Name: design of cecal ligation and puncture and intranasal infection dual model of sepsis-induced immunosuppression
Uploaded: 2019-06-15T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Design of Cecal Ligation and Puncture and Intranasal Infection Dual Model of Sepsis-Induced Immunosuppression at JoVE.com

Questo lavoro è stato supportato da National Institutes of Health Grants R01 AI138203-01, AI109317-04, AI101973-01 e AI097532-01A1 a M. W. Le strutture principali dell'Università del Dakota del Nord sono state supportate da sovvenzioni NIH (INBRE P20GM103442 e COBRE P20GM113123). Questo lavoro è stato sostenuto anche dal Key Program of National Nature Science Foundation of China (81530063) a Jianxin Jiang. I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio, nella raccolta e nell'analisi dei dati, nella decisione di pubblicazione o nella preparazione del manoscritto. Ringraziamo Marvin Leier (Center for Rural Health, University of North Dakota) per aver fatto il video.

Tutti i metodi qui descritti sono stati eseguiti in conformità con il National Institute of Health Guide for Care and Use of Laboratory Animals e approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali da parte dell'Università del Dakota del Nord (IACUC).
1. Legatura e puntura Cecal
NOTA: I topi femminili C57BL/6 (peso, 18-22 g; età, 6-8 settimane) sono suddivisi in sei gruppi: gruppo di controllo (Ctrl), gruppo di infezioni (SA per S. aureus),</...

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	<li>Singer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Third+International+Consensus+Definitions+for+Sepsis+and+Septic+Shock+(Sepsis-3).">The Third International Consensus Definitions for Sepsis and Septic Shock (Sepsis-3).</a> JAMA. 315 (8), 801-810 (2016).</li><li>Delano, M. J., Ward, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immune+system's+role+in+sepsis+progression,+resolution,+and+long-term+outcome.">The immune system's role in sepsis progression, resolution, and long-term outcome.</a> Immunological Reviews. 274 (1), 330-353 (2016).</li><li>Mayr, F. B., Yende, S., Angus, D. 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Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atg7+Deficiency+Intensifies+Inflammasome+Activation+and+Pyroptosis+in+Pseudomonas+Sepsis.">Atg7 Deficiency Intensifies Inflammasome Activation and Pyroptosis in Pseudomonas Sepsis.</a> Journal of Immunology. 198 (8), 3205-3213 (2017).</li><li>Zanotti-Cavazzoni, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+resuscitation+influences+cardiovascular+performance+and+mortality+in+a+murine+model+of+sepsis.">Fluid resuscitation influences cardiovascular performance and mortality in a murine model of sepsis.</a> Intensive Care Medicine. 35 (4), 748-754 (2009).</li><li>Chin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+macromolecular+approach+to+eradicate+multidrug+resistant+bacterial+infections+while+mitigating+drug+resistance+onset.">A macromolecular approach to eradicate multidrug resistant bacterial infections while mitigating drug resistance onset.</a> Nature Communications. 9 (1), 917 (2018).</li><li>Nascimento, D. 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Come modello standard d'oro per la ricerca sulla sepsi, il CLP ha una combinazione di tre insulti, tra cui il trauma tissutale causato dalla laparotomia, la necrosi dovuta alla legatura del cecum e l'infezione a causa di perdite microbiche che causano peritonite con traslocazione di batteri nel sangue8. Pertanto, CLP imita la complessità della sepsi umana meglio di molti altri modelli. Tuttavia, una delle principali limitazioni dell'attuale modello CLP è l'incapacità di riflettere la fase più ...

Sepsis avvia un complesso gioco di processi pro-infiammatori e antinfiammatori dell'ospite ed è caratterizzato da una risposta iperinfiammatoria e dalla conseguente disfunzione immunitaria1,2. La sepsi rappresenta una priorità sanitaria globale e causa un elevato numero di decessi nelle unità di terapia intensiva (ICU)3. Si stima che l'incidenza della sepsi superi i 30 milioni di casi in tutto il mondo all'anno, con tassi di mortalità fino al 30% nonostante i progressi nella gestione delle unità di terapia intensiva4,5. Nel 2017, l'Organizzazione Mondiale della Sanità ha adottato una risoluzione per migliorare la prevenzione, la diagnosi e la gestione di questa malattia mortale5. Tuttavia, studi recenti hanno dimostrato che la morte non deriva da infezione primaria in pazienti settici gravi, ma piuttosto da infezione nosocomiale secondaria (in particolare polmonite) causata dall'immunosoppressione6,7 . Pertanto, è urgente comprendere i meccanismi del perché i pazienti settici sviluppano infezioni secondarie e scoprono trattamenti più efficaci. Qui, viene descritto un doppio modello, noto anche come modello a doppio colpo, per studiare il fenomeno immunosoppressivo che si verifica nei pazienti con sepsi prolungata.
Poiché il modello sperimentale gold standard nella ricerca sulla sepsi polimicrobica, la legatura e la puntura della ceca (CLP) è un intervento chirurgico caratterizzato da legatura e perforazione del cecum, che contribuisce alla peritonite polimicrobica e alla sepsi8,9 . Il processo patofisiologico e i profili di citochina, insieme alla cinetica e alla grandezza, sono simili alla sepsi clinica. La posizione della legatura, la dimensione dell'ago utilizzato per la puntura e il numero di forature del ceca sono fattori importanti che influenzano la mortalità dopo il CLP.
La polmonite nosocomiale è la principale causa di mortalità tra i pazienti gravemente malati di sepsi. Il principale tipo di organismi che causano sepsi grave sono lo Staphylococcus aureus (20,5%), le specie Pseudomonas (19,9%), le Enterobacteriacae (principalmente E. coli, 16,0%) e i funghi (19%). Nel frattempo, studi recenti hanno suggerito una crescente incidenza di organismi gram-positivi, che ora sono quasi altrettanto comuni delle infezioni gram-negative3.
Il metodo descritto in questo protocollo coinvolge CLP, eseguito come il "primo colpo" per indurre peritonite polimicrobica subletale, che manifesta una condizione di immunosoppressione. La procedura comporta anche la successiva instillazione intranasale di S. aureus come il "secondo colpo" per fornire una piattaforma di ricerca clinicamente rilevante.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1009px;" width="1007">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">21 G 1 &#189; Needle</td>
			<td style="width:191px;">BD</td>
			<td style="width:201px;">BD305167</td>
			<td style="width:263px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ACK lysing buffer</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A10492-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:22px;width:355px;">Anti-mouse CD11b antibody</td>
			<td style="width:191px;">Biolegend</td>
			<td style="width:201px;">101201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:355px;">Anti-mouse Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) antibody</td>
			<td style="width:191px;">Biolegend</td>
			<td style="width:201px;">108401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">C57BL/6 mice&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Harlan (Indianapolis)</td>
			<td style="width:201px;">C57BL/6NHsd</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Desk light</td>
			<td style="width:191px;">General Supply</td>
			<td style="width:201px;">General Supply</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Disinfecting wipes</td>
			<td style="width:191px;">Clorox</td>
			<td style="width:201px;">B07NV5JMCS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:22px;width:355px;">Electric razor</td>
			<td style="width:191px;">General Supply</td>
			<td style="width:201px;">General Supply</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:22px;width:355px;">ELISA kits (mouse IL-1&#946;, IL-6 and TNF&#945;)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:201px;">88-7013, 88-7064, and 88-7324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Iodine</td>
			<td style="width:191px;">Dynarex</td>
			<td style="width:201px;">B003U463PY</td>
			<td>PVP Iodine Wipes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Ketamine</td>
			<td style="width:191px;">FORT DODGE</td>
			<td style="width:201px;">NDC 0856-2013-01</td>
			<td>Amine hydrochloride injection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Laboratory scale</td>
			<td style="width:191px;">General Supply</td>
			<td style="width:201px;">General Supply</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">LB Agar, Miller</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:201px;">BP1425-500</td>
			<td>Molecular genetics, powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Micropipette</td>
			<td style="width:191px;">ErgoOne</td>
			<td style="width:201px;">7100-1100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Normal saline</td>
			<td style="width:191px;">General Supply</td>
			<td style="width:201px;">General Supply</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Polylined towel</td>
			<td>CardinalHealth, Convertors</td>
			<td>3520</td>
			<td style="width:263px;">Surgical drape, sterile, for single use only</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:22px;width:355px;">Silk suture, 4-0</td>
			<td style="width:191px;">DAVIS &#38; GECK</td>
			<td style="width:201px;">1123-31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Small animal needle holder</td>
			<td style="width:191px;">General Supply</td>
			<td style="width:201px;">General Supply</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Small animal surgery scissors</td>
			<td style="width:191px;">General Supply</td>
			<td style="width:201px;">General Supply</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Small animal surgical forceps</td>
			<td style="width:191px;">General Supply</td>
			<td style="width:201px;">General Supply</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Staphylococcus aureus</td>
			<td>ATCC</td>
			<td style="width:201px;">13301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Warm pad</td>
			<td style="width:191px;">General Supply</td>
			<td style="width:201px;">General Supply</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Xylazine</td>
			<td style="width:191px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:201px;">7361-61-7</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

design of cecal ligation and puncture and intranasal infection dual model of sepsis-induced immunosuppression

La sepsi, un'infezione pericolosa per la vita grave e complicata, è caratterizzata da uno squilibrio tra risposte pro e antinfiammatorie in più organi. Con lo sviluppo delle terapie, la maggior parte dei pazienti sopravvive alla fase iperinfiammatoria, ma progredisce verso una fase immunosoppressiva, che aumenta l'emergere di infezioni secondarie. Pertanto, una migliore comprensione della patogenesi alla base delle infezioni ospedaliere secondarie acquisite in ospedale nella fase immunosoppressiva durante la sepsi è di enorme importanza. Segnalato qui è un modello per testare i risultati infettivi creando infezioni a doppio colpo nei topi. Una procedura chirurgica standard viene utilizzata per indurre la peritonite polimicrobica mediante legatura e puntura (CLP) e seguita da un'infezione intranasale dello Staphylococcus aureus per simulare la polmonite che si verifica nella soppressione immunitaria che si vede frequentemente in pazienti settici. Questo doppio modello può riflettere lo stato immunosoppressivo che si verifica in pazienti con sepsi prolungata e suscettibilità all'infezione secondaria da polmonite nosocomiale. Quindi, questo modello fornisce un semplice approccio sperimentale per studiare la fisiopatologia della polmonite batterica secondaria indotta dalla sepsi, che può essere utilizzata per scoprire nuovi trattamenti per la sepsi e le sue complicazioni.

A seconda della progettazione e delle procedure sperimentali, i topi C57BL/6 sono stati sottoposti a CLP e, dopo 3 giorni, sono stati somministrati batteri per via intranasale (Figura1). Come mostrato nella Figura 2, i topi hanno cominciato a morire a 12 h dopo l'induzione della peritonite. Due topi del gruppo CLP-SA e tre topi del gruppo CLP-NS sono morti prima dell'instillazione intranasale S. aureus. Nessuna mortalit...

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Design of Cecal Ligation and Puncture and Intranasal Infection Dual Model of Sepsis-Induced Immunosuppression

Questo protocollo descrive le tecniche per misurare gli esiti infettivi alla base delle infezioni ospedaliere secondarie acquisite in ospedale nella condizione immunosoppressiva, prima istituendo topi di legatura/foratura della ceca e poi sfidandoli con infezioni intranasali creare un modello clinicamente rilevante di sepsi immunosoppressione.

Progettazione del doppio modello di legatura e puntura ceca dell'infezione intranasale dell'immunosoppressione indotta dalla sepsi

Sepsis, a severe and complicated life-threatening infection, is characterized by an imbalance between pro- and anti-inflammatory responses in multiple ...

Preparare il mouse per l'intervento chirurgico. Radere i quadranti inferiori dell'addome usando un rasoio e disinfettare l'area con iodio. Posizionare il mouse su una superficie di lavoro pulita sulla schiena con la testa rivolta lontano dall'operatore.Fai un'incisione longitudinale della pelle lunga circa mezzo centimetro nell'addome inferiore sinistro. Fare attenzione a non penetrare nella cavità peritoneale. Usa piccole forbici per estendere l'incisione di circa uno o due centimetri.Fare un'incisione intramuscolare per ottenere l'accesso alla cavità peritoneale. Nella maggior parte dei casi, il cieco si trova sul lato sinistro dell'addome. Isolare il cieco.Utilizzando forcep smussate e anatomiche, esporre delicatamente e accuratamente il cieco attraverso l'incisione. Il quarto passo è la legazione. La posizione della legatura sul cieco determina il livello di gravità della sepsi.Legare circa il 75% del cieco induce una sepsi grave. Legare il 50% del cieco induce sepsi di medio livello. Mentre legare il 25% o meno del cieco si tradurrà in sepsi minore.Ligate il cieco nella posizione designata. Assicurarsi di non ligare la valvola ileocecale. Il quinto passo è quello di forare il cieco.Usando un ago, perforare il cieco con una singola puntura attraverso e attraverso la foratura a metà strada tra la legatura e la punta del cieco. Assicurati di non forare alcun vasi sanguigni. Per assicurarsi che ci fosse una puntura completa, estrudere una piccola goccia di feci da entrambi i fori dell'ago.Sostituire con cura il cieco nella cavità addominale. Chiudere la muscolatura addominale applicando semplici suture da corsa e chiudere la pelle. Pulire la pelle con iodio.Iniettare al topo una soluzione salina preri warmed per rianimare. Riposizionare il mouse nella gabbia con accesso illimitato a cibo e acqua. Dopo circa tre giorni dalla legatura cecale e dalla puntura o dalla procedura CLP, sottosenziamo il topo a un secondo colpo con un'infezione intranasale per stimolare la polmonite che spesso si verifica in sepsi.Avvicinati al collo del mouse da dietro, senza intoppi e delicatamente. Il pollice e l'indice della mano sinistra formano una posizione a forma di U. Tieni il collo immediatamente dietro le orecchie in modo che la testa del mouse sia completamente contenuta.Introdurre l'infezione intranasale. Utilizzando una pipetta da 100 microliter, infondere il ceppo di stafilococco aureo per via intranasale. Tenendo il mouse in posizione verticale, far cadere lentamente da due a tre microlitri della soluzione batterica in entrambe le narici del topo.Sollevare il mouse su e giù con la testa su e la coda verso il basso per aiutare la soluzione batterica a entrare nella trachea. Sollevare rapidamente il mouse abbassarlo delicatamente e lentamente. Ripetere l'instillazione 15 volte o fino a quando non viene instillata tutta la soluzione batterica.L'ultimo passaggio è completare la procedura. Appoggiare il mouse sulla biancheria da letto angolata con un angolo di circa 35 gradi per recuperare. Assicurarsi che il mouse sia sulla schiena con la testa sdraiata.Guarda il mouse per assicurarti che sia completamente recuperato dall'anestesia e dalla procedura. Dopo aver appiattito la biancheria da letto, riposizionare il mouse nella gabbia con accesso illimitato a cibo e acqua. I topi hanno iniziato a morire circa 12 ore dopo l'induzione della peritonite.La mortalità era molto più alta per i topi con CLP prima di una polmonite. Tre giorni dopo l'intervento chirurgico, i topi CLP avevano più mortalità con una somministrazione intranasale di stafilococco aureo. I livelli di citochine pro-infiammatorie del siero sono aumentati significativamente a 24 ore dopo l'instillazione batterica nei topi di sepsi rispetto ai topi che avevano CLP da soli o ai topi operati da Sham con un secondo colpo.Tuttavia, i topi a doppio colpo hanno mostrato una significativa diminuzione dei livelli di citochina del fluido BAL rispetto alla chirurgia SA e Sham più topi SA. Quindi il CLP compromette la difesa dell'ospite e aumenta la suscettibilità alle infezioni. Questo modello a doppio colpo è uno strumento prezioso per comprendere i meccanismi molecolari per l'interazione ospite-patogeno, che possono aprire la strada allo sviluppo di nuovi farmaci efficaci e altre terapie per le infezioni da superbug.

Research

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