Name: predicting in vivo payloads delivery using a blood-brain tumor-barrier in a dish
Uploaded: 2019-04-16T14:30:00
Duration: 13 min 34 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Predicting In Vivo Payloads Delivery using a Blood-brain Tumor-barrier in a Dish at JoVE.com

Bu araştırma hibe Fin kanser kuruluşları, Jane & fotograf Erkko Vakfı ve Sigrid Juselius Vakfı (için P.L. ve V.L.J.), İsviçre Ulusal Bilim Vakfı tarafından desteklenmiştir (Gelişmiş Postdoc.Mobility vermek no: P300PB_164732, S. için K.), Orion Araştırma Vakfı (için spor kulübü), Maud Kuistila Anıtı Vakfı (için spor kulübü) ve Finlandiya Akademisi (TERVA 2017 vermek no: 314 498). Biomedicum görüntüleme ünitesi (Helsinki) çekirdek tesis Imaging mikroskobu sağlamak için kabul edilmektedir.

<ol>
	<li>Daneman, R., Prat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-brain+barrier.">The blood-brain barrier.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (1), a020412 (2015).</li><li>Quail, D. F., Joyce, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Microenvironmental+Landscape+of+Brain+Tumors.">The Microenvironmental Landscape of Brain Tumors.</a> Cancer Cell. 31 (3), 326-341 (2017).</li><li>Wang, Z., Sun, H., Yakisich, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+the+blood-brain+barrier+for+chemotherapy:+limitations,+challenges+and+rising+problems.">Overcoming the blood-brain barrier for chemotherapy: limitations, challenges and rising problems.</a> Anticancer Agents in Medicinal Chemistry. 14 (8), 1085-1093 (2014).</li><li>Alkins, R. D., Brodersen, P. M., Sodhi, R. N., Hynynen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+drug+delivery+for+boron+neutron+capture+therapy+of+brain+tumors+with+focused+ultrasound.">Enhancing drug delivery for boron neutron capture therapy of brain tumors with focused ultrasound.</a> Neuro Oncology. 15 (9), 1225-1235 (2013).</li><li>Alli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brainstem+blood+brain+barrier+disruption+using+focused+ultrasound:+A+demonstration+of+feasibility+and+enhanced+doxorubicin+delivery.">Brainstem blood brain barrier disruption using focused ultrasound: A demonstration of feasibility and enhanced doxorubicin delivery.</a> Journal of Controlled Release. 281, 29-41 (2018).</li><li>Ashby, L. S., Smith, K. A., Stea, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gliadel+wafer+implantation+combined+with+standard+radiotherapy+and+concurrent+followed+by+adjuvant+temozolomide+for+treatment+of+newly+diagnosed+high-grade+glioma:+a+systematic+literature+review.">Gliadel wafer implantation combined with standard radiotherapy and concurrent followed by adjuvant temozolomide for treatment of newly diagnosed high-grade glioma: a systematic literature review.</a> World Journal of Surgical Oncology. 14 (1), 225 (2016).</li><li>Guishard, A. F., Yakisich, J. S., Azad, N., Iyer, A. K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+gap+in+ongoing+clinical+trials+for+glioma.">Translational gap in ongoing clinical trials for glioma.</a> Journal of Clinical Neurosciences. 47, 28-42 (2018).</li><li>Rahman, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalized+endothelial+cell+lines+for+in+vitro+blood-brain+barrier+models:+A+systematic+review.">Immortalized endothelial cell lines for in vitro blood-brain barrier models: A systematic review.</a> Brain Research. 1642, 532-545 (2016).</li><li>Helms, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+of+the+blood-brain+barrier:+An+overview+of+commonly+used+brain+endothelial+cell+culture+models+and+guidelines+for+their+use.">In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 36 (5), 862-890 (2016).</li><li>Wang, J. D., Khafagy, e. l. -. S., Khanafer, K., Takayama, S., ElSayed, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+Endothelial+Cells,+Pericytes,+and+Astrocytes+into+a+3D+Microfluidic+in+Vitro+Model+of+the+Blood-Brain+Barrier.">Organization of Endothelial Cells, Pericytes, and Astrocytes into a 3D Microfluidic in Vitro Model of the Blood-Brain Barrier.</a> Molecular Pharmaceutics. 13 (3), 895-906 (2016).</li><li>Phan, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier-on-a-chip:+Microphysiological+systems+that+capture+the+complexity+of+the+blood-central+nervous+system+interface.">Blood-brain barrier-on-a-chip: Microphysiological systems that capture the complexity of the blood-central nervous system interface.</a> Experimental Biology and Medicine (Maywood). 242 (17), 1669-1678 (2017).</li><li>Bang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Low+Permeability+Microfluidic+Blood-Brain+Barrier+Platform+with+Direct+Contact+between+Perfusable+Vascular+Network+and+Astrocytes.">A Low Permeability Microfluidic Blood-Brain Barrier Platform with Direct Contact between Perfusable Vascular Network and Astrocytes.</a> Scientific Reports. 7 (1), 8083 (2017).</li><li>Wilhelm, I., Krizbai, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+of+the+blood-brain+barrier+for+the+study+of+drug+delivery+to+the+brain.">In vitro models of the blood-brain barrier for the study of drug delivery to the brain.</a> Molecular Pharmacology. 11 (7), 1949-1963 (2014).</li><li>Campisi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+self-organized+microvascular+model+of+the+human+blood-brain+barrier+with+endothelial+cells,+pericytes+and+astrocytes.">3D self-organized microvascular model of the human blood-brain barrier with endothelial cells, pericytes and astrocytes.</a> Biomaterials. 180, 117-129 (2018).</li><li>Pirsko, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Effect+of+Culture+Media+on+Epithelial+Differentiation+Markers+in+Breast+Cancer+Cell+Lines+MCF7,+MDA-MB-436+and+SkBr3.">An Effect of Culture Media on Epithelial Differentiation Markers in Breast Cancer Cell Lines MCF7, MDA-MB-436 and SkBr3.</a> Medicina (Kaunas). 54 (2), (2018).</li><li>Stebbins, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+and+characterization+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+brain+microvascular+endothelial+cells.">Differentiation and characterization of human pluripotent stem cell-derived brain microvascular endothelial cells.</a> Methods. 101, 93-102 (2016).</li><li>Canfield, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+isogenic+blood-brain+barrier+model+comprising+brain+endothelial+cells,+astrocytes,+and+neurons+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">An isogenic blood-brain barrier model comprising brain endothelial cells, astrocytes, and neurons derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Journal of Neurochemistry. 140 (6), 874-888 (2017).</li><li>Cao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-inducible+factor-1alpha+is+involved+in+isoflurane-induced+blood-brain+barrier+disruption+in+aged+rats+model+of+POCD.">Hypoxia-inducible factor-1alpha is involved in isoflurane-induced blood-brain barrier disruption in aged rats model of POCD.</a> Behavioural Brain Research. 339, 39-46 (2018).</li><li>Abbott, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte-endothelial+interactions+and+blood-brain+barrier+permeability.">Astrocyte-endothelial interactions and blood-brain barrier permeability.</a> Journal of Anatomy. 200 (6), 629-638 (2002).</li><li>Kinnari, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+homing+peptide-functionalized+porous+silicon+nanovectors+for+cancer+therapy.">Tumour homing peptide-functionalized porous silicon nanovectors for cancer therapy.</a> Biomaterials. 34 (36), 9134-9141 (2013).</li><li>Levin, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personalized+medicine+in+neuro-oncology.">Personalized medicine in neuro-oncology.</a> CNS Oncology. 5 (2), 55-58 (2016).</li><li>Weathers, S. S., Gilbert, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+Personalized+Targeted+Therapeutics:+An+Overview.">Toward Personalized Targeted Therapeutics: An Overview.</a> Neurotherapeutics. 14 (2), 256-264 (2017).</li><li>O'Duibhir, E., Carragher, N. O., Pollard, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerating+glioblastoma+drug+discovery:+Convergence+of+patient-derived+models,+genome+editing+and+phenotypic+screening.">Accelerating glioblastoma drug discovery: Convergence of patient-derived models, genome editing and phenotypic screening.</a> Molecular and Cellular Neuroscience. 80, 198-207 (2017).</li><li>Kaya, M., Ahishali, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+permeability+in+barrier+type+of+endothelium+in+brain+using+tracers:+Evans+blue,+sodium+fluorescein,+and+horseradish+peroxidase.">Assessment of permeability in barrier type of endothelium in brain using tracers: Evans blue, sodium fluorescein, and horseradish peroxidase.</a> Methods in Molecular Biology. 763, 369-382 (2011).</li><li>Yang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+two+immortalized+cell+lines,+ECV304+and+bEnd3,+for+in+vitro+permeability+studies+of+blood-brain+barrier.">Identification of two immortalized cell lines, ECV304 and bEnd3, for in vitro permeability studies of blood-brain barrier.</a> PLoS One. 12 (10), e0187017 (2017).</li><li>Blouw, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hypoxic+response+of+tumors+is+dependent+on+their+microenvironment.">The hypoxic response of tumors is dependent on their microenvironment.</a> Cancer Cell. 4 (2), 133-146 (2003).</li><li>Argaw, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte-derived+VEGF-A+drives+blood-brain+barrier+disruption+in+CNS+inflammatory+disease.">Astrocyte-derived VEGF-A drives blood-brain barrier disruption in CNS inflammatory disease.</a> Journal of Clinical Investigation. 122 (7), 2454-2468 (2012).</li><li>Miao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF+increases+paracellular+permeability+in+brain+endothelial+cells+via+upregulation+of+EphA2.">VEGF increases paracellular permeability in brain endothelial cells via upregulation of EphA2.</a> The Anatomical Record (Hoboken). 297 (5), 964-972 (2014).</li><li>Heinolainen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGFR3+Modulates+Vascular+Permeability+by+Controlling+VEGF/VEGFR2+Signaling.">VEGFR3 Modulates Vascular Permeability by Controlling VEGF/VEGFR2 Signaling.</a> Circulation Research. 120 (9), 1414-1425 (2017).</li><li>Claesson-Welsh, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+permeability--the+essentials.">Vascular permeability--the essentials.</a> Upsala Journal of Medical Sciences. 120 (3), 135-143 (2015).</li><li>Adriani, G., Ma, D., Pavesi, A., Goh, E. L., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+the+Blood-Brain+Barrier+in+a+3D+triple+co-culture+microfluidic+system.">Modeling the Blood-Brain Barrier in a 3D triple co-culture microfluidic system.</a> Conference Proceedings - IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. 2015, 338-341 (2015).</li><li>Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hCMEC/D3+cell+line+as+a+model+of+the+human+blood+brain+barrier.">The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier.</a> Fluids and Barriers of the CNS. 10 (1), 16 (2013).</li><li>Paatero, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyses+in+zebrafish+embryos+reveal+that+nanotoxicity+profiles+are+dependent+on+surface-functionalization+controlled+penetrance+of+biological+membranes.">Analyses in zebrafish embryos reveal that nanotoxicity profiles are dependent on surface-functionalization controlled penetrance of biological membranes.</a> Scientific Reports. 7 (1), 8423 (2017).</li><li>Prabhakar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimuli-responsive+hybrid+nanocarriers+developed+by+controllable+integration+of+hyperbranched+PEI+with+mesoporous+silica+nanoparticles+for+sustained+intracellular+siRNA+delivery.">Stimuli-responsive hybrid nanocarriers developed by controllable integration of hyperbranched PEI with mesoporous silica nanoparticles for sustained intracellular siRNA delivery.</a> International Journal of Nanomedicine. 11, 6591-6608 (2016).</li><li>Hyvonen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+target+for+peptide-based+imaging+and+treatment+of+brain+tumors.">Novel target for peptide-based imaging and treatment of brain tumors.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 13 (4), 996-1007 (2014).</li><li>Feng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammary-Derived+Growth+Inhibitor+Targeting+Peptide-Modified+PEG-PLA+Nanoparticles+for+Enhanced+Targeted+Glioblastoma+Therapy.">Mammary-Derived Growth Inhibitor Targeting Peptide-Modified PEG-PLA Nanoparticles for Enhanced Targeted Glioblastoma Therapy.</a> Bioconjugate Chemistry. 26 (8), 1850-1861 (2015).</li><li>Nance, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dense+poly(ethylene+glycol)+coating+improves+penetration+of+large+polymeric+nanoparticles+within+brain+tissue.">A dense poly(ethylene glycol) coating improves penetration of large polymeric nanoparticles within brain tissue.</a> Science Translational Medicine. 4 (149), 149rA119 (2012).</li><li>Berg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+nanoparticle+transport+through+in+vitro+blood-brain+barrier+models.">Quantitative analysis of nanoparticle transport through in vitro blood-brain barrier models.</a> Tissue Barriers. 4 (1), e1143545 (2016).</li><li>Noumbissi, M. E., Galasso, B., Stins, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+vascular+heterogeneity:+implications+for+disease+pathogenesis+and+design+of+in+vitro+blood-brain+barrier+models.">Brain vascular heterogeneity: implications for disease pathogenesis and design of in vitro blood-brain barrier models.</a> Fluids and Barriers of the CNS. 15 (1), 12 (2018).</li><li>Heymans, M., Sevin, E., Gosselet, F., Lundquist, S., Culot, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mimicking+brain+tissue+binding+in+an+in+vitro+model+of+the+blood-brain+barrier+illustrates+differences+between+in+vitro+and+in+vivo+methods+for+assessing+the+rate+of+brain+penetration.">Mimicking brain tissue binding in an in vitro model of the blood-brain barrier illustrates differences between in vitro and in vivo methods for assessing the rate of brain penetration.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 127, 453-461 (2018).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

İnterpatient tümör değişkenlik kavramı yükselişi kişiselleştirilmiş kanser ilaç21üzerinde araştırma yenilendi. Bu değişkenlik de merkezi sinir sistemi neoplazmlar bir özelliğidir. Tahmin edilemezlik tümör nedeniyle yanıt-e doğru kemoterapi BBB için ilaç dağıtım askerlerinden etkisini ekler ve tamamen hasta bakımı22büyük zorlukları kabul ettiğiniz anlamına gelir. Daha etkili tedaviler geliştirmek için genellikle ekran büyük yeni moleküller kitaplıklarına gereklidir. Antitümör etkinlik ve tümör sitesine ulaşmak için yeni tedavi yol yeteneği değerlendirmek için en iyi seçenek hasta elde edilen hücrelerde vivo içinde fare hasta avatars implante preklinik çalışmadır. Pratik (mali, zaman, insan ve tesis kaynakları) ve etik nedenlerle (laboratuvar hayvanlarının kullanırken 3Rs İlkesi) nedeniyle, böyle bir büyük ölçekli içinde vivo tarama platformu geliştirilmesi mümkün ve bu nedenle, hücre tabanlı deneyleri değil kez bir model seçim23kalır. Hücre satırları seçmek için asıl nedeni kurulan ve Primer hücre kaçınarak tekrarlanabilirlik kolaylaştırmak ve yalıtım ve birincil fare kültürler kurulması için ana kaynağı laboratuvar hayvanlarının kullanımı azaltmak etmektir. Burada, sunma yöntemleri sıkıca uymak 3Rs ile verimli bir şekilde nano tanecikleri bir ek preklinik araştırmaların kriter üzerinde modeli BBTB çapraz için kendi yetersizlik üzerinden atmak. Bir kanıtı-of-ilke olarak, biz burada geliştirme ve BBTB doğrulama sırasında elde edilen bulgular tarif. Örneğin ne zaman ölçme bir 376 Da sodyum floresein pasif Difüzyon tüp bebek bulgular içinde vivo onaylamak başardık.
Bu yazıda belirtilen iletişim kuralı endotel hücreleri ile astrocytes cocultured hazırlanması bir tüp bebek Kur kan-beyin tümörü bariyer gibi arabiriminde oluşturmak için açıklar. Bu iki hücre tipleri arasında fiziksel bir temas kurulduktan sonra endotel hücre katmanı BBB (örneğin, bir hücre yüzey ifade sıkı kavşak proteinlerin ve nispeten düşük geçirgenlik) ile benzerlikler sergiler. İlginçtir, fare BBTB taklit özellikle benzer Na-Fl geçirgenlik değerleri bu içinde vivo fare BBB geçirgenliği ölçüm24ile elde sağlamak için görünüyordu. Bu nedenle, BBTB taklit eder performansını doğrudan seçtiğiniz bir bariyer oluşturmak için kullanılan hücrelere bağlantılı olur. BEND3 endotel hücreleri ve beyinden köken astrocytes25ile cocultured zaman engelleri oluşturan başarılı olduğu bilinmektedir. Ancak, ölümsüzleştirdi HIFko astrocytes26 BBTB taklit oluşturmak için kullanıyoruz. Hipoksi-indüklenebilir faktör onların eksikliği nedeniyle, bu astrocytes üretmek VEGF-A, burada açıklanan BBTB taklit'ın istikrar içinde özetin özeti olduğu. Astrocytes örneğin VEGF-bir yanıt neuroinflammation27olarak sürümü ile BBB geçirgenliği modülatörler olarak tespit edilmiştir. Harekete geçirmek-vasküler endotelyal büyüme faktörü reseptörü (VEGFRs) in vitro28 ve içinde vivo29hem de endotel/vasküler geçirgenliği anahtar bir düzenleyicisidir. Bu nedenle, VEGF-A takviyeleri orta VE-cadherin30gibi adherens junction proteinlerin fosforilasyon neden olmaktadır VEGFR2 endotel hücreleri üzerinde etkinleştirin. Endotel hücre-hücre kişiler kaybı yüksek geçirgen kan damarları oluşturur. Benzer şekilde, güçlü mitogenic özelliği ve hücre kültürü deneyleri içinde kullanılan fetal sığır sera bilinmeyen kompozisyon önemli konular bariyer istikrar ve tahlil tekrarlanabilirlik neden.
İnsan göbek damar endotel hücreleri (HUVECs) bazen vitro31' BBB oluşturmak için kullanılır; hCMEC/D3 hücre satır32, gen ekspresyonu ve bariyer şekillendirme açısından gibi Ancak, onlar önemli ölçüde beyin mikrovasküler endotel hücreleri, farklı özellikleri. Ancak, bEND3 için yalnız yetiştirilen HuAR2T hücreleri ile elde edilen değerler karşılaştırıldığında nispeten daha yüksek geçirgenliği büyük ölçüde azalır ile insan birincil astrocytes coculturing tarafından. Endotel hücreleri hücresel duvar oluşturmak için gerekli olmasına rağmen astrocytes BBTB oluşumu ve istikrar için eşit derecede önemli bir rolü olduğu açık görülüyor.
Hasta kaynaklı gliyom küreler bu denkleme eklendiğinde, fare BBTB taklit bazı beyin damarlara ve tümör hücre hedefleme yoluyla uyuşturucu Difüzyon gibi fare xenografts özellikleri recapitulated. Burada tartışılan BBTB taklit eder örneğin, ne zaman biz farklı çaplarda birkaç nano tanecikleri ekranlı içinde vivo davranış ikizlemede başarılı oldu. Tüp Bebek ve içinde vivo modelleri arasında paralellik göstermek için biz yukarıda açıklanan mesoporous silikat nano tanecikleri33 34 hücre delici özellikleri üzerinde tümör hedefleme peptid CooP Birleşik ile kullanılan onların surface20. CooP hedefleme peptid evleri meme kaynaklı büyüme inhibitörü (MDGI) için özel bağlayıcı ile invaziv tümör hücreleri için. Birkaç kanserleri gliomas, dahil olmak üzere, hangi kümes çok verimli bir tümör hedefleme yan artan yükü20teslimini yetenekli kılan normal doku35' e, karşılaştırıldığında MDGI overexpressing. Burada kullanılan nano tanecikleri daha önce beyin parankimi (27547955) yaygın gösterilmiştir ve Taxol ile functionalized, bu nano-yükler preklinik modelleri36tümörü büyümesi azaltılmasında başarılı olmuştur. Polietilen glikol (PEG) artıkları nano tanecikleri yüzeyde ilavesi de onların statik şarj pozitif değerler için tutulan (çevresinde + 4 mV), nörovasküler birim37 ile daha iyi etkileşim sağlayan ve aynı zamanda onların istikrar artan dolaşımda. NP350s PEG 10 kDa ile kaplı iken sunulan veri, NP110s için PEG, 3 kDa Birleşik. Ancak, artan molekül ağırlıklı PEG da nanopartikül çapı, bu nedenle önemli bir artış BBB geçmeye fiziksel yeteneklerini sonuçlandı. Bu nedenle, ister parçacıkların fiziksel boyutları BBTB onların geçitle engelledi ve olup bu gözlemler içinde vivo yansıtılması kontrol ettik.
Daha önce yayımlanmış gözlemler uygun olarak, biz NP110s tüp bebek BBTB ve NP350s BBTB taklit ve kan damarlarının luminal tarafında muhafaza ederken İntrakraniyal tümörler taşıyan fareler BBB yoluyla extravasated gözlenen fareler. Bu benzer sonuçlar BBTB modeli BBB çapraz ve beyin ulaşmak için nano tanecikleri içinde vivo yeteneğini öngörülen şiddetle tavsiye ederim.
BBB hücresel modelleri alaka sık sık, hatta nano tanecikleri38Merkez teslime ele alınmıştır. Burada birincil astrocytes ve endotel hücreleri, hem en alakalı tüp bebek araçları olarak kabul ölümsüzleştirdi ve/veya piyasada bulunan hücreleri tarafından değiştirilebilir olduğunu daha fazla ölçeklenebilirlik ve tekrarlanabilirlik sağlanması gösteriyoruz. Tüp Bebek BBB taklit eder yeni nesil yapısal olarak gerçek BBB12,14benzer güzel biçimlendirilmiş nörovasküler birimleri izin mikrosıvısal cihazlar dahil ederek geliştirilebilir. Ancak, şu anda teslim14takip teknik sınırlamalar nedeniyle gliomas teslim molekülleri yüksek üretilen iş taranması için uygun olmayan bu tür modellerdir. Gerçekten de bir tabak içinde BBB fizyolojik karmaşıklığı yakalamak zordur ve bazı reseptörleri/BBB tarafından ifade edilmesi için bilinen proteinler, olası eksikliği sonuçların yorumlanması tehlikeye atabilir. Başka bir bağımsız değişken gen ifadesinin içinde vivo ve in vitro içinde koşullar arasında yanı sıra başka bir, özellikle dikkate endotel hücreleri tek bir hücrede satırından büyük değişkenlik ilgilendiriyor. Ancak, aynı zamanda nörovasküler birimi içinde beyin39Tekdüzen bir varlık değil söylenebilir. Biyoloji bilimsel araştırma nerede hayvan refahı, etik sorumluluk ve hayvan hayat kullanma maliyetini her zaman bir deney tasarlamadan önce kabul edilir bir insana ilişkin dönem ulaştı. Bu nedenle, hayvanlar değiştirme desteklemek için son yıllarda yapılan çalışmalarda giderek artan sayıda göstermek bu modellerin sınırlarını ve bariyer kurmak için hücresel modellerin dikkatli seçimi bilincini — astrocytes üzerine vurgu ile — garanti bir maç sonuçları arasında bir tabak içinde elde edilen ve hayvan40modelleri. Burada açıklanan yöntemi ile biz BBB transcytosis için potansiyel tedavi amacı eleme için deneysel hayvan sayısını azaltmak için bir adım daha yakın olsun.

Nöronlar, astrocytes ve perisitlerden, astrocytes, endotel hücreleri ve beyin microvasculature1şekillendirme ilişkili membran arasındaki karmaşık bağlantıları tarafından kurulan BBB, nörovasküler birim oluşmaktadır. Bu sıkı hücresel duvar tarafından sürekli, nonfenestrated gemiler ince oluşan iyonlar ve moleküllerin (hormonlar, besin veya uyuşturucu gibi) aynı zamanda hücreleri1dolaşan hareket düzenlemektedir. Özellikle düşük transcytosis terapötik antikorlar, uyuşturucu conjugates veya nanocompounds, gibi yüksek molekül ağırlıklı molekülleri BBB yoluyla önemli ölçüde Malign dahil olmak üzere nörolojik hastalıklar için ilaç keşif gelişmeler kısıtlar gliomas2. Gerçekten de, oral veya intravenöz teslim edilen chemotherapies bir antitümör Etkisi ikna etmek için sık sık yeterli ölçüde düşük konsantrasyonlarda, beyin parankimi ulaşmak veya neoplastik hücrelerin3ulaşmak için BBTB geçmeye sadece mümkün değildir. Birkaç preklinik ve klinik çalışmalar BBTB penetrasyon sorunu ile ele değil ama geçici, örneğin odaklanmış ultrasonlardan4,5, kullanarak BBTB bozmaya veya direkt in situ olarak tarafından aşmak için teşebbüs var. uyuşturucu6dır. Ancak, bu teknikleri hiçbiri kaçınılmaz Tümör Genişleme karşı koymak veya nüks başardık. Bu nedenle, roman antiglioma tedaviler geliştirirken, difüzyon yoluyla BBTB bir terapötik ajanlar7başarılı teslim etmek için kritik yönleri olarak düşünülmelidir.
BBTB içinde hücre etkileşimleri çok karmaşık yapısı nedeniyle, laboratuvar hayvanlarının içinde vivo çalışmalarda seçimdi beyin kan molekülleri geçiş okurken gibi görünmektedir. Ancak, yüksek ölçekli içinde vivo yöntemler için oldukça karmaşık kurmak ve bu nedenle, molekülleri yüksek üretilen iş tarama makul bir süre içinde makul bir maliyetle izin vermez. Daha da önemlisi, hayvan testleri İyileştir i) tanımlanan 3R etik kılavuz izleyin, II) azaltmak ve geçerli içerik alaka düzeyi, III) (örneğin, In vitro/içinde silis yöntemleri) alternatif iletişim kuralları tarafından değiştirmek vardır. Bu nedenle, BBTB tüp bebek eğlence ilginç ve çekici bir olasılık olarak görünür, ancak aynı zamanda çeşitli sınırlamalar tarafından meydan karmaşık bir görev teşkil eder. Çok kültürlü Primer hücre veya hücre satırlarından köpek, domuz, fare ve insan bile kökenli yayınlanmıştır (Rahman ve ark.8 ve Helms ve ark.9tarafından gözden gibi) ile karmaşık bu bölümü yeniden oluşturmak çalışır. Klasik co kültürlerde göre değişik multitudes ekler sistemleri ve üç boyutlu mikrosıvısal sistemleri10, BBB-on-a-chip11,12, bu modelleri içerir. Yine de, şu anki mikrosıvısal çip olmayan durumda hızlı, yüksek-den geçerek uyuşturucu doğrulama çalışmaları13,14 ya da şu anda çalışmalar ile uyumsuz Beyin Tümörleri uyuşturucu teslimat için uygundur. Buna ek olarak, 155 yayımlanmış modeller Primer hücre, indüklenebilir pluripotent kök hücreler (IPSC) veya ticari hücre hatları kullanarak gözden tüm ortak olarak kültürlü ekler onların ölçümleri ve/veya sonuçlar8' interstudy tutarsızlık için bir eğilim gösterdi. Bu eksikliği interlaboratory tekrarlanabilirlik i) nonnormalized kültür koşullarla, örneğin ile isteğe bağlı kat membran matris proteinler hücre kültür gemisi, II) artan sayıda alt kültür ve kullanımı ile ilişkili serum içeren medya, her iki büyük sürücü genetik ve fenotipik değişiklikler hücre hatları15veya III) zorluk tekrarlanarak astroglial ve bir tabak içinde endotel bileşenleri arasındaki doğru dengeyi yeniden oluşturun. Her ne kadar bir tüp bebek BBB modeli yoksun bazı Primer hücre yalnızca kullanan benzer modellerle karşılaştırıldığında özelliklerini kurmak için ölümsüzleştirdi hücreleri veya ticari hücre hatları, açıklanan yöntemde biz sağ kombinasyonu sergiler hücreleri göstermek bir çok karşılaştırılabilir performans için başvuru16,17diğer modellerinde çalışmaları yayınlandı. Sonunda, Beyin Tümörleri BBTB aracılığıyla hedefleme terapötik bileşiklerin geçit çalışmaya bir sağlam ve tekrarlanabilir model eksikliği bizi burada açıklanan yöntemleri geliştirmek için motive.
Kalenin içinde vivo Preklinik hayvan modellerinde nano tanecikleri teslimini tahmin etmek için modeli kullanmak üzere olduğu için biz ilk BBTB model fare astrocytes ile temas halinde fare endotel hücreleri içeren ekler kullanarak geçerliliği. Buna ek olarak, biz de bazı insan hücre hatları kullanılacak modelini optimize. Bir kez stabilize, hücre engelleri kültürleri hasta kaynaklı glioblastoma küreler veya ticari gliyom hücre hatları ile aktarılır. Bundan sonra transcytosis nano tanecikleri ve tümör hücre hedefleme tarafından confocal mikroskobu görüntülenir ve zaman içinde örnekleri toplayarak sayılabilir. Önemlisi, BBTB taklit eder kullanarak elde edilen sonuçlar güvenilir içinde BBTB kopyalama izni kullanımını destekleyen vivo, nano tanecikleri davranışını preklinik doğrulama tahmin olabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1761px;" width="1761">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:1761px;">Cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">bEND3</td>
			<td style="width:239px;">ATCC</td>
			<td style="width:273px;">CRL-2299</td>
			<td style="width:961px;">Cultured in: DMEM (1g/L glucose) supplemented with 10% FBS, 5 mL L-glutamine and 5 mL penicillin/streptomycin</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">HIFko immortalized mouse astrocytes</td>
			<td style="width:239px;">Isolated in Dr. Gabriele Bergers Lab</td>
			<td style="width:273px;">https://doi.org/10.1016/S1535-6108(03)00194-6</td>
			<td style="width:961px;">Cultured in: BME-1 supplemented with 5% FBS, 5 mL 1 M HEPES, 5 mL 100 mM sodium pyruvate, 3 g D-glucose and 5 mL penicillin/streptomycin</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">HuAR2T</td>
			<td style="width:239px;">Isolated in Dr. Dagmar Wirth Lab</td>
			<td style="width:273px;">https://doi.org/10.1089/ten.tea.2009.0184</td>
			<td style="width:961px;">Cultured in: EBM-2 with SupplementMix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">normal human primary astrocytes</td>
			<td style="width:239px;">Lonza</td>
			<td style="width:273px;">CC-2565</td>
			<td style="width:961px;">Cultured in: ABM with SingleQuots</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:1761px;">Material and reagents</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100x17mm Dish, Nunclon Delta</td>
			<td style="width:239px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td>150350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">10 mL serological pipet</td>
			<td style="width:239px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:273px;">170361</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">15mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:239px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:273px;">339650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">ABM Basal Medium, 500 mL</td>
			<td style="width:239px;">Lonza</td>
			<td style="width:273px;">CC-3187</td>
			<td>For primary human astrocytes. ABM+: contains all the additives from the supplement mix. ABM-:all the additives except for rhEGF and FBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Accutase Cell Detachment Solution</td>
			<td style="width:239px;">Corning</td>
			<td style="width:273px;">25-058-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">AGM SingleQuots Supplements and Growth Factors</td>
			<td style="width:239px;">Lonza</td>
			<td>CC-4123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">B27 supplement</td>
			<td style="width:239px;">Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>for both GBM + and - medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Basal Medium Eagle</td>
			<td style="width:239px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:273px;">21010046</td>
			<td>BME-1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Corning Costar TC-Treated 6-Well Plates</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:273px;">CLS3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">Corning Transwell polyester membrane cell culture inserts</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:273px;">CLS3452&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">D-glucose</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:273px;">G8270</td>
			<td>dissolve in 50 mL of BME-1 and sterile filter before adding to the medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium/Nutrient F-12 Ham</td>
			<td style="width:239px;">Gibco</td>
			<td>21331-020</td>
			<td>Specific to the culture of the patient-derived spheres isolated in our lab, may vary for other glioma cell lines</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EBM-2 growth Medium SupplementMix</td>
			<td style="width:239px;">PromoCell</td>
			<td style="width:273px;">c-39216</td>
			<td>EBM+: contains all the additives from the supplement mix. EBM-:all the additives except for VEGF-A and FBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Endothelial Basal Medium 2 (EBM-2)</td>
			<td style="width:239px;">PromoCell</td>
			<td style="width:273px;">c-22211</td>
			<td>EBM+: contains all the additives from the supplement mix. EBM-:all the additives except for VEGF-A and FBS</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:288px;">Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin</td>
			<td style="width:239px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:273px;">10500056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Fluorescein sodium salt</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:273px;">F6377</td>
			<td style="width:961px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Greiner CELLSTAR 96 well plates</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:273px;">Greiner 655090</td>
			<td>black polystyrene wells flat bottom (with micro-clear bottom)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">Menzel-Gl&#228;ser 0.9 cm round borosilicate Cover Slips</td>
			<td style="width:239px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:273px;">10313573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">PBS tablets</td>
			<td style="width:239px;">Medicago</td>
			<td>09-9400-100</td>
			<td>one tablet per liter of dH2O, then sterilize the solution by autoclaving</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Poly-D-lysine hydrobromide</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6407&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Recombinant Human EGF</td>
			<td style="width:239px;">Peprotech</td>
			<td style="width:273px;">GMP100-15</td>
			<td>for GBM+ medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.)</td>
			<td style="width:239px;">Peprotech</td>
			<td style="width:273px;">100-18B</td>
			<td>for GBM+ medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Immunofluorescence</td>
			<td style="width:239px;"></td>
			<td style="width:273px;"></td>
			<td style="width:961px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:273px;">158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;width:288px;">24 x 60 mm microscope slide cover glass</td>
			<td style="width:239px;">ORSAtec</td>
			<td style="width:273px;">0224601-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:288px;">AlexaFluor 488 and 594 secondary antibodies</td>
			<td style="width:239px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:273px;"></td>
			<td>dilution: 1/500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Anti-Claudin-5 antibody</td>
			<td style="width:239px;">Abcam</td>
			<td style="width:273px;">ab15106</td>
			<td>dilution: 1/150</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Anti-GFAP antibody clone GF5</td>
			<td style="width:239px;">Abcam</td>
			<td style="width:273px;">ab10062</td>
			<td>dilution: 1/150</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">Anti-Mouse CD31&#160;antibody Clone MEC 13.3</td>
			<td style="width:239px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:273px;">550274</td>
			<td>dilution 1/800</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Anti-SV40 T-antigen antibody</td>
			<td style="width:239px;">Abcam</td>
			<td style="width:273px;">ab16879</td>
			<td>dilution: 1/150</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Anti-Zonula Occludens-1</td>
			<td style="width:239px;">Abcam</td>
			<td style="width:273px;">ab96587</td>
			<td>dilution: 1/200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">DAPI</td>
			<td style="width:239px;">TOCRIS</td>
			<td style="width:273px;">5748</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">Fluoromount Aqueous Mounting Medium&#160;</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:273px;">F4680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">LysoTracker Red DND-99</td>
			<td style="width:239px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:273px;">L7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Animal procedures</td>
			<td style="width:239px;"></td>
			<td style="width:273px;"></td>
			<td style="width:961px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">10 cm curved dissecting scissors</td>
			<td style="width:239px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:273px;">14394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">BD Microlance 25-gauge needles</td>
			<td style="width:239px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:273px;">300600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Fine Forceps (12.5 cm)</td>
			<td style="width:239px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:273px;">503283</td>
			<td>for tissue dissociation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Intramedic Polyethylene tubing PE20</td>
			<td style="width:239px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:273px;">427406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Ketaminol vet 50 mg/mL</td>
			<td style="width:239px;">Intervet</td>
			<td style="width:273px;">Vnr511485</td>
			<td>Ketamine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Mains Powered microdrill</td>
			<td style="width:239px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:273px;">503599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">Menzel-Gl&#228;ser 0.5 cm round borosilicate Cover Slips</td>
			<td style="width:239px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:273px;">11888372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Micro Bulldog clamp</td>
			<td style="width:239px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:273px;">14119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">Physiological saline solution</td>
			<td style="width:239px;">Mustela</td>
			<td style="width:273px;">Sterile single dose vials 20 x 5 mL / 40 x 5 mL - Medical device class</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Rochester-Oschner forceps</td>
			<td style="width:239px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:273px;">501709</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Rompun vet 20 mg/mL</td>
			<td style="width:239px;">Intervet</td>
			<td style="width:273px;">Vnr148999</td>
			<td>Xylazine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Stereotaxic adapter</td>
			<td style="width:239px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:273px;">502063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Sugi Sponge Points</td>
			<td style="width:239px;">Kettenbach</td>
			<td style="width:273px;">31603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Equipment</td>
			<td style="width:239px;"></td>
			<td style="width:273px;"></td>
			<td style="width:961px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">Axio Zoom.V16 fluorescence stereo zoom microscope&#160;</td>
			<td style="width:239px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:273px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">FLUOstar Omega microplate reader</td>
			<td style="width:239px;">BMG Labtech</td>
			<td style="width:273px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">ORCA-Flash 4.0 digital sCMOS camera</td>
			<td style="width:239px;">Hamamatsu Photonics</td>
			<td style="width:273px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Universal 320 tabletop centrifuge&#160;</td>
			<td style="width:239px;">Hettich</td>
			<td style="width:273px;">Cat. No. 1401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">ZEISS LSM 880 with Airyscan confocal microscope</td>
			<td style="width:239px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:273px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

predicting in vivo payloads delivery using a blood-brain tumor-barrier in a dish

Doğası gereği çok seçici, kan - beyin bariyerini (BBB) fizyolojik şartlarda beyin homeostazı için esastır. Ancak, Beyin Tümörleri bağlamında, BBB moleküler seçicilik de neoplastik hücrelerin periferik yönetilen chemotherapies teslimini engelleyerek kalkanlar. Kötü huylu beyin tümörü ideal hedefleme geliştirme (dahil nano tanecikleri) roman ilaçların ilaç transcytosis ve antitümör etkinliği çalışmaya preklinik hayvan modelleri kullanılmasını gerektirir. 3R İlkesi ile uygun davranmak için (rafine, azaltmak ve eski yerine koymak) bir tekrarlanabilir tüp bebek insan geliştirdiğimiz laboratuvar hayvanlarının deneysel kurulumunda sayısını azaltmak ve antitümör aracıları büyük bir kütüphanesi yüksek üretilen iş tarama gerçekleştirmek için ve üç katmanlı kültürleri endotel hücreleri, astrocytes ve hasta kaynaklı glioblastoma küreler kullanarak fare taklit kan-beyin tümör-bariyer (BBTB). Daha yüksek ölçeklenebilirlik ve tekrarlanabilirlik için ticari hücre hatları veya ölümsüzleştirdi hücreleri özel koşullarda gerçek BBB benzeyen bir bariyer oluşumunu sağlamak için kullanılmaktadır. Burada bir BBTB taklit astrocytes, ekler üzerinde belirli hücre yoğunluğu ile temas endotel hücreleri kültür tarafından elde etmek için bir protokol açıklayın. Bu BBTB mimik, örneğin, miktar ve tümör hücre içinde aynı tahlil hedefleme değerlendirilmesi yanı sıra endotel ve astrositik engelleri nanopartikül geçitle confocal görüntüleme için kullanılabilir. Ayrıca, elde edilen verileri nano tanecikleri preklinik hayvan modellerinde davranışını tahmin etmek için kullanılabileceğini göstermektedir. Daha geniş bir perspektif içinde tüp bebek bu model diğer nörodejeneratif hastalıklar geçit BBB yoluyla yeni tedavi moleküllerin belirlenmesi için adapte olabilir ve/veya doğrudan etkinliğini değerlendirmek için beyin organoids ile takıma uyuşturucu.

Fare BBTB taklit confocal görüntüleme bEND3 içinde ifade ve sıkı kavşak proteinler zonula occludens-1 (ZO-1) ve claudin-5 Hücrede yerleşimi gösterir. Kişiler endotel hücreleri ve astrocytes arasında açıkça ZO-1 ve claudin-5 bEND3 monocultures (şekil 1 d) göre endotel hücre-hücre kişilere tehcir indüklenen. GFAP'nin ifade astrocytes membran beyin tarafındaki görselleştirmek için boyama ayirt kullanarak, gözlemlemek ve astrositik işlemleri ve son-feet (şekil 1E membran ile endotel hücreleri başvurarak çalışma olanağı vardır ). Astrocyte endotel hücre rehber teşvik ve hücresel bariyer sıkma için bilinen ve BBB19daha düşük geçirgenlik değerleri ile ilişkili. Bu uygun olarak, biz 6.74 (± 3.01) x 10-6 cm/s için Na Fl 27.63 (± 3,45) x 10-6 cm/s monocultures durumunda üzerinden fare BBTB taklit geçirgenliği önemli bir düşüş gözlenen zaman hipoksi-indüklenebilir ile birlikte kültürlü faktör knock out (HIFko) astrocytes (Tablo 1). Ölümsüzleştirdi HuAR2T formu yüksek geçirgen hücresel engelleri (104.92 ± 27,1 x 10-6 cm/sn, Tablo 1). HuAR2T hücreleri insan birincil astrocytes (Tablo 1) ile birlikte kültürlü yaşındayken fare modeline benzer, önemli ölçüde daha düşük BBTB Na-FL, yani 47.4 (± 14.32) x 10-6 cm/s, geçirgenliği şiddetindeydi.
Fare ve insan BBTB taklit eder, hasta kaynaklı glioblastoma küreler varlığı endotel hücre-astrocyte ortak kültürler yalnız için karşılaştırıldığında geçirgenlik değerleri (Tablo 1) hafif bir artış indüklenen. Bu olay birkaç ile görülmektedir ancak tüm hasta gliyom modelleri küre. Bu VEGF-A bu bazı bu hasta kaynaklı hücreler tarafından salgılanan nedeniyle olabilir.
Tüp Bebek BBTB taklit eder içinde vivo BBB ile geçirgenlik değeri karşılaştırmak için Na-Fl çıplak fareler implante kafatası penceresinden gerçek zamanlı Difüzyon görüntüsü. Floresan stereomicroscope kullanarak, Na-Fl Difüzyon ana pial kan damarları türetme damar kılcal dan önce sırasında ve sonrasında sonda (şekil 2C) Sistemik enjeksiyon kaydedildi. Zaman içinde dolaşan kan ve beyin beyin parankimi fark Floresans değerleri ölçümler bize çıplak fare'yaklaşık geçirgenlik değerlerini hesaplamak izin s BBB Na-Fl (5,57 ± 2.19 x 10-6 cm/sn, için Tablo 1).
Bu BBTB taklit bileşikleri kan tarafa geçiş beyin yanına görselleştirme için nasıl kullanılabileceğini göstermek için ø 110 nm (NP110) ve ø 350 nm (NP350) nano tanecikleri hedefleme hasta kaynaklı glioblastoma küreler transcytosis karşılaştırıldığında. Sonuçlar elde tüp bebek o zaman içinde vivo transcytosis karşılaştırıldı. Sunulan örnekte, nano tanecikleri tümör hedefleme peptid ile CooP20 kaplı yüzey ve floresan boya (görselleştirme kolaylaştırmak için FITC) ile yüklü. Biz lizozomal boya kullanarak hücreleri etiketli ve BBTB kan tarafında FITC nano tanecikleri taklit ve confocal Filmler (örneğin, kan yan, membran, beyin yan, farklı düzeylerde kazanılmış sonra DAPI 24 s counterstained ve hasta glioblastoma küreler) (şekil 3A). Organellerin endotel hücreleri, astrocytes ve tümör hücreleri ile colocalized NP110 ilişkili floresan sinyali. Buna ek olarak, NP110s tespit edilen ikisinin arasında olduğunu endotel hücreleri ve Ekle (şekil 3A) membran gözenekler geçen astrocytes.
NP110s geçirilmesi Floresans kan ve beyin taraftan toplanan örnekleri üzerinden ölçerek sayısal. Bu nano tanecikleri için belirlenen bu geçirgenlik değerleri karşılaştırıldı ø 350 nm (NP350). Sonuçlar yalnızca NP110 BBTB taklit eder (şekil 3B) geçmek mümkün olduğunu gösterir. NP350 daha düşük geçirgenlik değerleri için bu nano tanecikleri sonuçlandı BBTB taklit kan tarafında kaldı.
İçinde vivo modellerle karşılaştırıldığında BBTB taklit eder alaka vurgulamak için çıplak fareler intravenöz tümör hedefleme peptid ile CooP kaplı ve algılama için kırmızı floresan boya (TRITC) ile Birleşik NP110 veya NP350 nano tanecikleri ile enjekte edildi. Birkaç saat noktalarda toplanan doku 8 h sonra dolaşımda kaldı olanlar ağırlıklı olarak sistemik dolaşım içinde vivo silinmesinden geçirgen ise beyin parankimi içine BBB-geçirgen nano tanecikleri extravasated saptandı. Bu nedenle, beyin toplanan ve nano tanecikleri milimetre kare 8 h postinjection başına sayısı sayılabilir. Tüp Bebek bulgular, NP110 ama değil NP350 uygun olarak, başarılı bir şekilde (şekil 3 c) beyin parankimi extravasated. Yüksek büyütme görüntüleme beyin nanopartikül konumunun NP110 homojen beyin parankimi dışında kan kılcal dağıtılan ve başarılı bir şekilde (şekil 3D) implante glioblastoma hücrelere bağlantılı gösterdi. Yan (CooP) hedefleme aynı tümör sergilenmesi rağmen NP350 beyin parankimi extravasate açamadı ve sadece beyin kan damarları (şekil 3E), tüp bebek. elde edilen sonuçlar benzer luminal tarafına içinde algılandı
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59384/59384fig1.jpg"> Şekil 1: kan-beyin tümör-bariyer (BBTB) modelinin açıklaması. (A)farklı hücre tipleri yerlerini şematik gösterimi. 6-şey plaka kapak ve tohumlama tekniği için astrocytes Ekle'beyin tarafındaki Ekle yerleştirme (B) örnek s membran. (C) astrocyte yapışma sağlayan 6-şey plaka yerleşim Illustration. (D) ayirt Filmler sıkı kavşak proteinler zonula occludens-1 (ZO-1, üst satır, kırmızı) ve claudin-5 (alt satır, yeşil). Protein ifade bir Monokültür (sol sütun) olarak veya fare ölümsüzleştirdi HIFko astrocytes (sağ sütun) ile yalnız BBTB kan tarafında kültürlü fare beyin mikrovasküler endotel hücreleri (bEND3) karşılaştırılır. Hücre çekirdeği DAPI (mavi) ile counterstained. (E) HIFko astrocytes BBTB beyin yanında kültürlü gliyal fibrillary asidik protein (GFAP'nin, kırmızı) gösteren ayirt test. Yüksek büyütme resim astrocyte işlemleri gösterir ve son-feet (oklar) membran ile endotel hücreleri temas (doğru kapı aynası) gözenekleri. HIFko astrocytes kimliği hücreleri əbadoləşdirmək için kullanılan simian virüs 40 büyük T antijen (SV40 büyük T, yeşil) ayirt boyama tarafından doğrulandı. Endotel hücreleri ne GFAP'nin ne de SV40 büyük T hızlı ve bu nedenle, kısmen saydam, karşı tarafında salt DAPI lekeli hücreler (kesikli çizgiler) olarak membran aracılığıyla görülebilir. Hücre çekirdeği DAPI (mavi) ile counterstained. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59384/59384fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59384/59384fig2.jpg"> Resim 2: Canlı belirlenmesi intravital: fare BBB geçirgenliği. (A)implante edilebilir Kaudal ven kateteri hazırlanması. (1) alet ve ekipmanlar şunlardır: (bir) bir PE20 polietilen boru (b) iki 25 G iğneler (c) Rochester Ochsner forseps ve (d) küçük bir bulldog kelepçe. (2) A 25 G iğne tarafından birkaç torsion kaldırılır forseps ve (3) dikkatli bir şekilde kullanarak tüp takılı. (4) tüp diğer tarafında başka bir 25 G iğneye bağlı. (B) rehberlik kateter implantasyon ve konumlandırma için bir fare kuyruğu ven ile sodyum floresein çözüme demleyin. Daire içinde alan cyanoacrylate tutkal bir damla kateter güvenliğini sağlamak için yerleştirildiği alanı gösterir. Bulldog kelepçe kateter işlemek için kullanılan ve kateter güvenli bir kez kaldırıldı. Sodyum floresein geçirgenlik değerleri belirlemek için (C) temsilcisi görüntüleme ve miktar yöntemi. Sodyum floresein infüzyon (sol sütun) önce autofluorescence/boş beyin (üst panel, beyaz dikdörtgen) ve damar alanları (alt paneli, kırmızı dikdörtgen) üzerine yerleştirilmiş bir bölgesi (ROI) ilgi içinde ölçülür. Sodyum floresein infüzyon sırasında (sağ sütun) floresan yoğunluğu BBB geçirgenliği hesaplama sağlayan her iki ROIs içinde ölçülür. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59384/59384fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59384/59384fig3.jpg"> Şekil 3: nano tanecikleri BBB içinde tüp bebek BBTB modelini kullanarak vivo aracılığıyla intraserebral transcytosis değerlendirilmesinde. (A)temsilcisi confocal görüntülerle fare BBTB modeli belirtilen farklı düzeylerde elde BBTB tahlil grafik gösterimi. Nano tanecikleri 110 nm çapında (NP110) ve konjuge FITC (yeşil) için eklenen kan yan BBTB hücrelerinin lizozomal sonda (LT-99, kırmızı) ile etiketli.  (1) Endothelial hücre, (2) Endothelial transcytosis nano tanecikleri membran (beyaz Kesikli çizgi), (3) astrocytes, gözenekler yoluyla, ve (4) hasta glioblastoma küreler grafiğin üzerinde tanımlanır ve karşılık gelen confocal Filmler (sağda). Lizozomal encapsulation (oklar) nano tanecikleri etkin transcytosis BBTB endotel ve astrocyte katmanları öneriyor. Tüp Bebek BBTB ile belirtilen nanopartikül geçirgenliği (B) miktar (n = 6). (C) miktar beyin dokusu içinde belirtilen nanopartikül yoğunluğu bölümleri, çıplak fareler Kaudal ven infüzyonu sonra 8 h (n = 3). (D) Confocal Filmler fare beyin doku bölümlerde 110 nm nano tanecikleri (NP110, kırmızı) ø dağılımını gösteren bir anti-fare CD31 antikor (yeşil) ile Etiketlenmiş. Oku nanopartikül transcytosis (sol panelde) vurgulamaktadır. Nano tanecikleri sayesinde onların yüzey üzerinde sunulan CooP hedefleme peptid Beyin tümör hücreleri (tümör, doğru kapı aynası) etrafında birikmiş. Hiçbir önemli posta beyin dokusunda (beyin) görülmektedir. (E) Confocal Filmler fare beyin doku bölümlerde bir anti-fare CD31 antikor (yeşil) etiketli 350 nm nano tanecikleri (NP350, kırmızı) ø dağılımı gösterir. Kan damarı Lümen muhafaza ve muhtemelen onların daha büyük çap NP110s. hücre çekirdeği karşılaştırıldığında nedeniyle BBB çapraz koyamadık NP350s noktasına ok uçları DAPI (mavi) ile counterstained. P < 0,01. P-değerleri hesaplanan iki uçlu, parametrik olmayan Mann-Whitney U testi kullanma. Hata çubukları standart sapmayı temsil eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59384/59384fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>fare BBTB taklit</td>
			<td>bEND3</td>
			<td>bEND3 + HIFko olarak</td>
			<td>bEND3 + GB</td>
			<td>bEND3 + HIFko olarak + GB</td>
			<td>İn vivo</td>
		</tr>
<tr>
<td>Geçirgenliği (10-6 cm/s)</td>
			<td>27.63</td>
			<td>6.74</td>
			<td>26,8</td>
			<td>10.83</td>
			<td>5,57</td>
		</tr>
<tr>
<td>SD (10-6 cm/s)</td>
			<td>3,45</td>
			<td>3.01</td>
			<td>7,99</td>
			<td>2,65</td>
			<td>2.19</td>
		</tr>
<tr>
<td>insan BBTB taklit</td>
			<td>HuAR2T</td>
			<td>HuAR2T + hIAs</td>
			<td>HuAR2T + GB</td>
			<td>HuAR2T + hIAs + GB</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Geçirgenliği (10-6 cm/s)</td>
			<td>104.92</td>
			<td>47.4</td>
			<td>89.08</td>
			<td>48.24</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>SD (10-6 cm/s)</td>
			<td>27,1</td>
			<td>14.32</td>
			<td>10.21</td>
			<td>13.07</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: in vitro belirlenen sodyum floresein (Na-Fl) geçirgenliği (cm / sn) cinsinden değerleri belirtilen ortak kültür sistemlerindeki ve içinde vivo NMRI çıplak farelerde. Veri temsili bir deneme (n = 3 fareler).

Watch this Scientific Journal Video about Predicting In Vivo Payloads Delivery using a Blood-brain Tumor-barrier in a Dish at JoVE.com

Predicting In Vivo Payloads Delivery using a Blood-brain Tumor-barrier in a Dish

Tahmin içinde Vivo Payloads bir kan-beyin tümör-engel bir tabak içinde kullanarak teslim

Uyuşturucu merkezi sinir sistemi tümörleri için hedefleme büyük bir sorun olduğunu. Burada kan-beyin tümör-bariyer fare ve/veya insan hücreleri kullanarak bir tüp bebek taklit üretmek ve onların ilgi merkezi sinir sistemi tümörü içinde vivo hedefleme öngörülebilirliği için tartışmak için bir protokol açıklayın.

Highly selective by nature, the blood-brain barrier (BBB) is essential for the brain homeostasis in physiological conditions. However, in the context of ...

Merkezi sinir sistemindeki tümörleri hedef alan yeni ilaçlar ve bileşikler geliştirmek için kan-beyin bariyerinden erişilebilirlik ve geçiş son derece önemlidir. Bileşiklerin sitotoksisitesi kolayca terapötik moleküller ile hücreleri kuluçka ile ölçülebilir rağmen, gerçekten beyinde tümör bölgesine gerçek teslimat hakkında bir şey söylemez. Bu sorunu gidermek için, bir çanak üzerinde in vitro kan-beyin tümör bariyerini yeniden açıklayan aşağıdaki protokolü geliştirdik.Murine veya insan kökenli ölümsüzleştirilmiş hücrelerin kullanımı bu tahlili çok esnek hale getirir. Ayrıca kolayca yüksek tekrarlanabilirlik ile bileşiklerin ekran düzinelerce kadar ölçeklenebilir. Buna ek olarak, bu yöntem preklinik modellere geçmeden önce bileşiklerin geçişinin hem niceliksel hem de görselleştirilmesini sağlar.Bu nedenle, yöntemimiz kısmen önceden kurulmuş hücre hatları kullanarak hayvan modelleri yerini alır. Hasta kaynaklı beyin tümörü hücrelerinin dahil edilmesi hastanın heterojenliğini tahlil ederken, kan-beyin bariyerini oluşturmak için ölümsüzleştirilmiş hücrelerin kullanılması sonuçların tekrarlanabilirliğini sağlar. Tamamen, Bu kan-beyin bariyermodeli ilaç difüzyon veya uyuşturucu araçların teslim tahlili için gerçekten ilginç bir araç sunuyor.Ekse'nin karşı tarafındaki hücrelerin tohumlanması, benzer kurulum kullanılarak diğer protokollerde sık sık tanımlanmamış bir manipülasyon gerektirdiğinden yöntemin görsel gösterimi çok önemlidir. Örneğin, ekleme baş aşağı yerleştirildiğinde astrositlerin yapışmasını elde görsel gösterimi son derece yararları. Steril bir hücre kültürü başlık altında, dikkatle steril PBS beş mililitre ile kültürlü astrositler yıkayın.PBS'yi nazikçe atmak için bir vakum pompası kullanın ve hücreleri ayırmak için beş dakika boyunca iki mililitre hücre ayrıştırma reaktifi ekleyin. Sonra, hücre bölünmesi reaktif aktivitesini inhibe etmek için damara steril komple astrosit hücre kültürü orta 10 mililitre ekleyin. Müstakil hücreleri damardan steril 15 mililitrelik bir tüpe aktarmak için steril serolojik pipet kullanın.Oda sıcaklığında üç dakika boyunca 250 kez g santrifüj. Bu arada, ekler yola. Steril altı kuyulu bir plakanın kapağına beyin tarafı ile ekler yerleştirmek için steril forceps kullanın.Santrifüj tamamlandığında, dikkatlice hücre süspansiyon supernatant atın ve abm artı bir mililitre içinde astrosit pelet yavaşça beş kez tüpün duvarında pelet borulama tarafından yeniden askıya. Daha sonra hücreleri sayın ve hücre süspansiyon yoğunluğunu kesici uç başına 400 mikrolitre ABM artı hücresayısına ayarlayın. Hücre süspansiyonuna kesici uç zarının beyin tarafının ortasına yerleştirin ve steril pipet ucuyla kılcal kuvvet kullanarak dikkatlice yayın.Kesici uçların beyin tarafı hala yukarıyken, altı kuyulu plakayı kesici uçların üzerine geri yerleştirin. Hücre yapışmasına izin vermek için plakayı ve kesici uçları, beyin tarafı yukarı, 37 santigrat derecede bir kuvöze ve %5 karbondioksite yerleştirin. Bundan sonra, altı kuyulu plakayı normal pozisyonuna geri döndürün, kesici uçlar şimdi kan tarafını yukarı yaslar.Orta ekleyin ve metin protokolünde belirtildiği gibi kuluçka devam edin. Steril bir hücre kültürü başlık altında, dikkatle steril PBS beş mililitre ile kültürlü endotel hücreleri yıkayın. PBS'yi nazikçe atmak için bir vakum pompası kullanın ve hücreleri ayırmak için beş dakika boyunca iki mililitre hücre ayrıştırma reaktifi ekleyin.Sonra, hücre bölünmesi reaktif aktivitesini inhibe etmek için damara steril komple endotel hücre kültürü orta 10 mililitre ekleyin. Müstakil hücreleri damardan steril 15 mililitrelik bir tüpe aktarmak için steril serolojik pipet kullanın. Oda sıcaklığında üç dakika boyunca 250 kez g santrifüj.Bundan sonra, supernatant atın ve eBM artı bir mililitre içinde endotel hücre pelet yavaş yavaş beş kez tüpün duvarında hücre süspansiyon pipetting tarafından yeniden askıya. Hücreleri sayın ve hücre süspansiyon yoğunluğunu 200'e ayarlayın, serum ve vasküler endotelyal büyüme faktörü-A kesici uç başına yoksun 2,5 mililitre endotel hücre kültüründe 000 hücre. Kesici uçları içeren plakayı alın.Dikkatle kan tarafında orta atın ve endotel hücre süspansiyon 2.5 mililitre ile değiştirin. Daha sonra, kuvöze plaka dönmek ve endotel hücrelerinin membrana uymak için izin vermek için bir gecede bırakın. Ertesi gün, her kuyuya önceden ısıtılmış ÜÇ mililitre ABM-eksi aktararak altı kuyulu bir tabak hazırlayın.Steril çerteler kullanarak, endotel tam ortasını kan tarafından dikkatlice atmak için uçları dikkatlice takın ve kesici ucu ABM eksi içeren yeni plakaya yerleştirin. Sonra, EBM-eksi 2,5 mililitre ekleyin. Kesici uçları en az fiziksel rahatsızlık veya sıcaklık değişimi yle birlikte kuvözde beş gün bekletin.Aktarım günü, ortamı değiştirin. İmmünofloresan görüntüleme için, poli-D-lizin iki mililitre içeren altı kuyuplaka her kuyu içine dört yuvarlak steril borosilikat kapakları yerleştirin. 30 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya yat.Bu arada, dikkatle hücre kültür damarından 15 mililitrelik steril tüp tümör küreleri aktarmak için steril bir serolojik pipet kullanın. Üç dakika boyunca 250 kez g tümör küreleri santrifüj. Supernatant atın ve yavaşça GBM-eksi bir mililitre küreler yeniden askıya.Hücreleri sayın ve hücre yoğunluğunu mililitre başına 10,000 küre veya 100,000 hücreGBM eksi olarak ayarlayın. Daha sonra, poli-D-lizin kuyulardan atın ve steril PBS ile kuyuları üç kez durulayın. Tümör küresel süspansiyon üç mililitre ile plaka her iyi tohum, ve tümör hücre süspansiyon üzerine BBTB taklit ile ekler transfer.Bir gecede 37 santigrat derecede %5 karbondioksit ile inkübe edin ve tahminin kan ve beyin tümörü taraflarının dengeye gelmesini sağlar. Ertesi gün, EBM-eksi molekülleri ile takviye ile kan tarafında medya değiştirin, ilaçlar, ya da ilgi nano tanecikleri. Daha önce açıklandığı gibi doğrudan niceleme için zaman içinde örnekleri toplayın.İlk olarak, BBTB mimik kan ve beyin taraflarından hem kan ve beyin tarafında orta 100 mikrolitre toplamak ve sonraki floresan ölçümleri için ayrı bir düz dipli, siyah, 96-iyi plaka her transfer. Daha sonra, EBM-eksi sodyum floresan 50 mikromolar çözelti hazırlamak, iyi başına 2,5 mililitre hazırlamak için emin olun. Bu çözeltiyi 37 dereceye ısıtın ve kesici uçların kan tarafındaki ortamı bu sodyum floresan çözeltisini içeren ortamla değiştirin.Ortam değiştirilir değiştirilmez bir zamanlayıcı başlatın. Kesici uçların kan ve beyin taraflarından beş dakika, 30 dakika, 60 dakika ve 120 dakika boyunca 100 mikrolitre medya yı dikkatlice toplayın. Her numuneyi uygun siyah, 96 kuyulu plakanın ayrı kuyularına aktarın.Toplanan örneklerden floresan ölçmek için bir plaka okuyucu kullanın. İlk olarak, önceden ısıtılmış ortamda uygun çalışma konsantrasyonuna lizozom floresan boya seyreltin. Bunu hücrelere ekleyin ve 45 dakika boyunca %5 karbondioksitle 37 derecede kuluçkaya yatırın.Daha sonra hücreleri buz gibi PBS ile üç kez durulayın. PBS atın ve eklemek için kuyulara buz gibi% 4 paraformaldehit üç mililitre ekleyin ve 2.5 mililitre. 10 dakika boyunca buzda kuluçkaya yat.Bundan sonra, paraformaldehit atın ve PBS ile hücreleri üç kez durulayın. PBS'yi çıkarın ve distile suda mililitre başına bir mikrogramlık bir mikrogramın son konsantrasyonunda dapi çözeltisi kullanarak hücre çekirdeklerini lekeleyin. Yedi dakika oda sıcaklığında kuluçkaya yat.Sonra, DAPI çıkarın ve distile su ile üç kez membranlar yıkayın. Membranı dikkatlice kesin, distile suyu çıkarın ve cam bir mikroskop kaydırağı üzerine bir damla montaj ortamının üzerine yerleştirin. Membranın diğer tarafına başka bir damla montaj ortamı ekleyin ve borosilikat kapak camı ile dikkatlice kapatın.Bu çalışmada, endotel hücreleri in vitro kurulumda kan-beyin tümörü bariyerbenzeri bir arayüz oluşturmak için astrositlerle birlikte kültürlendi. murine BBTB mimik konfokal görüntüleme bEND3 sıkı kavşak proteinleri zonula oklüden-1 ve claudin-5 ekspresyonu ve hücresel lokalizasyonu gösterir. Endotel hücreleri ve astrositler arasındaki temaslar, bu iki proteinin bEND3 monokültürlerine göre endotel hücre-hücre temaslarına taşınmasına neden olur.Membranın beyin tarafındaki GFAP ifade eden astrositleri görselleştirmek için immünororesans boyama kullanarak, membran aracılığıyla endotel hücrelerine temas eden astrositik süreçleri ve son ayakları gözlemlemek ve incelemek mümkündür. In vitro BBTB taklitlerinin geçirgenlik değerlerini in vitro kan-beyin bariyeri ile karşılaştırmak için, sodyum floresan gerçek zamanlı difüzyon çıplak fareler implante bir kafatası penceresi ile görüntülenir. Floresan stereo mikroskop kullanılarak, ana pial kan damarlarından kaynaklanan kan damarı kılcal damarlarından sodyum floresan difüzyonu probun sistemik enjeksiyonundan önce, sırasında ve sonrasında kaydedilir.Hasta kaynaklı glioblastoma kürelerini hedef alan nano partiküllerin transistozu, bu BBTB miminin kan tarafından beyin tarafına geçen bileşiklerin geçişini görselleştirmek için nasıl kullanılabileceğini göstermek için karşılaştırılır. NP110 ile ilişkili floresan sinyali endotel hücreleri, astrositler ve tümör hücrelerindeki lizozomlarla birlikte lokalize olur. Buna ek olarak, NP110s endotel hücreleri ve astrositler arasında tespit edilir, kesici uç membran gözenekleri geçerek.NP110'ların geçişi, hem kan hem de beyin tarafından toplanan örneklerden alınan floresan ölçülerek ölçülür ve bu değerler 350 nanometre olan belirlenen nano taneciklerle karşılaştırılır. Görüldüğü gibi, sadece NP110s BBTB mimikler geçmek edebiliyoruz, NP350 kan tarafında kaldı, bu nano tanecikleri için daha düşük geçirgenlik değerleri ile sonuçlanan. Kesici ucu dikkatle ele alın ve membrana doğrudan temas etmeden kesici nin beyin tarafına astrosit hücre süspansiyonu dikkatlice yayıldı.Membranda herhangi bir hasar sızıntısına neden olur. Bu yöntem, periferik olarak yönetilen yüklerin beyin teslimi sorusuna cevap vermek için uyarlanabilir. Daha büyük membran gözenekleri ile farklı ekler kullanarak, hücre ekstravazasyon çalışması da mümkündür.Bu teknik, diğer hücresel engelleri taklit etmek için farklı hücre türleri kullanılarak değiştirilebilir. Ayrıca, kanserle mücadele de ilaç doğrulamaiçin kullanılan laboratuvar hayvanlarının sayısını azaltmayı amaçlayan daha sorumlu ve etik bir araştırmanın da önünü açıyor. Paraformaldehitin çok toksik bir kimyasal olduğunu ve buna göre ele alınması gerektiğini lütfen unutmayın.Ayrıca, ekler membranlar ayıklamak için keskin bir neşter kullanırken dikkatli olun.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

<em&gt; Drosophila</em&gt; Hayali Disk Tümör Modeli: Genetik Mozaikler kullanma Gen İfade ve Tümör invazivliğinin Görselleştirme ve

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

Vivo EPR pH, pO2, Redox durumu ve fosfat konsantrasyonları ve glutatyon tümör Microenvironment olarak değerlendirilmesi

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

Fluorescence Molecular Tomography for In Vivo Imaging of Glioblastoma Xenografts

Fluorescence Molecular Tomography for In Vivo Imaging of Glioblastoma Xenografts

Floresans moleküler tomografi Glioblastoma Xenografts in Vivo içinde görüntüleme için

Tumorigenicity is the capability of cancer cells to form a tumor mass. A widely used approach to determine if the cells are tumorigenic is by injecting ...

In Vivo Inhibition of MicroRNA to Decrease Tumor Growth in Mice

Farelerde Tümör Büyümesini Azaltmak için MikroRNA'nın Vivo İnhibisyonu

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression through their ability to destabilize mRNA and inhibit translation of target mRNAs. An ...

Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs

Kuyruk Ven Metastaz Tahlilleri ve Gerçek Zamanlı Vivo Görüntüleme Kombine Kullanımı Meme Kanseri Metastatik Kolonizasyon ve Yük Akciğerlerde Quantify için

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification ...

In Vivo Targeting of Xenografted Human Cancer Cells with Functionalized Fluorescent Silica Nanoparticles in Zebrafish

Zebrabalığında Fonksiyonel Floresan Silika Nano partikülleri ile Ksenogreftli İnsan Kanser Hücrelerinin Vivo Hedeflemesinde

Developing nanoparticles capable of detecting, targeting, and destroying cancer cells is of great interest in the field of nanomedicine. In vivo animal ...

Using Computer-based Image Analysis to Improve Quantification of Lung Metastasis in the 4T1 Breast Cancer Model

4T1 Meme Kanseri Modelinde Akciğer Metastazının Nicelleştirilmesini Geliştirmek Için Bilgisayar Tabanlı Görüntü Analizinin Kullanılması

Breast cancer is a devastating malignancy, accounting for 40,000 female deaths and 30% of new female cancer diagnoses in the United States in 2019 alone. ...

Patient-Derived Tumor Explants As a "Live" Preclinical Platform for Predicting Drug Resistance in Patients

Hasta Kaynaklı Tümör, Hastalarda İlaç Direncini Tahmin Etmek İçin "Canlı" Preklinik Bir Platform Olarak Eksplantlar

An understanding of drug resistance and the development of novel strategies to sensitize highly resistant cancers rely on the availability of suitable ...

Evaluation of the In vivo Antitumor Activity of Polyanhydride IL-1&#945; Nanoparticles

Evaluation of the In vivo Antitumor Activity of Polyanhydride IL-1ÃƒÅ½Ã‚Â± Nanoparticles

Polianhidrit IL-1α Nanopartiküllerinin In vivo Antitümör Aktivitesinin Değerlendirilmesi

Cytokine therapy is a promising immunotherapeutic strategy that can produce robust antitumor immune responses in cancer patients. The proinflammatory ...

Longitudinal Intravital Imaging Through Clear Silicone Windows

Şeffaf Silikon Pencerelerle Uzunlamasına İntravital Görüntüleme

Intravital microscopy (IVM) enables visualization of cell movement, division, and death at single-cell resolution. IVM through surgically inserted imaging ...