Name: design of cecal ligation and puncture and intranasal infection dual model of sepsis-induced immunosuppression
Uploaded: 2019-06-15T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Design of Cecal Ligation and Puncture and Intranasal Infection Dual Model of Sepsis-Induced Immunosuppression at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Subvenciones de Salud R01 AI138203-01, AI109317-04, AI101973-01, y AI097532-01A1 a M. W. Las instalaciones principales de la Universidad de Dakota del Norte contaron con el apoyo de subvenciones de NIH (INBRE P20GM103442 y COBRE P20GM113123). Este trabajo también fue apoyado por el Programa Clave de la Fundación Nacional de Ciencias de la Naturaleza de China (81530063) a Jianxin Jiang. Los funderos no tenían ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito. Agradecemos a Marvin Leier (Centro de Salud Rural, Universidad de Dakota del Norte) por hacer el video.

Todos los métodos descritos aquí fueron realizados de acuerdo con el Instituto Nacional de La Guía de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Dakota del Norte (IACUC).
1. Ligadura cecal y punción
NOTA: Los ratones hembra C57BL/6 (peso, 18-22 g; edad, 6-8 semanas) se dividen aleatoriamente en seis grupos: grupo de control (Ctrl), grupo de infección (SA para <e...

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	<li>Singer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Third+International+Consensus+Definitions+for+Sepsis+and+Septic+Shock+(Sepsis-3).">The Third International Consensus Definitions for Sepsis and Septic Shock (Sepsis-3).</a> JAMA. 315 (8), 801-810 (2016).</li><li>Delano, M. J., Ward, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immune+system's+role+in+sepsis+progression,+resolution,+and+long-term+outcome.">The immune system's role in sepsis progression, resolution, and long-term outcome.</a> Immunological Reviews. 274 (1), 330-353 (2016).</li><li>Mayr, F. B., Yende, S., Angus, D. 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Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atg7+Deficiency+Intensifies+Inflammasome+Activation+and+Pyroptosis+in+Pseudomonas+Sepsis.">Atg7 Deficiency Intensifies Inflammasome Activation and Pyroptosis in Pseudomonas Sepsis.</a> Journal of Immunology. 198 (8), 3205-3213 (2017).</li><li>Zanotti-Cavazzoni, S. 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Como modelo estándar de oro para la investigación de la sepsis, CLP tiene una combinación de tres insultos, incluyendo traumatismo tisular causado por la laparotomía, necrosis debido a la ligadura del cecum, y la infección como resultado de la fuga microbiana que causa peritonitis con translocación de bacterias en la sangre8. Por lo tanto, CLP imita la complejidad de la sepsis humana mejor que muchos otros modelos. Sin embargo, una limitación importante del modelo CLP actual es la incapacid...

La sepsis inicia una compleja interacción de procesos proinflamatorios y antiinflamatorios delhuésped y se caracteriza por una respuesta hiperinflamatoria y disfunción inmune posterior 1,2. La sepsis representa una prioridad sanitaria mundial y causa un altonúmero de muertes en las unidades de cuidados intensivos (ICU) 3. Se estima que la incidencia de sepsis supera los 30 millones de casos en todo el mundo al año, con tasas de mortalidad de hasta el 30% a pesar de los avances en la gestión de la UCI4,5. En 2017, la Organización Mundial de la Salud adoptó una resoluciónpara mejorar la prevención, el diagnóstico y la gestión de esta enfermedad mortal 5. Sin embargo, estudios recientes han ilustrado que la muerte no es el resultado de una infección primaria en pacientes sépticos graves, sino más bien de una infección nosocomial secundaria (particularmente neumonía) causada por la inmunosupresión6,7 . Por lo tanto, la comprensión de los mecanismos de por qué los pacientes sépticos desarrollan infección secundaria y descubrir tratamientos más eficaces son urgentemente necesarios. En este caso, se describe un modelo dual, también conocido como modelo de doble hit, para estudiar el fenómeno inmunosupresor que se produce en pacientes con sepsis prolongada.
Como el modelo experimental estándar de oro en la investigación sobre sepsis polimicrobiana, ligadura y punción cecal (CLP) es una cirugía caracterizada por ligadura de cecum y perforación, que contribuye a la peritonitis polimicrobiana y la sepsis8,9 . El proceso fisiopatológico y los perfiles de citoquinas, junto con la cinética y la magnitud, son similares a la sepsis clínica. La posición de la ligadura, el tamaño de la aguja utilizada para la punción y el número de pinchazos de cecal son factores principales que afectan la mortalidad después de la CLP.
La neumonía nosocomial es la principal causa de mortalidad entre los pacientes en estado crítico con sepsis. El principal tipo de organismos que causan sepsis graves incluye Staphylococcus aureus (20,5%), pseudomonas (19,9%), Enterobacteriacae (principalmente E. coli, 16,0%) y hongos (19%). Mientras tanto, estudios recientes han sugerido una creciente incidencia de organismos grampositivos, que ahora son casi tan comunes como las infecciones gramnegativas3.
El método descrito en este protocolo implica CLP, realizado como el "primer golpe" para inducir peritonitis polimicrobiana subletal, que manifiesta una condición de inmunosupresión. El procedimiento también implica la posterior inslación intranasal de S. aureus como el "segundo golpe" para proporcionar una plataforma de investigación clínicamente relevante.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1009px;" width="1007">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">21 G 1 &#189; Needle</td>
			<td style="width:191px;">BD</td>
			<td style="width:201px;">BD305167</td>
			<td style="width:263px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ACK lysing buffer</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A10492-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:22px;width:355px;">Anti-mouse CD11b antibody</td>
			<td style="width:191px;">Biolegend</td>
			<td style="width:201px;">101201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:355px;">Anti-mouse Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) antibody</td>
			<td style="width:191px;">Biolegend</td>
			<td style="width:201px;">108401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">C57BL/6 mice&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Harlan (Indianapolis)</td>
			<td style="width:201px;">C57BL/6NHsd</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Desk light</td>
			<td style="width:191px;">General Supply</td>
			<td style="width:201px;">General Supply</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Disinfecting wipes</td>
			<td style="width:191px;">Clorox</td>
			<td style="width:201px;">B07NV5JMCS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:22px;width:355px;">Electric razor</td>
			<td style="width:191px;">General Supply</td>
			<td style="width:201px;">General Supply</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:22px;width:355px;">ELISA kits (mouse IL-1&#946;, IL-6 and TNF&#945;)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:201px;">88-7013, 88-7064, and 88-7324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Iodine</td>
			<td style="width:191px;">Dynarex</td>
			<td style="width:201px;">B003U463PY</td>
			<td>PVP Iodine Wipes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Ketamine</td>
			<td style="width:191px;">FORT DODGE</td>
			<td style="width:201px;">NDC 0856-2013-01</td>
			<td>Amine hydrochloride injection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Laboratory scale</td>
			<td style="width:191px;">General Supply</td>
			<td style="width:201px;">General Supply</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">LB Agar, Miller</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:201px;">BP1425-500</td>
			<td>Molecular genetics, powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Micropipette</td>
			<td style="width:191px;">ErgoOne</td>
			<td style="width:201px;">7100-1100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Normal saline</td>
			<td style="width:191px;">General Supply</td>
			<td style="width:201px;">General Supply</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Polylined towel</td>
			<td>CardinalHealth, Convertors</td>
			<td>3520</td>
			<td style="width:263px;">Surgical drape, sterile, for single use only</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:22px;width:355px;">Silk suture, 4-0</td>
			<td style="width:191px;">DAVIS &#38; GECK</td>
			<td style="width:201px;">1123-31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Small animal needle holder</td>
			<td style="width:191px;">General Supply</td>
			<td style="width:201px;">General Supply</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Small animal surgery scissors</td>
			<td style="width:191px;">General Supply</td>
			<td style="width:201px;">General Supply</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Small animal surgical forceps</td>
			<td style="width:191px;">General Supply</td>
			<td style="width:201px;">General Supply</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Staphylococcus aureus</td>
			<td>ATCC</td>
			<td style="width:201px;">13301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Warm pad</td>
			<td style="width:191px;">General Supply</td>
			<td style="width:201px;">General Supply</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Xylazine</td>
			<td style="width:191px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:201px;">7361-61-7</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

design of cecal ligation and puncture and intranasal infection dual model of sepsis-induced immunosuppression

La sepsis, una infección grave y complicada potencialmente mortal, se caracteriza por un desequilibrio entre las respuestas pro y antiinflamatorias en múltiples órganos. Con el desarrollo de terapias, la mayoría de los pacientes sobreviven a la fase hiperinflamatoria, pero progresan a una fase inmunosupresora, lo que aumenta la aparición de infecciones secundarias. Por lo tanto, la mejora de la comprensión de la patogénesis subyacente a las infecciones hospitalarias secundarias en la fase inmunosupresora durante la sepsis es de enorme importancia. Aquí se informa un modelo para probar los resultados infecciosos mediante la creación de infecciones de doble impacto en ratones. Un procedimiento quirúrgico estándar se utiliza para inducir peritonitis polimicrobiana por ligadura y punción de cecal (CLP) y seguido de infección intranasal de Staphylococcus aureus para simular la neumonía que ocurre en la supresión inmune que se ve con frecuencia en pacientes sépticos. Este modelo dual puede reflejar el estado inmunosupresor que ocurre en pacientes con sepsis prolongada y susceptibilidad a la infección secundaria por neumonía nosocomial. Por lo tanto, este modelo proporciona un enfoque experimental simple para investigar la fisiopatología de la neumonía bacteriana secundaria inducida por sepsis, que puede ser utilizada para descubrir nuevos tratamientos para la sepsis y sus complicaciones.

Dependiendo del diseño experimental y los procedimientos, los ratones C57BL/6 fueron sometidos a CLP, y después de 3 días, se les administró bacterias por vía intranasal (Figura1). Como se muestra en la Figura2, los ratones comenzaron a morir a 12 h después de la inducción de la peritonitis. Dos ratones del grupo CLP+SA y tres ratones del grupo CLP+NS murieron antes de la insinstación intranasal de S. aureus. No...

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Design of Cecal Ligation and Puncture and Intranasal Infection Dual Model of Sepsis-Induced Immunosuppression

Este protocolo describe técnicas para medir los resultados infecciosos subyacentes a las infecciones secundarias adquiridas en el hospital en la condición inmunosupresora, primero estableciendo ratones de ligadura/punción cecal y luego desafiándolos con infección intranasal a crear un modelo clínicamente relevante de la sepsis de inmunosupresión.

Diseño de Ligadura Cecal y Punción e Infección Intranasal Modelo Dual de Inmunosupresión Inducida por Sepsis

Sepsis, a severe and complicated life-threatening infection, is characterized by an imbalance between pro- and anti-inflammatory responses in multiple ...

Prepare el ratón para la cirugía. Afeitar los cuadrantes inferiores del abdomen con una maquinilla de afeitar y desinfectar la zona con yodo. Coloque el ratón sobre una superficie de trabajo limpia en su espalda con la cabeza apuntando lejos del operador.Haga una incisión longitudinal de la piel de aproximadamente medio centímetro de largo en la parte inferior izquierda del abdomen. Tenga cuidado de no penetrar la cavidad peritoneal. Utilice tijeras pequeñas para extender la incisión de uno a dos centímetros.Haga una incisión intramuscular para acceder a la cavidad peritoneal. En la mayoría de los casos, el cecum está en el lado izquierdo del abdomen. Aísle el cecum.Usando fórceps anatómicos y contundentes, exponga suavemente y cuidadosamente el cecum a través de la incisión. El paso cuatro es la ligadura. La posición de la ligadura en el cecum determina el nivel de gravedad de la sepsis.La ligadura de aproximadamente el 75% del cecum induce sepsis grave. La ligando el 50% del cecum induce sepsis de nivel medio. Mientras que ligar el 25% o menos del cecum dará lugar a una sepsis menor.Ligar el cecum en la posición designada. Asegúrese de no ligar la válvula ileocecal. El paso cinco es perforar el cecum.Usando una aguja, perforar el cecum con un solo paso y a través de la punción a mitad de camino entre la ligadura y la punta del cecum. Asegúrese de no perforar ningún vaso sanguíneo. Para asegurarse de que hubo una punción completa, extruya una pequeña gota de heces de ambos orificios de aguja.Sustituya cuidadosamente el cecum en la cavidad abdominal. Cierre la musculatura abdominal aplicando suturas simples y cierrando la piel. Limpie la piel con yodo.Inyecte el ratón con una solución salina precale calentada para reanimar. Coloque el ratón de nuevo en la jaula con acceso ilimitado a alimentos y agua. Después de unos tres días desde la ligadura cecal y la punción o el procedimiento de CLP, sometemos al ratón a un segundo golpe con una infección intranasal para estimular la neumonía que a menudo ocurre en la sepsis.Acércate al cuello del ratón por detrás, suavemente y suavemente. El pulgar y el dedo índice de la mano izquierda forman una posición en forma de U. Sostenga el cuello inmediatamente detrás de las orejas para que la cabeza del ratón esté completamente restringida.Introducir la infección intranasal. Usando una pipeta de 100 microlitros, inculcar la cepa estafiloco aureus por vía intranasal. Sosteniendo el ratón en posición vertical, deje caer lentamente de dos a tres microlitros de la solución bacteriana en ambas fosas nasales del ratón.Levante el ratón hacia arriba y hacia abajo con la cabeza hacia arriba y hacia abajo para ayudar a la solución bacteriana a entrar en la tráquea. Levante el ratón rápidamente mientras lo baja suavemente y lentamente. Repita la instilación 15 veces o hasta que se infunda toda la solución bacteriana.El último paso es finalizar el procedimiento. Poner el ratón sobre la ropa de cama en ángulo en un ángulo de aproximadamente 35 grados para recuperar. Asegúrese de que el ratón está detrás con la cabeza puesta.Observe el ratón para asegurarse de que está completamente recuperado de la anestesia y el procedimiento. Después de aplanar la ropa de cama, coloque el ratón de nuevo en la jaula con acceso ilimitado a alimentos y agua. Los ratones comenzaron a morir alrededor de las 12 horas después de la inducción de la peritonitis.La mortalidad fue mucho mayor para los ratones con TPC antes de una neumonía. Tres días después de la cirugía, los ratones con CLP tuvieron más mortalidad con una administración intranasal de estafilococo aureus. Los niveles de citoquinas proinflamatorias séricas aumentaron significativamente a las 24 horas después de la instilación bacteriana en ratones con sepsis en comparación con los ratones que tenían CLP solos o los Sham operaban ratones con un segundo golpe.Sin embargo, los ratones de doble impacto mostraron una disminución significativa en los niveles de citoquinas de líquido BAL en comparación con la cirugía SA y Sham más ratones SA. Por lo tanto, clP afecta la defensa del huésped y aumenta la susceptibilidad a la infección. Este modelo de doble impacto es una herramienta valiosa para entender los mecanismos moleculares para la interacción huésped-patógeno, que pueden abrir la vía para desarrollar nuevos fármacos eficaces y otras terapias para las infecciones por soberbios.

Research

JoVE Journal

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Investigación

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El uso de<em&gt; Galleria mellonella</em&gt; Como organismo modelo para estudiar<em&gt; Legionella pneumophila</em&gt; Infección

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La ligadura y punción cecal inducida por sepsis como un modelo para estudiar la autofagia en ratones

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Methods to Evaluate Cytotoxicity and Immunosuppression of Combustible Tobacco Product Preparations

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