Name: predicting in vivo payloads delivery using a blood-brain tumor-barrier in a dish
Uploaded: 2019-04-16T14:30:00
Duration: 13 min 34 s
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Esta investigación fue apoyada por donaciones de las organizaciones de cáncer de Finlandia, Jane & Aatos Erkko Fundación y Sigrid Juselius Fundación (P.L. y V.L.J.), la Fundación Nacional Suiza de ciencia (Advanced Postdoc.Mobility subsidio no: P300PB_164732, al S. K.), la Fundación de investigación Orion (a S.K.), la Fundación Maud Kuistila Memorial (a S.K.) y la Academia de Finlandia (TERVA 2017, subsidio no: 314 498). La unidad de imagen Biomedicum (Helsinki) es reconocida por ofrecer la microscopia instalaciones centrales para la proyección de imagen.

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Los autores no tienen nada que revelar.

La subida del concepto de variabilidad notable tumor había rejuvenecido la investigación de medicina personalizada del cáncer21. Esta variabilidad es también un sello de neoplasias del sistema nervioso central. Debido a la imprevisibilidad del tumor, respuesta a la quimioterapia agrega en el sentido de acogida de la BBB para la entrega de la droga y en conjunto constituye grandes desafíos en el cuidado de los pacientes22. Para desarrollar terapias más eficaces, a menudo es necesario a las bibliotecas grandes de la pantalla de nuevas moléculas. Para evaluar la eficacia antitumoral y la capacidad de la nueva terapéutica conduce al llegar al sitio del tumor, la mejor opción es el estudio preclínico en células derivadas del paciente implantado en vivo en avatares paciente murinos. Debido a la práctica (recursos financieros, de tiempo, humanos y facilidad) y razones éticas (3R principio al usar animales de laboratorio), el desarrollo de una plataforma de proyección en vivo en gran escala a menudo no es posible y por lo tanto, los ensayos celulares siendo un modelo de elección23. La razón principal para la selección de líneas celulares establecidas y evitar células primarias es facilitar la reproducibilidad y reducir el uso de animales de laboratorio, que son la principal fuente para el aislamiento y el establecimiento de cultivos primarios murinos. Los métodos que presenta aquí, cumpliendo firmemente con las 3Rs, podrían descartar eficientemente nanopartículas de una posterior investigación preclínica en el criterio de su incapacidad para cruzar el modelo BBTB. Como una prueba de principio, Describimos aquí resultados obtenidos durante el desarrollo y validación de lo BBTB. Hemos podido confirmar hallazgos in vitro in vivo, por ejemplo, cuando mide la difusión pasiva de un 376 Da la fluoresceína sódica.
El protocolo descrito en este artículo describe la preparación de las células endoteliales morfología con astrocitos para formar una interfaz de tumoración barrera sangre-cerebro en una configuración en vitro. Una vez que se establece un contacto físico entre estos dos tipos celulares, la capa de células endoteliales exhibe semejanzas con el BBB (por ejemplo, una célula expresión superficial de las proteínas de Unión estrecha y relativamente baja permeabilidad). Curiosamente, el imitador BBTB murino parecía proporcionar valores de permeabilidad de Na-Fl particularmente similares a los obtenidos con el ratón en vivo de las mediciones de permeabilidad BBB24. Por lo tanto, el rendimiento de los imitadores BBTB estará directamente vinculado a la elección de las células utilizadas para formar la barrera. Las células endoteliales bEND3 originan en el cerebro y se saben que tener éxito en la formación de barreras cuando morfología con astrocitos25. Sin embargo, hemos utilizado el inmortalizado de astrocitos HIFko26 para generar al imitador BBTB. Debido a su carencia del factor inducible por la hipoxia, los astrocitos no producen VEGF-A, que es por excelencia en la estabilización de los mimic BBTB descrita aquí. Los astrocitos se han identificado como moduladores de la permeabilidad BBB, por ejemplo a través de la liberación de VEGF-A en respuesta a neuroinflamación27. Activación de los receptores del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFRs) es un regulador clave de la permeabilidad endotelial vascular tanto en vitro28 y29de en vivo. Por lo tanto, suplementos de VEGF-A en el medio de activan el VEGFR2 en las células endoteliales, que induce la fosforilación de proteínas de Unión adherentes como VE-cadherina30. La pérdida de contactos de la célula endotelial genera gran permeabilidad de los vasos sanguíneos. Del mismo modo, la fuerte característica mitogénica y composición desconocida del suero bovino fetal utilizado en los ensayos de cultura de célula causan problemas importantes en la reproducibilidad de la estabilización y el análisis de barrera.
Las células endoteliales de vena umbilical humano (HUVECs) se utilizan a veces para formar BBB en vitro31; sin embargo, significativamente difieren de las células endothelial microvasculares del cerebro, tales como la celda D3/hCMEC línea32, en términos de la expresión génica y la formación de barrera propiedades. Sin embargo, la permeabilidad relativamente mayor que los valores obtenidos con las células HuAR2T cultivadas solo comparados con el bEND3 fueron reducidos grandemente por cocultivo con astrocitos primarios humanos. Aunque las células endoteliales son necesarios para formar la pared celular, es claro que los astrocitos tienen un papel igualmente importante para la formación de BBTB y estabilización.
Cuando esferas de glioma derivados del paciente se agrega a esta ecuación, el imitador BBTB ratón recapitula algunas de las características de xenoinjertos murinos, tales como la difusión del fármaco a través de la vasculatura cerebral y tumor de la célula objetivo. Los imitadores BBTB aquí lograron, por ejemplo, refleja el comportamiento in vivo cuando defendimos varias nanopartículas con diferentes diámetros. Para ilustrar el paralelismo entre los modelos in vitro e in vivo, hemos utilizado el de nanopartículas de silicato mesoporosos previamente descritos33 con penetración celular propiedades34 conjugado con el péptido tumor targeting CooP en su surface20. Los hogares dirigidos a CooP de péptido a las células del tumor invasivo a través de la unión específica para el inhibidor de crecimiento mamario derivados (MDGI). Varios tipos de cáncer, como los gliomas, son overexpressing MDGI en comparación con el tejido normal35, que hace la cooperativa un grupo de metas de tumor muy eficiente capaz de aumentar la entrega de una capacidad de carga20. Las nanopartículas usadas aquí se ha demostrado previamente que difusa en el parénquima cerebral (27547955), y cuando funcionalizados con Taxol, estas nano-cargas han tenido éxito en la reducción del crecimiento de la glioma en modelos preclínicos36. La adición de residuos de polietileno glicol (PEG) en la superficie de las nanopartículas también mantuvo su carga estática a valores positivos (alrededor de + 4 mV), lo que permite mejor interacción con la unidad neurovascular del37 y también aumenta su estabilidad en la circulación. En los datos presentados, 3 kDa de PEG fue conjugado con NP110s, mientras NP350s se cubren de 10 kDa de PEG. Sin embargo, PEG de mayor peso molecular también resultó en un aumento significativo en el diámetro de nanopartículas, por lo tanto sus capacidades físicas para cruzar el BBB. Por lo tanto, comprobamos si las dimensiones físicas de las partículas impidieron su paso a través de lo BBTB y si estas observaciones pueden espejarse en vivo.
Acuerdo con las observaciones previamente publicadas, observamos que NP110s extravasados a través lo BBTB in vitro y la BBB de ratones con tumores intracraneales, mientras que NP350s retenido en el lado luminal de la imitador BBTB y en los vasos sanguíneos de la ratones. Estos resultados similares sugieren fuertemente que el modelo BBTB predijo la capacidad in vivo de nanopartículas para cruzar el BBB y alcanzar el cerebro.
Con frecuencia se discute la pertinencia de modelos de la BBB, incluso para el suministro central de nanopartículas38. Aquí mostramos que primaria astrocitos y células endoteliales, ambos considerados como los más relevantes instrumentos in vitro, se pueden substituir por las células inmortalizadas o disponibles en el mercado, garantizando una mayor escalabilidad y reproducibilidad. La próxima generación de los imitadores BBB in vitro podría ser desarrollada mediante la incorporación de los dispositivos microfluídicos, permitiendo unidades neurovasculares maravillosamente formado que estructuralmente se parecen a los reales BBB12,14. Sin embargo, tales modelos son actualmente inadecuados para el cribado de alto rendimiento de moléculas a gliomas, debido a limitaciones técnicas en el seguimiento de la entrega de14. Es de hecho difícil de capturar la complejidad fisiológica de la BBB en un plato, y la falta de algunos receptores/proteínas, conocido por ser expresada por el BBB, puede afectar la interpretación de los resultados. Otro argumento refiere a la gran variabilidad en la expresión génica entre las condiciones in vivo e in vitro, así como de la línea de una celda a otra, teniendo en cuenta las células endoteliales. Sin embargo, también se podría argumentar que la unidad neurovascular no es una entidad uniforme dentro el cerebro39. Investigación científica en biología ha llegado a una era humana donde el bienestar animal, responsabilidad ética y el costo del uso de vidas animales son considerados siempre antes de diseñar un experimento. Por lo tanto, para apoyar la sustitución de los animales, un creciente número de estudios recientes muestra que la conciencia de las limitaciones de los modelos y una cuidadosa selección de los modelos para establecer la barrera — con énfasis en los astrocitos, garantiza un coincidencia entre los resultados obtenidos en un plato y en animales modelos de40. Con la metodología aquí descrita, conseguimos un paso más cerca de reducir el número de animales de experimentación utilizados para la detección de efectos de transcitosis BBB para terapéutica potencial.

La unidad neurovascular se compone de neuronas, astrocitos y el BBB, formado por las intrincadas conexiones entre pericitos, astrocitos, células endoteliales y la membrana basal asociada formando la microvasculatura cerebral del1. Este apretada pared celular formada por vasos continuados, nonfenestrated finalmente regula el movimiento de iones y moléculas (incluyendo hormonas, nutrientes o medicamentos) sino también de circular las células1. La transcitosis en particular baja a través de la BBB de moléculas de alto peso molecular, tales como anticuerpos terapéuticos, fármacos conjugados o nanocompuestos, restringen considerablemente los avances en el descubrimiento de fármacos para enfermedades neurológicas, incluyendo mala los gliomas2. De hecho, quimioterapias entregadas por vía oral o intravenosa alcanzan el parénquima cerebral a menudo a protegidos bajas concentraciones para inducir un efecto antitumoral o simplemente no pueden cruzar lo BBTB para llegar a las células neoplásticas3. Varios estudios preclínicos y clínicos no han tratado el tema de la penetración BBTB pero han intentado interrumpir la BBTB transitoriamente, por ejemplo mediante el uso de ultrasonidos enfocado4,5, o para evadir por el directo en situ entrega de drogas6. Sin embargo, ninguna de estas técnicas fueron capaces de contrarrestar la expansión inevitable del tumor o de la recaída. Por lo tanto, en el desarrollo de nuevas terapias antiglioma, la difusión a través de lo BBTB puede considerarse uno de los aspectos críticos para la entrega exitosa de los agentes terapéuticos7.
Debido a la naturaleza compleja de las interacciones celulares dentro de lo BBTB, estudios in vivo en animales de laboratorio parecen ser la opción obvia al estudiar el paso de moléculas de la sangre al cerebro. Sin embargo, métodos in vivo de gran escala son relativamente complejos para establecer y, por lo tanto, no permite el cribado de alto rendimiento de moléculas en un tiempo razonable a un costo razonable. Más importante aún, la experimentación con animales debe seguir la pauta ética de 3R definida como i) refinar ii) reducir y, de relevancia para el contexto actual, iii) sustituir por protocolos alternativos (por ejemplo, en los métodos de vitro/in silico). Por lo tanto, recreando lo BBTB in vitro aparece como una posibilidad interesante y atractiva, pero también constituye una tarea compleja, desafiada por varias limitaciones. Muchos intentos de recrear este compartimiento complejo con cultivos de células primarios o líneas celulares de canino, porcino, origen murino y humano incluso se han publicado (ya revisado por Rahman et al.8 y9de la ley Helms et al.). Estos modelos incluyen microfluídicos tridimensional sistemas10, BBB-en-un-chip11,12, y rellenos de multitud de variantes, basadas en el clásicos co-cultivos en sistemas. Sin embargo, sistemas microfluídicos y chip actuales son o no adecuados para estudios de validación de medicamentos rápida, alto rendimiento13,14 o son actualmente incompatible con estudios de administración de fármacos para tumores cerebrales. Además, la revisión de 155 modelos publicados utilizando células primarias, células pluripotentes inducible (iPSC) o líneas celulares comerciales insertos Co cultivadas en todos mostraron una tendencia de discrepancia interstudy en sus mediciones y conclusiones8. Esta falta de reproducibilidad interlaboratorios podría ser correlacionada con las condiciones de cultivo i) nonnormalized, por ejemplo con el recubrimiento opcional con proteínas de la matriz de la membrana del sótano en el recipiente de cultivo celular, ii) un número creciente de subcultivo y uso del suero que contienen los medios de comunicación, los conductores principales de modificaciones genéticas y fenotípicas de la célula líneas15, o iii) la dificultad para recrear reproducible el equilibrio adecuado entre los componentes endoteliales en un plato y astroglial. Aunque el uso de las células inmortalizadas o celular comercial líneas para establecer un modelo in vitro de BBB carece de algunas de las propiedades en comparación con modelos similares que utilizan sólo células primarias, en el método descrito se muestra que la combinación de células exhibe una muy rendimiento comparable a estudios publicados en otros modelos de referencia16,17. Finalmente, la falta de un modelo robusto y reproducible para estudiar el paso de compuestos terapéuticos dirigidos a tumores cerebrales a través de lo BBTB nos motivó a desarrollar los métodos descritos aquí.
Puesto que el objetivo era usar el modelo para predecir la entrega en vivo de nanopartículas en modelos animales preclínicos, primero validamos el modelo BBTB mediante la utilización de insertos que contiene murinas células endoteliales en contacto con astrocitos murinos. Además de esto, nosotros también optimizado el modelo para utilizar ciertas líneas de células humanas. Una vez estabilizado, las barreras de la célula se transfieren a las culturas con esferas de glioblastoma derivados del paciente o líneas celulares de glioma comercial. Después de eso, la transcitosis de nanopartículas y tumor de la célula objetivo pueden ser visualizado por microscopía confocal y cuantificado por la recogida de muestras en el tiempo. Lo importante, resultados obtenidos utilizando la mímica BBTB confiablemente podrían predecir el comportamiento de las nanopartículas en vivo, apoyando el uso de la previa mímica BBTB la validación preclínica.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1761px;" width="1761">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:1761px;">Cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">bEND3</td>
			<td style="width:239px;">ATCC</td>
			<td style="width:273px;">CRL-2299</td>
			<td style="width:961px;">Cultured in: DMEM (1g/L glucose) supplemented with 10% FBS, 5 mL L-glutamine and 5 mL penicillin/streptomycin</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">HIFko immortalized mouse astrocytes</td>
			<td style="width:239px;">Isolated in Dr. Gabriele Bergers Lab</td>
			<td style="width:273px;">https://doi.org/10.1016/S1535-6108(03)00194-6</td>
			<td style="width:961px;">Cultured in: BME-1 supplemented with 5% FBS, 5 mL 1 M HEPES, 5 mL 100 mM sodium pyruvate, 3 g D-glucose and 5 mL penicillin/streptomycin</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">HuAR2T</td>
			<td style="width:239px;">Isolated in Dr. Dagmar Wirth Lab</td>
			<td style="width:273px;">https://doi.org/10.1089/ten.tea.2009.0184</td>
			<td style="width:961px;">Cultured in: EBM-2 with SupplementMix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">normal human primary astrocytes</td>
			<td style="width:239px;">Lonza</td>
			<td style="width:273px;">CC-2565</td>
			<td style="width:961px;">Cultured in: ABM with SingleQuots</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:1761px;">Material and reagents</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100x17mm Dish, Nunclon Delta</td>
			<td style="width:239px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td>150350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">10 mL serological pipet</td>
			<td style="width:239px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:273px;">170361</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">15mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:239px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:273px;">339650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">ABM Basal Medium, 500 mL</td>
			<td style="width:239px;">Lonza</td>
			<td style="width:273px;">CC-3187</td>
			<td>For primary human astrocytes. ABM+: contains all the additives from the supplement mix. ABM-:all the additives except for rhEGF and FBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Accutase Cell Detachment Solution</td>
			<td style="width:239px;">Corning</td>
			<td style="width:273px;">25-058-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">AGM SingleQuots Supplements and Growth Factors</td>
			<td style="width:239px;">Lonza</td>
			<td>CC-4123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">B27 supplement</td>
			<td style="width:239px;">Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>for both GBM + and - medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Basal Medium Eagle</td>
			<td style="width:239px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:273px;">21010046</td>
			<td>BME-1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Corning Costar TC-Treated 6-Well Plates</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:273px;">CLS3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">Corning Transwell polyester membrane cell culture inserts</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:273px;">CLS3452&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">D-glucose</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:273px;">G8270</td>
			<td>dissolve in 50 mL of BME-1 and sterile filter before adding to the medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium/Nutrient F-12 Ham</td>
			<td style="width:239px;">Gibco</td>
			<td>21331-020</td>
			<td>Specific to the culture of the patient-derived spheres isolated in our lab, may vary for other glioma cell lines</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EBM-2 growth Medium SupplementMix</td>
			<td style="width:239px;">PromoCell</td>
			<td style="width:273px;">c-39216</td>
			<td>EBM+: contains all the additives from the supplement mix. EBM-:all the additives except for VEGF-A and FBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Endothelial Basal Medium 2 (EBM-2)</td>
			<td style="width:239px;">PromoCell</td>
			<td style="width:273px;">c-22211</td>
			<td>EBM+: contains all the additives from the supplement mix. EBM-:all the additives except for VEGF-A and FBS</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:288px;">Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin</td>
			<td style="width:239px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:273px;">10500056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Fluorescein sodium salt</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:273px;">F6377</td>
			<td style="width:961px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Greiner CELLSTAR 96 well plates</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:273px;">Greiner 655090</td>
			<td>black polystyrene wells flat bottom (with micro-clear bottom)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">Menzel-Gl&#228;ser 0.9 cm round borosilicate Cover Slips</td>
			<td style="width:239px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:273px;">10313573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">PBS tablets</td>
			<td style="width:239px;">Medicago</td>
			<td>09-9400-100</td>
			<td>one tablet per liter of dH2O, then sterilize the solution by autoclaving</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Poly-D-lysine hydrobromide</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6407&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Recombinant Human EGF</td>
			<td style="width:239px;">Peprotech</td>
			<td style="width:273px;">GMP100-15</td>
			<td>for GBM+ medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.)</td>
			<td style="width:239px;">Peprotech</td>
			<td style="width:273px;">100-18B</td>
			<td>for GBM+ medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Immunofluorescence</td>
			<td style="width:239px;"></td>
			<td style="width:273px;"></td>
			<td style="width:961px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:273px;">158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;width:288px;">24 x 60 mm microscope slide cover glass</td>
			<td style="width:239px;">ORSAtec</td>
			<td style="width:273px;">0224601-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:288px;">AlexaFluor 488 and 594 secondary antibodies</td>
			<td style="width:239px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:273px;"></td>
			<td>dilution: 1/500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Anti-Claudin-5 antibody</td>
			<td style="width:239px;">Abcam</td>
			<td style="width:273px;">ab15106</td>
			<td>dilution: 1/150</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Anti-GFAP antibody clone GF5</td>
			<td style="width:239px;">Abcam</td>
			<td style="width:273px;">ab10062</td>
			<td>dilution: 1/150</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">Anti-Mouse CD31&#160;antibody Clone MEC 13.3</td>
			<td style="width:239px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:273px;">550274</td>
			<td>dilution 1/800</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Anti-SV40 T-antigen antibody</td>
			<td style="width:239px;">Abcam</td>
			<td style="width:273px;">ab16879</td>
			<td>dilution: 1/150</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Anti-Zonula Occludens-1</td>
			<td style="width:239px;">Abcam</td>
			<td style="width:273px;">ab96587</td>
			<td>dilution: 1/200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">DAPI</td>
			<td style="width:239px;">TOCRIS</td>
			<td style="width:273px;">5748</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">Fluoromount Aqueous Mounting Medium&#160;</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:273px;">F4680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">LysoTracker Red DND-99</td>
			<td style="width:239px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:273px;">L7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Animal procedures</td>
			<td style="width:239px;"></td>
			<td style="width:273px;"></td>
			<td style="width:961px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">10 cm curved dissecting scissors</td>
			<td style="width:239px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:273px;">14394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">BD Microlance 25-gauge needles</td>
			<td style="width:239px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:273px;">300600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Fine Forceps (12.5 cm)</td>
			<td style="width:239px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:273px;">503283</td>
			<td>for tissue dissociation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Intramedic Polyethylene tubing PE20</td>
			<td style="width:239px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:273px;">427406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Ketaminol vet 50 mg/mL</td>
			<td style="width:239px;">Intervet</td>
			<td style="width:273px;">Vnr511485</td>
			<td>Ketamine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Mains Powered microdrill</td>
			<td style="width:239px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:273px;">503599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">Menzel-Gl&#228;ser 0.5 cm round borosilicate Cover Slips</td>
			<td style="width:239px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:273px;">11888372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Micro Bulldog clamp</td>
			<td style="width:239px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:273px;">14119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">Physiological saline solution</td>
			<td style="width:239px;">Mustela</td>
			<td style="width:273px;">Sterile single dose vials 20 x 5 mL / 40 x 5 mL - Medical device class</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Rochester-Oschner forceps</td>
			<td style="width:239px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:273px;">501709</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Rompun vet 20 mg/mL</td>
			<td style="width:239px;">Intervet</td>
			<td style="width:273px;">Vnr148999</td>
			<td>Xylazine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Stereotaxic adapter</td>
			<td style="width:239px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:273px;">502063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Sugi Sponge Points</td>
			<td style="width:239px;">Kettenbach</td>
			<td style="width:273px;">31603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Equipment</td>
			<td style="width:239px;"></td>
			<td style="width:273px;"></td>
			<td style="width:961px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">Axio Zoom.V16 fluorescence stereo zoom microscope&#160;</td>
			<td style="width:239px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:273px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">FLUOstar Omega microplate reader</td>
			<td style="width:239px;">BMG Labtech</td>
			<td style="width:273px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">ORCA-Flash 4.0 digital sCMOS camera</td>
			<td style="width:239px;">Hamamatsu Photonics</td>
			<td style="width:273px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Universal 320 tabletop centrifuge&#160;</td>
			<td style="width:239px;">Hettich</td>
			<td style="width:273px;">Cat. No. 1401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">ZEISS LSM 880 with Airyscan confocal microscope</td>
			<td style="width:239px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:273px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

predicting in vivo payloads delivery using a blood-brain tumor-barrier in a dish

Altamente selectivo por naturaleza, la barrera blood - brain (BBB) es esencial para la homeostasis cerebral en condiciones fisiológicas. Sin embargo, en el contexto de los tumores cerebrales, la selectividad molecular de BBB también protege a las células neoplásticas bloqueando el suministro de quimioterapia administrada periféricamente. El desarrollo de nuevos fármacos (incluya nanopartículas) dirigidos a tumores cerebrales malignos idealmente requiere el uso de modelos animales preclínicos para estudiar la droga transcitosis y eficacia antitumoral. Para cumplir con el principio de las 3R (refinar, reducir y sustituir) para reducir el número de animales de laboratorio en la configuración experimental y realizar la proyección de alto rendimiento de una gran biblioteca de agentes antitumorales, desarrollamos un humano in vitro reproducible y murino imitador del tumor-barrera blood-brain (BBTB) utilizando cultivos de tres capas de células endoteliales, astrocitos y glioblastoma derivados del paciente. Para una mayor escalabilidad y reproducibilidad, inmortalizadas células o líneas celulares comerciales se han utilizado en condiciones a la medida para permitir la formación de una barrera que se asemeja a la BBB real. Aquí se describe un protocolo para obtener a un imitador BBTB por cultivo de células endoteliales en contacto con astrocitos en densidades celulares específicas en partes movibles. Este imitador BBTB puede utilizarse, por ejemplo, para la cuantificación y proyección de imagen confocal del paso de nanopartículas a través de las barreras endoteliales y astrocíticos, además de la evaluación de la focalización de célula de tumor dentro del mismo ensayo. Por otra parte, se muestra que los datos obtenidos pueden utilizarse para predecir el comportamiento de las nanopartículas en modelos animales preclínicos. En una perspectiva más amplia, este modelo in vitro podría ser adaptado a otras enfermedades neurodegenerativas para la determinación de la aprobación de nuevas moléculas terapéuticas a través de la BBB o complementarse con organoides del cerebro para evaluar directamente la eficacia de la medicamentos.

Proyección de imagen confocal del mimic BBTB murine demuestra la expresión y localización celular de las proteínas de Unión estrecha zonula occludens-1 (ZO-1) y claudin-5 en bEND3. Contactos entre las células endoteliales y astrocitos claramente inducida por la reubicación de la ZO-1 y claudin-5 a los contactos de la célula endotelial en comparación con el monocultivo de bEND3 (figura 1). Mediante la inmunofluorescencia que manchaba para visualizar los astrocitos expresan GFAP en el cerebro del lado de la membrana, es posible observar y estudiar los procesos astrocytic y final-pies en contacto con las células endoteliales a través de la membrana (Figura 1E ). Los contactos de la célula endotelial astrositos se conocen para promover y estabilizar el estrechamiento de la barrera celular y se asocian con valores más bajos de la permeabilidad de la BBB19. De acuerdo con eso, se observó una sustancial disminución en la permeabilidad de la imitador BBTB de ratón para la Na-Fl de 27.63 (± 3,45) x 10-6 cm/s en el caso de los monocultivos a 6.74 (± 3.01) x 10-6 cm/s cuando cultivadas conjuntamente con la hipoxia inducible factor knock out (HIFko) astrocitos (tabla 1). HuAR2T inmortalizado forman barreras celulares altamente permeables (104.92 ± 27,1 x 10-6 cm/s, tabla 1). Similar al modelo murino, se evaluó la permeabilidad significativamente más baja de lo BBTB Na-FL, es decir, 47.4 (± 14.32) x 10-6 cm/s, cuando las células HuAR2T cultivadas conjuntamente con los astrocitos primarios humanos (tabla 1).
En imitadores BBTB murinos y humanos, la presencia de las esferas del paciente derivado del glioblastoma indujo un ligero aumento en los valores de permeabilidad en comparación con las célula endotelial-astrositos co-cultivos solo (tabla 1). Este fenómeno se observa con varios pero no todos lo paciente glioma esfera modelos. Esto puede ser debido al VEGF-A que es secretada por algunas de estas células derivadas del paciente.
Para comparar los valores de permeabilidad de los in vitro BBTB imitadores con lo BBB en vivo, hemos reflejado la difusión en tiempo real de la Na-Fl a través de una ventana craneal implantada en ratones desnudos. Mediante un estereomicroscopio de fluorescencia, difusión de Na-Fl de los capilares de los vasos sanguíneos derivados de los principales vasos piales grabó antes, durante y después de la inyección sistémica de la sonda (figura 2). Las mediciones de los valores de fluorescencia diferencial del parénquima cortical circulación de sangre y el cerebro con el tiempo nos ha permitido calcular los valores aproximados de la permeabilidad del ratón desnudo's BBB para Na-Fl (5,57 ± 2.19 x 10-6 cm/s, Tabla 1).
Para ilustrar cómo este imitador BBTB puede utilizarse para la visualización del paso de compuestos al lado de sangre hacia el cerebro, comparamos la transcitosis de ø 110 nm (NP110) y ø 350 nm (NP350) nanopartículas dirigida a glioblastoma derivados del paciente. Resultados obtienen in vitro fueron luego comparados con la transcitosis en vivo. En el ejemplo presentado, las nanopartículas fueron superficie cubierta con el péptido tumor targeting CooP20 y cargado con el colorante fluorescente (FITC) para facilitar la visualización. Hemos marcado las células usando el tinte lisosomal y contratinción DAPI 24 h después de la incorporación de las nanopartículas FITC en el lado arterial de la BBTB mímico y adquirido micrografías confocales a diferentes niveles (por ejemplo, el lado de la sangre, la membrana, del lado del cerebro, y las esferas de glioblastoma pacientes) (Figura 3A). La señal fluorescente asociados NP110 colocalized con los lisosomas en células endoteliales, astrocitos y células del tumor. Además, NP110s fueron detectada entre las células endoteliales y astrocitos, pasando a través de los poros de la membrana de la inserción (Figura 3A).
El paso de NP110s se cuantificó midiendo la fluorescencia de las muestras recogidas de la sangre y el cerebro de lado. Estos valores de permeabilidad fueron comparados con los determinados para las nanopartículas de ø 350 nm (NP350). Los resultados muestran que sólo NP110 era capaz de atravesar a los imitadores BBTB (figura 3B). NP350 permaneció en el lado arterial de la imitador BBTB, que dio lugar a valores más bajos de la permeabilidad de estas nanopartículas.
Para resaltar la importancia de la mímica BBTB frente a los modelos en vivo, ratones desnudos fueron inyectados por vía intravenosa con nanopartículas NP110 o NP350 cubierto con el péptido tumor targeting CooP y conjugado con colorante fluorescente rojo (TRITC) para la detección. Los tejidos recogidos en varios puntos del tiempo revelaron que después de 8 h, permeable a la BBB nanopartículas han extravasados en el parénquima cerebral, mientras que el nonpermeable que me alojé en la circulación principalmente eran despejaron de la circulación sistémica en vivo. Por lo tanto, se recogieron los cerebros y había cuantificado el número de nanopartículas por milímetro cuadrado postinjection de 8 h. Acuerdo con los resultados in vitro, NP110, pero no NP350, con éxito extravasados en el parénquima cerebral (figura 3). Proyección de imagen de alta magnificación de la ubicación de nanopartículas en el cerebro mostró que NP110 fue homogéneamente distribuidos en el parénquima cerebral fuera de los capilares sanguíneos y alojados con éxito a las células de glioblastoma implantado (figura 3D). A pesar de que el mismo tumor targeting moiety (CooP), NP350 pudo extravasate en el parénquima cerebral y sólo fue detectada en el lado luminal de cerebro los vasos sanguíneos (figura 3E), similares a los resultados obtenidos in vitro.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59384/59384fig1.jpg"> Figura 1: Descripción del modelo (BBTB) tumor-barrera sangre-cerebro. (A) representación esquemática de la ubicación de diferentes tipos de células. (B) ilustración de la colocación de insertar en la cubierta de placa de 6 pozos y la técnica de siembra por los astrocitos en el lado del cerebro de la inserción'membrana s. (C) ilustración de la colocación de placa de 6 pozos que permite la adherencia de los astrositos. (D) imágenes de inmunofluorescencia de la ensambladura apretada proteínas zonula occludens-1 (ZO-1, superior de la fila, rojo) y claudin-5 (fila inferior, verde). La expresión de la proteína es comparada con el cerebro murino microvascular células endoteliales (bEND3) cultivadas en la parte de la sangre de lo BBTB solo como un monocultivo (columna izquierda) o con astrocitos de HIFko inmortalizados murinos (columna derecha). Núcleos celulares son contratinción con DAPI (azul). (E) micrografía de inmunofluorescencia mostrando la proteína ácida fibrilosa glial (GFAP, rojo) en los astrocitos de HIFko cultivados en el lado del cerebro de lo BBTB. La imagen de alta magnificación muestra procesos de astrositos y final-pies (flechas) en contacto con las células endoteliales a través de la membrana de poros (panel derecho). Se verificó la identidad de los astrocitos HIFko manchando de la inmunofluorescencia del simian virus 40 grandes T antígeno (SV40 grande T, verde) utilizado para la inmortalización de las células. Las células endoteliales expresan la GFAP ni la T grande de SV40 y, por lo tanto, se pueden observar parcialmente a través de la transparencia, opuesta al lado de la membrana como DAPI sólo células (líneas discontinuas). Núcleos celulares son contratinción con DAPI (azul). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59384/59384fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59384/59384fig2.jpg"> Figura 2: Determinación vivo intravital del ratón permeabilidad BBB. (A) preparación del catéter implantable vena caudal. (1) herramientas y equipos son los siguientes: (a) un PE20 tubo de polietileno (b) dos 25 G agujas fórceps (c) Rochester-Ochsner y (d) un pequeño bulldog pinza. Se retira aguja (2) A 25 G por varias torsiones con las pinzas y (3) con cuidado introduce en el tubo. (4) al otro lado del tubo se conecta a otra aguja de 25 G. (B) guía para la implantación del catéter y posicionamiento para infundir la solución de fluoresceína de sodio a través de la vena de la cola de un ratón. El área dentro de un círculo indica el área donde se coloca una gota de pegamento del cianocrilato para asegurar el catéter. La pinza bulldog se utiliza para manejar el catéter y retirar una vez que el catéter está asegurado. (C) método representativo la proyección de imagen y cuantificación para determinar los valores de permeabilidad de la fluoresceína de sodio. Antes de la infusión de la fluoresceína de sodio (columna izquierda), se mide el autofluorescence/espacio en blanco dentro de una región de interés (ROI) a las áreas de vasos sanguíneos (rectángulo de fondo panel rojo) y cerebro (rectángulo del panel superior, blanco). Durante la infusión de la fluoresceína de sodio (columna derecha), la intensidad de fluorescencia se mide en ambos ROIs, lo que permite el cálculo de la permeabilidad BBB. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59384/59384fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59384/59384fig3.jpg"> Figura 3: predicción de la transcitosis intracerebral de nanopartículas a través de la BBB en vivo usando el modelo in vitro de BBTB. (A) representación gráfica del ensayo BBTB con imágenes confocales representativos obtenidos en los distintos niveles señalados del modelo murino BBTB. Nanopartículas de 110 nm de diámetro (NP110) y conjugado a FITC (verde) fueron agregados a la sangre parte de las células BBTB fueron etiquetados con la sonda lisosomal (LT-99, rojo).  (1) endotelial de las células, (2) endotelial transcitosis de las nanopartículas a través de los poros de la membrana (línea blanca punteada), astrocitos (3), y (4) pacientes glioblastoma esferas están identificadas en el gráfico y micrografías confocales correspondientes (derecha). Lysosomal encapsulación de nanopartículas (flechas) sugiere transcitosis activa a través de las capas endoteliales y astrositos de lo BBTB. (B) cuantificación de la permeabilidad de la nanopartícula indicado a través de lo BBTB in vitro (n = 6). (C) la cuantificación de la densidad indicada nanopartículas en el tejido cerebral secciones, 8 h después de la infusión de la vena caudal de ratones nude (n = 3). (D) micrografías confocales mostrando la distribución de la ø 110 nm nanopartículas (NP110, rojo) en las secciones de tejido de cerebro de ratón marcado con un anticuerpo anti-ratón de CD31 (verde). La flecha destaca la transcitosis de nanopartículas (panel izquierdo). Las nanopartículas acumulan alrededor de las células del tumor cerebral (tumor, panel derecho) debido al péptido CooP-targeting presentada en su superficie. No significativo autoguiado hacia el blanco se observa en el tejido cerebral (cerebro). Fotografías Confocal (E) muestran la distribución de la ø 350 nm nanopartículas (NP350 rojo) en secciones del tejido de cerebro de ratón marcadas con un anticuerpo anti-ratón de CD31 (verde). Punto de puntas de flecha a la NP350s que se conservaron en el lumen del vaso sanguíneo y no pudieron cruzar el BBB, debido probablemente a su mayor diámetro en comparación con los núcleos de la célula NP110s. son counterstained con DAPI (azul). P < 0.01. P-los valores se calcularon mediante una prueba de dos colas, no paramétrica U de Mann-Whitney. Las barras de error representan el desvío estándar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59384/59384fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>mimic BBTB murino</td>
			<td>bEND3</td>
			<td>bEND3 + HIFko como</td>
			<td>bEND3 + GB</td>
			<td>bEND3 + HIFko como + GB</td>
			<td>En vivo</td>
		</tr>
<tr>
<td>Permeabilidad (10-6 cm/s)</td>
			<td>27.63</td>
			<td>6.74</td>
			<td>26.8</td>
			<td>10,83</td>
			<td>5.57</td>
		</tr>
<tr>
<td>SD (10-6 cm/s)</td>
			<td>3.45</td>
			<td>3.01</td>
			<td>7.99</td>
			<td>2.65</td>
			<td>2.19</td>
		</tr>
<tr>
<td>humano imitador BBTB</td>
			<td>HuAR2T</td>
			<td>HuAR2T + hIAs</td>
			<td>HuAR2T + GB</td>
			<td>HuAR2T hIAs + GB</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Permeabilidad (10-6 cm/s)</td>
			<td>104.92</td>
			<td>47.4</td>
			<td>89.08</td>
			<td>48.24</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>SD (10-6 cm/s)</td>
			<td>27.1</td>
			<td>14.32</td>
			<td>10.21</td>
			<td>13.07</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: valores de la permeabilidad del sodio-fluoresceína (Na-Fl) (en centímetros por segundo) en vitro en los sistemas de co-cultivo indicado e in vivo en ratones desnudos NMRI. Los datos de un experimento representativo (n = 3 ratones).

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Predicting In Vivo Payloads Delivery using a Blood-brain Tumor-barrier in a Dish

Prediciendo en Vivo cargas entrega usando una Barrera Blood-brain Tumor en un plato

Medicamentos dirigidos a tumores del sistema nervioso central es un gran desafío. Aquí se describe un protocolo para producir a un imitador in vitro de la tumor-barrera blood-brain con células murinas y humanas y discutir su pertinencia para la previsibilidad del sistema nervioso central tumor targeting in vivo.

Highly selective by nature, the blood-brain barrier (BBB) is essential for the brain homeostasis in physiological conditions. However, in the context of ...

Con el fin de desarrollar nuevos fármacos y compuestos que se dirigen a los tumores en el sistema nervioso central, la accesibilidad y el paso a través de la barrera hematoencefálica es muy importante. Aunque la citotoxicidad de los compuestos se puede medir fácilmente incubando las células con las moléculas terapéuticas, realmente no dice nada sobre la entrega real al sitio del tumor en el cerebro. Para abordar este problema, desarrollamos el siguiente protocolo que describe cómo recrear la barrera tumoral blood - brain in vitro en un plato.El uso de células inmortalizadas de origen murino u humano hace que este ensayo sea muy flexible. También se puede escalar fácilmente para examinar docenas de compuestos con alta reproducibilidad. Además, este método permite cuantificar y visualizar el paso y la capacidad de orientación de los compuestos antes de proceder con modelos preclínicos.Por lo tanto, nuestro método reemplaza parcialmente los modelos animales mediante el uso de las líneas celulares preestablecidas. La inclusión de células tumorales cerebrales derivadas del paciente ensaya la heterogeneidad del paciente, mientras que el uso de células inmortalizadas para establecer la barrera hematoencefálica asegura la reproducibilidad de los resultados. En conjunto, este modelo de barrera hematoencefálica ofrece una herramienta realmente interesante para ensayar la difusión de fármacos o la administración de vehículos farmacéuticos.La demostración visual del método es crítica porque la siembra de las celdas en el lado opuesto de la inserción requiere una manipulación que no se describe a menudo en otros protocolos que utilizan una configuración similar. Por ejemplo, la obtención de la adhesión de los astrocitos cuando la plaquita se coloca al revés se beneficia mucho de la representación visual. Bajo una capucha de cultivo celular estéril, lave cuidadosamente los astrocitos cultivados con cinco mililitros de PBS estéril.Utilice una bomba de vacío para desechar suavemente el PBS y agregue dos mililitros de reactivo de disociación celular durante cinco minutos para separar las células. Luego, agregue 10 mililitros de medio de cultivo celular de astrocito completo estéril al recipiente para inhibir la actividad del reactivo de disociación celular. Utilice una pipeta serológica estéril para transferir las células separadas del recipiente a un tubo estéril de 15 mililitros.Centrifugar a 250 veces g durante tres minutos a temperatura ambiente. Mientras tanto, establece las inserciones. Utilice fórceps estériles para colocar las inserciones con el lado del cerebro hacia arriba en la tapa de una placa estéril de seis pocillos.Cuando la centrifugación esté completa, deseche cuidadosamente el sobrenadante de la suspensión celular, y resuspender el pellet de astrocito en un mililitro de ABM-plus pipeteando suavemente el pellet en la pared del tubo hasta cinco veces. Luego, cuente las celdas y ajuste la densidad de la suspensión celular a 150.000 células en 400 microlitros de ABM-plus por plaquita. Coloque la suspensión celular en el centro del lado cerebral de la membrana del inserto y extiéndala cuidadosamente usando fuerza capilar con una punta de pipeta estéril.Con el lado del cerebro de las plaquitas todavía hacia arriba, coloque la placa de seis pozos de nuevo en las plaquitas. Coloque la placa y las inserciones, con el cerebro hacia arriba, en una incubadora a 37 grados Celsius y 5%dióxido de carbono para permitir la adhesión celular. Después de esto, revierta la placa de seis pozos de nuevo a su posición regular, con las inserciones ahora lado de sangre hacia arriba.Agregue el medio y continúe la incubación como se describe en el protocolo de texto. Bajo una capucha de cultivo celular estéril, lave cuidadosamente las células endoteliales cultivadas con cinco mililitros de PBS estéril. Utilice una bomba de vacío para desechar suavemente el PBS y agregue dos mililitros de reactivo de disociación celular durante cinco minutos para separar las células.A continuación, agregue 10 mililitros de medio de cultivo celular endotelial completo estéril al recipiente para inhibir la actividad del reactivo de disociación celular. Utilice una pipeta serológica estéril para transferir las células separadas del recipiente a un tubo estéril de 15 mililitros. Centrifugar a 250 veces g durante tres minutos a temperatura ambiente.Después de esto, deseche el sobrenadante, y resuspendir el pellet de célula endotelial en un mililitro de EBM-plus pipetiendo lentamente la suspensión celular en la pared del tubo hasta cinco veces. Cuente las células y ajuste la densidad de la suspensión celular a 200.000 células en 2,5 mililitros de cultivo celular endotelial desprovisto de suero y factor de crecimiento endotelial vascular-A por inserción. Recuperar la placa que contiene las plaquitas.Deseche cuidadosamente el medio del lado sanguíneo y reemplácelo con los 2,5 mililitros de suspensión de células endoteliales. Luego, devuelva la placa a la incubadora, y déjela durante la noche para permitir que las células endoteliales se adhieran a la membrana. Al día siguiente, prepare una placa de seis pozos transfiriendo tres mililitros de ABM-menos precalentado a cada pozo.Con fórceps estériles, manipule las plaquitas para desechar cuidadosamente el medio completo endotelial del lado sanguíneo, y coloque la plaquita en la nueva placa que contiene ABM-menos. A continuación, agregue 2,5 mililitros de EBM-menos. Deje las plaquitas en la incubadora con mínima perturbación física o variación de temperatura durante cinco días.El día de la transferencia, sustituya el medio. Para la toma de imágenes por inmunofluorescencia, coloque hasta cuatro cubreobjetos de borosilicato estériles redondos en cada pocólieto de una placa de seis pocillos que contenga dos mililitros de poli-D-lisina. Incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos.Mientras tanto, utilice una pipeta serológica estéril para transferir cuidadosamente las esferas tumorales del recipiente de cultivo celular a un tubo estéril de 15 mililitros. Centrifugar las esferas tumorales a 250 g durante tres minutos. Deseche el sobrenadante y resuspender suavemente las esferas en un mililitro de GBM-menos.Cuente las celdas y ajuste la densidad de celdas a aproximadamente 10.000 esferas o 100.000 celdas por mililitro de GBM menos. A continuación, desechar la poli-D-lisina de los pozos, y enjuague los pozos tres veces con PBS estéril. Semilla de cada pozo de la placa con tres mililitros de la suspensión del esferoide tumoral, y transferir las plaquitas con la BBTB imitar a la suspensión celular tumoral.Incubar durante la noche a 37 grados celsius con 5% de dióxido de carbono para permitir que los lados del tumor sanguíneo y cerebral del ensayo lleguen al equilibrio. Al día siguiente, reemplace los medios en el lado sanguíneo con EBM-menos complementado con las moléculas, fármacos o nanopartículas de interés. Recoja las muestras a lo largo del tiempo para la cuantificación directa como se describió anteriormente.En primer lugar, recoger 100 microlitros del medio de la sangre y los lados del cerebro de la imitación BBTB, y transferir cada uno a una placa separada de fondo plano, negro, de 96 pozos para las mediciones de fluorescencia posteriores. A continuación, prepare una solución de 50 micromolares de fluoresceína sódica en EBM-menos, asegurándose de preparar 2,5 mililitros por pozo. Precaliente esta solución a 37 grados centígrados y sustituya el medio del lado sanguíneo de las plaquitas por medios que contengan esta solución de fluoresceína de sodio.Inicie un temporizador tan pronto como se sustituya el medio. Recoja cuidadosamente 100 microlitros de medios de los lados de la sangre y del cerebro de las plaquitas a los cinco minutos, 30 minutos, 60 minutos y 120 minutos. Transfiera cada muestra a pozos separados de la placa negra de 96 pozos apropiada.Utilice un lector de placas para cuantificar la fluorescencia de las muestras recogidas. En primer lugar, diluir el tinte fluorescente lisoso a la concentración de trabajo adecuada en medio precalegado. Añadir esto a las células, e incubar a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono durante 45 minutos.Luego, enjuague las células tres veces con PBS helado. Deseche el PBS y agregue tres mililitros de 4%paraformaldehído helado al inserto. Incubar sobre hielo durante 10 minutos.Después de esto, deseche el paraformaldehído y enjuague las células tres veces con PBS. Retire el PBS y contratuer los núcleos celulares utilizando una solución DAPI a una concentración final de un microgramo por mililitro en agua destilada. Incubar a temperatura ambiente durante siete minutos.A continuación, retire el DAPI y lave las membranas tres veces con agua destilada. Corte cuidadosamente la membrana, retire el agua destilada y colóquela en una gota de medio de montaje en un portaobjetos de microscopio de vidrio. Agregue otra gota de medio de montaje en el otro lado de la membrana y cúbrala cuidadosamente con un vidrio de cubierta de borosilicato.En este estudio, las células endoteliales fueron co-cultivadas con astrocitos para formar una interfaz similar a una barrera tumoral blood - brain en una configuración in vitro. Las imágenes confocales de la imitación murina BBTB muestran la expresión y localización celular de las proteínas de unión estrecha zonula ocludens-1 y claudin-5 en bEND3. Los contactos entre las células endoteliales y los astrocitos inducen claramente la reubicación de estas dos proteínas en los contactos endoteliales de célula a célula en comparación con los monocultivos bEND3.Utilizando la tinción de inmunofluorescencia para visualizar los astrocitos que expresan GFAP en el lado cerebral de la membrana, es posible observar y estudiar los procesos astrocíticos y los pies finales que contactan las células endoteliales a través de la membrana. Para comparar los valores de permeabilidad de las imitaciones in vitro de BBTB con la barrera hematoencefálica in vitro, la difusión en tiempo real de fluoresceína sódica se obtiene una imagen a través de una ventana craneal implantada en ratones desnudos. Utilizando un microscopio estéreo de fluorescencia, la difusión de fluoresceína sódica de los capilares de los vasos sanguíneos de los vasos sanguíneos de los vasos sanguíneos principales se registra antes, durante y después de la inyección sistémica de la sonda.La transcitotosis de nanopartículas que se dirigen a las esferas de glioblastoma derivadas del paciente se compara entonces para ilustrar cómo esta imitación de BBTB se puede utilizar para visualizar el paso de compuestos desde el lado de la sangre al lado del cerebro. La señal fluorescente asociada al NP110 se co-localiza con los lisosomas en las células endoteliales, astrocitos y células tumorales. Además, los NP110 se detectan entre las células endoteliales y los astrocitos, pasando a través de los poros de membrana de la plaquita.El paso de NP110s se cuantifica midiendo la fluorescencia de muestras recogidas tanto del lado de la sangre como del cerebro, y estos valores se comparan con las nanopartículas determinadas que son 350 nanómetros. Como se puede ver, sólo los NP110 son capaces de cruzar las imitaciones BBTB, mientras que NP350 permaneció en el lado de la sangre, lo que resultó en valores de permeabilidad más bajos para estas nanopartículas. Manipule el inserto con cuidado, y extienda con cautela la suspensión de la célula de astrocitos en el lado cerebral de la plaquita sin contacto directo de la membrana.Cualquier daño de la membrana resultará en fugas. Este método se puede adaptar para responder a la pregunta de la entrega cerebral de cargas útiles administradas periféricamente. Mediante el uso de diferentes inserciones con poros de membrana más grandes, también es posible estudiar la extravasación celular.Esta técnica se puede modificar mediante el uso de diferentes tipos de células para imitar otras barreras celulares. También allana el camino a una investigación más responsable y ética, con el objetivo de reducir el número de animales de laboratorio utilizados para la validación de fármacos contra el cáncer. Recuerde que el paraformaldehído es un producto químico muy tóxico y debe manipularse en consecuencia.Además, tenga cuidado al usar un bisturí afilado para extraer las membranas de las inserciones.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

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