Name: predicting in vivo payloads delivery using a blood-brain tumor-barrier in a dish
Uploaded: 2019-04-16T14:30:00
Duration: 13 min 34 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Predicting In Vivo Payloads Delivery using a Blood-brain Tumor-barrier in a Dish at JoVE.com

Denna forskning stöddes av bidrag från de finska Cancer organisationer, Jane & Aatos Erkkos stiftelse, och Sigrid Juselius stiftelsen (till P.L. och V.L.J.), den schweiziska National Science Foundation (Advanced Postdoc.Mobility bevilja nr: P300PB_164732, s. K.), Orion forskningsstiftelsen (S.K.), Stiftelsen Maud Kuistilas Memorial (till S.K.) och Finlands Akademi (TERVA 2017, bevilja nr: 314 498). Biomedicum Imaging enheten (Helsingfors) är erkänt för att tillhandahålla microscopyen imaging core facilitet.

<ol>
	<li>Daneman, R., Prat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-brain+barrier.">The blood-brain barrier.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (1), a020412 (2015).</li><li>Quail, D. F., Joyce, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Microenvironmental+Landscape+of+Brain+Tumors.">The Microenvironmental Landscape of Brain Tumors.</a> Cancer Cell. 31 (3), 326-341 (2017).</li><li>Wang, Z., Sun, H., Yakisich, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+the+blood-brain+barrier+for+chemotherapy:+limitations,+challenges+and+rising+problems.">Overcoming the blood-brain barrier for chemotherapy: limitations, challenges and rising problems.</a> Anticancer Agents in Medicinal Chemistry. 14 (8), 1085-1093 (2014).</li><li>Alkins, R. D., Brodersen, P. M., Sodhi, R. N., Hynynen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+drug+delivery+for+boron+neutron+capture+therapy+of+brain+tumors+with+focused+ultrasound.">Enhancing drug delivery for boron neutron capture therapy of brain tumors with focused ultrasound.</a> Neuro Oncology. 15 (9), 1225-1235 (2013).</li><li>Alli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brainstem+blood+brain+barrier+disruption+using+focused+ultrasound:+A+demonstration+of+feasibility+and+enhanced+doxorubicin+delivery.">Brainstem blood brain barrier disruption using focused ultrasound: A demonstration of feasibility and enhanced doxorubicin delivery.</a> Journal of Controlled Release. 281, 29-41 (2018).</li><li>Ashby, L. S., Smith, K. A., Stea, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gliadel+wafer+implantation+combined+with+standard+radiotherapy+and+concurrent+followed+by+adjuvant+temozolomide+for+treatment+of+newly+diagnosed+high-grade+glioma:+a+systematic+literature+review.">Gliadel wafer implantation combined with standard radiotherapy and concurrent followed by adjuvant temozolomide for treatment of newly diagnosed high-grade glioma: a systematic literature review.</a> World Journal of Surgical Oncology. 14 (1), 225 (2016).</li><li>Guishard, A. F., Yakisich, J. S., Azad, N., Iyer, A. K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+gap+in+ongoing+clinical+trials+for+glioma.">Translational gap in ongoing clinical trials for glioma.</a> Journal of Clinical Neurosciences. 47, 28-42 (2018).</li><li>Rahman, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalized+endothelial+cell+lines+for+in+vitro+blood-brain+barrier+models:+A+systematic+review.">Immortalized endothelial cell lines for in vitro blood-brain barrier models: A systematic review.</a> Brain Research. 1642, 532-545 (2016).</li><li>Helms, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+of+the+blood-brain+barrier:+An+overview+of+commonly+used+brain+endothelial+cell+culture+models+and+guidelines+for+their+use.">In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 36 (5), 862-890 (2016).</li><li>Wang, J. D., Khafagy, e. l. -. S., Khanafer, K., Takayama, S., ElSayed, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+Endothelial+Cells,+Pericytes,+and+Astrocytes+into+a+3D+Microfluidic+in+Vitro+Model+of+the+Blood-Brain+Barrier.">Organization of Endothelial Cells, Pericytes, and Astrocytes into a 3D Microfluidic in Vitro Model of the Blood-Brain Barrier.</a> Molecular Pharmaceutics. 13 (3), 895-906 (2016).</li><li>Phan, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier-on-a-chip:+Microphysiological+systems+that+capture+the+complexity+of+the+blood-central+nervous+system+interface.">Blood-brain barrier-on-a-chip: Microphysiological systems that capture the complexity of the blood-central nervous system interface.</a> Experimental Biology and Medicine (Maywood). 242 (17), 1669-1678 (2017).</li><li>Bang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Low+Permeability+Microfluidic+Blood-Brain+Barrier+Platform+with+Direct+Contact+between+Perfusable+Vascular+Network+and+Astrocytes.">A Low Permeability Microfluidic Blood-Brain Barrier Platform with Direct Contact between Perfusable Vascular Network and Astrocytes.</a> Scientific Reports. 7 (1), 8083 (2017).</li><li>Wilhelm, I., Krizbai, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+of+the+blood-brain+barrier+for+the+study+of+drug+delivery+to+the+brain.">In vitro models of the blood-brain barrier for the study of drug delivery to the brain.</a> Molecular Pharmacology. 11 (7), 1949-1963 (2014).</li><li>Campisi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+self-organized+microvascular+model+of+the+human+blood-brain+barrier+with+endothelial+cells,+pericytes+and+astrocytes.">3D self-organized microvascular model of the human blood-brain barrier with endothelial cells, pericytes and astrocytes.</a> Biomaterials. 180, 117-129 (2018).</li><li>Pirsko, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Effect+of+Culture+Media+on+Epithelial+Differentiation+Markers+in+Breast+Cancer+Cell+Lines+MCF7,+MDA-MB-436+and+SkBr3.">An Effect of Culture Media on Epithelial Differentiation Markers in Breast Cancer Cell Lines MCF7, MDA-MB-436 and SkBr3.</a> Medicina (Kaunas). 54 (2), (2018).</li><li>Stebbins, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+and+characterization+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+brain+microvascular+endothelial+cells.">Differentiation and characterization of human pluripotent stem cell-derived brain microvascular endothelial cells.</a> Methods. 101, 93-102 (2016).</li><li>Canfield, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+isogenic+blood-brain+barrier+model+comprising+brain+endothelial+cells,+astrocytes,+and+neurons+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">An isogenic blood-brain barrier model comprising brain endothelial cells, astrocytes, and neurons derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Journal of Neurochemistry. 140 (6), 874-888 (2017).</li><li>Cao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-inducible+factor-1alpha+is+involved+in+isoflurane-induced+blood-brain+barrier+disruption+in+aged+rats+model+of+POCD.">Hypoxia-inducible factor-1alpha is involved in isoflurane-induced blood-brain barrier disruption in aged rats model of POCD.</a> Behavioural Brain Research. 339, 39-46 (2018).</li><li>Abbott, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte-endothelial+interactions+and+blood-brain+barrier+permeability.">Astrocyte-endothelial interactions and blood-brain barrier permeability.</a> Journal of Anatomy. 200 (6), 629-638 (2002).</li><li>Kinnari, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+homing+peptide-functionalized+porous+silicon+nanovectors+for+cancer+therapy.">Tumour homing peptide-functionalized porous silicon nanovectors for cancer therapy.</a> Biomaterials. 34 (36), 9134-9141 (2013).</li><li>Levin, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personalized+medicine+in+neuro-oncology.">Personalized medicine in neuro-oncology.</a> CNS Oncology. 5 (2), 55-58 (2016).</li><li>Weathers, S. S., Gilbert, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+Personalized+Targeted+Therapeutics:+An+Overview.">Toward Personalized Targeted Therapeutics: An Overview.</a> Neurotherapeutics. 14 (2), 256-264 (2017).</li><li>O'Duibhir, E., Carragher, N. O., Pollard, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerating+glioblastoma+drug+discovery:+Convergence+of+patient-derived+models,+genome+editing+and+phenotypic+screening.">Accelerating glioblastoma drug discovery: Convergence of patient-derived models, genome editing and phenotypic screening.</a> Molecular and Cellular Neuroscience. 80, 198-207 (2017).</li><li>Kaya, M., Ahishali, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+permeability+in+barrier+type+of+endothelium+in+brain+using+tracers:+Evans+blue,+sodium+fluorescein,+and+horseradish+peroxidase.">Assessment of permeability in barrier type of endothelium in brain using tracers: Evans blue, sodium fluorescein, and horseradish peroxidase.</a> Methods in Molecular Biology. 763, 369-382 (2011).</li><li>Yang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+two+immortalized+cell+lines,+ECV304+and+bEnd3,+for+in+vitro+permeability+studies+of+blood-brain+barrier.">Identification of two immortalized cell lines, ECV304 and bEnd3, for in vitro permeability studies of blood-brain barrier.</a> PLoS One. 12 (10), e0187017 (2017).</li><li>Blouw, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hypoxic+response+of+tumors+is+dependent+on+their+microenvironment.">The hypoxic response of tumors is dependent on their microenvironment.</a> Cancer Cell. 4 (2), 133-146 (2003).</li><li>Argaw, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte-derived+VEGF-A+drives+blood-brain+barrier+disruption+in+CNS+inflammatory+disease.">Astrocyte-derived VEGF-A drives blood-brain barrier disruption in CNS inflammatory disease.</a> Journal of Clinical Investigation. 122 (7), 2454-2468 (2012).</li><li>Miao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF+increases+paracellular+permeability+in+brain+endothelial+cells+via+upregulation+of+EphA2.">VEGF increases paracellular permeability in brain endothelial cells via upregulation of EphA2.</a> The Anatomical Record (Hoboken). 297 (5), 964-972 (2014).</li><li>Heinolainen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGFR3+Modulates+Vascular+Permeability+by+Controlling+VEGF/VEGFR2+Signaling.">VEGFR3 Modulates Vascular Permeability by Controlling VEGF/VEGFR2 Signaling.</a> Circulation Research. 120 (9), 1414-1425 (2017).</li><li>Claesson-Welsh, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+permeability--the+essentials.">Vascular permeability--the essentials.</a> Upsala Journal of Medical Sciences. 120 (3), 135-143 (2015).</li><li>Adriani, G., Ma, D., Pavesi, A., Goh, E. L., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+the+Blood-Brain+Barrier+in+a+3D+triple+co-culture+microfluidic+system.">Modeling the Blood-Brain Barrier in a 3D triple co-culture microfluidic system.</a> Conference Proceedings - IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. 2015, 338-341 (2015).</li><li>Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hCMEC/D3+cell+line+as+a+model+of+the+human+blood+brain+barrier.">The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier.</a> Fluids and Barriers of the CNS. 10 (1), 16 (2013).</li><li>Paatero, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyses+in+zebrafish+embryos+reveal+that+nanotoxicity+profiles+are+dependent+on+surface-functionalization+controlled+penetrance+of+biological+membranes.">Analyses in zebrafish embryos reveal that nanotoxicity profiles are dependent on surface-functionalization controlled penetrance of biological membranes.</a> Scientific Reports. 7 (1), 8423 (2017).</li><li>Prabhakar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimuli-responsive+hybrid+nanocarriers+developed+by+controllable+integration+of+hyperbranched+PEI+with+mesoporous+silica+nanoparticles+for+sustained+intracellular+siRNA+delivery.">Stimuli-responsive hybrid nanocarriers developed by controllable integration of hyperbranched PEI with mesoporous silica nanoparticles for sustained intracellular siRNA delivery.</a> International Journal of Nanomedicine. 11, 6591-6608 (2016).</li><li>Hyvonen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+target+for+peptide-based+imaging+and+treatment+of+brain+tumors.">Novel target for peptide-based imaging and treatment of brain tumors.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 13 (4), 996-1007 (2014).</li><li>Feng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammary-Derived+Growth+Inhibitor+Targeting+Peptide-Modified+PEG-PLA+Nanoparticles+for+Enhanced+Targeted+Glioblastoma+Therapy.">Mammary-Derived Growth Inhibitor Targeting Peptide-Modified PEG-PLA Nanoparticles for Enhanced Targeted Glioblastoma Therapy.</a> Bioconjugate Chemistry. 26 (8), 1850-1861 (2015).</li><li>Nance, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dense+poly(ethylene+glycol)+coating+improves+penetration+of+large+polymeric+nanoparticles+within+brain+tissue.">A dense poly(ethylene glycol) coating improves penetration of large polymeric nanoparticles within brain tissue.</a> Science Translational Medicine. 4 (149), 149rA119 (2012).</li><li>Berg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+nanoparticle+transport+through+in+vitro+blood-brain+barrier+models.">Quantitative analysis of nanoparticle transport through in vitro blood-brain barrier models.</a> Tissue Barriers. 4 (1), e1143545 (2016).</li><li>Noumbissi, M. E., Galasso, B., Stins, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+vascular+heterogeneity:+implications+for+disease+pathogenesis+and+design+of+in+vitro+blood-brain+barrier+models.">Brain vascular heterogeneity: implications for disease pathogenesis and design of in vitro blood-brain barrier models.</a> Fluids and Barriers of the CNS. 15 (1), 12 (2018).</li><li>Heymans, M., Sevin, E., Gosselet, F., Lundquist, S., Culot, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mimicking+brain+tissue+binding+in+an+in+vitro+model+of+the+blood-brain+barrier+illustrates+differences+between+in+vitro+and+in+vivo+methods+for+assessing+the+rate+of+brain+penetration.">Mimicking brain tissue binding in an in vitro model of the blood-brain barrier illustrates differences between in vitro and in vivo methods for assessing the rate of brain penetration.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 127, 453-461 (2018).</li></ol>

Författarna har något att avslöja.

Ökningen av begreppet interindividuella tumör variabilitet föryngrad forskning om personlig cancer medicin21. Denna variation är också ett signum för centrala nervsystemet tumörer. På grund av oförutsägbarhet av tumören, svar på kemoterapi läggs till den skyddande effekten av BBB för drogen leverans och alldeles utgör stora utmaningar i patientvården22. För att utveckla effektivare terapier, är det ofta nödvändigt att skärmen stora bibliotek med nya molekyler. Utvärdera antitumöreffekt effekt och förmåga av nya terapeutiska leder att nå webbplatsen tumören, är det bästa alternativet den preklinisk studien om patientderiverade cellerna implanteras i vivo i murina patienten avatarer. På grund av praktiska (finansiella, tid, mänskliga och anläggning resurser) och etiska skäl (3R-principen när du använder försöksdjur), är utvecklingen av sådan storskalig Invivo undersökning plattform ofta inte möjligt, och därför de cellbaserade analyserna förbli en modell av val23. Rektor resonerar för att välja etablerade cellinjer och undvika primära celler är att underlätta reproducerbarhet och minska användningen av försöksdjur, som är den huvudsakliga källan för isolering och inrättandet av primära murina kulturer. De metoder som presenterar här, kunde fast uppfyller 3R, effektivt kassera nanopartiklar från en ytterligare prekliniska undersökningar på kriteriet av deras oförmåga att korsa modellen BBTB. Som ett proof-of-principle beskriver vi här resultat som erhållits under utveckling och validering av BBTB. Vi har kunnat bekräfta in vitro-fynd in vivo exempelvis vid mätning av en 376 Da natrium-fluorescein passiv diffusion.
Protokollet beskrivs i detta dokument beskrivs utarbetandet av endothelial celler cocultured med astrocyterna bildar en blod-hjärn tumör-barriär-liknande gränssnitt i en in vitro-setup. När en fysisk kontakt mellan dessa två celltyper är etablerad, uppvisar endotelceller lagret likheter med BBB (t.ex. en cell surface uttryck av åtsittande föreningspunkt proteiner och relativt låg permeabilitet). Intressant, tycktes den murina BBTB härma ge särskilt liknande Na-Fl permeabilitet värden som erhålls med Invivo musen BBB permeabilitet mätningar24. Därför länkas prestandan hos de BBTB härmar direkt till valet av de celler som används för att bilda barriären. De bEND3 endothelial cellerna härstammar från hjärnan och är kända för att vara framgångsrik i att bilda hinder när cocultured med astrocyter25. Vi har dock använt den förevigade HIFko astrocyter26 för att generera den BBTB härma. På grund av deras bristande hypoxi-inducerbara faktor, dessa astrocyter inte producerar VEGF-A, som är sinnebilden för den BBTB härma stabilisering beskrivs här. Astrocyterna har identifierats som modulatorer av BBB permeabilitet, till exempel genom frisättning av VEGF-A svar på neuroinflammation27. Aktivering av vaskulär endotelial tillväxtfaktor receptorer (VEGFRs) är en viktig regulator av endothelial/vaskulär permeabilitet både vitro28 och Invivo29. Därför aktivera VEGF-A tillskott i mediet den VEGFR2 på endotelceller, vilket inducerar fosforyleringen av adherens junction proteiner som VE-cadherin30. Förlusten av cell-endotelceller kontakter genererar mycket genomsläpplig blodkärl. På samma sätt orsaka både stark mitogena boende och okänd sammansättning av fostrets bovint serum används i cell kultur analyserna stora problem i barriär stabilisering och haltbestämning reproducerbarhet.
Mänskliga navel ven endotelceller (HUVECs) används ibland för att bilda BBB i vitro31. dock de avsevärt skiljer sig från hjärnan mikrovaskulära endotelceller, som cellen hCMEC/D3 linje32, när det gäller genuttryck och barriär-bilda boenden. Dock relativt högre permeabilitet värden som erhålls med HuAR2T celler odlas enbart jämfört med bEND3 minskade kraftigt med coculturing dem med mänskliga primära astrocyter. Även endotelceller krävs att bilda cellulära väggen, är det tydligt att astrocyterna har en lika viktig roll att spela för BBTB bildning och stabilisering.
När patientderiverade gliom sfärer lades till denna ekvation, redovisas mus BBTB härma några av funktionerna i murina xenograft, såsom narkotika diffusion genom den hjärnan vaskulatur och tumör cell inriktning. De BBTB härmar diskuteras här lyckades, exempelvis spegling i vivo beteendet när vi flera nanopartiklar med olika diametrar. För att illustrera parallellismen mellan in vitro- och in vivo modeller, vi använde de tidigare beskrivna mesoporous silikat nanopartiklar33 med cell-penetrerande egenskaper34 konjugerat till tumör-targeting peptiden CooP på deras surface20. CooP-targeting peptid hem till invasiv tumörceller genom den specifika bindningen till den mammary-derived tillväxt-hämmaren (MDGI). Flera cancerformer, inklusive gliom, överuttryck av MDGI jämfört med normal vävnad35, vilket gör CooP en mycket effektiv tumör-targeting biexponentiellt kan öka leveransen av en nyttolast20. De nanopartiklar används här har visats tidigare diffunderar in hjärnparenkymet (27547955), och när functionalized med Taxol, dessa nano-cargos har lyckats minska glioma tillväxt i prekliniska modeller36. Tillägg av polyetylenglykol (PEG) rester på ytan av nanopartiklarna underhålls också deras statisk laddning till positiva värden (runt + 4 mV), vilket gav bättre interaktion med de neurovaskulära enhet37 och även öka deras stabilitet i omlopp. I presenterade uppgifter, var 3 kDa av PEG konjugerat till NP110s, medan NP350s var belagda med 10 kDa av PEG. Dock resulterat ökade molekylvikt PEG också i en betydande ökning av nanopartiklar diameter, därav deras fysiska kapacitet att passera BBB. Därför, vi kollade om de fysiska dimensionerna av partiklarna hindras deras passage genom BBTB och huruvida dessa observationer kan avspeglas i vivo.
I enlighet med de tidigare publicerade synpunkter, vi konstaterade att NP110s extravasering genom både BBTB in vitro- och BBB möss med intrakraniell tumörer, medan NP350s behålls på luminala sida av den BBTB härma och i blodkärlen i den möss. Dessa liknande resultat tyder starkt på att den BBTB modellen förutspådde Invivo förmågan av nanopartiklar att passera BBB och når hjärnan.
Relevansen av cellulära modeller av BBB diskuteras ofta, även för den centrala leveransen av nanopartiklar38. Vi visar här att primära astrocyter och endotelceller, båda anses vara de mest relevanta in vitro-verktyg, kan ersättas av förevigade eller kommersiellt tillgängliga celler, att säkerställa större skalbarhet och reproducerbarhet. Nästa generation av de in vitro-BBB härmar skulle kunna utvecklas genom att införliva de mikroflödessystem enheter som låter vackert bildade neurovaskulära enheter som strukturellt liknar den faktiska BBB12,14. Sådana modeller är dock för närvarande olämpliga för high-throughput screening av molekyler som levereras till gliom, på grund av tekniska begränsningar i uppföljningen av leverans14. Det är verkligen svårt att fånga fysiologiska komplexiteten i BBB i en skål och möjliga bristen på vissa receptorer/proteiner, kända för att uttryckas med BBB, skulle kunna äventyra tolkningen av resultaten. Ett annat argument som rör den stora variabiliteten i genuttryck mellan in vivo och in vitro-villkor, samt från en cell linje till en annan, särskilt med tanke på endotelceller. Det kan emellertid också hävdas att neurovaskulära enheten inte är en enhetlig enhet inom den hjärna39. Vetenskaplig forskning i biologi har nått en human era där djurens välbefinnande, etiskt ansvar och kostnaden för att använda animaliskt liv anses alltid innan du utformar ett experiment. Därför, för att stödja utbyte av djur, ett ökande antal nyligen genomförda studier visar att medvetenheten om begränsningarna av modellerna och noggrant urval av de cellulära modellerna att upprätta barriären – med betoning på astrocyterna — garanterar en match mellan resultat som erhålls i en skål och i djur modeller40. Med den metod som beskrivs här, får vi ett steg närmare till att minska antalet försöksdjur som används vid screening av BBB transcytos för potentiella therapeutics.

Neurovaskulära enheten består av nervceller, astrocyter och BBB, bildas av intrikata kopplingar mellan pericyter, astrocyter, endotelceller och associerade basalmembranet bildar hjärnan mikrocirkulation1. Denna snäva cell-vägg bildas av kontinuerlig, nonfenestrated fartyg fint reglerar rörelsen av joner och molekyler (inklusive hormoner, näringsämnen eller droger), men också av cirkulerande celler1. Den särskilt låga transcytos via BBB av hög molekylvikt molekyler, såsom terapeutiska antikroppar, drog konjugat eller nanocompounds, begränsar dramatiskt framstegen inom läkemedelsutveckling för neurologiska sjukdomar, inklusive maligna gliom2. Verkligen, oralt eller intravenöst levererade Kemoterapier nå hjärnparenkymet ofta vid otillräckligt låga koncentrationer att inducera en antitumöreffekt effekt eller helt enkelt inte att korsa BBTB för att nå de neoplastiska celler3. Flera prekliniska och kliniska studier behandlat inte frågan om BBTB penetration men har försökt att störa BBTB övergående, till exempel genom att använda fokuserat ultraljud4,5, eller för att kringgå det genom direkt i situ leverans av narkotika6. Ingen av dessa tekniker var dock kunna motverka den oundvikliga tumör expansionen eller återfall. Därför, när du utvecklar roman antiglioma terapier, diffusion genom BBTB anses vara en av de kritiska aspekterna för framgångsrik leverans av den terapeutiska medel7.
Mycket komplex Pågrund av cell interaktioner inom BBTB tycks in vivo-studier på försöksdjur vara det självklara valet när man studerar passage av molekyler från blodet till hjärnan. Hög skala Invivo metoder är dock relativt komplexa att upprätta och, därför, inte tillåter hög genomströmning screening av molekyler i rimlig tid till en rimlig kostnad. Ännu viktigare, har djurförsök att följa de 3R etiska riktlinjer definieras i) förfina, ii) minska, och, av relevans för den aktuella kontexten, iii) ersätta av alternativa protokoll (t.ex. in vitro/in silico-metoder). Därför att återskapa BBTB in vitro-visas som en intressant och attraktiv möjlighet, men det utgör också en komplex uppgift som utmanas av olika begränsningar. Många försöker återskapa detta komplexa fack med odlade primära celler eller cellinjer från hund, svin, murina, och även mänskliga ursprung har publicerats (som granskas av Rahman et al.8 och Helms et al.9). Dessa modeller inkluderar tredimensionella mikroflödessystem system10, BBB-på-ett-chip11,12, och mängder av varianter som baseras på klassisk samtidig kulturerna i infogar system. Nuvarande mikroflödessystem och chip system är dock antingen inte lämpar sig för snabb, hög genomströmning drog-validering studier13,14 eller är för närvarande inte kompatibelt med studier av drogen leverans till hjärntumörer. Dessutom visade översynen 155 publicerade modeller använder primära celler, inducerbara pluripotenta stamceller (iPSC) eller kommersiella cellinjer alla tillsammans odlade på skär en trend för interstudy diskrepans i sina mätningar eller slutsatser8. Denna brist på interlaboratory reproducerbarhet kunde korreleras med i) nonnormalized kultur förhållanden, till exempel med valfri beläggning med basalmembranet matrix proteiner i cellen kultur fartyget, ii) ett ökat antal subkultur och användning av serum-innehållande media, båda större förare av genetiska och fenotypiska ändringar av cell linjer15eller iii) svårigheten att reproducibly återskapa den rätt jämvikten mellan astroglial och endotel komponenterna i en maträtt. Även om användningen av förevigade celler eller kommersiella cell linjer för att upprätta en in vitro-BBB-modell saknar några av de egenskaper jämfört med liknande modeller som bara använder primära celler, i den beskrivna metoden visar vi att rätt kombination av celler uppvisar en mycket jämförbara prestanda till publicerade studier i andra modeller referens16,17. Så småningom, motiverade avsaknaden av en robust och reproducerbara modell för att studera passage av terapeutiska föreningar målgrupp hjärntumors genom BBTB oss att utveckla de metoder som beskrivs här.
Eftersom målet var att använda modellen för att förutsäga Invivo leverans av nanopartiklar i prekliniska djurmodeller, validerade vi först den BBTB modellen genom att utnyttja skär som innehåller murina endotelceller i kontakt med murin astrocyter. Utöver detta har optimerad vi också modellen för att använda vissa mänskliga cellinjer. När stabiliserad, överförs cellen hindren till kulturer med patientderiverade glioblastoma sfärer eller kommersiella glioma cell linjer. Därefter kan transcytos av nanopartiklar och tumör cell inriktning visualiseras genom konfokalmikroskopi och kvantifieras genom att samla prover över tid. Allt kunde resultat som erhållits med de BBTB härmar tillförlitligt förutsäga beteendet hos nanopartiklarna i vivo, stödja användningen av BBTB härma föregående prekliniska validering.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1761px;" width="1761">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:1761px;">Cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">bEND3</td>
			<td style="width:239px;">ATCC</td>
			<td style="width:273px;">CRL-2299</td>
			<td style="width:961px;">Cultured in: DMEM (1g/L glucose) supplemented with 10% FBS, 5 mL L-glutamine and 5 mL penicillin/streptomycin</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">HIFko immortalized mouse astrocytes</td>
			<td style="width:239px;">Isolated in Dr. Gabriele Bergers Lab</td>
			<td style="width:273px;">https://doi.org/10.1016/S1535-6108(03)00194-6</td>
			<td style="width:961px;">Cultured in: BME-1 supplemented with 5% FBS, 5 mL 1 M HEPES, 5 mL 100 mM sodium pyruvate, 3 g D-glucose and 5 mL penicillin/streptomycin</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">HuAR2T</td>
			<td style="width:239px;">Isolated in Dr. Dagmar Wirth Lab</td>
			<td style="width:273px;">https://doi.org/10.1089/ten.tea.2009.0184</td>
			<td style="width:961px;">Cultured in: EBM-2 with SupplementMix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">normal human primary astrocytes</td>
			<td style="width:239px;">Lonza</td>
			<td style="width:273px;">CC-2565</td>
			<td style="width:961px;">Cultured in: ABM with SingleQuots</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:1761px;">Material and reagents</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100x17mm Dish, Nunclon Delta</td>
			<td style="width:239px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td>150350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">10 mL serological pipet</td>
			<td style="width:239px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:273px;">170361</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">15mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:239px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:273px;">339650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">ABM Basal Medium, 500 mL</td>
			<td style="width:239px;">Lonza</td>
			<td style="width:273px;">CC-3187</td>
			<td>For primary human astrocytes. ABM+: contains all the additives from the supplement mix. ABM-:all the additives except for rhEGF and FBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Accutase Cell Detachment Solution</td>
			<td style="width:239px;">Corning</td>
			<td style="width:273px;">25-058-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">AGM SingleQuots Supplements and Growth Factors</td>
			<td style="width:239px;">Lonza</td>
			<td>CC-4123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">B27 supplement</td>
			<td style="width:239px;">Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>for both GBM + and - medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Basal Medium Eagle</td>
			<td style="width:239px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:273px;">21010046</td>
			<td>BME-1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Corning Costar TC-Treated 6-Well Plates</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:273px;">CLS3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">Corning Transwell polyester membrane cell culture inserts</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:273px;">CLS3452&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">D-glucose</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:273px;">G8270</td>
			<td>dissolve in 50 mL of BME-1 and sterile filter before adding to the medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium/Nutrient F-12 Ham</td>
			<td style="width:239px;">Gibco</td>
			<td>21331-020</td>
			<td>Specific to the culture of the patient-derived spheres isolated in our lab, may vary for other glioma cell lines</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EBM-2 growth Medium SupplementMix</td>
			<td style="width:239px;">PromoCell</td>
			<td style="width:273px;">c-39216</td>
			<td>EBM+: contains all the additives from the supplement mix. EBM-:all the additives except for VEGF-A and FBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Endothelial Basal Medium 2 (EBM-2)</td>
			<td style="width:239px;">PromoCell</td>
			<td style="width:273px;">c-22211</td>
			<td>EBM+: contains all the additives from the supplement mix. EBM-:all the additives except for VEGF-A and FBS</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:288px;">Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin</td>
			<td style="width:239px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:273px;">10500056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Fluorescein sodium salt</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:273px;">F6377</td>
			<td style="width:961px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Greiner CELLSTAR 96 well plates</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:273px;">Greiner 655090</td>
			<td>black polystyrene wells flat bottom (with micro-clear bottom)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">Menzel-Gl&#228;ser 0.9 cm round borosilicate Cover Slips</td>
			<td style="width:239px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:273px;">10313573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">PBS tablets</td>
			<td style="width:239px;">Medicago</td>
			<td>09-9400-100</td>
			<td>one tablet per liter of dH2O, then sterilize the solution by autoclaving</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Poly-D-lysine hydrobromide</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6407&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Recombinant Human EGF</td>
			<td style="width:239px;">Peprotech</td>
			<td style="width:273px;">GMP100-15</td>
			<td>for GBM+ medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.)</td>
			<td style="width:239px;">Peprotech</td>
			<td style="width:273px;">100-18B</td>
			<td>for GBM+ medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Immunofluorescence</td>
			<td style="width:239px;"></td>
			<td style="width:273px;"></td>
			<td style="width:961px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:273px;">158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;width:288px;">24 x 60 mm microscope slide cover glass</td>
			<td style="width:239px;">ORSAtec</td>
			<td style="width:273px;">0224601-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:288px;">AlexaFluor 488 and 594 secondary antibodies</td>
			<td style="width:239px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:273px;"></td>
			<td>dilution: 1/500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Anti-Claudin-5 antibody</td>
			<td style="width:239px;">Abcam</td>
			<td style="width:273px;">ab15106</td>
			<td>dilution: 1/150</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Anti-GFAP antibody clone GF5</td>
			<td style="width:239px;">Abcam</td>
			<td style="width:273px;">ab10062</td>
			<td>dilution: 1/150</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">Anti-Mouse CD31&#160;antibody Clone MEC 13.3</td>
			<td style="width:239px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:273px;">550274</td>
			<td>dilution 1/800</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Anti-SV40 T-antigen antibody</td>
			<td style="width:239px;">Abcam</td>
			<td style="width:273px;">ab16879</td>
			<td>dilution: 1/150</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Anti-Zonula Occludens-1</td>
			<td style="width:239px;">Abcam</td>
			<td style="width:273px;">ab96587</td>
			<td>dilution: 1/200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">DAPI</td>
			<td style="width:239px;">TOCRIS</td>
			<td style="width:273px;">5748</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">Fluoromount Aqueous Mounting Medium&#160;</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:273px;">F4680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">LysoTracker Red DND-99</td>
			<td style="width:239px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:273px;">L7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Animal procedures</td>
			<td style="width:239px;"></td>
			<td style="width:273px;"></td>
			<td style="width:961px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">10 cm curved dissecting scissors</td>
			<td style="width:239px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:273px;">14394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">BD Microlance 25-gauge needles</td>
			<td style="width:239px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:273px;">300600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Fine Forceps (12.5 cm)</td>
			<td style="width:239px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:273px;">503283</td>
			<td>for tissue dissociation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Intramedic Polyethylene tubing PE20</td>
			<td style="width:239px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:273px;">427406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Ketaminol vet 50 mg/mL</td>
			<td style="width:239px;">Intervet</td>
			<td style="width:273px;">Vnr511485</td>
			<td>Ketamine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Mains Powered microdrill</td>
			<td style="width:239px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:273px;">503599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">Menzel-Gl&#228;ser 0.5 cm round borosilicate Cover Slips</td>
			<td style="width:239px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:273px;">11888372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Micro Bulldog clamp</td>
			<td style="width:239px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:273px;">14119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">Physiological saline solution</td>
			<td style="width:239px;">Mustela</td>
			<td style="width:273px;">Sterile single dose vials 20 x 5 mL / 40 x 5 mL - Medical device class</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Rochester-Oschner forceps</td>
			<td style="width:239px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:273px;">501709</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Rompun vet 20 mg/mL</td>
			<td style="width:239px;">Intervet</td>
			<td style="width:273px;">Vnr148999</td>
			<td>Xylazine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Stereotaxic adapter</td>
			<td style="width:239px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:273px;">502063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Sugi Sponge Points</td>
			<td style="width:239px;">Kettenbach</td>
			<td style="width:273px;">31603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Equipment</td>
			<td style="width:239px;"></td>
			<td style="width:273px;"></td>
			<td style="width:961px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">Axio Zoom.V16 fluorescence stereo zoom microscope&#160;</td>
			<td style="width:239px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:273px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">FLUOstar Omega microplate reader</td>
			<td style="width:239px;">BMG Labtech</td>
			<td style="width:273px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">ORCA-Flash 4.0 digital sCMOS camera</td>
			<td style="width:239px;">Hamamatsu Photonics</td>
			<td style="width:273px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Universal 320 tabletop centrifuge&#160;</td>
			<td style="width:239px;">Hettich</td>
			<td style="width:273px;">Cat. No. 1401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">ZEISS LSM 880 with Airyscan confocal microscope</td>
			<td style="width:239px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:273px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

predicting in vivo payloads delivery using a blood-brain tumor-barrier in a dish

Mycket selektiv av naturen, på blod - hjärnbarriären (BBB) är viktigt för hjärnan homeostas i fysiologiska förhållanden. Dock i samband med hjärntumörer sköldar BBB molekylär selektivitet även de neoplastiska cellerna genom att blockera leverans av perifert administrerade kemoterapi. Utvecklingen av nya läkemedel (inklusive nanopartiklar) inriktning maligna hjärntumörer idealiskt kräver användning av prekliniska djurmodeller att studera läkemedlets transcytos och antitumöreffekt effekt. För att uppfylla principen 3R (förfina, minska och ersätta) för att minska antalet försöksdjur i experimentellt ställa in och utföra high-throughput screening av ett stort bibliotek av antitumöreffekt agenter, vi utvecklat en reproducerbar in vitro-människa och murina härma av blod-hjärn tumör-barriären (BBTB) med tre lager cellkulturer av endotelceller, astrocyter och patientderiverade glioblastoma sfärer. För högre skalbarhet och reproducerbarhet, har kommersiella cellinjer eller förevigade celler använts i skräddarsydda villkor för att tillåta bildandet av en barriär som liknar riktiga BBB. Här beskriver vi ett protokoll för att få en BBTB härma genom odling endotelceller i kontakt med astrocyter vid viss cell tätheter på skären. Denna BBTB härma kan användas, exempelvis för kvantifiering och confocal avbildning av nanopartiklar passagen genom de endothelial och astrocytic hinder, förutom utvärdering av tumör cell inriktningen inom samma analysen. Vi visar dessutom att de erhållna uppgifterna kan användas för att förutsäga beteendet hos nanopartiklar i prekliniska djurmodeller. I ett bredare perspektiv, in vitro-modellen skulle kunna anpassas till andra neurodegenerativa sjukdomar för bestämning av passagen av nya terapeutiska molekyler via BBB eller kompletteras med hjärnan organoids direkt utvärdera effekten av läkemedel.

Confocal avbildning av den murina BBTB härma visar uttryck och cellulär lokalisering av åtsittande föreningspunkt proteiner zonula occludens-1 (ZO-1) och claudin-5 i bEND3. Kontakter mellan endotelceller och astrocyter inducerad tydligt omlokalisering av ZO-1 och claudin-5 till cell-endotelceller kontakter jämfört med de bEND3 monokulturer (figur 1 d). Med hjälp av immunofluorescens färgning för att visualisera de Fredsgenomförande-uttryckande astrocyterna på hjärnan-sidan av membranet, är det möjligt att observera och studera de astrocytic processer och slutet-fötter att kontakta endotelceller genom membranet (figur 1E ). Astrocyten-endotelceller kontakterna är kända för att främja och stabilisera åtstramning av den cellulära barriären och är associerade med lägre permeabilitet värden av BBB19. I enlighet med det, vi observerat en betydande minskning genomträngligheten av mus BBTB härma för Na-Fl från 27,63 (± 3,45) x 10-6 cm/s vid monokulturer till 6,74 (± 3.01) x 10-6 cm/s när co odlade med den hypoxi-inducerbara faktor knock-out (HIFko) astrocyter (tabell 1). Den förevigade HuAR2T bildar högpermeabel cellulära hinder (104.92 ± 27,1 x 10-6 cm/s, tabell 1). Liknar murina modellen, vi mätte betydligt lägre permeabilitet av BBTB till Na-Fl, nämligen (± 14,32) 47,4 x 10-6 cm/s, när de HuAR2T cellerna var samtidig odlade med människans primära astrocyterna (tabell 1).
I såväl mänskliga som murina BBTB härmar inducerade förekomsten av sfärernas patientderiverade glioblastoma en liten ökning i permeabilitet värden jämfört med de endothelial cellen-astrocyten samtidig kulturerna ensam (tabell 1). Detta fenomen kan iakttas med flera men inte alla av de tålmodiga gliom sfär modeller. Detta kan bero på den VEGF-A som utsöndras av några av dessa patientderiverade celler.
För att jämföra permeabilitet värdena för de in vitro-BBTB härmar med Invivo BBB, avbildade vi realtid diffusionen av Na-Fl genom ett kraniala fönster som implanteras i nakna möss. Använder ett fluorescens-stereomikroskop, spelades Na-Fl diffusion från blodkärl kapillärerna som härrör från huvudsakliga pial blodkärlen före, under och efter systemisk injektion av sonden (figur 2 c). Mätningar av differentiell fluorescens värdena från cirkulerande blod och hjärna kortikala parenkymet över tiden tillät oss att beräkna ungefärlig permeabilitet värden för naken musen's BBB för Na-Fl (5.57 ± 2,19 x 10-6 cm/s, Tabell 1).
För att illustrera hur denna BBTB härma kan användas för visualisering av passagen av föreningar från blod sida till hjärnan sida, jämförde vi transcytos ø 110 nm (NP110) och ø 350 nm (NP350) nanopartiklar inriktning patientderiverade glioblastoma sfärer. Resultat erhållna in vitro jämfördes sedan med de Invivo transcytos. I exemplet presenteras nanopartiklar var bestrukna med tumör-targeting peptiden CooP20 och laddad med den fluorescerande färgämnen (FITC) att underlätta visualiseringen. Vi märkt cellerna använder lysosomala färgämnet och counterstained med DAPI 24 h efter tillägg av de FITC nanopartiklarna på blod-sidan av BBTB härma och förvärvade confocal micrographs på olika nivåer (t.ex. blod sidan, membranet, hjärnan sidan, och patientens glioblastoma kulorna) (figur 3A). NP110-associerade fluorescerande signalen colocalized med lysosomerna i endotelceller, astrocyter och tumörceller. Dessutom NP110s var upptäckta däremellan den endothelial celler och astrocyter, passerar genom membranet porerna i skäret (figur 3A).
Passage av NP110s kvantifierades genom att mäta fluorescensen från prover som tagits från både blod och hjärna sida. Dessa permeabilitet värden jämfördes med dem som fastställts för nanopartiklarna av ø 350 nm (NP350). Resultaten visar att endast NP110 skulle kunna passera de BBTB härmar (figur 3B). NP350 förblev på blod-sidan av den BBTB härma, vilket resulterade i lägre permeabilitet värden för dessa nanopartiklar.
För att belysa betydelsen av de BBTB härmar jämfört med i vivo modeller, injicerades naken möss intravenöst med NP110 eller NP350 nanopartiklar belagda med tumör-targeting peptiden CooP och konjugerat med röd fluorescerande färgämne (TRITC) för detektion. Vävnader som samlats in vid flera tidpunkter avslöjade att efter 8 h, BBB-permeable nanopartiklar har extravasering i hjärnparenkymet, medan de nonpermeable de som bott i cirkulationen rensades främst från den systemiska cirkulationen Invivo. Därför vi samlade in hjärnor och kvantifieras antalet nanopartiklar per kvadrera millimetern 8 h postinjection. I enlighet med den in vitro-fynd, NP110, men inte NP350, framgångsrikt extravasering i hjärnparenkymet (figur 3 c). Hög förstoring avbildning av nanopartiklar platsen i hjärnan visade att NP110 var homogent fördelade i hjärnparenkymet utanför blod kapillärerna och framgångsrikt homed på implanterade glioblastoma celler (figur 3D). Trots uppvisar samma tumören inriktning biexponentiellt (CooP), NP350 kunde extravasate in i hjärnparenkymet och upptäcktes endast inom den luminala sidan av hjärnan blodkärl (figur 3E), liknar de uppnådda resultaten in vitro-.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59384/59384fig1.jpg"> Figur 1: Beskrivning av modellen, blod-hjärn tumör-barriär (BBTB). (A) Schematisk bild av platser av olika celltyper. (B) Illustration av Infoga placeringen på 6-well plate omslaget och sådd teknik för astrocyterna på hjärnan sida av insatsen's membran. (C) Illustration av 6-well plate placeringen möjliggör astrocyten vidhäftningen. (D) immunofluorescens micrographs av åtsittande föreningspunkt proteiner zonula occludens-1 (ZO-1, övre raden, röda) och claudin-5 (nedre raden, grön). Proteinuttryck jämfört med murin hjärnan mikrovaskulära endotelceller (bEND3) odlade på blod sida av BBTB ensam som en monokultur (vänster kolumn) eller med murin förevigade HIFko astrocyter (högra kolumnen). Cellkärnan är counterstained med DAPI (blå). (E) immunofluorescens mikrograf visar glial fibrillary sura proteinet (Fredsgenomförande, röd) i HIFko astrocyter odlade på hjärnan sidan av BBTB. Hög förstoring bilden visar astrocyten processer och slutet-fötter (pilar) att kontakta endotelceller genom membranet porer (höger panel). HIFko astrocyterna identitet har verifierats med immunofluorescens färgning av simian virus 40 stora T antigenet (SV40 stora T, grön) används för immortalization av cellerna. Endotelceller uttrycker Fredsgenomförande varken SV40 stora T och därför delvis kan observeras genom den genomskinliga, motsatta sidan av membranet som endast DAPI-färgade celler (streckade linjer). Cellkärnan är counterstained med DAPI (blå). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59384/59384fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59384/59384fig2.jpg"> Figur 2: Intravital levande bestämning av musen BBB permeabilitet. (A) beredning av implanterbara kaudala ven katetern. (1) verktyg och utrustning är följande: (en) en PE20 polyeten rör (b) två 25 G nålar (c), Rochester-Ochsner pincett, och (d), en liten bulldog klämman. (2) en 25 G nål avlägsnas genom flera torsions med hjälp av pincetten och (3) noga insatt i röret. (4), den andra sidan av röret är ansluten till en annan 25 G nål. (B) vägledning för katetern implantation och positionering för att ingjuta natrium-fluorescein lösningen genom svansen av en mus. Inringade området anger området där en droppe cyanoakrylat lim är placerad för att säkra katetern. Bulldog klämman används för att hantera katetern och tas bort när katetern är säkrad. (C) representativa avbildning och kvantifiering metod att bestämma natrium-fluorescein permeabilitet värdena. Före den natrium-fluorescein infusionen (vänster kolumn) mäts autofluorescens/tomma inom en region av intresse (ROI) placeras på hjärnan (övre panelen, vit rektangel) och blodkärl områden (nedre panelen, röd rektangel). Under natrium-fluorescein infusionen (högra kolumnen) mäts fluorescensintensiteten i båda ROIs, möjliggör beräkning av BBB permeabilitet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59384/59384fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59384/59384fig3.jpg"> Figur 3: Prediktion av den intracerebral transcytos av nanopartiklar via BBB Invivo med hjälp av in vitro-BBTB-modellen. (A) grafisk representation av BBTB analysen med representativa confocal bilder tagna på de angivna olika nivåerna av murina BBTB modellen. Nanopartiklar av 110 nm i diameter (NP110) och konjugerad till FITC (grön) lades till blodet sida av BBTB celler har märkts med den lysosomala sonden (LT-99, röd).  (1), Endothelial celler, (2), Endothelial transcytos av nanopartiklarna genom porerna i membranet (vit streckad linje), (3) astrocyter, och (4) patientens glioblastoma kulorna på bilden är identifierade och motsvarande confocal micrographs (höger). Lysosomala inkapsling av nanopartiklarna (pilar) föreslår aktiva transcytos genom de endothelial och astrocyten lager av BBTB. (B) kvantifiering av angivna nanopartiklar permeabilitet genom den in vitro-BBTB (n = 6). (C) kvantifiering indikerade nanopartiklar densitet i hjärnvävnaden avsnitt, 8 h efter den kaudala ven infusionen av naken möss (n = 3). (D) Confocal micrographs visar fördelningen av ø 110 nm nanopartiklar (NP110, röd) i murina hjärnan vävnadssnitt märkt med en CD31 antimus-antikropp (grön). På pilen belyser de nanopartiklar transcytos (till vänster). Nanopartiklar ackumuleras runt hjärnans tumörceller (tumör, högra panelen) på grund av CooP-targeting peptiden presenterade på deras yta. Inga betydande homing observeras i hjärnvävnad (hjärnan). (E) Confocal micrographs visar fördelningen av ø 350 nm nanopartiklar (NP350, röd) i murina hjärnan vävnadssnitt märkt med en CD31 antimus-antikropp (grön). Pilspetsar pekar på den NP350s som behölls i blodkärl lumen och inte kunde passera BBB, förmodligen på grund av deras större diameter jämfört med de NP110s. cellkärnorna är counterstained med DAPI (blå). P < 0,01. P-värdena beräknades med en tvåsidiga, icke-parametriska Mann-Whitney U test. Felstaplar representera standardavvikelsen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59384/59384fig3large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>murina BBTB härma</td>
			<td>bEND3</td>
			<td>bEND3 + HIFko som</td>
			<td>bEND3 + GB</td>
			<td>bEND3 + HIFko som + GB</td>
			<td>In vivo</td>
		</tr>
<tr>
<td>Permeabilitet (10-6 cm/s)</td>
			<td>27,63</td>
			<td>6,74</td>
			<td>26,8</td>
			<td>10,83</td>
			<td>5,57</td>
		</tr>
<tr>
<td>SD (10-6 cm/s)</td>
			<td>3,45</td>
			<td>3.01</td>
			<td>7,99</td>
			<td>2,65</td>
			<td>2.19</td>
		</tr>
<tr>
<td>mänskliga BBTB härma</td>
			<td>HuAR2T</td>
			<td>HuAR2T + hIAs</td>
			<td>HuAR2T + GB</td>
			<td>HuAR2T + hIAs + GB</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Permeabilitet (10-6 cm/s)</td>
			<td>104.92</td>
			<td>47,4</td>
			<td>89.08</td>
			<td>48.24</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>SD (10-6 cm/s)</td>
			<td>27,1</td>
			<td>14,32</td>
			<td>10,21</td>
			<td>13.07</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: värderingar av natrium-fluorescein (Na-Fl) permeabilitet (i centimeter per sekund) bestäms in vitro- i de angivna co kultur system och in vivo i NMRI naken möss. Data från ett representativt experiment (n = 3 möss).

Watch this Scientific Journal Video about Predicting In Vivo Payloads Delivery using a Blood-brain Tumor-barrier in a Dish at JoVE.com

Predicting In Vivo Payloads Delivery using a Blood-brain Tumor-barrier in a Dish

Förutsäga i Vivo nyttolaster leverans med en blod-hjärn tumör-barriär i en maträtt

Drogen inriktning till centrala nervsystemet tumörer är en stor utmaning. Här beskriver vi ett protokoll för att producera en in vitro-härma av blod-hjärn tumör-barriären med murin eller mänskliga celler och diskutera deras relevans för förutsägbarheten i centrala nervsystemet tumör inriktning Invivo.

Highly selective by nature, the blood-brain barrier (BBB) is essential for the brain homeostasis in physiological conditions. However, in the context of ...

För att utveckla nya läkemedel och föreningar som riktar tumörer i centrala nervsystemet, tillgänglighet och passage genom blod - hjärnbarriären är mycket viktigt. Även om cytotoxiciteten hos föreningarna lätt kan mätas genom att inkubera cellerna med de terapeutiska molekylerna, det egentligen inte berätta något om den faktiska leveransen till tumören platsen i hjärnan. För att ta itu med denna fråga, utvecklade vi följande protokoll som beskriver hur man återskapar blod - hjärntumör barriären in vitro på en maträtt.Användningen av förevigade celler av murin eller mänskligt ursprung gör denna analys mycket flexibel. Det kan också lätt skalas upp till skärmen dussintals föreningar med hög reproducerbarhet. Dessutom möjliggör denna metod både kvantifiering och visualisering av föreningarnas passage och inriktningsförmåga innan man fortsätter med prekliniska modeller.Därför ersätter vår metod delvis djurmodellerna genom att använda de i förväg fastställda cellinjerna. Inkludering av patient-härledda hjärntumör celler assays patienten heterogenitet, medan användningen av förevigade celler för att fastställa den blood - brain barriären säkerställer reproducerbarheten av resultaten. Sammantaget erbjuder denna blod - hjärnbarriären modell ett riktigt intressant verktyg för att assay drogen diffusion eller leverans av narkotika fordon.Visuell demonstration av metoden är kritisk eftersom sådd av cellerna på motsatt sida av skäret kräver manipulering som inte ofta beskrivs i andra protokoll med hjälp av liknande inställningar. Till exempel, erhålla vidhäftning av astrocyter när skäret placeras upp och ner mycket nytta av visuell representation. Under en steril cellkultur huva, tvätta noggrant de odlade astrocyterna med fem milliliter steril PBS.Använd en vakuumpump för att försiktigt kassera PBS, och tillsätt två milliliter av cellavskiljningsreagens i fem minuter för att lossa cellerna. Tillsätt sedan 10 milliliter sterila komplett astrocyte cell kulturmedium till kärlet för att hämma aktiviteten av cellen dissociation reagens. Använd en steril serologisk pipet för att överföra de fristående cellerna från kärlet till ett sterilt 15-milliliterrör.Centrifugera vid 250 gånger g i tre minuter vid rumstemperatur. Under tiden, ställ ut skären. Använd sterila trikåer för att placera inläggen med hjärnsidan uppåt på locket till en steril sex-brunnsplatta.När centrifugeringen är klar, kassera försiktigt supernatanten från cellupphängningen, och återanvända astrocytepelleten i en milliliter ABM-plus genom att försiktigt pipettera pelleten på rörets vägg upp till fem gånger. Räkna sedan cellerna, och justera cellen suspension densitet till 150, 000 celler i 400 mikroliter av ABM-plus per insats. Placera cellfjädringen i mitten av hjärnsidan av insatsens membran, och sprid den försiktigt med hjälp av kapillärkraft med en steril pipettspets.Med hjärnsidan av skären fortfarande upp, placera sex-väl plattan tillbaka på skären. Placera plattan och skär, med hjärnan sidan upp, i en inkubator på 37 grader Celsius och 5% koldioxid för att möjliggöra celladhesion. Efter detta, återgå sex-väl plattan tillbaka till sin ordinarie position, med skär nu blod sidan upp.Lägg till medium, och fortsätt inkubationen enligt textprotokollet. Under en steril cellkultur huva, tvätta noggrant de odlade endotelcellerna med fem milliliter steril PBS. Använd en vakuumpump för att försiktigt kassera PBS, och tillsätt två milliliter av cellavskiljningsreagens i fem minuter för att lossa cellerna.Tillsätt sedan 10 milliliter sterila kompletta endotelcellskulturmedium till kärlet för att hämma aktiviteten hos cellens dissociationsreagens. Använd en steril serologisk pipet för att överföra de fristående cellerna från kärlet till ett sterilt 15-milliliterrör. Centrifugera vid 250 gånger g i tre minuter vid rumstemperatur.Efter detta, kassera supernatant, och återanvända endotelcellpellets i en milliliter av EBM-plus genom att långsamt pipettera cellupphängningen på rörets vägg upp till fem gånger. Räkna cellerna, och justera cellen suspension densitet till 200, 000 celler i 2,5 milliliter av endotel cellodling saknar serum och vaskulär endotel tillväxtfaktor-A per skär. Hämta den platta som innehåller skären.Kassera försiktigt mediet från blodsidan, och ersätt det med 2,5 milliliter av endotelcellsupphängning. Sedan, tillbaka plattan till inkubatorn, och lämna den över natten så att endotelcellerna att hålla sig till membranet. Nästa dag, förbereda en sex-brunns platta genom att överföra tre milliliter av förvuppvade ABM-minus till varje brunn.Med hjälp av sterila forceps, hantera inläggen för att försiktigt kassera endothelialt komplett medium från blodsidan, och placera insatsen i den nya plattan som innehåller ABM-minus. Lägg sedan till 2,5 milliliter EBM-minus. Låt inskärsorna vara kvar i inkubatorn med minimal fysisk störning eller temperaturvariation i fem dagar.På dagen för överföringen, byt medium. För avbildning av immunofluorescens, placera upp till fyra runda sterila borosilikatöverdrag i varje brunn av en sex-brunnsplatta som innehåller två milliliter poly-D-lysin. Inkubera i rumstemperatur i 30 minuter.Under tiden, använd en steril serologisk pipet för att noggrant överföra tumörsfärerna från cellodlingskärlet till ett 15 milliliter sterilt rör. Centrifugera tumörsfärerna vid 250 gånger g i tre minuter. Kasta supernatanten och försiktigt återanvänd sfärerna i en milliliter GBM-minus.Räkna cellerna, och justera celltätheten till ungefär 10, 000 sfärer eller 100, 000 celler per milliliter GBM-minus. Därefter kasta poly-D-lysin från brunnarna, och skölj brunnarna tre gånger med steril PBS. Frö varje brunn av plattan med tre milliliter av tumören sfäroid suspension, och överföra skär med BBTB härma på tumörcellen suspension.Inkubera över natten vid 37 grader Celsius med 5%koldioxid för att låta blod och hjärntumör sidor av analysen att komma till jämvikt. Nästa dag, ersätta media i blodet sidan med EBM-minus kompletteras med molekyler, droger, eller nanopartiklar av intresse. Samla in proverna över tiden för direkt kvantifiering enligt tidigare beskrivning.Samla först 100 mikroliter av mediet från både blodet och hjärnsidorna av BBTB-härma, och överför var och en till en separat plattbottnad, svart, 96-brunnsplatta för efterföljande fluorescensmätningar. Därefter förbereda en 50-mikromolarlösning av natrium fluorescein i EBM-minus, se till att förbereda 2,5 milliliter per brunn. Förvävar denna lösning till 37 grader Celsius, och byt ut media från blodsidan av skären med media som innehåller denna natriumfluoresceinlösning.Starta en timer så snart mediet är utbytt. Samla försiktigt 100 mikroliter media från både blod och hjärna sidor av skär på fem minuter, 30 minuter, 60 minuter och 120 minuter. Överför varje prov för att separera brunnar av lämplig svart, 96-brunnsplatta.Använd en plattläsare för att kvantifiera fluorescensen från de insamlade proverna. Först späd lysosomen fluorescerande färgämne till lämplig arbetskoncentration i förvättat medium. Lägg detta till cellerna, och inkubera vid 37 grader Celsius med 5%koldioxid i 45 minuter.Skölj sedan cellerna tre gånger med iskall PBS. Kasta PBS, och tillsätt tre milliliter iskall 4%paraformaldehyd till brunnarna och 2,5 milliliter till skäret. Inkubera på is i 10 minuter.Efter detta, kassera paraformaldehyd, och skölj cellerna tre gånger med PBS. Ta bort PBS, och räknar cellkärnor med hjälp av en DAPI-lösning vid en slutlig koncentration av ett mikrogram per milliliter i destillerat vatten. Inkubera i rumstemperatur i sju minuter.Ta sedan bort DAPI, och tvätta membranen tre gånger med destillerat vatten. Skär försiktigt membranet, ta bort destillerat vatten, och placera den på en droppe monteringsmedium på ett glas mikroskop slide. Lägg till ytterligare en droppe monteringsmedium på andra sidan av membranet, och täck den försiktigt med ett borosilikatöverdragsglas.I denna studie, endotelceller var co-odlade med astrocyter att bilda en blod - hjärntumör barriär-liknande gränssnitt i en in vitro-setup. Confocal bildbehandling av murine BBTB härma visar uttryck och cellulära lokalisering av den snäva knutpunkten proteiner zonula occludens-1 och claudin-5 i bEND3. Kontakter mellan endotelceller och astrocyter inducerar tydligt omlokalisering av dessa två proteiner till de endotelcellscell-till-cell kontakter jämfört med bEND3 monokulturer.Med hjälp av immunofluorescensfärgning för att visualisera de GFAP-uttryckande astrocyterna vid hjärnans sida av membranet är det möjligt att observera och studera de astrocytiska processerna och ändfötterna som kontaktar endotelcellerna genom membranet. För att jämföra in vitro BBTB:s permeabilitetsvärden härmar med in vitro-blod-hjärnbarriären avbildas den realtidsdiffusion av natriumfluorescein genom ett kranialfönster som implanteras i nakna möss. Med hjälp av fluorescensstereomikroskop registreras natrium fluoresceindiffusion från blodkärlsmönsillärerna som härrör från de viktigaste pialblodkärlen före, under och efter systemisk injektion av sonden.Transcytos av nanopartiklar som riktar patient-härledda glioblastom sfärer jämförs sedan för att illustrera hur denna BBTB härma kan användas för att visualisera passagen av föreningar från blodsidan till hjärnsidan. DEN NP110-associerade fluorescerande signalen samlokaliserar med lysosomer i endotelceller, astrocyter och tumörceller. Dessutom, NP110s detekteras i mellan endotelceller och astrocyter, passerar genom membranet porerna i insatsen.Passagen av NP110s kvantifieras genom att mäta fluorescensen från prover som samlats in från både blod- och hjärnsidan, och dessa värden jämförs med de bestämda nanopartiklar som är 350 nanometer. Som kan ses, endast NP110s har möjlighet att passera BBTB härmar, medan NP350 kvar på blodsidan, vilket resulterar i lägre permeabilitet värden för dessa nanopartiklar. Hantera insatsen med omsorg, och försiktigt sprida astrocytecellen suspension på hjärnan sidan av insatsen utan direkt kontakt av membranet.Eventuella skador på membranet kommer att resultera i läckage. Denna metod kan anpassas för att besvara frågan om hjärnan leverans av perifert administrerade nyttolaster. Genom att använda olika skär med större membran porer, det är också möjligt att studera cell extravasation.Den här tekniken kan ändras genom att använda olika celltyper för att efterlikna andra cellulära hinder. Det banar också väg för en mer ansvarsfull och etisk forskning, som syftar till att minska antalet försöksdjur som används för validering av läkemedel mot cancer. Kom ihåg att paraformaldehyd är en mycket giftig kemikalie och bör hanteras därefter.Var också försiktig medan du använder en skarp skalpell för att extrahera membranen från skären.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

De<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal skiva Tumör Modell: Visualisering och kvantifiering av genuttryck och tumör invasiv använda genetiska mosaiker

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR bedömning av pH, pO2, Redox Status, och koncentrationer av fosfat och glutation i den tumör mikromiljö

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

Fluorescence Molecular Tomography for In Vivo Imaging of Glioblastoma Xenografts

Fluorescence Molecular Tomography for In Vivo Imaging of Glioblastoma Xenografts

Fluorescens molekylär tomografi för In Vivo Imaging av Glioblastoma xenograft

Tumorigenicity is the capability of cancer cells to form a tumor mass. A widely used approach to determine if the cells are tumorigenic is by injecting ...

In Vivo Inhibition of MicroRNA to Decrease Tumor Growth in Mice

In vivo-hämning av mikroRNA för att minska tumörtillväxten hos möss

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression through their ability to destabilize mRNA and inhibit translation of target mRNAs. An ...

Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs

Kombinerad användning av Stjärtvenmetastaser-analyser och real tids in vivo-avbildning för att kvantifiera bröst cancer metastaserande kolonisering och börda i lungorna

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification ...

In Vivo Targeting of Xenografted Human Cancer Cells with Functionalized Fluorescent Silica Nanoparticles in Zebrafish

In Vivo Targeting av Xenografted Human Cancer Cells med functionalized Fluorescent Silica Nanopartiklar i Zebrafish

Developing nanoparticles capable of detecting, targeting, and destroying cancer cells is of great interest in the field of nanomedicine. In vivo animal ...

Using Computer-based Image Analysis to Improve Quantification of Lung Metastasis in the 4T1 Breast Cancer Model

Använda datorbaserad bildanalys för att förbättra kvantifiering av lung metastasering i 4T1 Bröstcancermodellen

Breast cancer is a devastating malignancy, accounting for 40,000 female deaths and 30% of new female cancer diagnoses in the United States in 2019 alone. ...

Patient-Derived Tumor Explants As a "Live" Preclinical Platform for Predicting Drug Resistance in Patients

Patient-härledda tumör explanter som en "levande" preklinisk plattform för att förutsäga läkemedelsresistens hos patienter

An understanding of drug resistance and the development of novel strategies to sensitize highly resistant cancers rely on the availability of suitable ...

Evaluation of the In vivo Antitumor Activity of Polyanhydride IL-1&#945; Nanoparticles

Evaluation of the In vivo Antitumor Activity of Polyanhydride IL-1ÃƒÅ½Ã‚Â± Nanoparticles

Utvärdering av in vivo antitumöraktivitet av polyanhydrid IL-1α nanopartiklar

Cytokine therapy is a promising immunotherapeutic strategy that can produce robust antitumor immune responses in cancer patients. The proinflammatory ...

Longitudinal Intravital Imaging Through Clear Silicone Windows

Längsgående intravital avbildning genom tydliga silikonfönster

Intravital microscopy (IVM) enables visualization of cell movement, division, and death at single-cell resolution. IVM through surgically inserted imaging ...