Name: predicting in vivo payloads delivery using a blood-brain tumor-barrier in a dish
Uploaded: 2019-04-16T14:30:00
Duration: 13 min 34 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Predicting In Vivo Payloads Delivery using a Blood-brain Tumor-barrier in a Dish at JoVE.com

Denne forskningen ble støttet av tilskudd fra den finske kreft organisasjoner, Jane & Wen Erkko Foundation, og Sigrid Juselius Foundation (til P.L. og V.L.J.), Swiss National Science Foundation (avanserte Postdoc.Mobility gir ingen: P300PB_164732, til S. K.), Orion Research Foundation (til S.K.), Maud Kuistila Memorial Foundation (til S.K.) og for Finlands akademi (TERVA 2017, gir ingen: 314 498). Biomedicum Imaging enheten (Helsinki) er anerkjent for å gi mikroskopi imaging kjernen anlegget.

<ol>
	<li>Daneman, R., Prat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-brain+barrier.">The blood-brain barrier.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (1), a020412 (2015).</li><li>Quail, D. F., Joyce, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Microenvironmental+Landscape+of+Brain+Tumors.">The Microenvironmental Landscape of Brain Tumors.</a> Cancer Cell. 31 (3), 326-341 (2017).</li><li>Wang, Z., Sun, H., Yakisich, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+the+blood-brain+barrier+for+chemotherapy:+limitations,+challenges+and+rising+problems.">Overcoming the blood-brain barrier for chemotherapy: limitations, challenges and rising problems.</a> Anticancer Agents in Medicinal Chemistry. 14 (8), 1085-1093 (2014).</li><li>Alkins, R. D., Brodersen, P. M., Sodhi, R. N., Hynynen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+drug+delivery+for+boron+neutron+capture+therapy+of+brain+tumors+with+focused+ultrasound.">Enhancing drug delivery for boron neutron capture therapy of brain tumors with focused ultrasound.</a> Neuro Oncology. 15 (9), 1225-1235 (2013).</li><li>Alli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brainstem+blood+brain+barrier+disruption+using+focused+ultrasound:+A+demonstration+of+feasibility+and+enhanced+doxorubicin+delivery.">Brainstem blood brain barrier disruption using focused ultrasound: A demonstration of feasibility and enhanced doxorubicin delivery.</a> Journal of Controlled Release. 281, 29-41 (2018).</li><li>Ashby, L. S., Smith, K. A., Stea, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gliadel+wafer+implantation+combined+with+standard+radiotherapy+and+concurrent+followed+by+adjuvant+temozolomide+for+treatment+of+newly+diagnosed+high-grade+glioma:+a+systematic+literature+review.">Gliadel wafer implantation combined with standard radiotherapy and concurrent followed by adjuvant temozolomide for treatment of newly diagnosed high-grade glioma: a systematic literature review.</a> World Journal of Surgical Oncology. 14 (1), 225 (2016).</li><li>Guishard, A. F., Yakisich, J. S., Azad, N., Iyer, A. K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+gap+in+ongoing+clinical+trials+for+glioma.">Translational gap in ongoing clinical trials for glioma.</a> Journal of Clinical Neurosciences. 47, 28-42 (2018).</li><li>Rahman, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalized+endothelial+cell+lines+for+in+vitro+blood-brain+barrier+models:+A+systematic+review.">Immortalized endothelial cell lines for in vitro blood-brain barrier models: A systematic review.</a> Brain Research. 1642, 532-545 (2016).</li><li>Helms, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+of+the+blood-brain+barrier:+An+overview+of+commonly+used+brain+endothelial+cell+culture+models+and+guidelines+for+their+use.">In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 36 (5), 862-890 (2016).</li><li>Wang, J. D., Khafagy, e. l. -. S., Khanafer, K., Takayama, S., ElSayed, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+Endothelial+Cells,+Pericytes,+and+Astrocytes+into+a+3D+Microfluidic+in+Vitro+Model+of+the+Blood-Brain+Barrier.">Organization of Endothelial Cells, Pericytes, and Astrocytes into a 3D Microfluidic in Vitro Model of the Blood-Brain Barrier.</a> Molecular Pharmaceutics. 13 (3), 895-906 (2016).</li><li>Phan, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier-on-a-chip:+Microphysiological+systems+that+capture+the+complexity+of+the+blood-central+nervous+system+interface.">Blood-brain barrier-on-a-chip: Microphysiological systems that capture the complexity of the blood-central nervous system interface.</a> Experimental Biology and Medicine (Maywood). 242 (17), 1669-1678 (2017).</li><li>Bang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Low+Permeability+Microfluidic+Blood-Brain+Barrier+Platform+with+Direct+Contact+between+Perfusable+Vascular+Network+and+Astrocytes.">A Low Permeability Microfluidic Blood-Brain Barrier Platform with Direct Contact between Perfusable Vascular Network and Astrocytes.</a> Scientific Reports. 7 (1), 8083 (2017).</li><li>Wilhelm, I., Krizbai, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+of+the+blood-brain+barrier+for+the+study+of+drug+delivery+to+the+brain.">In vitro models of the blood-brain barrier for the study of drug delivery to the brain.</a> Molecular Pharmacology. 11 (7), 1949-1963 (2014).</li><li>Campisi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+self-organized+microvascular+model+of+the+human+blood-brain+barrier+with+endothelial+cells,+pericytes+and+astrocytes.">3D self-organized microvascular model of the human blood-brain barrier with endothelial cells, pericytes and astrocytes.</a> Biomaterials. 180, 117-129 (2018).</li><li>Pirsko, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Effect+of+Culture+Media+on+Epithelial+Differentiation+Markers+in+Breast+Cancer+Cell+Lines+MCF7,+MDA-MB-436+and+SkBr3.">An Effect of Culture Media on Epithelial Differentiation Markers in Breast Cancer Cell Lines MCF7, MDA-MB-436 and SkBr3.</a> Medicina (Kaunas). 54 (2), (2018).</li><li>Stebbins, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+and+characterization+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+brain+microvascular+endothelial+cells.">Differentiation and characterization of human pluripotent stem cell-derived brain microvascular endothelial cells.</a> Methods. 101, 93-102 (2016).</li><li>Canfield, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+isogenic+blood-brain+barrier+model+comprising+brain+endothelial+cells,+astrocytes,+and+neurons+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">An isogenic blood-brain barrier model comprising brain endothelial cells, astrocytes, and neurons derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Journal of Neurochemistry. 140 (6), 874-888 (2017).</li><li>Cao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-inducible+factor-1alpha+is+involved+in+isoflurane-induced+blood-brain+barrier+disruption+in+aged+rats+model+of+POCD.">Hypoxia-inducible factor-1alpha is involved in isoflurane-induced blood-brain barrier disruption in aged rats model of POCD.</a> Behavioural Brain Research. 339, 39-46 (2018).</li><li>Abbott, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte-endothelial+interactions+and+blood-brain+barrier+permeability.">Astrocyte-endothelial interactions and blood-brain barrier permeability.</a> Journal of Anatomy. 200 (6), 629-638 (2002).</li><li>Kinnari, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+homing+peptide-functionalized+porous+silicon+nanovectors+for+cancer+therapy.">Tumour homing peptide-functionalized porous silicon nanovectors for cancer therapy.</a> Biomaterials. 34 (36), 9134-9141 (2013).</li><li>Levin, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personalized+medicine+in+neuro-oncology.">Personalized medicine in neuro-oncology.</a> CNS Oncology. 5 (2), 55-58 (2016).</li><li>Weathers, S. S., Gilbert, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+Personalized+Targeted+Therapeutics:+An+Overview.">Toward Personalized Targeted Therapeutics: An Overview.</a> Neurotherapeutics. 14 (2), 256-264 (2017).</li><li>O'Duibhir, E., Carragher, N. O., Pollard, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerating+glioblastoma+drug+discovery:+Convergence+of+patient-derived+models,+genome+editing+and+phenotypic+screening.">Accelerating glioblastoma drug discovery: Convergence of patient-derived models, genome editing and phenotypic screening.</a> Molecular and Cellular Neuroscience. 80, 198-207 (2017).</li><li>Kaya, M., Ahishali, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+permeability+in+barrier+type+of+endothelium+in+brain+using+tracers:+Evans+blue,+sodium+fluorescein,+and+horseradish+peroxidase.">Assessment of permeability in barrier type of endothelium in brain using tracers: Evans blue, sodium fluorescein, and horseradish peroxidase.</a> Methods in Molecular Biology. 763, 369-382 (2011).</li><li>Yang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+two+immortalized+cell+lines,+ECV304+and+bEnd3,+for+in+vitro+permeability+studies+of+blood-brain+barrier.">Identification of two immortalized cell lines, ECV304 and bEnd3, for in vitro permeability studies of blood-brain barrier.</a> PLoS One. 12 (10), e0187017 (2017).</li><li>Blouw, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hypoxic+response+of+tumors+is+dependent+on+their+microenvironment.">The hypoxic response of tumors is dependent on their microenvironment.</a> Cancer Cell. 4 (2), 133-146 (2003).</li><li>Argaw, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte-derived+VEGF-A+drives+blood-brain+barrier+disruption+in+CNS+inflammatory+disease.">Astrocyte-derived VEGF-A drives blood-brain barrier disruption in CNS inflammatory disease.</a> Journal of Clinical Investigation. 122 (7), 2454-2468 (2012).</li><li>Miao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF+increases+paracellular+permeability+in+brain+endothelial+cells+via+upregulation+of+EphA2.">VEGF increases paracellular permeability in brain endothelial cells via upregulation of EphA2.</a> The Anatomical Record (Hoboken). 297 (5), 964-972 (2014).</li><li>Heinolainen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGFR3+Modulates+Vascular+Permeability+by+Controlling+VEGF/VEGFR2+Signaling.">VEGFR3 Modulates Vascular Permeability by Controlling VEGF/VEGFR2 Signaling.</a> Circulation Research. 120 (9), 1414-1425 (2017).</li><li>Claesson-Welsh, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+permeability--the+essentials.">Vascular permeability--the essentials.</a> Upsala Journal of Medical Sciences. 120 (3), 135-143 (2015).</li><li>Adriani, G., Ma, D., Pavesi, A., Goh, E. L., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+the+Blood-Brain+Barrier+in+a+3D+triple+co-culture+microfluidic+system.">Modeling the Blood-Brain Barrier in a 3D triple co-culture microfluidic system.</a> Conference Proceedings - IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. 2015, 338-341 (2015).</li><li>Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hCMEC/D3+cell+line+as+a+model+of+the+human+blood+brain+barrier.">The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier.</a> Fluids and Barriers of the CNS. 10 (1), 16 (2013).</li><li>Paatero, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyses+in+zebrafish+embryos+reveal+that+nanotoxicity+profiles+are+dependent+on+surface-functionalization+controlled+penetrance+of+biological+membranes.">Analyses in zebrafish embryos reveal that nanotoxicity profiles are dependent on surface-functionalization controlled penetrance of biological membranes.</a> Scientific Reports. 7 (1), 8423 (2017).</li><li>Prabhakar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimuli-responsive+hybrid+nanocarriers+developed+by+controllable+integration+of+hyperbranched+PEI+with+mesoporous+silica+nanoparticles+for+sustained+intracellular+siRNA+delivery.">Stimuli-responsive hybrid nanocarriers developed by controllable integration of hyperbranched PEI with mesoporous silica nanoparticles for sustained intracellular siRNA delivery.</a> International Journal of Nanomedicine. 11, 6591-6608 (2016).</li><li>Hyvonen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+target+for+peptide-based+imaging+and+treatment+of+brain+tumors.">Novel target for peptide-based imaging and treatment of brain tumors.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 13 (4), 996-1007 (2014).</li><li>Feng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammary-Derived+Growth+Inhibitor+Targeting+Peptide-Modified+PEG-PLA+Nanoparticles+for+Enhanced+Targeted+Glioblastoma+Therapy.">Mammary-Derived Growth Inhibitor Targeting Peptide-Modified PEG-PLA Nanoparticles for Enhanced Targeted Glioblastoma Therapy.</a> Bioconjugate Chemistry. 26 (8), 1850-1861 (2015).</li><li>Nance, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dense+poly(ethylene+glycol)+coating+improves+penetration+of+large+polymeric+nanoparticles+within+brain+tissue.">A dense poly(ethylene glycol) coating improves penetration of large polymeric nanoparticles within brain tissue.</a> Science Translational Medicine. 4 (149), 149rA119 (2012).</li><li>Berg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+nanoparticle+transport+through+in+vitro+blood-brain+barrier+models.">Quantitative analysis of nanoparticle transport through in vitro blood-brain barrier models.</a> Tissue Barriers. 4 (1), e1143545 (2016).</li><li>Noumbissi, M. E., Galasso, B., Stins, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+vascular+heterogeneity:+implications+for+disease+pathogenesis+and+design+of+in+vitro+blood-brain+barrier+models.">Brain vascular heterogeneity: implications for disease pathogenesis and design of in vitro blood-brain barrier models.</a> Fluids and Barriers of the CNS. 15 (1), 12 (2018).</li><li>Heymans, M., Sevin, E., Gosselet, F., Lundquist, S., Culot, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mimicking+brain+tissue+binding+in+an+in+vitro+model+of+the+blood-brain+barrier+illustrates+differences+between+in+vitro+and+in+vivo+methods+for+assessing+the+rate+of+brain+penetration.">Mimicking brain tissue binding in an in vitro model of the blood-brain barrier illustrates differences between in vitro and in vivo methods for assessing the rate of brain penetration.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 127, 453-461 (2018).</li></ol>

Forfatterne ikke avsløre.

Fremveksten av interpatient svulst variasjon konseptet fornyet forskning på personlig kreft medisin21. Denne variasjonen er også et kjennetegn på sentralnervesystemet neoplasms. På grunn av uforutsigbarhet svulsten, reaksjon på kjemoterapi legger til beskyttende effekten av BBB for narkotika-leveranser, og helt utgjør store utfordringer i pasientomsorg22. For å utvikle mer effektive terapi, er det ofte nødvendig å skjermen store biblioteker av nye molekyler. For å evaluere antitumor effekt og evne til de nye terapeutiske kundeemnene på svulst nettstedet, er det beste alternativet prekliniske studiet på pasient-avledede celler implantert i vivo i murine pasienten avatarer. Praktisk (finans, tid, menneskelige og anlegget ressurser) og etiske grunner (3Rs prinsippet ved forsøksdyr), er utviklingen av slik storskala i vivo screening plattform ofte ikke mulig, og derfor cellebasert analyser være en modell av valg23. Den viktigste grunnen for valg etablert linjer og unngå primære celler er å lette reproduserbarhet og redusere bruken av forsøksdyr, som er den viktigste kilden for isolasjon og etablering av primære murine kulturer. Metodene presenterer her, kan fast i samsvar med 3Rs, effektivt forkaste nanopartikler fra en videre prekliniske undersøkelser på criterium av deres manglende evne til å krysse modellen BBTB. Som et bevis-av-prinsipp beskriver vi her resultatene innhentet under utvikling og validering av BBTB. Vi klarte å bekrefte i vitro funn i vivo, for eksempel ved måling passiv spredningen av en 376 Da natrium-fluorescein.
Protokollen beskrevet i dette dokumentet beskriver utarbeidelse av endotelceller cocultured med astrocyttene å danne en blod-hjerne svulst barriere som grensesnitt i en i vitro oppsett. Når en fysisk kontakt mellom disse to celletyper er opprettet, viser endothelial celle laget likheter med BBB (f.eks en celle overflaten uttrykk tett krysset proteiner og relativt lav permeabilitet). Interessant, syntes murine BBTB forhåndsvisningen å gi spesielt lignende Na-Fl permeabilitet verdiene til dem med i vivo musen BBB permeabilitet målinger24. Derfor vil ytelsen til BBTB etterlikner være direkte knyttet til valg av cellene som brukes til å danne barrieren. BEND3 endotelceller kommer fra hjernen og er kjent for å være vellykket i forming barrierer når cocultured med astrocyttene25. Men har vi brukt udødeliggjort HIFko astrocyttene26 for å generere BBTB forhåndsvisningen. På grunn av deres mangel på hypoksi-induserbart faktor, produserer ikke disse astrocyttene VEGF-A, som er typisk i BBTB etterligne stabilisering beskrevet her. Astrocyttene har blitt identifisert som modulatorer av BBB permeabilitet, for eksempel gjennom utgivelsen av VEGF-A svar på neuroinflammation27. Aktivering av vaskulær endotelial vekstfaktor reseptorer (VEGFRs) er en viktig regulator av endothelial/vaskulær permeabilitet både i vitro28 og i vivo29. Derfor aktivere VEGF-A kosttilskudd i medium VEGFR2 på endotelceller, som induserer fosforylering adherens junction proteiner som VE-cadherin30. Tap av endothelial celle-celle kontakter genererer svært permeable blodkar. På samme måte føre både sterke mitogenic eiendom og ukjent sammensetningen av de fosterets bovin sera brukes i celle kultur analyser til store problemer i barriere stabilisering og analysen reproduserbarhet.
Menneskelige umbilical blodåre endotelceller (HUVECs) brukes til BBB i vitro31; men de avviker seg betydelig fra hjernen mikrovaskulær endotelceller, som hCMEC/D3 cellen linje32, genuttrykk og barriere-forming egenskaper. Men relativt høyere permeabilitet verdier hentet med HuAR2T celler dyrket alene sammenlignet med bEND3 ble sterkt redusert ved coculturing dem med menneskelige primære astrocyttene. Selv endotelceller må danne mobilnettet veggen, er det klart at astrocyttene har en like viktig rolle å spille for BBTB dannelse og stabilisering.
Når pasient-avledede glioma kuler ble lagt til denne ligningen, recapitulated musen BBTB etterligne noen av funksjonene i murine xenografts, som narkotika spredningen gjennom hjerne blodkar og svulst celle målretting. BBTB etterlikner diskutert her var for eksempel vellykket i speilet i vivo virkemåten når vi vist flere nanopartikler med forskjellige diametere. For å illustrere parallellisme mellom i vitro og in vivo modeller, vi brukte tidligere beskrevet mesoporous silikat nanopartikler33 med celle-gjennomtrengende egenskaper34 konjugert til tumor målretting peptid CooP på deres surface20. De CooP målretting peptid boliger til invasiv tumorceller gjennom bestemte bindingen til den mammary-avledet vekst inhibitor (MDGI). Flere typer kreft, inkludert gliomas, er overexpressing MDGI sammenlignet med det normalt vev35, noe som gjør CooP en svært effektiv svulst målretting moiety kan øke levering av en nyttelast20. Nanopartikler her har vist tidligere å spre inn i hjernen parenchyma (27547955), og når functionalized med Taxol, disse nano-cargos har vært vellykket i å redusere glioma vekst i preklinisk modeller36. Tillegg av polyetylenglykol (PEG) rester på overflaten av nanopartikler også beholdt sine statiske kostnader til positive verdier (rundt + 4 mV), som tillater bedre samspill med nevrovaskulære enheten37 og også øke deres stabilitet i sirkulasjon. I presenteres dataene, var 3 kDa av PEG konjugert til NP110s, mens NP350s ble belagt med 10 kDa av PINNEN. Men resultert økt-molekylvekt PEG også i en betydelig økning i hydrogenion diameter, derav deres fysiske evner å krysse BBB. Derfor sjekket vi om de fysiske dimensjonene til partikler hindret deres passasje gjennom BBTB og om disse observasjonene kan speiles i vivo.
I samsvar med de tidligere publiserte observasjonene, observerte vi at NP110s extravasated gjennom både BBTB i vitro og BBB mus bærer intrakranielt svulster, mens NP350s beholdes på luminal side av BBTB etterligne og i blodkar av den mus. Disse lignende resultater sterkeste at BBTB modellen spådde i vivo evne til nanopartikler krysse BBB og kommer i hjernen.
Relevansen av mobilnettet modeller av BBB er ofte diskutert, selv for sentrale levering av nanopartikler38. Vi viser her at primære astrocyttene og endotelceller, begge ansett som de mest relevante i vitro verktøyene, kan erstattes av udødelighet og/eller kommersielt tilgjengelig celler, som sikrer bedre skalerbarhet og reproduserbarhet. Neste generasjon i vitro BBB imiterer kunne utvikles ved å innlemme microfluidic enheter, slik at vakkert formet nevrovaskulære enheter som strukturelt ligner den faktiske BBB12,14. Men er slike modeller for tiden uegnet for høy gjennomstrømming screening av molekyler levert til gliomas, på grunn av tekniske begrensninger i oppfølgingen levering14. Det er faktisk vanskelig å fange fysiologiske kompleksiteten i BBB i en parabol, og mulig mangel på noen reseptorer/proteiner, kjent for å være uttrykt av BBB, kunne kompromittere tolkning av resultatene. Et annet argument gjelder stor variasjon i genuttrykk mellom i vivo og in vitro forhold, samt fra én celle linje til en annen, spesielt vurderer endotelceller. Men kan det også hevdes at nevrovaskulære enheten ikke er en ensartet enhet i hjernen39. Vitenskapelig forskning i biologi har nådd en human æra der dyr velferd, etiske ansvaret og kostnaden ved å bruke dyr liv er alltid vurdert før utforme et eksperiment. Derfor, for å støtte utskifting av dyr, et økende antall nyere studier viser at bevisstheten om begrensningene for modellene og forsiktig utvalg av mobilnettet modeller å etablere barrieren, med vekt på astrocyttene-garanterer en kampen mellom resultater oppnådd i en rett og i dyr modeller40. Med metodikk beskrevet her, får vi et skritt nærmere å redusere antall forsøksdyr som brukes for screening av BBB transcytosis for potensielle therapeutics.

Nevrovaskulære enheten er sammensatt av neurons, astrocyttene og BBB, dannet av intrikate tilkoblinger mellom pericytes, astrocyttene, endotelceller og tilknyttede kjelleren membranen danner hjernen microvasculature1. Denne stramt mobilnettet veggen dannet av kontinuerlig, nonfenestrated fartøy fint regulerer bevegelsen av ioner og molekyler (inkludert hormoner, næringsstoffer eller narkotika), men også av sirkulerende celler1. De spesielt lave transcytosis gjennom BBB av høy-molekylvekt molekyler, som terapeutiske antistoffer, narkotika conjugates eller nanocompounds, begrenser dramatisk fremskritt i stoffet funnet for nevrologiske sykdommer, inkludert ondartet gliomas2. Faktisk, muntlig eller intravenøst levert chemotherapies nå hjernen parenchyma ofte på mangelfullt Lavinnblanding å indusere en antitumor effekt eller bare ikke krysse BBTB for å nå de neoplastic celler3. Flere prekliniske og kliniske studier har ikke behandlet spørsmålet om BBTB penetrasjon men har forsøkt å avbryte BBTB transiently, for eksempel ved å bruke fokusert ultrasounds4,5, eller omgå det ved direkte i situ levering av narkotika6. Men var ingen av disse teknikkene kunne motvirke uunngåelig svulst utvidelse eller tilbakefall. Derfor, når utvikle romanen antiglioma terapi, spredning gjennom BBTB anses som en av de viktige aspektene for vellykket levering av terapeutiske agenter7.
På grunn av svært komplekse natur celle interaksjoner i BBTB synes i vivo studier i forsøksdyr å være det opplagte valget når studere passering av molekyler fra blod til hjernen. Men høy-skala i vivo metoder er relativt komplisert å etablere og, derfor tillater ikke høy gjennomstrømming screening av molekyler i rimelig tid til en rimelig pris. Enda viktigere, må dyreforsøk følge 3R etiske retningslinjen definert som i) Forny ii) redusere og, av relevans til gjeldende kontekst, iii) erstatter av alternative protokoller (f.eks i vitro/i sili metoder). Derfor gjenskape BBTB i vitro vises som en interessant og attraktiv mulighet, men også utgjør en komplisert oppgave utfordret av ulike begrensninger. Mange forsøk på å gjenskape dette komplekse seksjon med kulturperler primære celler eller linjer fra hjørnetann, svin, murine, og selv menneskelige opprinnelse har blitt publisert (som vurderes av Rahman et al.8 og Helms et al.9). Disse modellene inkluderer tredimensjonale microfluidic systemer10, BBB-on-a-chip11,12, og mengder av varianter basert på den klassiske co kulturene i setter systemer. Likevel, gjeldende microfluidic og chip-systemer er ikke egnet for rask, høy gjennomstrømming narkotika-validering studier13,14 eller er ikke kompatibelt med studier av narkotika-leveranser til hjernesvulster. I tillegg gjennomgang av 155 publiserte modeller med primær celler, induserbart pluripotent stamceller (iPSC) eller kommersielle cellelinjer alle co kultivert på innlegg viste en trend for interstudy avvik i sitt mål og/eller konklusjoner8. Denne mangelen på interlaboratory reproduserbarhet kan være korrelert med i) nonnormalized kultur forhold, for eksempel med valgfri belegget med kjelleren membran matrix proteiner i celle kultur fartøyet, ii) et økt antall subkultur og bruk av serum inneholder medier, både viktige drivere av genetiske og fenotypiske endringer av cellen linjer15eller iii) er vanskelig å gjenskape reproduserbar høyre likevekt mellom astroglial og endothelial komponenter i en rett. Selv om bruken av udødeliggjort celler eller kommersielle cellen linjer for å opprette en i vitro BBB modell mangler noen av egenskapene i forhold til lignende modeller som bare bruker primære celler, i metoden beskrevet vi vise at den rette kombinasjonen av celler utstillinger en svært sammenlignbare resultater til publiserte studier i andre modeller av referanse16,17. Til slutt, motivert mangel på en robust og reproduserbar modell å studere passering av terapeutiske forbindelser målretting hjernesvulster gjennom BBTB oss å utvikle metodene som er beskrevet her.
Siden målet var å bruke modellen til å forutsi i vivo levering av nanopartikler i preklinisk dyremodeller, bekreftet vi først BBTB modellen ved å benytte setter inneholder murine endotelceller i kontakt med murine astrocyttene. I tillegg til dette optimalisert vi også modellen til å bruke bestemte humane cellelinjer. Når stabilisert, overføres celle barrierer til kulturer med pasient-avledede glioblastom kuler eller kommersielle glioma linjer. Transcytosis av nanopartikler og svulst celle målretting kan deretter visualisert ved AC confocal mikroskopi og kvantifisert ved å samle eksempler over tid. Viktigst, kan resultatene med BBTB etterlikner sikkert forutsi oppførselen til nanopartikler i vivo, støtter bruk av BBTB etterligne forutgående prekliniske valideringen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1761px;" width="1761">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:1761px;">Cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">bEND3</td>
			<td style="width:239px;">ATCC</td>
			<td style="width:273px;">CRL-2299</td>
			<td style="width:961px;">Cultured in: DMEM (1g/L glucose) supplemented with 10% FBS, 5 mL L-glutamine and 5 mL penicillin/streptomycin</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">HIFko immortalized mouse astrocytes</td>
			<td style="width:239px;">Isolated in Dr. Gabriele Bergers Lab</td>
			<td style="width:273px;">https://doi.org/10.1016/S1535-6108(03)00194-6</td>
			<td style="width:961px;">Cultured in: BME-1 supplemented with 5% FBS, 5 mL 1 M HEPES, 5 mL 100 mM sodium pyruvate, 3 g D-glucose and 5 mL penicillin/streptomycin</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">HuAR2T</td>
			<td style="width:239px;">Isolated in Dr. Dagmar Wirth Lab</td>
			<td style="width:273px;">https://doi.org/10.1089/ten.tea.2009.0184</td>
			<td style="width:961px;">Cultured in: EBM-2 with SupplementMix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">normal human primary astrocytes</td>
			<td style="width:239px;">Lonza</td>
			<td style="width:273px;">CC-2565</td>
			<td style="width:961px;">Cultured in: ABM with SingleQuots</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:1761px;">Material and reagents</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100x17mm Dish, Nunclon Delta</td>
			<td style="width:239px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td>150350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">10 mL serological pipet</td>
			<td style="width:239px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:273px;">170361</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">15mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:239px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:273px;">339650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">ABM Basal Medium, 500 mL</td>
			<td style="width:239px;">Lonza</td>
			<td style="width:273px;">CC-3187</td>
			<td>For primary human astrocytes. ABM+: contains all the additives from the supplement mix. ABM-:all the additives except for rhEGF and FBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Accutase Cell Detachment Solution</td>
			<td style="width:239px;">Corning</td>
			<td style="width:273px;">25-058-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">AGM SingleQuots Supplements and Growth Factors</td>
			<td style="width:239px;">Lonza</td>
			<td>CC-4123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">B27 supplement</td>
			<td style="width:239px;">Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>for both GBM + and - medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Basal Medium Eagle</td>
			<td style="width:239px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:273px;">21010046</td>
			<td>BME-1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Corning Costar TC-Treated 6-Well Plates</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:273px;">CLS3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">Corning Transwell polyester membrane cell culture inserts</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:273px;">CLS3452&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">D-glucose</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:273px;">G8270</td>
			<td>dissolve in 50 mL of BME-1 and sterile filter before adding to the medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium/Nutrient F-12 Ham</td>
			<td style="width:239px;">Gibco</td>
			<td>21331-020</td>
			<td>Specific to the culture of the patient-derived spheres isolated in our lab, may vary for other glioma cell lines</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EBM-2 growth Medium SupplementMix</td>
			<td style="width:239px;">PromoCell</td>
			<td style="width:273px;">c-39216</td>
			<td>EBM+: contains all the additives from the supplement mix. EBM-:all the additives except for VEGF-A and FBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Endothelial Basal Medium 2 (EBM-2)</td>
			<td style="width:239px;">PromoCell</td>
			<td style="width:273px;">c-22211</td>
			<td>EBM+: contains all the additives from the supplement mix. EBM-:all the additives except for VEGF-A and FBS</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:288px;">Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin</td>
			<td style="width:239px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:273px;">10500056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Fluorescein sodium salt</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:273px;">F6377</td>
			<td style="width:961px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Greiner CELLSTAR 96 well plates</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:273px;">Greiner 655090</td>
			<td>black polystyrene wells flat bottom (with micro-clear bottom)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">Menzel-Gl&#228;ser 0.9 cm round borosilicate Cover Slips</td>
			<td style="width:239px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:273px;">10313573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">PBS tablets</td>
			<td style="width:239px;">Medicago</td>
			<td>09-9400-100</td>
			<td>one tablet per liter of dH2O, then sterilize the solution by autoclaving</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Poly-D-lysine hydrobromide</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6407&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Recombinant Human EGF</td>
			<td style="width:239px;">Peprotech</td>
			<td style="width:273px;">GMP100-15</td>
			<td>for GBM+ medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.)</td>
			<td style="width:239px;">Peprotech</td>
			<td style="width:273px;">100-18B</td>
			<td>for GBM+ medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Immunofluorescence</td>
			<td style="width:239px;"></td>
			<td style="width:273px;"></td>
			<td style="width:961px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:273px;">158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;width:288px;">24 x 60 mm microscope slide cover glass</td>
			<td style="width:239px;">ORSAtec</td>
			<td style="width:273px;">0224601-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:288px;">AlexaFluor 488 and 594 secondary antibodies</td>
			<td style="width:239px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:273px;"></td>
			<td>dilution: 1/500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Anti-Claudin-5 antibody</td>
			<td style="width:239px;">Abcam</td>
			<td style="width:273px;">ab15106</td>
			<td>dilution: 1/150</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Anti-GFAP antibody clone GF5</td>
			<td style="width:239px;">Abcam</td>
			<td style="width:273px;">ab10062</td>
			<td>dilution: 1/150</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">Anti-Mouse CD31&#160;antibody Clone MEC 13.3</td>
			<td style="width:239px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:273px;">550274</td>
			<td>dilution 1/800</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Anti-SV40 T-antigen antibody</td>
			<td style="width:239px;">Abcam</td>
			<td style="width:273px;">ab16879</td>
			<td>dilution: 1/150</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Anti-Zonula Occludens-1</td>
			<td style="width:239px;">Abcam</td>
			<td style="width:273px;">ab96587</td>
			<td>dilution: 1/200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">DAPI</td>
			<td style="width:239px;">TOCRIS</td>
			<td style="width:273px;">5748</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">Fluoromount Aqueous Mounting Medium&#160;</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:273px;">F4680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">LysoTracker Red DND-99</td>
			<td style="width:239px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:273px;">L7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Animal procedures</td>
			<td style="width:239px;"></td>
			<td style="width:273px;"></td>
			<td style="width:961px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">10 cm curved dissecting scissors</td>
			<td style="width:239px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:273px;">14394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">BD Microlance 25-gauge needles</td>
			<td style="width:239px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:273px;">300600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Fine Forceps (12.5 cm)</td>
			<td style="width:239px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:273px;">503283</td>
			<td>for tissue dissociation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Intramedic Polyethylene tubing PE20</td>
			<td style="width:239px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:273px;">427406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Ketaminol vet 50 mg/mL</td>
			<td style="width:239px;">Intervet</td>
			<td style="width:273px;">Vnr511485</td>
			<td>Ketamine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Mains Powered microdrill</td>
			<td style="width:239px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:273px;">503599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">Menzel-Gl&#228;ser 0.5 cm round borosilicate Cover Slips</td>
			<td style="width:239px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:273px;">11888372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Micro Bulldog clamp</td>
			<td style="width:239px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:273px;">14119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">Physiological saline solution</td>
			<td style="width:239px;">Mustela</td>
			<td style="width:273px;">Sterile single dose vials 20 x 5 mL / 40 x 5 mL - Medical device class</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Rochester-Oschner forceps</td>
			<td style="width:239px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:273px;">501709</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Rompun vet 20 mg/mL</td>
			<td style="width:239px;">Intervet</td>
			<td style="width:273px;">Vnr148999</td>
			<td>Xylazine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Stereotaxic adapter</td>
			<td style="width:239px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:273px;">502063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Sugi Sponge Points</td>
			<td style="width:239px;">Kettenbach</td>
			<td style="width:273px;">31603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Equipment</td>
			<td style="width:239px;"></td>
			<td style="width:273px;"></td>
			<td style="width:961px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">Axio Zoom.V16 fluorescence stereo zoom microscope&#160;</td>
			<td style="width:239px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:273px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">FLUOstar Omega microplate reader</td>
			<td style="width:239px;">BMG Labtech</td>
			<td style="width:273px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">ORCA-Flash 4.0 digital sCMOS camera</td>
			<td style="width:239px;">Hamamatsu Photonics</td>
			<td style="width:273px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Universal 320 tabletop centrifuge&#160;</td>
			<td style="width:239px;">Hettich</td>
			<td style="width:273px;">Cat. No. 1401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">ZEISS LSM 880 with Airyscan confocal microscope</td>
			<td style="width:239px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:273px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

predicting in vivo payloads delivery using a blood-brain tumor-barrier in a dish

Svært selektive av natur, blod - hjerne barrieren (BBB) er avgjørende for hjernen homeostase i fysiologiske forhold. Men i sammenheng med hjernesvulster beskytter molekylær selektivitet av BBB også neoplastic cellene ved å blokkere levering av perifert administrert chemotherapies. Utviklingen av romanen narkotika (inkludert nanopartikler) målretting ondartede hjernesvulster ideelt krever bruk av prekliniske dyremodeller stoffets transcytosis og antitumor effekt. For å overholde 3R prinsippet (avgrense, redusere og erstatte) for å redusere antall forsøksdyr i eksperimentelle oppsett og utføre høy gjennomstrømming screening av et stort bibliotek med antitumor midler, vi utviklet et reproduserbar i vitro menneske og murine etterligne av blod-hjerne svulst-barrieren (BBTB) bruker tre-lagdelt kulturer av endotelceller, astrocyttene og pasient-avledede glioblastom kuler. Høyere skalerbarhet og reproduserbarhet, har kommersielle linjer eller udødeliggjort celler blitt brukt i skreddersydd forhold at dannelsen av en barriere som ligner faktiske BBB. Her beskriver vi en protokoll for å få en BBTB etterligne av dyrking endotelceller i kontakt med astrocyttene på bestemt celle tettheter på innlegg. Denne BBTB etterligne kan for eksempel brukes for kvantifisering og AC confocal avbildning av hydrogenion passasjen gjennom endothelial og astrocytic barrierer, i tillegg til evalueringen av svulst celle målretting innenfor samme analysen. Videre viser vi at innhentet data kan brukes til å forutsi oppførselen til nanopartikler i preklinisk dyremodeller. I et bredere perspektiv, denne i vitro modellen kan tilpasses til andre nevrodegenerative sykdommer for fastsettelse av passering av nye terapeutiske molekyler gjennom BBB og/eller suppleres med hjernen organoids direkte evaluere effekten av narkotika.

AC confocal avbildning av murine BBTB forhåndsvisningen viser uttrykk og mobilnettet lokalisering av tett krysset proteiner zonula occludens-1 (ZO-1) og claudin-5 i bEND3. Kontakter mellom endotelceller og astrocyttene indusert tydelig flytting av ZO-1 og claudin-5 endothelial celle-celle kontaktene sammenlignet bEND3 monokulturer (figur 1 d). Bruke immunofluorescence flekker for å visualisere GFAP-uttrykke astrocyttene på hjernen-siden av membranen, er det mulig å observere og studere astrocytic prosesser og slutten-fot å kontakte endotelceller gjennom membran (figur 1E ). Astrocytter-endothelial celle kontaktene er kjent for å fremme og stabilisere innstramming av mobilnettet barrieren og er assosiert med lavere permeabilitet verdier av BBB19. I samsvar med det, observerte vi en betydelig reduksjon i permeabilitet av musen BBTB forhåndsvisningen for Na-Fl fra 27.63 (± 3,45) x 10-6 cm/s ved monokulturer til 6.74 (± 3.01) x 10-6 cm/s når co kultivert med hypoksi-induserbart faktor fortrenging astrocyttene og (HIFko) (tabell 1). Den udødeliggjort HuAR2T utgjør svært permeable mobilnettet barrierer (104.92 ± 27,1 x 10-6 cm/s, tabell 1). Ligner murine modellen, vi målt betydelig lavere permeabilitet av BBTB å Na-Fl, nemlig 47,4 (± 14.32) x 10-6 cm/s, da HuAR2T cellene var co kulturperler med de menneskelige primære astrocyttene (tabell 1).
I både murine og menneskelig BBTB etterlikner indusert tilstedeværelse av pasient-avledede glioblastom kulene en svak økning i permeabilitet verdiene sammenlignet med endotelial celle-astrocytter co kulturer alene (tabell 1). Dette fenomenet er observert med flere, men ikke alle av det pasienten glioma sphere modeller. Dette kan skyldes VEGF-A som utskilles av noen av disse pasient-avledet celler.
Hvis du vil sammenligne permeabilitet verdiene for de i vitro BBTB imiterer med i vivo BBB, fotografert vi sanntid spredningen av Na-Fl gjennom et skallen vindu implantert i naken mus. Bruker en fluorescens stereomicroscope, ble Na-Fl diffusjon fra blodkaret kapillærene avledet fra viktigste pial blodkar registrert før, under og etter systemisk injeksjon av sonden (figur 2C). Målinger av differensial fluorescens verdiene fra sirkulerende blod og hjernen kortikale parenchyma over tid tillot oss å beregne omtrentlig permeabilitet verdiene av naken musen's BBB for Na-Fl (5.57 ± 2.19 x 10-6 cm/s, Tabell 1).
For å illustrere hvordan denne BBTB etterligne kan brukes for visualisering av tidens forbindelser fra til siden blod til hjernen side, sammenlignet vi transcytosis ø 110 nm (NP110) og ø 350 nm (NP350) nanopartikler målretting pasient-avledede glioblastom kuler. Resultatene i vitro ble sammenlignet med den i vivo transcytosis. I eksemplet presentert nanopartikler var overflaten-belagt med svulst målretting peptid CooP20 og lastet med fluorescerende fargestoff (FITC) å forenkle visualisering. Vi merket cellene med lysosomale fargestoff og counterstained med DAPI 24 h etter tillegg av FITC nanopartikler på blod-siden av BBTB etterligner og kjøpt AC confocal micrographs på ulike nivåer (f.eks blod siden membranen, siden hjernen og pasienten glioblastom kuler) (figur 3A). NP110-assosiert fluorescerende signalet colocalized med lysosomer i endotelceller, astrocyttene og kreftceller. I tillegg NP110s ble oppdaget i mellom endotelceller og astrocyttene, passerer gjennom membranen porene av sette (figur 3A).
Passering av NP110s ble kvantifisert ved å måle fluorescens fra prøver fra både blod og hjernen side. Disse permeabilitet verdiene ble sammenliknet med dem bestemt for nanopartikler av ø 350 nm (NP350). Resultatene viser at bare NP110 kunne krysse BBTB etterlikner (figur 3B). NP350 forble på blod-siden av den BBTB etterligne, som resulterte i lavere permeabilitet verdier for disse nanopartikler.
For å fremheve relevansen av BBTB etterlikner sammenlignet i vivo modellene, ble naken musene intravenøst injisert med NP110 eller NP350 nanopartikler belagt med svulst målretting peptid CooP og konjugert med rød fluorescerende farge (TRITC) for påvisning. Vev samlet på flere tidspunkt avdekket at etter 8 h, BBB-permeable nanopartikler har extravasated i hjernen parenchyma, mens den nonpermeable de som bodde i sirkulasjon hovedsakelig ble tømt fra systemisk sirkulasjonen i vivo. Derfor vi samlet hjernen og kvantifisert antall nanopartikler per kvadrat millimeter 8 h postinjection. I samsvar med den i vitro funn, NP110, men ikke NP350, ble extravasated i hjernen parenchyma (Figur 3 c). Høy forstørrelse bildebehandling av hydrogenion plassering i hjernen viste at NP110 var homogent distribuert i hjernen parenchyma utenfor blod blodkar og vellykket homed til implantert glioblastom cellene (figur 3D). Til tross for viser samme svulsten målretting moiety (CooP), NP350 ikke extravasate i hjernen parenchyma og fant bare innenfor den luminal siden av hjerne blodkar (figur 3E), ligner på resultatene i vitro.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59384/59384fig1.jpg"> Figur 1: beskrivelse av blod-hjerne svulst barriere (BBTB) modell. (A) skjematisk fremstilling av plasseringen av forskjellige celletyper. (B) illustrasjon av sett inn plassering på 6-vel plate dekselet og seeding teknikken for astrocyttene på hjernen side av sette's membran. (C) illustrasjon av 6-vel plate plasseringen slik at astrocytter vedheft. (D) Immunofluorescence micrographs av tett krysset proteiner zonula occludens-1 (ZO-1, øvre rad, rød) og claudin-5 (nederste rad, grønn). Protein uttrykk sammenlignes murine hjernen mikrovaskulær endotelceller (bEND3) kultivert på blod side av BBTB alene som en monokultur (venstre kolonne) eller med murine udødeliggjort HIFko astrocyttene (høyre kolonne). Cellen kjerner er counterstained med DAPI (blå). (E) Immunofluorescence mikroskop-bilde viser glial fibrillary Sure protein (GFAP, rød) i HIFko astrocyttene kultivert på hjernen side av BBTB. Høy forstørrelse bildet viser astrocytter prosesser og slutten-fot (piler) kontakter endotelceller gjennom membranen porene (høyre panel). Identiteten til HIFko astrocyttene ble bekreftet av immunofluorescence farging av simian virus 40 store T antigen (SV40 store T, grønn) brukes for immortalization i cellene. Endotelceller uttrykke GFAP verken SV40 store T, og derfor kan være delvis observert gjennom gjennomsiktig, motsatt side av membranen som bare DAPI-farget celler (stiplet linje). Cellen kjerner er counterstained med DAPI (blå). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59384/59384fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59384/59384fig2.jpg"> Figur 2: Intravital live fastsettelse av musen BBB permeabilitet. (A) utarbeidelse av implanterbare caudal blodåre kateter. (1) verktøy og utstyr er følgende: (en) en PE20 polyetylen rør (b) to 25 G nåler (c) Rochester-Ochsner tang, og (d) en liten bulldog klemme. (2) en 25 G nålen fjernes ved flere torsions ved hjelp av tang og (3) nøye inn i røret. (4) den andre siden av røret er koblet til en annen 25 G pinnen. (B) veiledning for kateter implantation og posisjonering å sette mot natrium-fluorescein løsningen gjennom halen åre mus. Innringet området angir området der en dråpe cyanoacrylate lim er plassert for å sikre kateter. Bulldog klemmen brukes til å håndtere kateter, fjernet når kateter er sikret. (C) representant bildebehandling og kvantifisering metode å avgjøre natrium-fluorescein permeabilitet verdiene. Før natrium-fluorescein infusjon (venstre kolonne) målt den autofluorescence/tomt innenfor et område av interesse (ROI) plassert på hjernen (toppanelet, hvitt rektangel) og blodkar områder (bunnen panel, røde rektanglet). Under natrium-fluorescein infusjon (høyre kolonne) måles fluorescens intensiteten i begge ROIs, slik at beregningen av BBB permeabilitet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59384/59384fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59384/59384fig3.jpg"> Figur 3: prediksjon av de intracerebral transcytosis av nanopartikler gjennom BBB i vivo bruker i vitro BBTB modellen. (A) grafisk representasjon av BBTB analysen med representant AC confocal bilder på de angitte ulike nivåene av murine BBTB modellen. Nanopartikler på 110 nm i diameter (NP110) og konjugert til FITC (grønn) ble lagt til blodet side BBTB cellene var merket med lysosomale sonden (LT-99, rød).  (1) Endothelial celler, (2) Endothelial transcytosis av nanopartikler gjennom porene i membranen (hvit stiplet linje), astrocyttene og (3), og (4) pasienten glioblastom kuler identifiseres på grafikken og tilsvarende AC confocal micrographs (til høyre). Lysosomale innkapsling av nanopartikler (piler) antyder aktive transcytosis gjennom endothelial og astrocytter lagene i BBTB. (B) kvantifisering av angitte hydrogenion permeabilitet gjennom BBTB i vitro (n = 6). (C) kvantifisering av angitte hydrogenion tetthet i hjernevevet seksjoner, 8 timer etter caudal blodåre-infusjon av naken mus (n = 3). (D) AC Confocal micrographs viser fordelingen av ø 110 nm nanopartikler (NP110, rød) i murine hjernen vev deler merket med et anti-musen CD31 antistoff (grønn). Pilen høydepunkter hydrogenion transcytosis (venstre panel). Nanopartikler samlet rundt kreftceller hjernen (svulst, høyre panel) på grunn av CooP målretting peptid presentert på overflaten deres. Ingen betydelige homing er observert i hjernevevet (hjernen). (E) AC Confocal micrographs viser fordelingen av ø 350 nm nanopartikler (NP350, rød) i murine hjernen vev seksjoner merket med et anti-musen CD31 antistoff (grønn). Pilspisser peker til NP350s som ble beholdt i blodkar lumen og klarte ikke å krysse BBB, sannsynligvis på grunn av deres større diameter i forhold til NP110s.-cellen kjerner er counterstained med DAPI (blå). P < 0,01. P-verdier ble beregnet ved hjelp av en tosidig, parametriske Mann-Whitney U test. Feilfeltene representerer standardavviket. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59384/59384fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>murine BBTB etterligne</td>
			<td>bEND3</td>
			<td>bEND3 + HIFko som</td>
			<td>bEND3 + GB</td>
			<td>bEND3 + HIFko som + GB</td>
			<td>In vivo</td>
		</tr>
<tr>
<td>Permeabilitet (10-6 cm/s)</td>
			<td>27.63</td>
			<td>6.74</td>
			<td>26.8</td>
			<td>10.83</td>
			<td>5.57</td>
		</tr>
<tr>
<td>SD (10-6 cm/s)</td>
			<td>3,45</td>
			<td>3.01</td>
			<td>7,99</td>
			<td>2,65</td>
			<td>2.19</td>
		</tr>
<tr>
<td>menneskelige BBTB etterligne</td>
			<td>HuAR2T</td>
			<td>HuAR2T + hIAs</td>
			<td>HuAR2T + GB</td>
			<td>HuAR2T + hIAs + GB</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Permeabilitet (10-6 cm/s)</td>
			<td>104.92</td>
			<td>47,4</td>
			<td>89.08</td>
			<td>48.24</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>SD (10-6 cm/s)</td>
			<td>27,1</td>
			<td>14.32</td>
			<td>10.21</td>
			<td>13.07</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: verdier av natrium-fluorescein (Na-Fl) permeabilitet (i cm per sekund) i vitro i angitte co kultur systemer og in vivo i NMRI naken mus. Data fra en representant eksperiment (n = 3 mus).

Watch this Scientific Journal Video about Predicting In Vivo Payloads Delivery using a Blood-brain Tumor-barrier in a Dish at JoVE.com

Predicting In Vivo Payloads Delivery using a Blood-brain Tumor-barrier in a Dish

Forutsi i Vivo Payloads levering med en blod-hjerne svulst barriere i en rett

Stoffet målretting til sentralnervesystemet svulster er en stor utfordring. Her beskriver vi en protokoll for å produsere en i vitro etterligne av blod-hjerne svulst-barrieren bruke murine og/eller menneskelige celler og diskutere deres relevans for forutsigbarheten av sentralnervesystemet svulst målretting i vivo.

Highly selective by nature, the blood-brain barrier (BBB) is essential for the brain homeostasis in physiological conditions. However, in the context of ...

For å utvikle nye legemidler og forbindelser som retter seg mot svulster i sentralnervesystemet, er tilgjengeligheten og passasjen gjennom blod-hjernebarrieren svært viktig. Selv om cytotoksisiteten til forbindelsene lett kan måles ved å inkubere cellene med terapeutiske molekyler, forteller det egentlig ikke noe om selve leveringen til tumorstedet i hjernen. For å løse dette problemet utviklet vi følgende protokoll som beskriver hvordan du gjenskaper blod-hjerne tumorbarrieren in vitro på en tallerken.Bruken av udødelige celler av murin eller menneskelig opprinnelse gjør denne analysen svært fleksibel. Det kan også enkelt skaleres opp til skjermen dusinvis av forbindelser med høy reproduserbarhet. I tillegg tillater denne metoden både kvantifisering og visualisering av passasjen og målrettingsevnen til forbindelsene før du fortsetter med prekliniske modeller.Derfor erstatter vår metode delvis dyremodellene ved hjelp av de forhåndsetablerte cellelinjene. Inkludering av pasientavledede hjernesvulstceller analyserer pasientens heterogenitet, mens bruk av udødelighetsceller for å etablere blod-hjernebarrieren sikrer reproduserbarheten av resultatene. Til sammen tilbyr denne blod-hjernebarrieremodellen et veldig interessant verktøy for å analysere stoffdiffusjonen eller levering av narkotikakjøretøy.Visuell demonstrasjon av metoden er kritisk fordi seeding av cellene på motsatt side av innsatsen krever manipulering som ikke ofte beskrives i andre protokoller ved hjelp av lignende oppsett. For eksempel, å få vedheft av astrocytter når innsatsen er plassert opp ned svært fordeler fra visuell representasjon. Under en steril cellekulturhette vasker du forsiktig de kultiverte astrocytter med fem milliliter steril PBS.Bruk en vakuumpumpe til å kaste PBS forsiktig, og tilsett to milliliter celledissosiasjonsreagens i fem minutter for å løsne cellene. Deretter legger du til 10 milliliter sterile komplette astrocyttcellekulturmedium til fartøyet for å hemme aktiviteten til celledissosiasjonsreagensen. Bruk en steril serologisk pipette til å overføre de frittliggende cellene fra fartøyet til et sterilt 15-milliliter rør.Sentrifuge ved 250 ganger g i tre minutter ved romtemperatur. I mellomtiden, sett ut innsatsene. Bruk sterile tang til å plassere innsatsene med hjernen side opp på lokket på en steril seks-brønns plate.Når sentrifugeringen er fullført, kast forsiktig supernatanten fra cellefjæringen, og gjenoppstår astrocyttpellet i en milliliter ABM-pluss ved å forsiktig pipettere pelleten på rørets vegg opptil fem ganger. Deretter teller cellene, og justerer cellefjæringstettheten til 150 000 celler i 400 mikroliter ABM-pluss per innsats. Plasser cellesuspensjonen i midten av hjernesiden av innsatsens membran, og spre den forsiktig ved hjelp av kapillærkraft med en steril pipettespiss.Med hjernesiden av innsatsene fortsatt opp, plasser seks-brønnsplaten tilbake på innsatsene. Plasser platen og innsatsene, med hjernen side opp, i en inkubator ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid for å tillate celle vedheft. Etter dette, gå tilbake seks-brønnsplaten tilbake til sin vanlige posisjon, med innsatsene nå blod side opp.Legg til medium, og fortsett inkubasjonen som beskrevet i tekstprotokollen. Under en steril cellekulturhette vasker du forsiktig de kultiverte endotelcellene med fem milliliter steril PBS. Bruk en vakuumpumpe til å kaste PBS forsiktig, og tilsett to milliliter celledissosiasjonsreagens i fem minutter for å løsne cellene.Deretter legger du til 10 milliliter sterile komplette endotelcellekulturmedium til fartøyet for å hemme aktiviteten til celledissosiasjonsreagensen. Bruk en steril serologisk pipette til å overføre de frittliggende cellene fra fartøyet til et sterilt 15-milliliter rør. Sentrifuge ved 250 ganger g i tre minutter ved romtemperatur.Etter dette, kast den overnaturlige, og resuspend endotelcellepellet i en milliliter EBM-pluss ved sakte pipettering av cellefjæringen på rørets vegg opptil fem ganger. Tell cellene, og juster cellesuspensjonstettheten til 200 000 celler i 2,5 milliliter endotelcellekultur uten serum og vaskulær endotelvekstfaktor-A per innsats. Hent platen som inneholder innsatsene.Kast forsiktig mediet fra blodsiden, og erstatt det med 2,5 milliliter endotelcellesuspensjon. Deretter returnerer du platen til inkubatoren, og la den stå over natten for å la endotelcellene holde seg til membranen. Neste dag, forberede en seks-brønns plate ved å overføre tre milliliter av pre-varmet ABM-minus til hver brønn.Bruk sterile tang, håndter innsatsene for å forsiktig kaste endotelet komplett medium fra blodsiden, og plasser innsatsen i den nye platen som inneholder ABM-minus. Deretter legger du til 2,5 milliliter EBM-minus. La innsatsene stå i inkubatoren med minimal fysisk forstyrrelse eller temperaturvariasjon i fem dager.På overføringsdagen erstatter du mediet. For immunofluorescence imaging, plasser opptil fire runde sterile borosilikatdekslepper i hver brønn av en seksbrønnsplate som inneholder to milliliter poly-D-lysin. Inkuber ved romtemperatur i 30 minutter.I mellomtiden, bruk en steril serologisk pipette for å forsiktig overføre tumorkulene fra cellekulturkaret til et 15-milliliter sterilt rør. Sentrifuger tumorkulene ved 250 ganger g i tre minutter. Kast det overnaturlige, og resuspend sfærene forsiktig i ett milliliter GBM-minus.Tell cellene, og juster celletettheten til ca. 10 000 kuler eller 100 000 celler per milliliter GBM-minus. Deretter kaster du poly-D-lysinen fra brønnene, og skylle brønnene tre ganger med steril PBS. Seed hver brønn av platen med tre milliliter av svulsten sfæroid suspensjon, og overføre innsatsene med BBTB etterligne på tumorcelle suspensjon.Inkuber over natten ved 37 grader Celsius med 5% karbondioksid for å tillate blod og hjernesvulst sider av analysen å komme til likevekt. Neste dag, erstatt media i blodsiden med EBM-minus supplert med molekyler, legemidler eller nanopartikler av interesse. Samle prøvene over tid for direkte kvantifisering som tidligere beskrevet.Først samler du 100 mikroliter av mediet fra både blodet og hjernesidene av BBTB etterligne, og overfører hver til en separat flatbunnet, svart, 96-brønnsplate for påfølgende fluorescensmålinger. Deretter forbereder du en 50 mikromolaroppløsning av natriumfluorein i EBM-minus, og sørg for å forberede 2,5 milliliter per brønn. Forvarm denne løsningen til 37 grader Celsius, og erstatt mediet fra blodsiden av innsatsene med medier som inneholder denne natriumfluoresinoppløsningen.Start en tidtaker så snart mediet er skiftet ut. Samle forsiktig 100 mikroliter med media fra både blod- og hjernesidene av innsatsene etter fem minutter, 30 minutter, 60 minutter og 120 minutter. Overfør hver prøve for å skille brønner av riktig svart, 96-brønnsplate.Bruk en plateleser til å kvantifisere fluorescensen fra de innsamlede prøvene. For det første fortynne lysosomet fluorescerende fargestoff til riktig arbeidskonsentrasjon i forvarmet medium. Legg dette til cellene, og inkuber ved 37 grader Celsius med 5% karbondioksid i 45 minutter.Skyll deretter cellene tre ganger med iskald PBS. Kast PBS, og tilsett tre milliliter iskaldt 4% paraformaldehyd til brønnene og 2,5 milliliter til innsatsen. Inkuber på is i 10 minutter.Etter dette, kast paraformaldehyd, og skyll cellene tre ganger med PBS. Fjern PBS, og konstain cellekjernene ved hjelp av en DAPI-løsning ved en endelig konsentrasjon på ett mikrogram per milliliter i destillert vann. Inkuber ved romtemperatur i syv minutter.Deretter fjerner DU DAPI, og vask membranene tre ganger med destillert vann. Skjær forsiktig membranen, fjern det destillerte vannet, og legg det på en dråpe monteringsmedium på et glassmikroskopsklie. Tilsett en ny dråpe monteringsmedium på den andre siden av membranen, og dekk det forsiktig med et borosilikatdekselglass.I denne studien ble endotelceller co-dyrket med astrocytter for å danne et blod-hjerne tumor barriere-lignende grensesnitt i en in vitro oppsett. Konfokal avbildning av murine BBTB etterligne viser uttrykket og cellulær lokalisering av tette knutepunkt proteiner reguleringsplan okkluder-1 og claudin-5 i bEND3. Kontakter mellom endotelcellene og astrocytter induserer tydelig flytting av disse to proteinene til endotelcell-til-celle-kontaktene sammenlignet med bEND3 monokulturer.Ved hjelp av immunofluorescence farging for å visualisere GFAP-uttrykkende astrocytter på hjernesiden av membranen, er det mulig å observere og studere astrocytiske prosesser og endeføtter som kontakter endotelcellene gjennom membranen. For å sammenligne permeabilitetsverdiene til in vitro BBTB etterligner med in vitro blod-hjernebarrieren, avbildet sanntidsdiffusjonen av natriumfluorein gjennom et kranialt vindu implantert i nakne mus. Ved hjelp av et fluorescensstereomikroskop registreres natriumfluoresindiffusjon fra blodkarets kapillærer som stammer fra de viktigste pialblodkarene før, under og etter systemisk injeksjon av sonden.Transcytose av nanopartikler som retter seg mot pasientavledede glioblastomsfærer, sammenlignes deretter for å illustrere hvordan denne BBTB-etterlignen kan brukes til å visualisere passasjen av forbindelser fra blodsiden til hjernesiden. Det NP110-tilknyttede fluorescerende signalet er samtidig lokalisert med lysosomene i endotelcellene, astrocytter og tumorceller. I tillegg oppdages NP110s mellom endotelcellene og astrocytter, som passerer gjennom membran porene i innsatsen.Passasjen av NP110s kvantifiseres ved å måle fluorescensen fra prøver samlet inn fra både blod- og hjernesiden, og disse verdiene sammenlignes med de bestemte nanopartikler som er 350 nanometer. Som det kan ses, er bare NP110s i stand til å krysse BBTB etterligner, mens NP350 forble på blodsiden, noe som resulterer i lavere permeabilitetsverdier for disse nanopartiklene. Håndter innsatsen forsiktig, og spre forsiktig astrocyttcellesuspensjonen på hjernesiden av innsatsen uten direkte kontakt med membranen.Eventuelle skader på membranen vil resultere i lekkasje. Denne metoden kan tilpasses for å svare på spørsmålet om hjernelevering av perifert administrerte nyttelaster. Ved å bruke forskjellige innsatser med større membranporer, er det også mulig å studere celle ekstravasasjon.Denne teknikken kan endres ved hjelp av forskjellige celletyper for å etterligne andre cellulære barrierer. Det baner også vei for en mer ansvarlig og etisk forskning, med sikte på å redusere antall laboratoriedyr som brukes til validering av kreftmedisiner. Husk at paraformaldehyd er et svært giftig kjemikalie og bør håndteres tilsvarende.Vær også forsiktig mens du bruker en skarp skalpell for å trekke ut membranene fra innsatsene.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

De<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal Disc Tumor Model: Visualisering og Kvantifisering av genekspresjon og Tumor Invasivitet Bruke Genetic Mosaikk

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

I Vivo EPR vurdering av pH, pO2, Redox Status, og konsentrasjoner av fosfat og glutation i svulst Microenvironment

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

Fluorescence Molecular Tomography for In Vivo Imaging of Glioblastoma Xenografts

Fluorescence Molecular Tomography for In Vivo Imaging of Glioblastoma Xenografts

Fluorescens molekylær tomografi ved i Vivo avbildning av glioblastom Xenografts

Tumorigenicity is the capability of cancer cells to form a tumor mass. A widely used approach to determine if the cells are tumorigenic is by injecting ...

In Vivo Inhibition of MicroRNA to Decrease Tumor Growth in Mice

In vivo hemming av MicroRNA å redusere tumor vekst i mus

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression through their ability to destabilize mRNA and inhibit translation of target mRNAs. An ...

Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs

Kombinert bruk av hale vene metastasering analyser og Real-Time in vivo Imaging å kvantifisere brystkreft metastatisk kolonisering og byrde i lungene

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification ...

In Vivo Targeting of Xenografted Human Cancer Cells with Functionalized Fluorescent Silica Nanoparticles in Zebrafish

In Vivo Målretting av Xenografted Human Cancer Celler med funksjonalisert fluorescerende silika nanopartikler i sebrafisk

Developing nanoparticles capable of detecting, targeting, and destroying cancer cells is of great interest in the field of nanomedicine. In vivo animal ...

Using Computer-based Image Analysis to Improve Quantification of Lung Metastasis in the 4T1 Breast Cancer Model

Bruke databasert bildeanalyse for å forbedre kvantifiseringen av lungemetastase i 4T1 brystkreftmodell

Breast cancer is a devastating malignancy, accounting for 40,000 female deaths and 30% of new female cancer diagnoses in the United States in 2019 alone. ...

Patient-Derived Tumor Explants As a "Live" Preclinical Platform for Predicting Drug Resistance in Patients

Pasientavledede tumor utviser som en "levende" preklinisk plattform for å forutsi legemiddelresistens hos pasienter

An understanding of drug resistance and the development of novel strategies to sensitize highly resistant cancers rely on the availability of suitable ...

Evaluation of the In vivo Antitumor Activity of Polyanhydride IL-1&#945; Nanoparticles

Evaluation of the In vivo Antitumor Activity of Polyanhydride IL-1ÃƒÅ½Ã‚Â± Nanoparticles

Evaluering av in vivo antitumoraktivitet av polyanhydrid IL-1a nanopartikler

Cytokine therapy is a promising immunotherapeutic strategy that can produce robust antitumor immune responses in cancer patients. The proinflammatory ...

Longitudinal Intravital Imaging Through Clear Silicone Windows

Langsgående intravital avbildning gjennom klare silikonvinduer

Intravital microscopy (IVM) enables visualization of cell movement, division, and death at single-cell resolution. IVM through surgically inserted imaging ...