheres isolated in our lab, may vary for other glioma cell lines</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EBM-2 growth Medium SupplementMix</td>
			<td style="width:239px;">PromoCell</td>
			<td style="width:273px;">c-39216</td>
			<td>EBM+: contains all the additives from the supplement mix. EBM-:all the additives except for VEGF-A and FBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Endothelial Basal Medium 2 (EBM-2)</td>
			<td style="width:239px;">PromoCell</td>
			<td style="width:273px;">c-22211</td>
			<td>EBM+: contains all the additives from the supplement mix. EBM-:all the additives except for VEGF-A and FBS</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:288px;">Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin</td>
			<td style="width:239px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:273px;">10500056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Fluorescein sodium salt</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:273px;">F6377</td>
			<td style="width:961px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Greiner CELLSTAR 96 well plates</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:273px;">Greiner 655090</td>
			<td>black polystyrene wells flat bottom (with micro-clear bottom)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">Menzel-Gl&#228;ser 0.9 cm round borosilicate Cover Slips</td>
			<td style="width:239px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:273px;">10313573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">PBS tablets</td>
			<td style="width:239px;">Medicago</td>
			<td>09-9400-100</td>
			<td>one tablet per liter of dH2O, then sterilize the solution by autoclaving</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Poly-D-lysine hydrobromide</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6407&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Recombinant Human EGF</td>
			<td style="width:239px;">Peprotech</td>
			<td style="width:273px;">GMP100-15</td>
			<td>for GBM+ medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.)</td>
			<td style="width:239px;">Peprotech</td>
			<td style="width:273px;">100-18B</td>
			<td>for GBM+ medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Immunofluorescence</td>
			<td style="width:239px;"></td>
			<td style="width:273px;"></td>
			<td style="width:961px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:273px;">158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;width:288px;">24 x 60 mm microscope slide cover glass</td>
			<td style="width:239px;">ORSAtec</td>
			<td style="width:273px;">0224601-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:288px;">AlexaFluor 488 and 594 secondary antibodies</td>
			<td style="width:239px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:273px;"></td>
			<td>dilution: 1/500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Anti-Claudin-5 antibody</td>
			<td style="width:239px;">Abcam</td>
			<td style="width:273px;">ab15106</td>
			<td>dilution: 1/150</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Anti-GFAP antibody clone GF5</td>
			<td style="width:239px;">Abcam</td>
			<td style="width:273px;">ab10062</td>
			<td>dilution: 1/150</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">Anti-Mouse CD31&#160;antibody Clone MEC 13.3</td>
			<td style="width:239px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:273px;">550274</td>
			<td>dilution 1/800</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Anti-SV40 T-antigen antibody</td>
			<td style="width:239px;">Abcam</td>
			<td style="width:273px;">ab16879</td>
			<td>dilution: 1/150</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Anti-Zonula Occludens-1</td>
			<td style="width:239px;">Abcam</td>
			<td style="width:273px;">ab96587</td>
			<td>dilution: 1/200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">DAPI</td>
			<td style="width:239px;">TOCRIS</td>
			<td style="width:273px;">5748</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">Fluoromount Aqueous Mounting Medium&#160;</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:273px;">F4680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">LysoTracker Red DND-99</td>
			<td style="width:239px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:273px;">L7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Animal procedures</td>
			<td style="width:239px;"></td>
			<td style="width:273px;"></td>
			<td style="width:961px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">10 cm curved dissecting scissors</td>
			<td style="width:239px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:273px;">14394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">BD Microlance 25-gauge needles</td>
			<td style="width:239px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:273px;">300600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Fine Forceps (12.5 cm)</td>
			<td style="width:239px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:273px;">503283</td>
			<td>for tissue dissociation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Intramedic Polyethylene tubing PE20</td>
			<td style="width:239px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:273px;">427406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Ketaminol vet 50 mg/mL</td>
			<td style="width:239px;">Intervet</td>
			<td style="width:273px;">Vnr511485</td>
			<td>Ketamine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Mains Powered microdrill</td>
			<td style="width:239px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:273px;">503599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">Menzel-Gl&#228;ser 0.5 cm round borosilicate Cover Slips</td>
			<td style="width:239px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:273px;">11888372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Micro Bulldog clamp</td>
			<td style="width:239px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:273px;">14119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">Physiological saline solution</td>
			<td style="width:239px;">Mustela</td>
			<td style="width:273px;">Sterile single dose vials 20 x 5 mL / 40 x 5 mL - Medical device class</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Rochester-Oschner forceps</td>
			<td style="width:239px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:273px;">501709</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Rompun vet 20 mg/mL</td>
			<td style="width:239px;">Intervet</td>
			<td style="width:273px;">Vnr148999</td>
			<td>Xylazine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Stereotaxic adapter</td>
			<td style="width:239px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:273px;">502063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Sugi Sponge Points</td>
			<td style="width:239px;">Kettenbach</td>
			<td style="width:273px;">31603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Equipment</td>
			<td style="width:239px;"></td>
			<td style="width:273px;"></td>
			<td style="width:961px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">Axio Zoom.V16 fluorescence stereo zoom microscope&#160;</td>
			<td style="width:239px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:273px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">FLUOstar Omega microplate reader</td>
			<td style="width:239px;">BMG Labtech</td>
			<td style="width:273px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">ORCA-Flash 4.0 digital sCMOS camera</td>
			<td style="width:239px;">Hamamatsu Photonics</td>
			<td style="width:273px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Universal 320 tabletop centrifuge&#160;</td>
			<td style="width:239px;">Hettich</td>
			<td style="width:273px;">Cat. No. 1401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">ZEISS LSM 880 with Airyscan confocal microscope</td>
			<td style="width:239px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:273px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

predicting in vivo payloads delivery using a blood-brain tumor-barrier in a dish

סלקטיבי מאוד על ידי הטבע, מחסום הדם - מוח (BBB) הוא חיוני עבור הומאוסטזיס המוח בתנאים פיזיולוגיים. עם זאת, בהקשר של גידולים במוח, מידת הבררנות מולקולרית של BBB גם מגן התאים אמצעים על-ידי חסימת מסירת chemotherapies מנוהלת באופן עקיף. פיתוח תרופות חדישות (כולל חלקיקים) מיקוד גידולים ממאירים במוח באופן אידיאלי מחייב השימוש במודלים בבעלי חיים פרה ללמוד transcytosis של התרופה והיעילות antitumor. על מנת לעלות בקנה אחד עם העיקרון 3R (צמצום, להפחית ולהחליף) כדי להפחית את מספר חיות מעבדה בהגדרת הניסוי ולבצע ההקרנה תפוקה גבוהה של ספריה גדולה של סוכנים antitumor, פיתחנו אדם במבחנה לשחזור, לחקות מאתר של דם-מוח הגידול-המכשול (BBTB) באמצעות שכבות 3 תרביות של תאי אנדותל, האסטרוציטים ספירות נגזר החולה גליובלסטומה. מדרגיות גבוהה יותר, הפארמצבטית, שורות תאים מסחרי או תאים מונצחים שימשו בתנאים מותאמים אישית כדי לאפשר היווצרות של מחסום דמוי BBB בפועל. כאן נתאר פרוטוקול להשיג לחקות BBTB על ידי culturing תאי אנדותל בקשר עם האסטרוציטים ב תאים מסוים הצפיפויות בחלק מוסיף. לחקות BBTB הזה יכול לשמש, למשל, כימות והדימות קונאפוקלית של המעבר ננו-חלקיק דרך המחסומים אנדותל, astrocytic, בנוסף הערכת פילוח תא הגידול בתוך אותו וזמינותו. יתר על כן, אנו מראים כי נתונים המתקבלים יכולים לשמש כדי לחזות את ההתנהגות של חלקיקים במודלים של בעלי חיים פרה. פרספקטיבה רחבה, המודל במבחנה זה יכול להיות מותאם כדי מחלות ניווניות אחרות מצפני המעבר של מולקולות טיפוליות חדשות דרך BBB ו/או להיות בתוספת organoids המוח כדי ישירות להעריך את היעילות של . סמים.

הדמיה קונאפוקלית של החיקוי BBTB מאתר מציג את הביטוי ולוקליזציה הסלולר של צומת חזק חלבונים zonula occludens-1 (זואי-1) ו- claudin-5 bEND3. הקשר בין תאי אנדותל האסטרוציטים המושרה בבירור המעבר של זואי-1 ו- claudin-5 לאנשי הקשר תא אנדותל-תא בהשוואה monocultures bEND3 (איור 1D). שימוש immunofluorescence מכתים להמחיש את האסטרוציטים לבטא GFAP המוח-בצד של הקרום, זה אפשרי לצפות וללמוד את התהליכים astrocytic והרגליים סוף-פנייה אל תאי אנדותל דרך הקרום (איור 1E ). המגעים תא אנדותל-אסטרוציט ידועים כדי לקדם ולייצב את הידוק של המכשול הסלולר והן משויכות ערכים נמוכים יותר חדירות של BBB19. לפי זה, הבחנו בירידה משמעותית החדירות של החיקוי BBTB העכבר לחליל Na-מ 27.63 (± 3.45) x 10-6 ס"מ/s במקרה של monocultures כדי 6.74 (± 3.01) x 10-6 ס"מ/s כאשר תרבותי משותף עם היפוקסיה inducible מדהימה פקטור האסטרוציטים (HIFko) (טבלה 1). HuAR2T immortalized בצורת מחסומים הסלולר חדיר מאוד (104.92 ± 27.1 x 10-6 ס"מ/s, טבלה 1). בדומה למודל מאתר, מדדנו החדירות נמוך משמעותית של BBTB ל נה-Fl, כלומר 47.4 (± 14.32) x 10-6 ס"מ/s, כאשר התאים HuAR2T היו בתרבית במשותף עם האסטרוציטים העיקרי אנושי (טבלה 1).
במחקה BBTB מאתר והן אנושית, הנוכחות של מרחבי גליובלסטומה נגזר החולה המושרה עלייה קלה בערכי חדירות לעומת התרבויות שיתוף תא אנדותל-אסטרוציט לבד (טבלה 1). תופעה זו נצפית עם כמה, אבל לא כל glioma החולה כדור מודלים. זה יכול להיות בגלל ה VEGF-A המופרש על ידי כמה תאים אלה נגזר החולה.
כדי להשוות בין ערכי חדירות מחקה BBTB במבחנה עם BBB ויוו, אנחנו עם תמונה בזמן אמת פעפוע של Na-Fl דרך חלון הגולגולת שהושתלו בעכברים עירום. שימוש stereomicroscope על-ידי קרינה פלואורסצנטית, Na-Fl דיפוזיה של הנימים כלי דם הנובעת כלי הדם pial הראשי הוקלט לפני, במהלך, ואחרי הזרקה מערכתית של המכשיר (איור 2C). מדידות של ערכי פלורסצנטיות דיפרנציאלית parenchyma קורטיקלית הדם והמוח מחזורי לאורך זמן מאפשרת לנו לחשב את הערכים חדירות משוער של העכבר עירום's BBB בשביל Na-חליל (5.57 ± 2.19 x 10-6 ס מ בשנייה, טבלה 1).
כדי להמחיש איך לחקות BBTB הזה יכול לשמש עבור ויזואליזציה של המעבר של תרכובות לצד דם בצד המוח, השווינו את transcytosis ø 110 nm (NP110), ø 350 nm (NP350) חלקיקים מיקוד גליובלסטומה נגזר החולה הספירות. התוצאות שהושגו במבחנה ואז, לעומת את transcytosis ויוו. בדוגמה שהוצגו, חלקיקים היו מצופים משטח עם פפטיד פילוח הגידול קופ20 , עמוסה הפלורסנט (FITC) כדי להקל על הפריט החזותי. אנחנו שכותרתו התאים באמצעות לצבוע lysosomal ואת counterstained עם דאפי 24 שעות לאחר התוספת של חלקיקים FITC על הצד-הדם של BBTB לחקות ואף רכשה micrographs קונאפוקלית ברמות שונות (למשל, דם בצד, הקרום, בצד המוח, את הכדורים גליובלסטומה החולה) (איור 3 א). NP110-הקשורים ניאון האות colocalized עם lysosomes תאי אנדותל, האסטרוציטים, וכן תאים סרטניים. בנוסף, NP110s היו באמצע זיהה תאי אנדותל ואת האסטרוציטים, עובר דרך הנקבוביות ממברנה של הקדמי (איור 3 א).
המעבר של NP110s הייתה לכמת על ידי מדידה של זריחה מן הדגימות שנאספו מהצד הדם ואת המוח. ערכים אלה חדירות הושוו לאלה שנקבע על חלקיקים של ø 350 nm (NP350). התוצאות הראה כי רק NP110 היה מסוגל לחצות את מחקה BBTB (איור 3B). NP350 נשאר בצד-הדם של החיקוי BBTB, אשר הביא ערכים נמוכים יותר חדירות עבור חלקיקים אלה.
כדי להבליט את הרלוונטיות של מחקה BBTB לעומת הדגמים ויוו, עכברים עירום הוזרקו לווריד חלקיקים NP110 או NP350 מצופה של פפטיד פילוח הגידול קופ, מצומדת עם צבע אדום פלואורסצנטי (TRITC) עבור הזיהוי. רקמות שנאספו במספר נקודות זמן גילה כי לאחר 8 שעות, חלקיקים BBB-חדיר יש extravasated אל parenchyma המוח, בעוד nonpermeable אלה שנשארו במחזור בעיקר נוקתה מכל הלב מחזור מערכתי ויוו. לכן, אנו נאספים המוח, לכמת את מספר חלקיקים לכל מילימטר מרובע 8 שעות postinjection. על פי הממצאים במבחנה, NP110, אבל לא NP350, בהצלחה extravasated אל parenchyma המוח (איור 3C). ההגדלה גבוהה הדמיה של המיקום nanoparticle במוח הראה כי NP110 היה homogeneously מופץ ב- parenchyma המוח מחוץ הנימים דם ולא בהצלחה שני חיבורים לתאים גליובלסטומה מושתל (דמות תלת-ממד). למרות המציגות את הגידול באותו מיקוד moiety (קופ), NP350 לא היתה אפשרות בורחת אל parenchyma המוח, התגלתה רק בתוך בצד luminal של המוח כלי הדם (איור 3E), הדומה התוצאות המתקבלות במבחנה.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59384/59384fig1.jpg"> איור 1: תיאור מודל הגידול-מכשול (BBTB) דם-מוח. (א) ייצוג סכמטי של המיקומים של סוגי תאים שונים. (B) איור של המיקום הוספה על הכיסוי של 6-. ובכן, את טכניקת זריעה האסטרוציטים בצד המוח של תותב's ממברנה. איור (C) של צלחת 6-ובכן מיקום המאפשר הדבקה אסטרוציט. (ד) Immunofluorescence micrographs של צומת חזק חלבונים zonula occludens-1 (שורה זו-1, העליון, אדום) ו- claudin-5 (שורה התחתונה, ירוק). הביטוי חלבון מושווה מאתר microvascular אנדותל תאי המוח (bEND3) תרבותי בצד דם של BBTB לבד כמו גידולי תעשייה (עמודה שמאלית) או עם מאתר מונצחים HIFko האסטרוציטים (בעמודה הימנית). גרעין התא counterstained עם דאפי (כחול). (E) מציג החלבון חומצי fibrillary גליה (GFAP, אדום) ב- HIFko האסטרוציטים תרבותי בצד המוח של BBTB micrograph Immunofluorescence. התמונה גבוהה ההגדלה מציגה אסטרוציט תהליכים, סוף-רגל (חיצים) פנייה אל תאי אנדותל דרך הקרום נקבוביות (לוח נכון). זהותו של האסטרוציטים HIFko אומתה על ידי immunofluorescence מכתים של וירוס קופיים 40 גדול T אנטיגן (SV40 גדול T, ירוק) המשמש את immortalization של התאים. תאי אנדותל לבטא את GFAP וגם את T גדול של SV40 ו, לכן, יכול להיות חלקית שנצפו דרך שקופים, בצד הנגדי של הקרום כמו תאים מוכתם, דאפי בלבד (קווים מקווקווים). גרעין התא counterstained עם דאפי (כחול). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59384/59384fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59384/59384fig2.jpg"> איור 2: Intravital נחישות בשידור חי של העכבר חדירות BBB. (א) הכנת הצנתר מושתלת וריד סימטרית. ציוד וכלים (1) הן הבאות: צינור פוליאתילן () PE20 (b) שני 25 גרם נידלס מלקחיים (c) רוצ'סטר-Ochsner, (ד) קטן בולדוג קלאמפ. (2) א 25 * G המחט יוסר על ידי מספר torsions באמצעות מלקחיים (3) בזהירות מוכנס הצינור. (4) לצד השני של הצינור מחובר עוד מחט 25 גרם. (B) הדרכה עבור השתלה קטטר ומיקום כדי להשרות את הפתרון סודיום-fluorescein דרך וריד הזנב עכבר. חגו באזור מציינת את האזור בו טיפה של דבק מגע, דבק הוא ממוקם מימין מאובטחים הצנתר. המלחציים בולדוג התעסקנו עם הצנתר, כשנקבל הצנתר מאובטחת. (ג) נציג הדמיה כימות שיטת כדי לקבוע את הערכים חדירות של נתרן-fluorescein. לפני החדרת סודיום-fluorescein (עמודה שמאלית), autofluorescence/הריק נמדד בתוך אזור בעל עניין (ROI) מניחים על המוח (מלבן החלונית העליונה, לבן) ואת כלי הדם באזורים (המלבן לוח, האדום התחתון). במהלך החדרת סודיום-fluorescein (בעמודה הימנית), עוצמת קרינה פלואורסצנטית נמדד בשני ROIs, המאפשר חישוב החדירות BBB. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59384/59384fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59384/59384fig3.jpg"> איור 3: חיזוי של transcytosis גרם של חלקיקים באמצעות BBB ויוו באמצעות מודל BBTB במבחנה. (א) ייצוג גרפי של וזמינותו BBTB להחליפן בתמונות קונאפוקלית שהושג ברמות שונות המצוין של המודל מאתר BBTB. חלקיקי של 110 nm קוטר (NP110) ואת מצומדת כדי FITC (ירוק) נוספו הדם היו בצד של התאים BBTB בלוחיות החללית lysosomal (LT-99, אדום).  (1) Endothelial תאים, transcytosis (2) Endothelial של חלקיקים דרך הנקבוביות של הקרום (לבן קו מקווקו), (3) האסטרוציטים, הספירות גליובלסטומה החולה (4) מזוהים על פריט הגרפיקה ולאחר המקביל micrographs קונאפוקלית (מימין). Lysosomal ומגעים חלקיקים (חיצים) מציע transcytosis פעיל דרך שכבות אנדותל, אסטרוציט של BBTB. כימות החדירות nanoparticle המצוין באמצעות הפריה BBTB (B) (n = 6). (ג) כימות של צפיפות nanoparticle המצוין בתוך רקמת המוח סעיפים, 8 שעות לאחר העירוי וריד סימטרית של העכברים עירום (n = 3). (ד) micrographs קונאפוקלית מציג את ההתפלגות של ø nm 110 חלקיקים (NP110, אדום) בסעיפים רקמת המוח מאתר בתווית עם נוגדן CD31 אנטי-עכבר (ירוק). החץ מסמן את transcytosis ננו-חלקיק (החלונית הימנית). חלקיקים שהצטברו סביב גידול תאי המוח (גידול, לוח נכון) בשל פפטיד פילוח קופ המוצגות על פני השטח שלהם. אין יונת משמעותי הוא ציין ברקמת המוח (המוח). Micrographs קונאפוקלית (E) מראים חלוקת ø 350 nm חלקיקים (NP350, אדום) רקמת המוח מאתר למקטעים הנקרא עם נוגדן CD31 אנטי-עכבר (ירוק). ראשי החץ לנקודת NP350s היו נשמרים בלומן כלי דם, לא הצליחו לעבור BBB, כנראה בגלל שלהם בקוטר גדול יותר בהשוואה גרעינים תא NP110s. הן counterstained עם דאפי (כחול). P < 0.01. P-ערכים חושבו באמצעות מבחן מאן-ויטני U-זנבית, nonparametric. קווי השגיאה מייצגים את סטיית התקן. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59384/59384fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>מאתר BBTB לחקות</td>
			<td>bEND3</td>
			<td>bEND3 + HIFko כמו</td>
			<td>bEND3 + ג'יגה-בתים</td>
			<td>bEND3 + HIFko כמו + ג'יגה-בתים</td>
			<td>אין ויוו</td>
		</tr>
<tr>
<td>חדירות (10-6 ס"מ/s)</td>
			<td>27.63</td>
			<td>6.74</td>
			<td>26.8</td>
			<td>10.83</td>
			<td>5.57 מקצועית</td>
		</tr>
<tr>
<td>SD (10-6 ס"מ/s)</td>
			<td>3.45</td>
			<td>3.01</td>
			<td>7.99</td>
			<td>2.65</td>
			<td>2.19</td>
		</tr>
<tr>
<td>האדם לחקות BBTB</td>
			<td>HuAR2T</td>
			<td>HuAR2T + hIAs</td>
			<td>HuAR2T + GB</td>
			<td>HuAR2T + hIAs + ג'יגה-בתים</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>חדירות (10-6 ס"מ/s)</td>
			<td>104.92</td>
			<td>47.4</td>
			<td>89.08</td>
			<td>48.24</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>SD (10-6 ס"מ/s)</td>
			<td>27.1</td>
			<td>14.32</td>
			<td>10.21</td>
			<td>13.07</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1: ערכים של החדירות נתרן-fluorescein (Na-Fl) (בסנטימטרים לשניה) נקבע במבחנה במערכות המצוין תרבות משותפת, אין ויוו בעכברים עירום NMRI. נתונים מניסוי נציג (n = 3 עכברים).

Watch this Scientific Journal Video about Predicting In Vivo Payloads Delivery using a Blood-brain Tumor-barrier in a Dish at JoVE.com

Predicting In Vivo Payloads Delivery using a Blood-brain Tumor-barrier in a Dish

Predicting ב Vivo מטענים משלוח באמצעות הגידול-מחסום דם-מוח בקערה

סמים המיקוד גידולים במערכת העצבים המרכזית היא אתגר גדול. כאן נתאר פרוטוקול לייצר לחקות במבחנה של דם-מוח הגידול-המכשול באמצעות תאים מאתר ו/או האדם, לדון את הרלוונטיות שלהם עבור מהמכונית של מערכת העצבים המרכזית הגידול מיקוד ויוו.

Highly selective by nature, the blood-brain barrier (BBB) is essential for the brain homeostasis in physiological conditions. However, in the context of ...

על מנת לפתח תרופות חדשניות ותרכובות כי היעד גידולים במערכת העצבים המרכזית, הנגישות ומעבר דרך מחסום הדם - מוח חשוב מאוד. למרות הציטוקסיות של התרכובות ניתן למדוד בקלות על ידי דגירה התאים עם מולקולות טיפוליות, זה לא ממש אומר שום דבר על המסירה בפועל לאתר הגידול במוח. כדי לטפל בבעיה זו, פיתחנו את הפרוטוקול הבא המתאר כיצד לשחזר את מחסום הגידול בדם - מוח במבחנה על צלחת.השימוש בתאים מונצחים ממוצא מורין או אנושי הופך את ההסתה הזו לגמישה מאוד. זה יכול גם להיות קנה מידה בקלות עד המסך עשרות תרכובות עם רבייה גבוהה. בנוסף, שיטה זו מאפשרת הן כימות והן הדמיה של המעבר ויכולת המיקוד של התרכובות לפני שתמשיך במודלים פרה-קליניים.לכן, השיטה שלנו מחליפה חלקית את המודלים של בעלי החיים באמצעות קווי התאים שנקבעו מראש. הכללת תאים סרטניים במוח שמקורם בחולה תוודא את ההטרוגניות של המטופל, בעוד שהשימוש בתאים מונצחים כדי להקים את מחסום הדם - מוח מבטיח את הרבייה של התוצאות. בסך הכל, מודל מחסום הדם - מוח הזה מציע כלי מעניין באמת כדי להתוות את דיפוזיה התרופה או משלוח של כלי רכב סמים.הדגמה חזותית של השיטה היא קריטית מכיוון שזרע של התאים בצד הנגדי של ההוספה דורש מניפולציה שלא מתוארת לעתים קרובות בפרוטוקולים אחרים באמצעות התקנה דומה. לדוגמה, קבלת הידבקות של אסטרוציטים כאשר הכנס ממוקם במהופך יתרונות גבוהים מייצוג חזותי. מתחת למכסה המנוע של תרבות התאים הסטריליים, שטפו בזהירות את האסטרוציטים התרבותיים עם חמישה מיליליטר של PBS סטרילי.השתמש במשאבת ואקום כדי להשליך בעדינות את ה- PBS, ולהוסיף שני מיליליטר של ניתוק תאים במשך חמש דקות כדי לנתק את התאים. לאחר מכן, להוסיף 10 מיליליטר של בינוני תרבות תאי אסטרוציטים מלאה סטרילית לכלי כדי לעכב את הפעילות של reagent דיסוציאציה התא. השתמש פיפטה סרולוגית סטרילית להעביר את התאים מנותקים מהכלי לצינור סטרילי 15 מיליליטר.צנטריפוגה ב 250 פעמים g במשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר. בינתיים, תגדיר את התוספים. השתמש במטסים סטריליים כדי למקם את המכניסים עם צד המוח על המכסה של צלחת סטרילית שש בארות.כאשר הצנטריפוגה הושלמה, בזהירות להשליך את supernatant מן ההשעיה התא, ו resuspend גלולת אסטרוציטים במיליליטר אחד של ABM פלוס על ידי צינור בעדינות את גלולה על הקיר של הצינור עד חמש פעמים. לאחר מכן, ספור את התאים והתאם את צפיפות מתלי התא ל- 150, 000 תאים ב- 400 מיקרוליטרים של ABM פלוס לכל הכנסה. מניחים את ההשעיה של התא באמצע צד המוח של קרום המוסף, ומפזרים אותו בזהירות באמצעות כוח נימי עם קצה פיפטה סטרילי.כאשר צד המוח של המוסיף עדיין למעלה, מקם את לוח ששת הטובים בחזרה על המוסיף. מניחים את הצלחת ומכניסים, עם צד המוח למעלה, לתוך אינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני כדי לאפשר הידבקות בתא. לאחר מכן, להחזיר את צלחת שש בארות בחזרה למיקום הרגיל שלה, עם מוסיף עכשיו צד הדם למעלה.הוסף מדיום והמשך את הדגירה כמפורט בפרוטוקול הטקסט. מתחת למכסה המנוע של תאים סטריליים, שטפו בזהירות את תאי האנדרותל התרבותיים עם חמישה מיליליטר של PBS סטרילי. השתמש במשאבת ואקום כדי להשליך בעדינות את ה- PBS, ולהוסיף שני מיליליטר של ניתוק תאים במשך חמש דקות כדי לנתק את התאים.לאחר מכן, להוסיף 10 מיליליטר של בינוני תרבות תאים אנדותל מלא סטרילי לכלי כדי לעכב את הפעילות של reagent דיסוציאציה התא. השתמש פיפטה סרולוגית סטרילית להעביר את התאים מנותקים מהכלי לצינור סטרילי 15 מיליליטר. צנטריפוגה ב 250 פעמים g במשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר.לאחר מכן, להשליך את supernatant, ולתלות מחדש את גלולת התא אנדותל במיליליטר אחד של EBM פלוס על ידי צינורות לאט המתלה התא על הקיר של הצינור עד חמש פעמים. לספור את התאים, ולהתאים את צפיפות המתלים התא ל 200, 000 תאים ב 2.5 מיליליטר של תרבות התא אנדותל נטול סרום וגורם גדילה אנדותל כלי דם-A לכל הכנסה. אחזר את הלוח המכיל את ההוספות.בזהירות להשליך את המדיום מצד הדם, ולהחליף אותו עם 2.5 מיליליטר של השעיה תא אנדותל. לאחר מכן, להחזיר את הצלחת לחממה, ולהשאיר אותו לילה כדי לאפשר לתאי ה אנדותל לדבוק הממברנה. למחרת, הכינו צלחת של שש בארות על ידי העברת שלושה מיליליטר של ABM-מינוס מחומם מראש לכל באר.באמצעות מדפים סטריליים, לטפל בתוספות כדי להשליך בזהירות את המדיום השלם אנדותל מצד הדם, ולמקם את הכנס לתוך הלוח החדש המכיל ABM-מינוס. לאחר מכן, להוסיף 2.5 מיליליטר של EBM-מינוס. השאירו את המכניסים באינקובטור עם הפרעה פיזית מינימלית או וריאציית טמפרטורה במשך חמישה ימים.ביום ההעברה, החלף את המדיום. להדמיית שפעת חיסונית, מניחים עד ארבעה כיסויי בורוזיליקט סטריליים עגולים לתוך כל באר של צלחת שש באר המכילה שני מיליליטר של פולי-D-ליזין. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות.בינתיים, השתמש פיפטה סרולוגית סטרילית להעביר בזהירות את כדורי הגידול מכלי תרבות התא לצינור סטרילי 15 מיליליטר. צנטריפוגה כדורי הגידול ב 250 פעמים g במשך שלוש דקות. השלך את העל-טבעי, ולחץ בעדינות על הספירות במיליליטר אחד של GBM-מינוס.ספור את התאים והתאם את צפיפות התאים לכ- 10, 000 כדורים או 100, 000 תאים למיליליטר של GBM-מינוס. לאחר מכן, השלך את הפולי-D-ליזין מה בארות, ולשטוף את הבאר שלוש פעמים עם PBS סטרילי. זרע כל באר של הצלחת עם שלושה מיליליטר של ההשעיה spheroid הגידול, ולהעביר את המכניסים עם חיקוי BBTB על ההשעיה תא הגידול.דגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס עם 5%פחמן דו חמצני כדי לאפשר את הדם ואת צידי הגידול במוח של ההסטה לבוא שיווי משקל. למחרת, להחליף את התקשורת בצד הדם עם EBM מינוס בתוספת מולקולות, תרופות, או חלקיקים של עניין. לאסוף את הדגימות לאורך זמן לכימות ישיר כפי שתואר קודם לכן.ראשית, לאסוף 100 microliters של המדיום הן מן הדם ואת צידי המוח של חיקוי BBTB, ולהעביר כל אחד נפרד שטוח תחתית, שחור, 96 גם צלחת עבור מדידות פלואורסצנטיות הבאים. לאחר מכן, להכין פתרון 50 מיקרומולר של נתרן פלואורסצין ב EBM-מינוס, הקפד להכין 2.5 מיליליטר ל הבאר. מחממים מראש את הפתרון הזה ל-37 מעלות צלזיוס, ומחליפים את המדיה מצד הדם של המוסיף במדיה המכילה את פתרון הנתרן הפלואורסין הזה.התחל שעון זמן ברגע שהמדיום מוחלף. בזהירות לאסוף 100 microliters של מדיה משני הצדדים הדם והמוח של מוסיף בחמש דקות, 30 דקות, 60 דקות, ו 120 דקות. מעבירים כל דגימה ל בארות נפרדות של הצלחת השחורה המתאימה, 96 בארות.השתמש בקורא לוחות כדי לכמת את הפלואורסצנטיות מהדגימות שנאספו. ראשית, מדללים את הצבע הפלואורסצנטי lysosome לריכוז העבודה המתאים במדיום מחומם מראש. מוסיפים את זה לתאים, ו דגירה ב 37 מעלות צלזיוס עם 5%פחמן דו חמצני במשך 45 דקות.לאחר מכן, לשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS קר כקרח. השליכו את ה-PBS, והוסיפו שלושה מיליליטר של פרפורמלדהיד קר כקרח 4% ל בארות ו-2.5 מיליליטר לתוספה. דגירה על קרח במשך 10 דקות.לאחר מכן, להשליך את paraformaldehyde, ולשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS. הסר את PBS, ונגד גרעיני התא באמצעות פתרון DAPI בריכוז סופי של מיקרוגרם אחד למיליליטר במים מזוקקים. דגירה בטמפרטורת החדר במשך שבע דקות.לאחר מכן, להסיר את DAPI, ולשטוף את הממברנות שלוש פעמים עם מים מזוקקים. חותכים בזהירות את הממברנה, מסירים את המים המזוקקים ומ מניחים אותה על טיפת מדיום הרכבה על מגלשת מיקרוסקופ זכוכית. מוסיפים עוד טיפה של מדיום הרכבה בצד השני של הממברנה, ומכסים אותה בזהירות בזכוכית כיסוי בורוסיליקט.במחקר זה, תאים אנדותל היו מתורבתים במשותף עם אסטרוציטים כדי ליצור מחסום גידול בדם - מוח כמו ממשק במערך במבחנה. הדמיה קונפוקל של חיקוי BBTB מורין מראה את הביטוי ואת לוקליזציה הסלולר של חלבוני צומת הדוק זונולה occludens-1 ו קלודין-5 ב bEND3. מגעים בין תאי האנדותל לאסטרוציטים גורמים בבירור להעברתם של שני חלבונים אלה למגעים אנדותל מתא לתא בהשוואה למונוקולטורות bEND3.באמצעות כתמי immunofluorescence כדי לדמיין את האסטרוציטים המביעים GFAP בצד המוח של הממברנה, ניתן להתבונן וללמוד את התהליכים האסטרוציטיים ואת רגלי הקצה ליצירת קשר עם תאי ה אנדותל דרך הממברנה. כדי להשוות את ערכי החדירה של חיקוי BBTB במבחנה עם מחסום הדם - מוח במבחנה, דיפוזיה בזמן אמת של נתרן פלואורסין הוא בתמונה דרך חלון גולגולת מושתל בעכברים עירומים. באמצעות מיקרוסקופ סטריאו פלואורסצנטי, דיפוזיה פלואורסין נתרן מן נימי כלי הדם הנובעים כלי הדם pial הראשי נרשם לפני, במהלך, ולאחר הזרקה מערכתית של החללית.טרנסציטוזיס של חלקיקים כי היעד כדורי גליובלסטומה שמקורם בחולה מושווה לאחר מכן כדי להמחיש כיצד זה חיקוי BBTB יכול לשמש כדי לדמיין את המעבר של תרכובות מצד הדם לצד המוח. אות הפלואורסצנט המשויך ל- NP110 מסמן במשותף עם הליזומים בתאי ה אנדותל, אסטרוציטים ותאי גידול. בנוסף, NP110s מזוהים בין תאי אנדותל ואסטרוציטים, עובר דרך נקבוביות הממברנה של הכנס.המעבר של NP110s הוא לכמת על ידי מדידת הפלואורסצנטיות מדגימות שנאספו הן בצד הדם והן בצד המוח, וערכים אלה מושווים אלה חלקיקים נחושים כי הם 350 ננומטר. כפי שניתן לראות, רק NP110s מסוגלים לחצות את חיקויי BBTB, בעוד NP350 נשאר בצד הדם, וכתוצאה מכך ערכי חברות נמוכים יותר עבור חלקיקים אלה. לטפל להוסיף בזהירות, בזהירות להפיץ את ההשעיה תא אסטרוציטים בצד המוח של הכנס ללא מגע ישיר של הממברנה.כל נזק של הממברנה יגרום לדליפה. שיטה זו יכולה להיות מותאמת כדי לענות על השאלה של אספקת המוח של מטענים מנוהלים היקפיים. באמצעות תוספות שונות עם נקבוביות ממברנה גדולות יותר, ניתן גם ללמוד פזרנות תאים.טכניקה זו ניתן לשנות באמצעות סוגי תאים שונים כדי לחקות מחסומים תאיים אחרים. זה גם סולל את הדרך למחקר אחראי ואתי יותר, שמטרתו להפחית את מספר חיות המעבדה המשמשות לאימות תרופות נגד סרטן. אנא זכרו כי paraformaldehyde הוא כימיקל רעיל מאוד ויש לטפל בו בהתאם.כמו כן, היזהר בעת שימוש אזמל חד כדי לחלץ את הממברנות מן מוסיף.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

ה<em&gt; תסיסנית</em&gt; דגם גידול דיסק דמותי: ויזואליזציה וכימות של ביטוי גנים סרטניים הפולשנות שימוש פסיפסים גנטי

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

אין ויוו הערכת EPR pH, pO2, מצב חמצון-חיזור, ואת ריכוזים של פוספט גלוטתיון ב Microenvironment הגידול

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

Fluorescence Molecular Tomography for In Vivo Imaging of Glioblastoma Xenografts

Fluorescence Molecular Tomography for In Vivo Imaging of Glioblastoma Xenografts

קרינה פלואורסצנטית טומוגרפיה מולקולרית עבור הדמיה In Vivo של גליובלסטומה Xenografts

Tumorigenicity is the capability of cancer cells to form a tumor mass. A widely used approach to determine if the cells are tumorigenic is by injecting ...

In Vivo Inhibition of MicroRNA to Decrease Tumor Growth in Mice

ב Vivo עיכוב של מיקרואורנה כדי להקטין את צמיחת הגידול בעכברים

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression through their ability to destabilize mRNA and inhibit translation of target mRNAs. An ...

Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs

שימוש משולב של הזנב וריד גרורה Assays ובזמן אמת ב Vivo הדמיה כדי לכמת מושבת סרטן השד ונטל בריאות

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification ...

In Vivo Targeting of Xenografted Human Cancer Cells with Functionalized Fluorescent Silica Nanoparticles in Zebrafish

ב Vivo מיקוד של תאים סרטניים אנושיים Xenografted עם חלקיקים פלורסנט פונקציונלי סיליקה ב דגי זברה

Developing nanoparticles capable of detecting, targeting, and destroying cancer cells is of great interest in the field of nanomedicine. In vivo animal ...

Using Computer-based Image Analysis to Improve Quantification of Lung Metastasis in the 4T1 Breast Cancer Model

שימוש בניתוח תמונה מבוסס מחשב כדי לשפר את כימות גרורות הריאות במודל סרטן השד 4T1

Breast cancer is a devastating malignancy, accounting for 40,000 female deaths and 30% of new female cancer diagnoses in the United States in 2019 alone. ...

Patient-Derived Tumor Explants As a "Live" Preclinical Platform for Predicting Drug Resistance in Patients

גידול שמקורו במטופל explants כפלטפורמה פרה-אקלינית "חיה" לחיזוי עמידות לתרופות בחולים

An understanding of drug resistance and the development of novel strategies to sensitize highly resistant cancers rely on the availability of suitable ...

Evaluation of the In vivo Antitumor Activity of Polyanhydride IL-1&#945; Nanoparticles

Evaluation of the In vivo Antitumor Activity of Polyanhydride IL-1ÃƒÅ½Ã‚Â± Nanoparticles

הערכת הפעילות האנטי-סרטנית In vivo של ננו-חלקיקים פוליאנהידריד IL-1α

Cytokine therapy is a promising immunotherapeutic strategy that can produce robust antitumor immune responses in cancer patients. The proinflammatory ...

Longitudinal Intravital Imaging Through Clear Silicone Windows

הדמיה תוך-ורידית אורכית דרך חלונות סיליקון שקופים

Intravital microscopy (IVM) enables visualization of cell movement, division, and death at single-cell resolution. IVM through surgically inserted imaging ...