Name: predicting in vivo payloads delivery using a blood-brain tumor-barrier in a dish
Uploaded: 2019-04-16T14:30:00
Duration: 13 min 34 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Predicting In Vivo Payloads Delivery using a Blood-brain Tumor-barrier in a Dish at JoVE.com

Questa ricerca è stata sostenuta da sovvenzioni da organizzazioni cancro finlandese, Jane & Aatos Erkko Foundation e Sigrid Juselius Foundation (P.L. e V.L.J.), la Swiss National Science Foundation (Advanced Postdoc.Mobility concedere no: P300PB_164732, a S. K.), la Fondazione di ricerca Orion (a S.K.), Maud Kuistila Memorial Foundation (a S.K.) e l'Accademia di Finlandia (TERVA 2017, concedere no: 314 498). L'unità di Imaging Biomedicum (Helsinki) è riconosciuto per fornire la formazione immagine di funzione di memoria di microscopia.

<ol>
	<li>Daneman, R., Prat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-brain+barrier.">The blood-brain barrier.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (1), a020412 (2015).</li><li>Quail, D. F., Joyce, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Microenvironmental+Landscape+of+Brain+Tumors.">The Microenvironmental Landscape of Brain Tumors.</a> Cancer Cell. 31 (3), 326-341 (2017).</li><li>Wang, Z., Sun, H., Yakisich, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+the+blood-brain+barrier+for+chemotherapy:+limitations,+challenges+and+rising+problems.">Overcoming the blood-brain barrier for chemotherapy: limitations, challenges and rising problems.</a> Anticancer Agents in Medicinal Chemistry. 14 (8), 1085-1093 (2014).</li><li>Alkins, R. D., Brodersen, P. M., Sodhi, R. N., Hynynen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+drug+delivery+for+boron+neutron+capture+therapy+of+brain+tumors+with+focused+ultrasound.">Enhancing drug delivery for boron neutron capture therapy of brain tumors with focused ultrasound.</a> Neuro Oncology. 15 (9), 1225-1235 (2013).</li><li>Alli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brainstem+blood+brain+barrier+disruption+using+focused+ultrasound:+A+demonstration+of+feasibility+and+enhanced+doxorubicin+delivery.">Brainstem blood brain barrier disruption using focused ultrasound: A demonstration of feasibility and enhanced doxorubicin delivery.</a> Journal of Controlled Release. 281, 29-41 (2018).</li><li>Ashby, L. S., Smith, K. A., Stea, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gliadel+wafer+implantation+combined+with+standard+radiotherapy+and+concurrent+followed+by+adjuvant+temozolomide+for+treatment+of+newly+diagnosed+high-grade+glioma:+a+systematic+literature+review.">Gliadel wafer implantation combined with standard radiotherapy and concurrent followed by adjuvant temozolomide for treatment of newly diagnosed high-grade glioma: a systematic literature review.</a> World Journal of Surgical Oncology. 14 (1), 225 (2016).</li><li>Guishard, A. F., Yakisich, J. S., Azad, N., Iyer, A. K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+gap+in+ongoing+clinical+trials+for+glioma.">Translational gap in ongoing clinical trials for glioma.</a> Journal of Clinical Neurosciences. 47, 28-42 (2018).</li><li>Rahman, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalized+endothelial+cell+lines+for+in+vitro+blood-brain+barrier+models:+A+systematic+review.">Immortalized endothelial cell lines for in vitro blood-brain barrier models: A systematic review.</a> Brain Research. 1642, 532-545 (2016).</li><li>Helms, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+of+the+blood-brain+barrier:+An+overview+of+commonly+used+brain+endothelial+cell+culture+models+and+guidelines+for+their+use.">In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 36 (5), 862-890 (2016).</li><li>Wang, J. D., Khafagy, e. l. -. S., Khanafer, K., Takayama, S., ElSayed, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+Endothelial+Cells,+Pericytes,+and+Astrocytes+into+a+3D+Microfluidic+in+Vitro+Model+of+the+Blood-Brain+Barrier.">Organization of Endothelial Cells, Pericytes, and Astrocytes into a 3D Microfluidic in Vitro Model of the Blood-Brain Barrier.</a> Molecular Pharmaceutics. 13 (3), 895-906 (2016).</li><li>Phan, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier-on-a-chip:+Microphysiological+systems+that+capture+the+complexity+of+the+blood-central+nervous+system+interface.">Blood-brain barrier-on-a-chip: Microphysiological systems that capture the complexity of the blood-central nervous system interface.</a> Experimental Biology and Medicine (Maywood). 242 (17), 1669-1678 (2017).</li><li>Bang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Low+Permeability+Microfluidic+Blood-Brain+Barrier+Platform+with+Direct+Contact+between+Perfusable+Vascular+Network+and+Astrocytes.">A Low Permeability Microfluidic Blood-Brain Barrier Platform with Direct Contact between Perfusable Vascular Network and Astrocytes.</a> Scientific Reports. 7 (1), 8083 (2017).</li><li>Wilhelm, I., Krizbai, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+of+the+blood-brain+barrier+for+the+study+of+drug+delivery+to+the+brain.">In vitro models of the blood-brain barrier for the study of drug delivery to the brain.</a> Molecular Pharmacology. 11 (7), 1949-1963 (2014).</li><li>Campisi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+self-organized+microvascular+model+of+the+human+blood-brain+barrier+with+endothelial+cells,+pericytes+and+astrocytes.">3D self-organized microvascular model of the human blood-brain barrier with endothelial cells, pericytes and astrocytes.</a> Biomaterials. 180, 117-129 (2018).</li><li>Pirsko, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Effect+of+Culture+Media+on+Epithelial+Differentiation+Markers+in+Breast+Cancer+Cell+Lines+MCF7,+MDA-MB-436+and+SkBr3.">An Effect of Culture Media on Epithelial Differentiation Markers in Breast Cancer Cell Lines MCF7, MDA-MB-436 and SkBr3.</a> Medicina (Kaunas). 54 (2), (2018).</li><li>Stebbins, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+and+characterization+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+brain+microvascular+endothelial+cells.">Differentiation and characterization of human pluripotent stem cell-derived brain microvascular endothelial cells.</a> Methods. 101, 93-102 (2016).</li><li>Canfield, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+isogenic+blood-brain+barrier+model+comprising+brain+endothelial+cells,+astrocytes,+and+neurons+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">An isogenic blood-brain barrier model comprising brain endothelial cells, astrocytes, and neurons derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Journal of Neurochemistry. 140 (6), 874-888 (2017).</li><li>Cao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-inducible+factor-1alpha+is+involved+in+isoflurane-induced+blood-brain+barrier+disruption+in+aged+rats+model+of+POCD.">Hypoxia-inducible factor-1alpha is involved in isoflurane-induced blood-brain barrier disruption in aged rats model of POCD.</a> Behavioural Brain Research. 339, 39-46 (2018).</li><li>Abbott, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte-endothelial+interactions+and+blood-brain+barrier+permeability.">Astrocyte-endothelial interactions and blood-brain barrier permeability.</a> Journal of Anatomy. 200 (6), 629-638 (2002).</li><li>Kinnari, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+homing+peptide-functionalized+porous+silicon+nanovectors+for+cancer+therapy.">Tumour homing peptide-functionalized porous silicon nanovectors for cancer therapy.</a> Biomaterials. 34 (36), 9134-9141 (2013).</li><li>Levin, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personalized+medicine+in+neuro-oncology.">Personalized medicine in neuro-oncology.</a> CNS Oncology. 5 (2), 55-58 (2016).</li><li>Weathers, S. S., Gilbert, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+Personalized+Targeted+Therapeutics:+An+Overview.">Toward Personalized Targeted Therapeutics: An Overview.</a> Neurotherapeutics. 14 (2), 256-264 (2017).</li><li>O'Duibhir, E., Carragher, N. O., Pollard, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerating+glioblastoma+drug+discovery:+Convergence+of+patient-derived+models,+genome+editing+and+phenotypic+screening.">Accelerating glioblastoma drug discovery: Convergence of patient-derived models, genome editing and phenotypic screening.</a> Molecular and Cellular Neuroscience. 80, 198-207 (2017).</li><li>Kaya, M., Ahishali, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+permeability+in+barrier+type+of+endothelium+in+brain+using+tracers:+Evans+blue,+sodium+fluorescein,+and+horseradish+peroxidase.">Assessment of permeability in barrier type of endothelium in brain using tracers: Evans blue, sodium fluorescein, and horseradish peroxidase.</a> Methods in Molecular Biology. 763, 369-382 (2011).</li><li>Yang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+two+immortalized+cell+lines,+ECV304+and+bEnd3,+for+in+vitro+permeability+studies+of+blood-brain+barrier.">Identification of two immortalized cell lines, ECV304 and bEnd3, for in vitro permeability studies of blood-brain barrier.</a> PLoS One. 12 (10), e0187017 (2017).</li><li>Blouw, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hypoxic+response+of+tumors+is+dependent+on+their+microenvironment.">The hypoxic response of tumors is dependent on their microenvironment.</a> Cancer Cell. 4 (2), 133-146 (2003).</li><li>Argaw, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte-derived+VEGF-A+drives+blood-brain+barrier+disruption+in+CNS+inflammatory+disease.">Astrocyte-derived VEGF-A drives blood-brain barrier disruption in CNS inflammatory disease.</a> Journal of Clinical Investigation. 122 (7), 2454-2468 (2012).</li><li>Miao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF+increases+paracellular+permeability+in+brain+endothelial+cells+via+upregulation+of+EphA2.">VEGF increases paracellular permeability in brain endothelial cells via upregulation of EphA2.</a> The Anatomical Record (Hoboken). 297 (5), 964-972 (2014).</li><li>Heinolainen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGFR3+Modulates+Vascular+Permeability+by+Controlling+VEGF/VEGFR2+Signaling.">VEGFR3 Modulates Vascular Permeability by Controlling VEGF/VEGFR2 Signaling.</a> Circulation Research. 120 (9), 1414-1425 (2017).</li><li>Claesson-Welsh, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+permeability--the+essentials.">Vascular permeability--the essentials.</a> Upsala Journal of Medical Sciences. 120 (3), 135-143 (2015).</li><li>Adriani, G., Ma, D., Pavesi, A., Goh, E. L., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+the+Blood-Brain+Barrier+in+a+3D+triple+co-culture+microfluidic+system.">Modeling the Blood-Brain Barrier in a 3D triple co-culture microfluidic system.</a> Conference Proceedings - IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. 2015, 338-341 (2015).</li><li>Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hCMEC/D3+cell+line+as+a+model+of+the+human+blood+brain+barrier.">The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier.</a> Fluids and Barriers of the CNS. 10 (1), 16 (2013).</li><li>Paatero, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyses+in+zebrafish+embryos+reveal+that+nanotoxicity+profiles+are+dependent+on+surface-functionalization+controlled+penetrance+of+biological+membranes.">Analyses in zebrafish embryos reveal that nanotoxicity profiles are dependent on surface-functionalization controlled penetrance of biological membranes.</a> Scientific Reports. 7 (1), 8423 (2017).</li><li>Prabhakar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimuli-responsive+hybrid+nanocarriers+developed+by+controllable+integration+of+hyperbranched+PEI+with+mesoporous+silica+nanoparticles+for+sustained+intracellular+siRNA+delivery.">Stimuli-responsive hybrid nanocarriers developed by controllable integration of hyperbranched PEI with mesoporous silica nanoparticles for sustained intracellular siRNA delivery.</a> International Journal of Nanomedicine. 11, 6591-6608 (2016).</li><li>Hyvonen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+target+for+peptide-based+imaging+and+treatment+of+brain+tumors.">Novel target for peptide-based imaging and treatment of brain tumors.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 13 (4), 996-1007 (2014).</li><li>Feng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammary-Derived+Growth+Inhibitor+Targeting+Peptide-Modified+PEG-PLA+Nanoparticles+for+Enhanced+Targeted+Glioblastoma+Therapy.">Mammary-Derived Growth Inhibitor Targeting Peptide-Modified PEG-PLA Nanoparticles for Enhanced Targeted Glioblastoma Therapy.</a> Bioconjugate Chemistry. 26 (8), 1850-1861 (2015).</li><li>Nance, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dense+poly(ethylene+glycol)+coating+improves+penetration+of+large+polymeric+nanoparticles+within+brain+tissue.">A dense poly(ethylene glycol) coating improves penetration of large polymeric nanoparticles within brain tissue.</a> Science Translational Medicine. 4 (149), 149rA119 (2012).</li><li>Berg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+nanoparticle+transport+through+in+vitro+blood-brain+barrier+models.">Quantitative analysis of nanoparticle transport through in vitro blood-brain barrier models.</a> Tissue Barriers. 4 (1), e1143545 (2016).</li><li>Noumbissi, M. E., Galasso, B., Stins, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+vascular+heterogeneity:+implications+for+disease+pathogenesis+and+design+of+in+vitro+blood-brain+barrier+models.">Brain vascular heterogeneity: implications for disease pathogenesis and design of in vitro blood-brain barrier models.</a> Fluids and Barriers of the CNS. 15 (1), 12 (2018).</li><li>Heymans, M., Sevin, E., Gosselet, F., Lundquist, S., Culot, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mimicking+brain+tissue+binding+in+an+in+vitro+model+of+the+blood-brain+barrier+illustrates+differences+between+in+vitro+and+in+vivo+methods+for+assessing+the+rate+of+brain+penetration.">Mimicking brain tissue binding in an in vitro model of the blood-brain barrier illustrates differences between in vitro and in vivo methods for assessing the rate of brain penetration.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 127, 453-461 (2018).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

L'ascesa del concetto di variabilità interpaziente tumore ringiovanito la ricerca sul cancro personalizzata medicina21. Questa variabilità è anche un segno distintivo di neoplasie del sistema nervoso centrale. Dovuto l'imprevedibilità del tumore, la risposta alla chemioterapia aggiunge all'effetto che ripara della BBB per il drug delivery e costituisce complessivamente grandi sfide nella cura del paziente22. Al fine di sviluppare terapie più efficaci, è spesso necessario librerie di grandi dimensioni di schermo di nuove molecole. Per valutare l'efficacia antitumorale e la capacità dei nuovi cavi terapeutici per raggiungere il sito del tumore, l'opzione migliore è lo studio preclinico su cellule derivate paziente impiantato in vivo nel paziente murino avatar. A causa di pratiche (risorse finanziarie, di tempo, umani e struttura) e motivi etici (principio 3R quando si utilizza animali da laboratorio), lo sviluppo di una piattaforma di screening in vivo su larga scala spesso non è possibile e conseguenza, l'analisi cell-based rimangono un modello di scelta23. Il motivo principale per la selezione di linee cellulari stabilizzate ed evitare le cellule primarie è per facilitare la riproducibilità e ridurre l'uso di animali da laboratorio, che sono la fonte principale per l'isolamento e l'istituzione di colture primarie di murini. I metodi che presentano qui, saldamente conforme le 3R, potrebbero scartare in modo efficiente nanoparticelle da un'ulteriore indagine preclinica sul criterium della loro incapacità di attraversare il modello YHBHU. Come un prova-de-principio, descriviamo qui i risultati ottenuti durante lo sviluppo e la convalida della YHBHU. Siamo stati in grado di confermare i risultati in vitro e in vivo, per esempio quando si misura la diffusione passiva di una 376 Da sodio-fluorescina.
Il protocollo descritto in questo articolo descrive la preparazione delle cellule endoteliali cocultured con gli astrociti per formare un'interfaccia simil-tumorale-barriera emato-encefalica in un'installazione in vitro. Una volta stabilito un contatto fisico tra questi due tipi di cellule, lo strato delle cellule endoteliali esibisce le somiglianze con il BBB (ad esempio, una cella espressione di superficie delle proteine di giunzione stretta e relativamente bassa permeabilità). È interessante notare che, il mimic YHBHU murino sembrava fornire valori di permeabilità Na-Fl particolarmente simili a quelli ottenuti con il topo in vivo BBB permeabilità misure24. Di conseguenza, le prestazioni dei Mimic di YHBHU saranno direttamente collegata alla scelta delle celle utilizzate per formare la barriera. Le cellule endoteliali bEND3 provengono dal cervello e sono noti per essere riuscito a formare barriere quando cocultured con gli astrociti25. Tuttavia, utilizziamo l'immortalizzate HIFko astrociti26 per generare il mimic di YHBHU. A causa della loro mancanza del fattore ipossia-inducibile, questi astrociti non producono VEGF-A, che è per eccellenza in termini di stabilizzazione del mimic YHBHU descritto qui. Gli astrociti sono stati identificati come modulatori della permeabilità BBB, per esempio attraverso il rilascio di VEGF-A in risposta a neuroinflammation27. L'attivazione dei recettori del fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGFRs) è un regolatore chiave della permeabilità endoteliale/vascolare sia in vitro28 e in vivo29. Pertanto, integratori di VEGF-A nel mezzo di attivano il VEGFR2 sulle cellule endoteliali, che induce la fosforilazione delle proteine di giunzione dei adherens come VE-caderina30. La perdita di contatti cellula-cellula endoteliale genera ad alta permeabilità dei vasi sanguigni. Allo stesso modo, sia la forte proprietà mitogenica e composizione sconosciuta dei sieri bovini fetali utilizzato nelle analisi di cultura cellulare causare grossi problemi nella riproducibilità di stabilizzazione e dosaggio di barriera.
Le cellule endoteliali di vena ombelicale umana (HUVECs) vengono talvolta utilizzate per formare BBB in vitro31; Tuttavia, differiscono significativamente da cellule endoteliali microvascolari del cervello, come la cella di hCMEC/D3 linea32, in termini di espressione genica e che formano barriera proprietà. Tuttavia, la permeabilità relativamente più elevata i valori ottenuti con le cellule di HuAR2T sviluppate da solo rispetto alla bEND3 notevolmente sono stati ridotti da li coculturing con astrociti di umani. Sebbene le cellule endoteliali sono tenute a formare la parete cellulare, è chiaro che gli astrociti hanno un ruolo altrettanto importante per la formazione di YHBHU e stabilizzazione.
Quando le sfere di glioma paziente-derivati sono stati aggiunti a questa equazione, si ricapitola il mimic di YHBHU del mouse alcune delle caratteristiche degli xenotrapianti murini, quali la diffusione di droga attraverso il sistema vascolare del cervello e il targeting di cellula tumorale. I mimic di YHBHU discussi qui erano, per esempio, successo in mirroring il comportamento in vivo quando abbiamo proiettato nanoparticelle diverse con differenti diametri. Per illustrare il parallelismo tra i modelli in vitro e in vivo, abbiamo usato il precedentemente descritti mesoporosi silicato nanoparticelle33 con cellula-penetrante proprietà34 coniugato al peptide targeting tumorale CooP il loro surface20. Le case di peptide CooP-targeting alle cellule del tumore invasivo attraverso il legame specifico con l'inibitore di crescita mammaria-derivato (MDGI). Parecchi cancri, compreso i gliomi, sono che overexpressing MDGI rispetto al tessuto normale35, che rende la CooP una frazione di targeting tumorale molto efficiente in grado di aumentare la consegna di un carico utile di20. Le nanoparticelle utilizzate qui sono state indicate precedentemente per diffondere nel parenchima cerebrale (27547955), e quando funzionalizzati con Taxol, questi nano-carichi hanno avuto successo nella riduzione della crescita del glioma in modelli preclinici36. L'aggiunta di glicole polietilenico (PEG) residui sulla superficie delle nanoparticelle anche mantenuto la loro carica statica ai valori positivi (intorno + 4 mV), consentendo la migliore interazione con l' unità neurovascolare37 e anche aumentando la loro stabilità in circolazione. Nei dati presentati, 3 kDa di PEG è stato coniugato al NP110s, mentre NP350s sono stati rivestiti con 10 kDa di PEG. Tuttavia, aumentato peso molecolare PEG inoltre ha provocato un significativo aumento del diametro delle nanoparticelle, quindi le loro capacità fisiche di attraversare la BBB. Di conseguenza, abbiamo controllato se le dimensioni fisiche delle particelle impedito loro passaggio attraverso il YHBHU e se queste osservazioni potrebbero riflettersi in vivo.
Secondo le osservazioni precedentemente pubblicate, abbiamo osservato che NP110s extravasated attraverso sia il YHBHU in vitro e la BBB di topi che sopportano i tumori intracranici, mentre NP350s mantenuto dal lato luminal del mimic di YHBHU e nei vasi sanguigni della topi. Questi risultati simili suggeriscono fortemente che il modello di YHBHU previsto la possibilità in vivo di nanoparticelle di attraversare la BBB e raggiungere il cervello.
La rilevanza di modelli cellulari della BBB è spesso discussa, anche per l'andanatura centrale di nanoparticelle38. Indichiamo qui che astrociti e cellule endoteliali, entrambi considerati come i più rilevanti strumenti in vitro, possono essere sostituite dalle cellule immortalizzate e/o disponibili in commercio, garantendo riproducibilità e una maggiore scalabilità. La prossima generazione dei Mimic BBB in vitro potrebbe essere sviluppata incorporando i dispositivi microfluidici, consentendo unità neurovascolare splendidamente formata che assomigliano strutturalmente le effettive BBB12,14. Tuttavia, tali modelli sono attualmente inadatti per lo screening di alto-rendimento delle molecole consegnato ai gliomas, a causa di limitazioni tecniche presenti nel follow-up della consegna14. È infatti difficile catturare la complessità fisiologica della BBB in un piatto, e la possibile mancanza di alcuni recettori e proteine, conosciuto per essere espresso da BBB, potrebbe compromettere l'interpretazione dei risultati. Un altro argomento riguarda la grande variabilità nell'espressione genica tra condizioni in vivo e in vitro, così come da una cellula a altra, soprattutto considerando le cellule endoteliali. Tuttavia, si potrebbe anche sostenere che l'unità neurovascolare non è un'entità uniforme all'interno del cervello39. Ricerca scientifica in biologia ha raggiunto una era umana dove il benessere degli animali, responsabilità etica e il costo di utilizzo vite animali sono sempre considerati prima di progettare un esperimento. Pertanto, per supportare la sostituzione degli animali, un numero crescente di studi recenti Mostra che la consapevolezza dei limiti dei modelli e un'attenta selezione di modelli cellulari per stabilire la barriera — con un'enfasi su astrociti — garantisce un corrispondenza tra i risultati ottenuti in un piatto e nell'animale modelli40. Con la metodologia descritta qui, otteniamo un passo avanti verso la riduzione del numero degli animali sperimentali utilizzati per scopi di transcitosi BBB per terapeutica potenziale di screening.

L'unità neurovascolare è composto da neuroni, astrociti e la BBB, formata da complesse connessioni tra periciti, astrociti, cellule endoteliali e la membrana basale associata formando il cervello microvasculature1. Questa stretta parete cellulare formata da continui, fenestrati vasi finemente regola il movimento di ioni e molecole (compresi gli ormoni, le sostanze nutrienti o farmaci), ma anche di fare circolare le cellule1. La transcitosi considerevolmente bassa attraverso la BBB di molecole ad alto peso molecolare, quali gli anticorpi terapeutici, i coniugati di droga o nanocompounds, limitano drasticamente i progressi nella scoperta di farmaci per le malattie neurologiche, tra cui maligno gliomi2. Infatti, per via orale o per via endovenosa consegnate chemioterapie raggiungono il parenchima cerebrale spesso alle concentrazioni sufficientemente basse per indurre un effetto antitumorale o sono semplicemente in grado di attraversare la YHBHU per raggiungere le cellule neoplastiche3. Parecchi studi preclinici e clinici non hanno affrontato il problema della penetrazione di YHBHU ma hanno tentato di perturbare la YHBHU transitoriamente, ad esempio utilizzando gli ultrasuoni focalizzati4,5, o per aggirarlo direttamente in situ consegna di farmaci6. Tuttavia, nessuna di queste tecniche sono state in grado di contrastare l'espansione di inevitabile del tumore o di ricaduta. Pertanto, durante lo sviluppo di nuove terapie antiglioma, la diffusione attraverso il YHBHU dovrebbe essere considerata come uno degli aspetti critici per il successo della fornitura di agenti terapeutici7.
A causa della natura complessa delle interazioni delle cellule all'interno del YHBHU, studi in vivo su animali da laboratorio sembrano essere la scelta più ovvia quando si studia il passaggio delle molecole dal sangue al cervello. Tuttavia, metodi in vivo su larga scala sono relativamente complesse da stabilire e, pertanto, non consentono la proiezione di alto-rendimento delle molecole in un tempo ragionevole ad un costo ragionevole. Ancora più importante, la sperimentazione animale deve seguire le linee guida etiche di 3R definita come rifinire i), ii) ridurre e, di rilevanza per il contesto corrente, iii) sostituire con protocolli alternativi (ad es., in vitro/in silico metodi). Di conseguenza, ricreando il YHBHU in vitro appare come una possibilità interessante e attraente, ma costituisce anche un compito complesso sfidato da varie limitazioni. Molti tentativi di ricreare questo complesso comparto con cellule in coltura primaria o linee cellulari da canino, porcina, origine murina e anche umano sono stati pubblicati (come Recensito da Rodriguez et al.8 e Helms et al.9). Questi modelli includono tridimensionale microfluidici sistemi10, BBB-on-a-chip11,12, e una moltitudine di varianti basate sulle co-colture del classiche in inserti sistemi. Tuttavia, sistemi microfluidici e chip attuali o non sono adatti per rapid, high throughput droga-convalida studi13,14 o sono attualmente incompatibile con gli studi di drug delivery ai tumori cerebrali. Inoltre, la revisione di 155 modelli pubblicati utilizzando cellule primarie, inducibile staminali pluripotenti (iPSC) o linee cellulari commerciali co-coltivate su tutti gli inserti ha mostrato una tendenza per interstudy discrepanza nelle loro misure e/o conclusioni8. Questa mancanza di riproducibilità interlaboratorio potrebbe essere correlata con le condizioni di coltura i) nonnormalized, per esempio con il rivestimento opzionale con proteine della matrice della membrana dello scantinato nel recipiente della cella cultura, ii) un numero aumentato di sottocultura e utilizzo di siero contenente media, entrambi i piloti principali delle modificazioni genetiche e fenotipiche delle cellule linee15, o iii) la difficoltà di riproducibile ricreare il giusto equilibrio fra il astroglial e componenti endoteliali in un piatto. Sebbene l'uso di cellule immortalizzate o cella commerciale linee per stabilire un modello in vitro di BBB manca di alcune delle proprietà rispetto a modelli simili che utilizzano solo le cellule primarie, nel metodo descritto ci mostra che la giusta combinazione di cellule mostre un molto prestazioni paragonabili a studi pubblicati in altri modelli di riferimento16,17. Alla fine, la mancanza di un modello affidabile e riproducibile per studiare il passaggio dei composti terapeutici targeting per tumori cerebrali attraverso la YHBHU ci ha motivato a sviluppare i metodi descritti qui.
Poiché l'obiettivo era quello di utilizzare il modello per prevedere la somministrazione in vivo di nanoparticelle in modelli animali preclinici, abbiamo prima validato il modello di YHBHU utilizzando inserti contenenti cellule murine endoteliale a contatto con gli astrociti murini. Oltre a questo, abbiamo ottimizzato anche il modello per l'utilizzo di alcune linee cellulari umane. Una volta stabilizzato, le barriere di cella vengono trasferite alle culture con sfere di glioblastoma paziente-derivati o linee cellulari di glioma commerciale. Da allora in poi, la transcitosi di nanoparticelle e targeting di cellula tumorale possono essere visualizzate da microscopia confocal e quantificato attraverso la raccolta di campioni nel corso del tempo. D'importanza, risultati ottenuti utilizzando i mimic di YHBHU potrebbero prevedere in modo affidabile il comportamento delle nanoparticelle in vivo, sostiene l'uso del Priore mimico YHBHU la validazione preclinica.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1761px;" width="1761">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:1761px;">Cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">bEND3</td>
			<td style="width:239px;">ATCC</td>
			<td style="width:273px;">CRL-2299</td>
			<td style="width:961px;">Cultured in: DMEM (1g/L glucose) supplemented with 10% FBS, 5 mL L-glutamine and 5 mL penicillin/streptomycin</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">HIFko immortalized mouse astrocytes</td>
			<td style="width:239px;">Isolated in Dr. Gabriele Bergers Lab</td>
			<td style="width:273px;">https://doi.org/10.1016/S1535-6108(03)00194-6</td>
			<td style="width:961px;">Cultured in: BME-1 supplemented with 5% FBS, 5 mL 1 M HEPES, 5 mL 100 mM sodium pyruvate, 3 g D-glucose and 5 mL penicillin/streptomycin</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">HuAR2T</td>
			<td style="width:239px;">Isolated in Dr. Dagmar Wirth Lab</td>
			<td style="width:273px;">https://doi.org/10.1089/ten.tea.2009.0184</td>
			<td style="width:961px;">Cultured in: EBM-2 with SupplementMix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">normal human primary astrocytes</td>
			<td style="width:239px;">Lonza</td>
			<td style="width:273px;">CC-2565</td>
			<td style="width:961px;">Cultured in: ABM with SingleQuots</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:1761px;">Material and reagents</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100x17mm Dish, Nunclon Delta</td>
			<td style="width:239px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td>150350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">10 mL serological pipet</td>
			<td style="width:239px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:273px;">170361</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">15mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:239px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:273px;">339650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">ABM Basal Medium, 500 mL</td>
			<td style="width:239px;">Lonza</td>
			<td style="width:273px;">CC-3187</td>
			<td>For primary human astrocytes. ABM+: contains all the additives from the supplement mix. ABM-:all the additives except for rhEGF and FBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Accutase Cell Detachment Solution</td>
			<td style="width:239px;">Corning</td>
			<td style="width:273px;">25-058-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">AGM SingleQuots Supplements and Growth Factors</td>
			<td style="width:239px;">Lonza</td>
			<td>CC-4123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">B27 supplement</td>
			<td style="width:239px;">Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>for both GBM + and - medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Basal Medium Eagle</td>
			<td style="width:239px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:273px;">21010046</td>
			<td>BME-1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Corning Costar TC-Treated 6-Well Plates</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:273px;">CLS3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">Corning Transwell polyester membrane cell culture inserts</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:273px;">CLS3452&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">D-glucose</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:273px;">G8270</td>
			<td>dissolve in 50 mL of BME-1 and sterile filter before adding to the medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium/Nutrient F-12 Ham</td>
			<td style="width:239px;">Gibco</td>
			<td>21331-020</td>
			<td>Specific to the culture of the patient-derived spheres isolated in our lab, may vary for other glioma cell lines</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EBM-2 growth Medium SupplementMix</td>
			<td style="width:239px;">PromoCell</td>
			<td style="width:273px;">c-39216</td>
			<td>EBM+: contains all the additives from the supplement mix. EBM-:all the additives except for VEGF-A and FBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Endothelial Basal Medium 2 (EBM-2)</td>
			<td style="width:239px;">PromoCell</td>
			<td style="width:273px;">c-22211</td>
			<td>EBM+: contains all the additives from the supplement mix. EBM-:all the additives except for VEGF-A and FBS</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:288px;">Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin</td>
			<td style="width:239px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:273px;">10500056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Fluorescein sodium salt</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:273px;">F6377</td>
			<td style="width:961px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Greiner CELLSTAR 96 well plates</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:273px;">Greiner 655090</td>
			<td>black polystyrene wells flat bottom (with micro-clear bottom)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">Menzel-Gl&#228;ser 0.9 cm round borosilicate Cover Slips</td>
			<td style="width:239px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:273px;">10313573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">PBS tablets</td>
			<td style="width:239px;">Medicago</td>
			<td>09-9400-100</td>
			<td>one tablet per liter of dH2O, then sterilize the solution by autoclaving</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Poly-D-lysine hydrobromide</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6407&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Recombinant Human EGF</td>
			<td style="width:239px;">Peprotech</td>
			<td style="width:273px;">GMP100-15</td>
			<td>for GBM+ medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.)</td>
			<td style="width:239px;">Peprotech</td>
			<td style="width:273px;">100-18B</td>
			<td>for GBM+ medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Immunofluorescence</td>
			<td style="width:239px;"></td>
			<td style="width:273px;"></td>
			<td style="width:961px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:273px;">158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;width:288px;">24 x 60 mm microscope slide cover glass</td>
			<td style="width:239px;">ORSAtec</td>
			<td style="width:273px;">0224601-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:288px;">AlexaFluor 488 and 594 secondary antibodies</td>
			<td style="width:239px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:273px;"></td>
			<td>dilution: 1/500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Anti-Claudin-5 antibody</td>
			<td style="width:239px;">Abcam</td>
			<td style="width:273px;">ab15106</td>
			<td>dilution: 1/150</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Anti-GFAP antibody clone GF5</td>
			<td style="width:239px;">Abcam</td>
			<td style="width:273px;">ab10062</td>
			<td>dilution: 1/150</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">Anti-Mouse CD31&#160;antibody Clone MEC 13.3</td>
			<td style="width:239px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:273px;">550274</td>
			<td>dilution 1/800</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Anti-SV40 T-antigen antibody</td>
			<td style="width:239px;">Abcam</td>
			<td style="width:273px;">ab16879</td>
			<td>dilution: 1/150</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Anti-Zonula Occludens-1</td>
			<td style="width:239px;">Abcam</td>
			<td style="width:273px;">ab96587</td>
			<td>dilution: 1/200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">DAPI</td>
			<td style="width:239px;">TOCRIS</td>
			<td style="width:273px;">5748</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">Fluoromount Aqueous Mounting Medium&#160;</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:273px;">F4680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">LysoTracker Red DND-99</td>
			<td style="width:239px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:273px;">L7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Animal procedures</td>
			<td style="width:239px;"></td>
			<td style="width:273px;"></td>
			<td style="width:961px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">10 cm curved dissecting scissors</td>
			<td style="width:239px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:273px;">14394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">BD Microlance 25-gauge needles</td>
			<td style="width:239px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:273px;">300600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Fine Forceps (12.5 cm)</td>
			<td style="width:239px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:273px;">503283</td>
			<td>for tissue dissociation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Intramedic Polyethylene tubing PE20</td>
			<td style="width:239px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:273px;">427406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Ketaminol vet 50 mg/mL</td>
			<td style="width:239px;">Intervet</td>
			<td style="width:273px;">Vnr511485</td>
			<td>Ketamine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Mains Powered microdrill</td>
			<td style="width:239px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:273px;">503599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">Menzel-Gl&#228;ser 0.5 cm round borosilicate Cover Slips</td>
			<td style="width:239px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:273px;">11888372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Micro Bulldog clamp</td>
			<td style="width:239px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:273px;">14119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">Physiological saline solution</td>
			<td style="width:239px;">Mustela</td>
			<td style="width:273px;">Sterile single dose vials 20 x 5 mL / 40 x 5 mL - Medical device class</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Rochester-Oschner forceps</td>
			<td style="width:239px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:273px;">501709</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Rompun vet 20 mg/mL</td>
			<td style="width:239px;">Intervet</td>
			<td style="width:273px;">Vnr148999</td>
			<td>Xylazine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Stereotaxic adapter</td>
			<td style="width:239px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:273px;">502063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Sugi Sponge Points</td>
			<td style="width:239px;">Kettenbach</td>
			<td style="width:273px;">31603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Equipment</td>
			<td style="width:239px;"></td>
			<td style="width:273px;"></td>
			<td style="width:961px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">Axio Zoom.V16 fluorescence stereo zoom microscope&#160;</td>
			<td style="width:239px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:273px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">FLUOstar Omega microplate reader</td>
			<td style="width:239px;">BMG Labtech</td>
			<td style="width:273px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">ORCA-Flash 4.0 digital sCMOS camera</td>
			<td style="width:239px;">Hamamatsu Photonics</td>
			<td style="width:273px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Universal 320 tabletop centrifuge&#160;</td>
			<td style="width:239px;">Hettich</td>
			<td style="width:273px;">Cat. No. 1401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">ZEISS LSM 880 with Airyscan confocal microscope</td>
			<td style="width:239px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:273px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

predicting in vivo payloads delivery using a blood-brain tumor-barrier in a dish

Altamente selettivo per natura, emato - encefalica (BBB) è essenziale per l'omeostasi del cervello in condizioni fisiologiche. Tuttavia, nell'ambito dei tumori cerebrali, la selettività molecolare di BBB protegge anche le cellule neoplastici bloccando la consegna di chemioterapie marginalmente amministrate. Lo sviluppo di nuovi farmaci (tra cui nanoparticelle) targeting per i tumori cerebrali maligni idealmente richiede l'utilizzo di modelli animali preclinici per studiare transcitosi efficacia antitumorale e della droga. Al fine di rispettare il principio di 3R (perfezionare, ridurre e sostituire) per ridurre il numero degli animali da laboratorio nella messa a punto sperimentale ed eseguire lo screening ad alta resa di una vasta libreria di agenti antitumorali, abbiamo sviluppato un essere umano in vitro riproducibile e mimic murino di tumore-barriera emato-encefalica (YHBHU) utilizzando colture a tre strati di cellule endoteliali, astrociti e sfere di glioblastoma paziente-derivato. Per una maggiore scalabilità e riproducibilità, linee cellulari commerciali o cellule immortalizzate sono state utilizzate in condizioni su misura per permettere la formazione di una barriera simile a BBB effettivo. Qui descriviamo un protocollo per ottenere un mimo di YHBHU coltivando le cellule endoteliali a contatto con gli astrociti a densità di cella specifica sugli inserti. La mimica di YHBHU può essere utilizzato, ad esempio, per la quantificazione e la formazione immagine confocal di passaggio delle nanoparticelle attraverso le barriere endoteliali e astrocytic, oltre alla valutazione di targeting delle cellule del tumore all'interno della stessa analisi. Inoltre, mostriamo i dati ottenuti possono essere utilizzati per prevedere il comportamento delle nanoparticelle nei modelli animali preclinici. In una prospettiva più ampia, questo modello in vitro potrebbe essere adattato ad altre malattie neurodegenerative per la determinazione del passaggio di nuove molecole terapeutiche attraverso la BBB e/o essere integrato con cervello organoids per valutare direttamente l'efficacia di farmaci.

Formazione immagine confocal del mimic YHBHU murino Mostra l'espressione e la localizzazione cellulare della giunzione stretta proteine zonula occludens-1 (ZO-1) e claudin-5 in bEND3. Contatti tra le cellule endoteliali e astrociti indotto chiaramente la rilocazione della ZO-1 e claudin-5 per i contatti cellula-cellula endoteliale rispetto per le monocolture di bEND3 (Figura 1). Utilizzando l'immunofluorescenza che macchia per visualizzare gli astrociti GFAP-esprimendo il cervello-lato della membrana, è possibile osservare e studiare i processi astrocitari e puntali contattando le cellule endoteliali attraverso la membrana (Figura 1E ). I contatti di Astrocita-endothelial delle cellule sono conosciuti per promuovere e stabilizzare il serraggio della barriera cellulare e sono associati con i valori più bassi di permeabilità del BBB19. In conformità con quello, abbiamo osservato una sostanziale diminuzione della permeabilità del mimic di YHBHU del mouse per la Na-Fl da 27,63 (± 3.45) x 10-6 cm/s in caso di monocolture a 6,74 (± 3.01) x 10-6 cm/s quando co-coltivate con ipossia-viscoelastico fattore knock out astrociti (HIFko) (tabella 1). Il HuAR2T immortalata formano barriere cellulari altamente permeabili (104.92 ± 27,1 x 10-6 cm/s, tabella 1). Simile al modello murino, abbiamo misurato la permeabilità significativamente più basso di YHBHU a Na-Fl, vale a dire (± 14,32) di 47,4 x 10-6 cm/s, quando le cellule di HuAR2T erano co-coltivate con gli astrociti umani primari (tabella 1).
In imita YHBHU sia murine ed umane, la presenza delle sfere glioblastoma paziente-derivato ha indotto un leggero aumento dei valori di permeabilità rispetto alle co-culture endoteliale delle cellule-Astrocita da solo (tabella 1). Questo fenomeno si osserva con molti ma non tutti il glioma paziente sfera modelli. Questo può essere dovuto il VEGF-A che viene secreto da alcune di queste cellule derivanti dal paziente.
Per confrontare i valori di permeabilità dei Mimic di YHBHU in vitro con il BBB in vivo, abbiamo ripreso la diffusione in tempo reale della Na-Fl attraverso una finestra cranica impiantata in topi nudi. Utilizzando un microscopio stereoscopico di fluorescenza, diffusione di Na-Fl dai vasi sanguigni capillari derivante dai vasi sanguigni pial principali è stata registrata prima, durante e dopo l'iniezione sistemica della sonda (Figura 2). Misurazioni dei valori di fluorescenza differenziale dal parenchima corticale con cervello e del sangue circolante nel corso del tempo ci ha permesso di calcolare i valori di permeabilità approssimativo del mouse nudo's BBB per Na-Fl (5,57 ± 2.19 x 10-6 cm/s, Tabella 1).
Per illustrare come la mimica di YHBHU può essere utilizzato per la visualizzazione del passaggio di composti al lato di sangue al lato del cervello, abbiamo confrontato la transcitosi di ø 110 nm (NP110) e ø 350 nm (NP350) nanoparticelle targeting glioblastoma paziente-derivato sfere. Risultati ottengono in vitro sono stati poi confrontati con la transcitosi in vivo. Nell'esempio presentato, le nanoparticelle sono state rivestite di superficie con il peptide di targeting tumorale CooP20 e caricato con il colorante fluorescente (FITC) per facilitare la visualizzazione. Abbiamo identificato le cellule usando il colorante lisosomiale e controcolorati con DAPI 24 h dopo l'aggiunta delle nanoparticelle FITC sul lato sangue della YHBHU imitare e acquisito confocale micrografie a diversi livelli (ad esempio, il lato di sangue, la membrana, il lato del cervello, e le sfere di glioblastoma paziente) (Figura 3A). Il segnale fluorescente NP110-collegato colocalized con i lisosomi nelle cellule endoteliali, astrociti e cellule tumorali. Inoltre, NP110s sono stato rilevato tra le cellule endoteliali e astrociti, passando attraverso i pori di membrana dell'inserto (Figura 3A).
Il passaggio di NP110s è stato quantificato misurando la fluorescenza da campioni raccolti da parte di sangue e nel cervello. Questi valori di permeabilità sono stati confrontati a quelli determinati per le nanoparticelle di ø 350 nm (NP350). I risultati mostrano che solo NP110 era in grado di attraversare i mimic di YHBHU (Figura 3B). NP350 è rimasto sul lato sangue del mimic di YHBHU, che ha provocato più bassi valori di permeabilità per queste nanoparticelle.
Per evidenziare la rilevanza dei Mimic di YHBHU rispetto ai modelli in vivo, topi nudi sono stati iniettati per via endovenosa con nanoparticelle NP110 o NP350 rivestito con il peptide di targeting tumorale CooP e coniugato con colorante fluorescente rosso (TRITC) per la rilevazione. Tessuti raccolti in diversi momenti ha rivelato che dopo 8 h, BBB-permeabile nanoparticelle hanno extravasated nel parenchima cerebrale, mentre il similgranito quelli che siamo stati nella circolazione erano principalmente hanno eliminati dalla circolazione sistemica in vivo. Di conseguenza, abbiamo raccolto i cervelli e quantificato il numero di nanoparticelle per millimetro quadrato di postinjection h 8. In conformità con i risultati in vitro, NP110, ma non NP350, con successo extravasated nel parenchima cerebrale (Figura 3). Formazione immagine ad alto ingrandimento della posizione delle nanoparticelle nel cervello ha mostrato che NP110 era distribuita omogeneamente nel parenchima del cervello fuori i capillari sanguigni e ospitati con successo per le cellule di glioblastoma impiantati (Figura 3D). Nonostante che esibiscono il tumore stesso targeting frazione (CooP), NP350 è riuscito a MPEG nel parenchima cerebrale e solo è stato rilevato all'interno lato luminale dei vasi sanguigni del cervello (Figura 3E), simile ai risultati ottenuti in vitro.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59384/59384fig1.jpg"> Figura 1: Descrizione del modello (YHBHU) tumore-barriera emato-encefalica. (A) rappresentazione schematica delle posizioni di diversi tipi di cellule. (B) illustrazione del posizionamento inserto sul coperchio piastra a 6 pozzetti e la tecnica di semina per i astrocytes sul lato del cervello dell'inserto'membrana s. (C) illustrazione del posizionamento piastra a 6 pozzetti permettendo l'adesione di astrociti. (D) micrografie di immunofluorescenza della giunzione stretta proteine zonula occludens-1 (riga ZO-1, superiore, rosso) e claudin-5 (riga inferiore, verde). L'espressione della proteina viene confrontato con le cellule endoteliali microvascolari di cervello murino (bEND3) coltivate sul lato di sangue della YHBHU da solo come una monocoltura (colonna sinistra) o con murini immortalizzati HIFko astrociti (colonna destra). Nuclei delle cellule sono controcolorati con DAPI (blu). (E) micrografo di immunofluorescenza mostrando la proteina silicea fibrillare glial (GFAP, rosso) negli astrociti HIFko coltivati a lato del cervello del YHBHU. L'immagine di alto ingrandimento Mostra processi astrociti e puntali (frecce) contatto con le cellule endoteliali attraverso la membrana pori (pannello di destra). L'identità di astrociti HIFko è stata verificata mediante immunofluorescenza colorazione del simian virus 40 grande T antigene (grande T di SV40, verde) utilizzato per l'immortalizzazione delle cellule. Cellule endoteliali express la GFAP, né il grande T di SV40 e, pertanto, possono essere parzialmente osservate attraverso il trasparente, sul lato opposto della membrana come sola DAPI cellule marcate (linee tratteggiate). Nuclei delle cellule sono controcolorati con DAPI (blu). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59384/59384fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59384/59384fig2.jpg"> Figura 2: Intravital determinazione diretta del mouse permeabilità BBB. (A) preparazione del catetere impiantabile vena caudale. (1) attrezzi e attrezzature sono i seguenti: (a) un PE20 tubo in polietilene (b) due 25 G aghi (c) Rochester-Ochsner forcipe e (d), un piccolo bulldog morsetto. (2), A 25 G ago viene rimosso da torsioni diversi utilizzando il forcipe e (3) attentamente inserito nel tubo. (4), da altra parte del tubo è collegato a un altro ago 25 G. (B) indicazioni per l'impianto di catetere e posizionamento per iniettare la soluzione di sodio-fluoresceina attraverso la vena caudale di un mouse. L'area cerchiata indica l'area in cui si trova una goccia di colla cianoacrilica per fissare il catetere. Il bulldog morsetto è utilizzato per gestire il catetere e rimosso una volta che il catetere è garantito. (C) rappresentante imaging e quantificazione metodo per determinare i valori di permeabilità di sodio-fluoresceina. Prima dell'infusione di sodio-fluoresceina (colonna sinistra), l'autofluorescenza/blank viene misurata all'interno di una regione di interesse (ROI) collocata sul cervello (rettangolo del pannello superiore, bianco) e zone di vaso sanguigno (rettangolo inferiore pannello, rosso). Durante l'infusione di sodio-fluoresceina (colonna destra), l'intensità di fluorescenza è misurata in entrambi ROIs, che permette il calcolo della permeabilità BBB. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59384/59384fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59384/59384fig3.jpg"> Figura 3: previsione della transcitosi intracerebrale delle nanoparticelle attraverso BBB in vivo usando il modello in vitro di YHBHU. (A) rappresentazione grafica del dosaggio YHBHU con immagini confocale rappresentative ottenuti ai diversi livelli del modello murino YHBHU indicati. Nanoparticelle di 110 nm di diametro (NP110) e coniugato a FITC (verde) sono stati aggiunti al sangue laterale delle cellule YHBHU sono stati etichettati con la sonda lisosomiale (LT-99, rosso).  (1), Endothelial cells, (2), Endothelial transcitosi delle nanoparticelle attraverso i pori della membrana (linea tratteggiata bianca), gli astrociti (3), e (4) pazienti di glioblastoma sfere sono identificati sul grafico e corrispondenti micrografie confocale (a destra). Lysosomal incapsulamento delle nanoparticelle (frecce) suggerisce transcitosi attivo attraverso i livelli endoteliali e astrociti della YHBHU. (B) quantificazione della permeabilità delle nanoparticelle indicato attraverso il YHBHU in vitro (n = 6). (C) quantificazione della densità delle nanoparticelle indicato nel tessuto cerebrale di sezioni, 8 h dopo l'infusione di vena caudale di topi nudi (n = 3). (D) confocale micrografie mostrano la distribuzione del ø 110 nm nanoparticelle (NP110, rosso) nelle sezioni del tessuto del cervello murino etichettati con un anticorpo anti-CD31 (verde). La freccia evidenzia la transcitosi di nanoparticelle (pannello di sinistra). Le nanoparticelle accumulato intorno alle cellule del tumore di cervello (tumore, pannello di destra) a causa del peptide CooP-targeting presentato sulla loro superficie. Nessun significativo homing è osservata nel tessuto cerebrale (cervello). (E) confocale micrografie mostrano la distribuzione del ø 350 nm nanoparticelle (NP350, rosso) in sezioni di tessuto del cervello murino etichettate con un anticorpo anti-CD31 (verde). Punte di freccia, scegliere il NP350s che sono stati mantenuti nel lume del vaso sanguigno e sono stati in grado di attraversare la BBB, probabilmente a causa del loro diametro maggiore rispetto ai nuclei cellulari NP110s. sono counterstained con DAPI (blu). P < 0.01. P-valori sono stati calcolati utilizzando un test di Mann-Whitney U a due code, non parametrico. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59384/59384fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>murino mimica di YHBHU</td>
			<td>bEND3</td>
			<td>bEND3 + HIFko come</td>
			<td>bEND3 + GB</td>
			<td>bEND3 + HIFko come + GB</td>
			<td>In vivo</td>
		</tr>
<tr>
<td>Permeabilità (10-6 cm/s)</td>
			<td>27,63</td>
			<td>6,74</td>
			<td>26,8</td>
			<td>10.83</td>
			<td>5,57</td>
		</tr>
<tr>
<td>SD (10-6 cm/s)</td>
			<td>3,45</td>
			<td>3.01</td>
			<td>7.99</td>
			<td>2.65</td>
			<td>2.19</td>
		</tr>
<tr>
<td>mimica di YHBHU umana</td>
			<td>HuAR2T</td>
			<td>HuAR2T + hIAs</td>
			<td>HuAR2T + GB</td>
			<td>HuAR2T + hIAs + GB</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Permeabilità (10-6 cm/s)</td>
			<td>104,92</td>
			<td>47,4</td>
			<td>89.08</td>
			<td>48,24</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>SD (10-6 cm/s)</td>
			<td>27.1</td>
			<td>14,32</td>
			<td>10.21</td>
			<td>13.07</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: valori di permeabilità sodio-fluoresceina (Na-Fl) (in centimetri al secondo) determinata in vitro nei sistemi di co-coltura indicato ed in vivo in topi nudi NMRI. I dati da un esperimento rappresentanza (n = 3 topi).

Watch this Scientific Journal Video about Predicting In Vivo Payloads Delivery using a Blood-brain Tumor-barrier in a Dish at JoVE.com

Predicting In Vivo Payloads Delivery using a Blood-brain Tumor-barrier in a Dish

Fornitura di payload predicting In Vivo utilizzando una tumore-barriera emato-encefalica in un piatto

Drug targeting per tumori del sistema nervoso centrale è una sfida importante. Qui descriviamo un protocollo per produrre un mimo in vitro del tumore-barriera emato-encefalica utilizzando cellule murine e/o umane e discutere la loro rilevanza per la prevedibilità del sistema nervoso centrale targeting tumorale in vivo.

Highly selective by nature, the blood-brain barrier (BBB) is essential for the brain homeostasis in physiological conditions. However, in the context of ...

Al fine di sviluppare nuovi farmaci e composti che prendono di mira i tumori nel sistema nervoso centrale, l'accessibilità e il passaggio attraverso la barriera ematica-encefalica è molto importante. Sebbene la citotossicità dei composti possa essere facilmente misurata incubando le cellule con le molecole terapeutiche, in realtà non dice nulla sull'effettiva consegna al sito tumorale nel cervello. Per risolvere questo problema, abbiamo sviluppato il seguente protocollo che descrive come ricreare la barriera tumorale e-encefalica in vitro su un piatto.L'uso di cellule immortalate di origine murina o umana rende questo saggio molto flessibile. Può anche essere facilmente scalato fino allo schermo dozzine di composti ad alta riproducibilità. Inoltre, questo metodo consente sia la quantificazione che la visualizzazione del passaggio e la capacità di targeting dei composti prima di procedere con modelli preclinici.Pertanto, il nostro metodo sostituisce parzialmente i modelli animali utilizzando le linee cellulari prestabilite. L'inclusione di cellule tumorali cerebrali derivate dal paziente dice l'eterogeneità del paziente, mentre l'uso di cellule immortalate per stabilire la barriera ematico-encefalica garantisce la riproducibilità dei risultati. Complessivamente, questo modello di barriera ematico-encefalica offre uno strumento davvero interessante per saggiare la diffusione del farmaco o la consegna di veicoli antidroga.La dimostrazione visiva del metodo è fondamentale perché il seeding delle celle sul lato opposto dell'inserto richiede una manipolazione che non viene spesso descritta in altri protocolli utilizzando impostazioni simili. Ad esempio, ottenere l'adesione degli astrociti quando l'inserto è posizionato capovolto beneficia fortemente della rappresentazione visiva. Sotto una cappa sterile per la coltura cellulare, lavare accuratamente gli astrociti coltivati con cinque millilitri di PBS sterile.Utilizzare una pompa per vuoto per scartare delicatamente il PBS e aggiungere due millilitri di reagente di dissociazione cellulare per cinque minuti per staccare le cellule. Quindi, aggiungere 10 millilitri di sterile mezzo completo di coltura cellulare astrocitale al vaso per inibire l'attività del reagente di dissociazione cellulare. Utilizzare una pipetta sierologica sterile per trasferire le cellule staccate dal recipiente in un tubo sterile da 15 millilitri.Centrifuga a 250 volte g per tre minuti a temperatura ambiente. Nel frattempo, impostare gli inserti. Utilizzare forcep sterili per posizionare gli inserti con il lato cerebrale sul coperchio di una piastra sterile a sei pozzi.Una volta completata la centrifugazione, scartare con cura il supernatante dalla sospensione cellulare e rimescolare il pellet di astrocita in un millilitro di ABM-plus tubazionando delicatamente il pellet sulla parete del tubo fino a cinque volte. Quindi, contare le celle e regolare la densità della sospensione cellulare a 150.000 celle in 400 microlitri di ABM-plus per inserto. Posizionare la sospensione cellulare al centro del lato cerebrale della membrana dell'inserto e diffonderla con cura usando la forza capillare con una punta sterile della pipetta.Con il lato cerebrale degli inserti ancora in alto, riposizionare la piastra a sei pozzi sugli inserti. Posizionare la piastra e gli inserti, con il lato cerebrale verso l'alto, in un'incubatrice a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per consentire l'adesione cellulare. Successivamente, ripristinare la piastra a sei pozzi nella sua posizione regolare, con gli inserti ora lato sangue verso l'alto.Aggiungere il supporto e continuare l'incubazione come descritto nel protocollo di testo. Sotto una cappa sterile di coltura cellulare, lavare accuratamente le cellule endoteliali coltivate con cinque millilitri di PBS sterile. Utilizzare una pompa per vuoto per scartare delicatamente il PBS e aggiungere due millilitri di reagente di dissociazione cellulare per cinque minuti per staccare le cellule.Quindi, aggiungere 10 millilitri di sterile mezzo completo di coltura cellulare endoteliale al vaso per inibire l'attività del reagente di dissociazione cellulare. Utilizzare una pipetta sierologica sterile per trasferire le cellule staccate dal recipiente in un tubo sterile da 15 millilitri. Centrifuga a 250 volte g per tre minuti a temperatura ambiente.Dopo questo, scartare il supernatante e rimescolare il pellet di cellule endoteliali in un millilitro di EBM-plus pipettando lentamente la sospensione cellulare sulla parete del tubo fino a cinque volte. Contare le cellule e regolare la densità di sospensione cellulare a 200.000 cellule in 2,5 millilitri di coltura cellulare endoteliale priva di siero e fattore di crescita endoteliale vascolare-A per inserto. Recuperate la piastra contenente gli inserti.Scartare con cura il mezzo dal lato del sangue e sostituirlo con i 2,5 millilitri di sospensione cellulare endoteliale. Quindi, riportare la piastra all'incubatrice e lasciarla durante la notte per consentire alle cellule endoteliali di aderire alla membrana. Il giorno dopo, preparare una piastra di sei porvili trasferendo tre millilitri di ABM-minus pre-riscaldato ad ogni pozzo.Utilizzando forcep sterili, maneggiare gli inserti per scartare con cura il mezzo completo endoteliale dal lato sanguigno e posizionare l'inserto nella nuova piastra contenente ABM-minus. Quindi, aggiungere 2,5 millilitri di EBM-minus. Lasciare gli inserti nell'incubatrice con minimo disturbo fisico o variazione di temperatura per cinque giorni.Il giorno del trasferimento, sostituire il mezzo. Per l'imaging ad immunofluorescenza, posizionare fino a quattro coverlips di borosilicato sterile rotondo in ogni pozzo di una piastra a sei po porsi contenente due millilitri di poli-D-lisina. Incubare a temperatura ambiente per 30 minuti.Nel frattempo, utilizzare una pipetta sierologica sterile per trasferire attentamente le sfere tumorali dal vaso di coltura cellulare a un tubo sterile da 15 millilitri. Centrifugare le sfere tumorali a 250 volte g per tre minuti. Scartare il supernatante e rimescolare delicatamente le sfere in un millilitro di GBM-meno.Contare le celle e regolare la densità cellulare a circa 10.000 sfere o 100.000 celle per millilitro di GBM-meno. Successivamente, scartare la poli-D-lisina dai pozzi e sciacquare i pozzi tre volte con PBS sterile. Seminare ogni pozzo della piastra con tre millilitri della sospensione dello sferoide tumorale e trasferire gli inserti con il BBTB imitare sulla sospensione delle cellule tumorali.Incubare durante la notte a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5% per consentire al sangue e ai lati del tumore al cervello del saggio di raggiungere l'equilibrio. Il giorno dopo, sostituire i media nel lato sanguigno con EBM-minus integrato con le molecole, i farmaci o le nanoparticelle di interesse. Raccogliere i campioni nel tempo per la quantificazione diretta come descritto in precedenza.In primo luogo, raccogliere 100 microlitri del mezzo sia dal lato sanguigno che da quello cerebrale dell'imitazione BBTB e trasferirli ciascuno su una piastra separata a fondo piatto, nera, a 96 poggia-porsi per successive misurazioni della fluorescenza. Successivamente, preparare una soluzione di 50 micromolare di fluoresceina di sodio in EBM-minus, assicurandosi di preparare 2,5 millilitri per pozzo. Pre-riscaldare questa soluzione a 37 gradi Celsius e sostituire il supporto dal lato sanguigno degli inserti con mezzi contenenti questa soluzione di fluoresceina di sodio.Avviare un timer non appena il supporto viene sostituito. Raccogliere con cura 100 microlitri di supporti sia dal lato sanguigno che da quello cerebrale degli inserti a cinque minuti, 30 minuti, 60 minuti e 120 minuti. Trasferire ogni campione in pozzi separati della piastra nera appropriata da 96 pozzi.Utilizzare un lettore di lastre per quantificare la fluorescenza dai campioni raccolti. In primo luogo, diluire il colorante fluorescente lysosome all'appropriata concentrazione di lavoro in mezzo preri riscaldato. Aggiungere questo alle cellule e incubare a 37 gradi Celsius con 5% di anidride carbonica per 45 minuti.Quindi, sciacquare le cellule tre volte con PBS ghiacciato. Scartare il PBS e aggiungere tre millilitri di paraformaldeide ghiacciata al 4% ai pozzi e 2,5 millilitri all'inserto. Incubare sul ghiaccio per 10 minuti.Successivamente, scartare la paraformaldeide e risciacquare le cellule tre volte con PBS. Rimuovere il PBS e controsostenere i nuclei cellulari utilizzando una soluzione DAPI ad una concentrazione finale di un microgrammo per millilitro in acqua distillata. Incubare a temperatura ambiente per sette minuti.Quindi, rimuovere il DAPI e lavare le membrane tre volte con acqua distillata. Tagliare con cura la membrana, rimuovere l'acqua distillata e posizionarla su una goccia di mezzo di montaggio su uno scivolo al microscopio di vetro. Aggiungere un'altra goccia di mezzo di montaggio sull'altro lato della membrana e coprirla con cura con un vetro di copertura borosilicato.In questo studio, le cellule endoteliali sono state co-coltivate con astrociti per formare un'interfaccia simile a una barriera tumorale emato-encefalica in una configurazione in vitro. L'imaging confocale della mimica BBTB murina mostra l'espressione e la localizzazione cellulare delle proteine di giunzione stretta zonula occludens-1 e claudin-5 in bEND3. I contatti tra le cellule endoteliali e gli astrociti inducono chiaramente il trasferimento di queste due proteine ai contatti cellula-cellula endoteliali rispetto alle monocolture bEND3.Utilizzando la colorazione immunofluorescenza per visualizzare gli astrociti che esprimono GFAP sul lato cerebrale della membrana, è possibile osservare e studiare i processi astrocitici e i piedi finali che contattano le cellule endoteliali attraverso la membrana. Per confrontare i valori di permeabilità dei mimici BBTB in vitro con la barriera emato-encefalica in vitro, la diffusione in tempo reale della fluoresceina di sodio viene visualizzata attraverso una finestra cranici impiantata in topi nudi. Utilizzando un microscopio stereo a fluorescenza, la diffusione della fluoresceina di sodio dai capillari dei vasi sanguigni derivanti dai principali vasi sanguigni piali viene registrata prima, durante e dopo l'iniezione sistemica della sonda.La transcitosi delle nanoparticelle che prendono di mira le sfere di glioblastoma derivate dal paziente viene quindi confrontata per illustrare come questo microfono BBTB possa essere usato per visualizzare il passaggio di composti dal lato sanguigno a quello cerebrale. Il segnale fluorescente associato all'NP110 si co-localizza con i lisosomi nelle cellule endoteliali, negli astrociti e nelle cellule tumorali. Inoltre, gli NP110 vengono rilevati tra le cellule endoteliali e gli astrociti, passando attraverso i pori della membrana dell'inserto.Il passaggio degli NP110 viene quantificato misurando la fluorescenza da campioni raccolti sia dal lato sanguigno che da quello cerebrale, e questi valori sono confrontati con quelle nanoparticelle determinate che sono 350 nanometri. Come si può vedere, solo gli NP110 sono in grado di attraversare le imitazioni BBTB, mentre NP350 è rimasto sul lato sanguigno, con conseguente valori di permeabilità più bassi per queste nanoparticelle. Maneggiare l'inserto con cura e diffondere con cautela la sospensione cellulare dell'astrocita sul lato cerebrale dell'inserto senza contatto diretto della membrana.Qualsiasi danno della membrana comporterà perdite. Questo metodo può essere adattato per rispondere alla domanda sulla consegna cerebrale di carichi utili amministrati periferici. Utilizzando diversi inserti con pori a membrana più grandi, è anche possibile studiare l'estravasazione cellulare.Questa tecnica può essere modificata utilizzando diversi tipi di cellule per imitare altre barriere cellulari. Apre inoltre la strada a una ricerca più responsabile ed etica, con l'obiettivo di ridurre il numero di animali da laboratorio utilizzati per la convalida dei farmaci antitumorali. Si prega di ricordare che la paraformaldeide è una sostanza chimica molto tossica e deve essere maneggiata di conseguenza.Inoltre, fai attenzione mentre usi un bisturi affilato per estrarre le membrane dagli inserti.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

Il<em&gt; Drosophila</em&gt; Immaginale Disc tumore Modello: visualizzazione e la quantificazione di espressione genica e di Tumor invasività Utilizzando genetica Mosaici

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR valutazione di pH, pO2, lo stato Redox e le concentrazioni di fosfato e glutatione nel microambiente tumorale

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

Fluorescence Molecular Tomography for In Vivo Imaging of Glioblastoma Xenografts

Fluorescence Molecular Tomography for In Vivo Imaging of Glioblastoma Xenografts

Fluorescenza tomografia molecolare per l'Imaging In Vivo di Glioblastoma xenotrapianti

Tumorigenicity is the capability of cancer cells to form a tumor mass. A widely used approach to determine if the cells are tumorigenic is by injecting ...

In Vivo Inhibition of MicroRNA to Decrease Tumor Growth in Mice

In vivivo Inibizione del MicroRNA per diminuire la crescita tumorale nei topi

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression through their ability to destabilize mRNA and inhibit translation of target mRNAs. An ...

Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs

Uso combinato dei saggi di metastasi della vena della coda e dell'imaging in vivo in tempo reale per quantificare la colonizzazione metastatica del cancro al seno e il carico nei polmoni

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification ...

In Vivo Targeting of Xenografted Human Cancer Cells with Functionalized Fluorescent Silica Nanoparticles in Zebrafish

In Vivo Targeting di cellule tumorali umane Xenografted con nanoparticelle di silice fluorescenti funzionalizzate nel pesce zebra

Developing nanoparticles capable of detecting, targeting, and destroying cancer cells is of great interest in the field of nanomedicine. In vivo animal ...

Using Computer-based Image Analysis to Improve Quantification of Lung Metastasis in the 4T1 Breast Cancer Model

Utilizzo dell'analisi delle immagini basata su computer per migliorare la quantificazione della metastasi polmonare nel modello di cancro al seno 4T1

Breast cancer is a devastating malignancy, accounting for 40,000 female deaths and 30% of new female cancer diagnoses in the United States in 2019 alone. ...

Patient-Derived Tumor Explants As a "Live" Preclinical Platform for Predicting Drug Resistance in Patients

Espianti tumorali derivati dal paziente come piattaforma preclinica "live" per prevedere la resistenza ai farmaci nei pazienti

An understanding of drug resistance and the development of novel strategies to sensitize highly resistant cancers rely on the availability of suitable ...

Evaluation of the In vivo Antitumor Activity of Polyanhydride IL-1&#945; Nanoparticles

Evaluation of the In vivo Antitumor Activity of Polyanhydride IL-1ÃƒÅ½Ã‚Â± Nanoparticles

Valutazione dell'attività antitumorale in vivo di nanoparticelle di polianidride IL-1α

Cytokine therapy is a promising immunotherapeutic strategy that can produce robust antitumor immune responses in cancer patients. The proinflammatory ...

Longitudinal Intravital Imaging Through Clear Silicone Windows

Imaging intravitale longitudinale tramite finestre in silicone trasparente

Intravital microscopy (IVM) enables visualization of cell movement, division, and death at single-cell resolution. IVM through surgically inserted imaging ...