Name: single-molecule tracking microscopy - a tool for determining the diffusive states of cytosolic molecules
Uploaded: 2019-09-05T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules at JoVE.com

نشكر أليسيا أكيموفيتش وتينغ يان على قراءتهما النقدية للمخطوطة. نشكر إد هول، كبير علماء الموظفين في مجموعة خدمات الحوسبة البحثية المتقدمة في جامعة فرجينيا، على المساعدة في إعداد إجراءات التحسين المستخدمة في هذا العمل. وقدمت جامعة فرجينيا التمويل اللازم لهذا العمل.

1. مزدوج الحلزون نقطة انتشار وظيفة المعايرة 2.
ملاحظة: يتم الحصول على الصور الموضحة في هذا القسم والأقسام التالية باستخدام مجهر الفلورة المقلوب المبني ة حسب الطلب، كما هو موضح في Rocha et al.23. نفس الإجراء ينطبق على تطبيقات المجهر المختلفة المصممة لتوطين جزيء واحد وتت?...

والعامل الحاسم للتطبيق الناجح للبروتوكول المعروض هو ضمان فصل إشارات الجزيء الواحد بشكل جيد عن بعضها البعض (أي أنها تحتاج إلى أن تكون متفرقة في الفضاء وفي الوقت المناسب(Supplementary Mov. 1)). إذا كان هناك أكثر من جزيء مفلور واحد في خلية في نفس الوقت، ثم يمكن تعيين التعريب بشكل غير صحيح إلى م...

دراسة السلوك المختلف للجزيئات الحيوية يوفر نظرة ثاقبة في وظائفها البيولوجية. أصبحت التقنيات المستندة إلى التنظير المجهري الفلوري أدوات قيمة لمراقبة الجزيئات الحيوية في بيئة الخلايا الأصلية الخاصة بها. الانتعاش الفلوري بعد تبييض الصور (FRAP) ومطياف الارتباط الفلوري (FCS)1 توفير السلوكيات الفرقية متوسط الفرقة. وعلى العكس من ذلك، فإن الفحص المجهري لتوطين جزيء واحد يتيح مراقبة الجزيئات الفردية ذات العلامات الفلورية ذات الدقة المكانية والزمنية العالية2و3و4. مراقبة الجزيئات الفردية مفيد لأن البروتين من الفائدة قد توجد في حالات مختلفة من عدم الأهمية. على سبيل المثال، تنشأ دولتان مختلفتان يمكن تمييزهما بسهولة عندما ينتشر منظم النسخ، مثل CueR في الإشريكية القولونية، بحرية في السيتوسول أو يرتبط بتسلسل الحمض النووي ويصبح معطلة على المقياس الزمني للقياس5 . يوفر تتبع جزيء واحد أداة لمراقبة هذه الدول المختلفة مباشرة، وليس هناك حاجة إلى تحليلات متطورة لحلها. ومع ذلك، يصبح من الصعب أكثر حل حالات متعددة غير مُقابَّلة وكسور سكانها في الحالات التي تكون فيها معدلاتها المشتتة أكثر تشابهاً. على سبيل المثال، بسبب الاعتماد على حجم معامل الانتشار، تظهر حالات القلة المختلفة للبروتين نفسها كحالات مختلفة غير مُقَدِّمة6و7و8و9 , 10- وتتطلب هذه الحالات نهجا متكاملا من حيث الحصول على البيانات وتجهيزها وتحليلها.
ومن العوامل الحاسمة التي تؤثر على المعدلات المختلفة للجزيئات الكليوم أثر الحبس بحدود الخلية. وتتسبب القيود المفروضة على الحركة الجزيئية من قبل حد الخلية البكتيرية في أن يظهر معدل الانتشار المقاس للجزيئات الكلوسالية أبطأ مما لو كان نفس الحركة قد حدث في مساحة غير محصورة. بالنسبة للجزيئات التي تنتشر ببطء شديد، فإن تأثير الحبس الخلوي لا يكاد يذكر بسبب عدم وجود تصادمات مع الحدود. في مثل هذه الحالات، قد يكون من الممكن حل الحالات المشتتة بدقة عن طريق تركيب توزيعات الإزاحات الجزيئية، ص،أو معاملات الانتشار الظاهرة، D*، باستخدام نماذج تحليلية تستند إلى معادلات الحركة البراونية ( نشر عشوائي)11،12،13. ومع ذلك، لنشر الجزيئات الخلوية بسرعة، والتوزيعات التجريبية لم تعد تشبه تلك التي تم الحصول عليها للحركة براونيان غير المحصورة بسبب اصطدام الجزيئات الناشرة مع حدود الخلية. يجب حساب آثار الحبس لتحديد معاملات الانتشار غير المحصورة للجزيئات التي تحمل علامة الفلورسنت بدقة. وقد وضعت مؤخرا عدة نهج لحساب آثار الحبس إما (شبه)تحليليا 5،14،15،16 أو عدديا من خلال محاكاة مونتي كارلو من نشر براونيان6،10،16،17،18،19.
هنا، نحن نقدم بروتوكول متكامل لجمع وتحليل البيانات المجهرية توطين جزيء واحد مع التركيز بشكل خاص على تتبع جزيء واحد. الهدف النهائي للبروتوكول هو حل الحالات المنافية للبروتينات السيتوفورية التي تحمل علامة الفلوروس داخل، في هذه الحالة، الخلايا البكتيرية على شكل قضيب. ويستند عملنا على بروتوكول سابق لتتبع جزيء واحد، الذي تم تبين أن بوليميراز الحمض النووي، PolI، موجودة في حالة الحمض النووي ملزمة وغير منضمة عن طريق تحليل نشر20. هنا، نقوم بتوسيع تحليل تتبع جزيء واحد إلى قياسات 3D وإجراء محاكاة حسابية أكثر واقعية لحل وقياس حالات مختلفة في وقت واحد موجودة في الخلايا. يتم الحصول على البيانات باستخدام مجهر الفلورة فائقة الدقة 3D بنيت في المنزل والتي هي قادرة على تحديد موقف 3D من باعثات الفلورسنت عن طريق التصوير مع مزدوج الحلزون نقطة انتشار وظيفة (DHPSF)21،22. تتم معالجة الصور الخام ذات الجزيء الواحد باستخدام برامج مكتوبة حسب الطلب لاستخراج التعريب ثلاثي الأبعاد أحادي الجزيء، والتي يتم دمجها بعد ذلك في مسارات أحادية الجزيء. يتم تجميع الآلاف من المسارات لتوليد توزيعات معاملات الانتشار الظاهرة. في خطوة أخيرة, تتناسب التوزيعات تجريبيّة مع عدديّا ينتج توزيعات ينال من خلال [مونت-كرلو] محاكاة من حركة [بروونين] في حجم يحصر. نحن نطبق هذا البروتوكول لحل حالات عدم الانتشار من نوع 3 إفراز نظام البروتين YscQ في العيش Yersinia enterocolitica. نظرًا لطبيعته النمطية، فإن بروتوكولنا ينطبق بشكل عام على أي نوع من تجارب تتبع الجزيئات الواحدة أو الجسيمات الواحدة في الجيومتريات الخلوية التعسفية.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2,6-diaminopimelic acid</td>
			<td>Chem Impex International</td>
			<td>5411</td>
			<td>Necessary for growth of Y. enterocolitica cells used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4f lenses</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC508-080-A</td>
			<td>f = 80mm, 2&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>514 nm laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>Genesis MX514 MTM</td>
			<td>Use for fluorescence excitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>agarose</td>
			<td>Inivtrogen</td>
			<td>16520100</td>
			<td>Used to make gel pads to mount liquid bacterial sample on microscope.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9434</td>
			<td>M2G ingredient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bandpass filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET510/bp</td>
			<td>Excitation pathway.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain Heart Infusion</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>53286</td>
			<td>Growth media for Y. enterocolitica.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>223506</td>
			<td>M2G ingredient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>camera</td>
			<td>Imaging Source</td>
			<td>DMK 23UP031</td>
			<td>Camera for phase contrast imaging.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dielectric phase mask</td>
			<td>Double Helix, LLC</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Produces DHPSF signal.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>disodium phosphate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>795410</td>
			<td>M2G ingredient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S311-100</td>
			<td>Chelates Ca2+. Induces secretion in the T3SS.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flip mirror</td>
			<td>Newport</td>
			<td>8892-K</td>
			<td>Allows for switching between fluorescence and phase contrast pathways.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fluospheres</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8792</td>
			<td>Fluorescent beads. 540/560 exication and emission wavelengths. 40 nm diameter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass cover slip</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-302</td>
			<td>#1.5, 22mmx22mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose</td>
			<td>Chem Impex International</td>
			<td>811</td>
			<td>M2G ingredient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>immersion oil</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Z-81025</td>
			<td>Placed on objective lens.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iron(II) sulfate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F0518</td>
			<td>M2G ingredient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>long pass filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>LP02-514RU-25</td>
			<td>Emission pathway.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnesium sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S25414A</td>
			<td>M2G ingredient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope platform</td>
			<td>Mad City Labs</td>
			<td>custom</td>
			<td>Platform for inverted microscope.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nalidixic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N4382</td>
			<td>Y. enterocolitica cells used are resistant to nalidixic acid.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>objective lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>1-U2B991</td>
			<td>60X, 1.4 NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ozone cleaner</td>
			<td>Novascan</td>
			<td>PSD-UV4</td>
			<td>Used to eliminate background fluorescence on glass cover slips.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium phosphate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>795488</td>
			<td>M2G ingredient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red LED</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>M625L3</td>
			<td>Illuminates sample for phase contrast imaging. 625nm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>ORCA-Flash 4.0 V2</td>
			<td>Camera for fluorescence imaging.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>short pass filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET700SP-2P8</td>
			<td>Emission pathway.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube lens</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC508-180-A</td>
			<td>f=180 mm, 2&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yersinia enterocolitica dHOPEMTasd</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Strain AD4442, eYFP-YscQ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>zero-order quarter-wave plate</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>WPQ05M-514</td>
			<td>Excitation pathway.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-molecule tracking microscopy - a tool for determining the diffusive states of cytosolic molecules

يسبر الفحص المجهري لتوطين جزيء واحد موضع وحركات الجزيئات الفردية في الخلايا الحية مع عشرات النانومتر المكاني والاستبانة الزمنية المليثانية. هذه القدرات تجعل من جزيء واحد التعريب المجهري ة مناسبة بشكل مثالي لدراسة الوظائف البيولوجية على المستوى الجزيئي في البيئات ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية. هنا، نقوم بتوضيح بروتوكول متكامل لكل من الحصول على ومعالجة/تحليل بيانات تتبع جزيء واحد لاستخراج مختلف الدول المشتتة التي قد تظهر البروتين ذات الأهمية. ويمكن استخدام هذه المعلومات لتحديد كمية تشكيل المعقدة الجزيئية في الخلايا الحية. نحن نقدم وصفا مفصلا لتجربة توطين جزيء واحد 3D المستندة إلى الكاميرا، فضلا عن خطوات معالجة البيانات اللاحقة التي تسفر عن مسارات الجزيئات الفردية. ثم يتم تحليل هذه المسارات باستخدام إطار تحليل عددي لاستخراج الحالات الانقباحية السائدة للجزيئات التي تحمل علامة الفلورسنت والوفرة النسبية لهذه الدول. ويستند إطار التحليل إلى عمليات محاكاة استوكاستك لمسارات الانتشار البنيداخل الخلايا التي تقتصر مكانياً على هندسة الخلايا التعسفية. استناداً إلى مسارات محاكاة، يتم إنشاء الصور الخام جزيء واحد وتحليلها بنفس الطريقة مثل الصور التجريبية. وبهذه الطريقة، فإن القيود التجريبية على الدقة والدقة، التي يصعب معايرة تجريبياً، تُدمج صراحة في سير عمل التحليل. يتم تحديد معامل الانتشار والكسور السكانية النسبية للحالات المشتتة السائدة عن طريق تركيب توزيعات القيم التجريبية باستخدام تركيبات خطية من التوزيعات المحاكاة. نحن نبرهن على فائدة بروتوكولنا من خلال حل الحالات المنافية للبروتين الذي يعرض حالات مختلفة من عدم الاكتراث عند تشكيل المجمعات المتجانسة والمتغايّرة القلة في السيتوسول من مسببات الأمراض البكتيرية.

في ظل الظروف التجريبية الموصوفة هنا (20،000 لقطة، طول المسار الحد الأدنى من 4 التعريب) واعتمادا على مستويات التعبير من البروتينات الانصهار المسمى الفلورسنت، ما يقرب من 200-3،000 التعريب تسفر عن 10-150 يمكن إنشاء مسارات لكل خلية(الشكل 2a،ب). وهناك عدد كبير م...

Watch this Scientific Journal Video about Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules at JoVE.com

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules

يتم استخدام الفحص المجهري لتوطين جزيء واحد ثلاثي الدمنل لسبر المواقف المكانية ومسارات الحركة للبروتينات ذات العلامات الفلورية في الخلايا البكتيرية الحية. يحدد بروتوكول تحليل البيانات التجريبية الموضحة هنا السلوكيات المشتتة السائدة للبروتينات الخلوية استناداً إلى مسارات أحادية الجزيء مجمعة.

مجهريتتبع جزيء واحد - أداة لتحديد الدول المنافية للجزيئات الخلوية

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and ...

يمكن أن يحدد تتبع 3D أحادي الجزيء تعريبات دون الخلايا وسلوكيات الحركة للبروتينات الفردية. إن مراقبة حركة البروتين في خلية حية توفر رؤى مهمة حول تفاعلها مع الشركاء الملزمين في بيئتها الأصلية. توفر الطريقة المعروضة هنا إطارًا عامًا لتحليل بيانات تتبع الجزيء الواحد لحل الحالات الناشرة للجزيئات البيولوجية.ويمكن تطبيقه على كل من المسارين 2D و 3D التي تقتصر على أحجام الخلايا على شكل تعسفي. بعد إيداع حبة الفلورسنت في وسادة agarose معدة مسبقًا كما هو موضح في بروتوكول النص المصاحب ، ضعه على زلة غلاف المجهر وأضمن زلة الغطاء إلى حامل عينة المجهر. ثم يتم تركيب حامل العينة على مجهر الفلورانس المقلوب.ثم تهيئة واجهة المستخدم الرسومية من المجهر ؛ هنا ، يتم استخدام البرامج المكتوبة حسب الطلب في MATLAB للتحكم في الصك. تهيئة برنامج الكاميرا HCImage لايف. في علامة التبويب التقاط ضمن قسم التحكم بالكاميرا، قم بتعيين وقت التعرض للضوء إلى 0.03 ثانية، ثم انقر على Live لبدء بث مباشر للكاميرا.انقر فوق زر الليزر المفتوح المناسب على واجهة GUI لإلغاء حظر الليزر وإثارة الخرز الفلورسنت على لوحة agarose. عرض الانبعاثات الفلورية على الكاميرا باستخدام وضع البث المباشر. ضبط مواضع X و Y لمرحلة المجهر بالنقر فوق أسهم XY-Position تحت قسم مرحلة تحديد المواقع الجزئية لواجهة المستخدم لوضع حبة فلورية واحدة على الأقل في وسط مجال الرؤية.إذا لزم الأمر، قم بتغيير حجم الخطوة بالنقر على المربع المنسدل أسفل الأسهم. قم بضبط الموضع Z لمرحلة المجهر عن طريق النقر على أسهم Z-Position تحت قسم مرحلة تحديد المواقع النانوني. تعيين اتجاه مزدوج الحلزون نقطة انتشار - وظيفة من حبة الفلورسنت لتكون عمودية.يتم تعريف هذا الاتجاه العمودي كنقطة بداية في معايرة Z. مسح 30 خطوة فوق وتحت موقف Z بدءا في 50 نانومتر الزيادات. سجل 10 إطارات في كل خطوة باستخدام وقت التعرض 0.03 ثانية.لبدء عملية الحصول على البيانات التلقائية، انقر على الانتقال تحت Z-معايرة. جهاز طرد مركزي ملليلتر واحد من حرارة صدمت Yersinia enterocolitica الثقافة في 5، 000 مرة الجاذبية لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة ثم إزالة الثقافة والتخلص من عظمى. غسل بيليه ثلاث مرات مع ملليلتر واحد من وسائل الإعلام M2G.بعد الشطف النهائي، resuspend البكتيريا بيليت في 250 ميكرولترات من وسائل الإعلام M2G. يضاف التالي الخرز الفلورسنت لاستخدامها كعلامات فيدوسية. يجب إضافة محلول حبة الفلورسنت بحيث لا يوجد سوى حبات واحدة إلى اثنين لكل مجال من مجالات الرؤية عند عرضها في المجهر.خلط بلطف التعليق عن طريق دوامة لفصل أي الخلايا المجمعة ولوحة 1.5 ميكرولترات من التعليق على 1.5 إلى 2٪ لوحة agarose مصنوعة من M2G، ثم عكس لوحة ووضعها على زلة غطاء المجهر تنظيف الأوزون. إضافة قطرة من زيت الغمر على الهدف المجهر ووضع حامل العينة على مرحلة المجهر وتأمينه في مكان. تهيئة واجهة المستخدم الرسومية للسيطرة على الكاميرا المجهر ، مرحلة العينة ، وأشعة الليزر الإثارة ثم تهيئة برنامج الكاميرا.في علامة التبويب التقاط ضمن المقطع "التحكم بالكاميرا"، قم بتعيين وقت التعرض للضوء إلى 0.025 ثانية ثم انقر فوق Live لبدء بث مباشر للكاميرا. ضبط مواقع س و ص من مرحلة المجهر عن طريق النقر فوق الأسهم XY-الموقف تحت قسم مرحلة تحديد المواقع الجزئية لمسح حول العينة والعثور على حقل رؤية مع مجموعة كثيفة بشكل مناسب من الخلايا البكتيرية. لزيادة سرعة نقل البيانات إلى أقصى حد، يجب أن تكون كثافة الخلية على زلة الغطاء أعلى مستوى ممكن دون تداخل الخلايا أو لمس بعضها البعض.وينبغي أن يشمل مجال الرؤية أيضاً حبة فلورية واحدة على الأقل كعلامة فيدوسية بحيث يمكن قياس التحول في المرحلة أثناء الحصول على البيانات. بعد ذلك ضبط موقف Z من مرحلة المجهر عن طريق النقر على الأسهم Z-موقف تحت قسم مرحلة تحديد المواقع نانو بحيث beadss'double-الحلزون نقطة انتشار وظيفة فصوص هي عمودي. ثم انتقل إلى التسلسل وحدد إعدادات المسح الضوئي.تغيير عدد عدد مرات الاعتماد على الإطارات إلى 20,000. اختر بعد ذلك مجلد وجهة حفظ بالنقر على الزر المسمى بثلاث نقاط. أخيرا انقر فوق ابدأ لجمع ما يصل إلى 20،000 إطارات الكاميرا باستخدام وقت التعرض قصيرة من 0.025 ثانية.عند الانتهاء، قم بحظر إضاءة الليزر بالنقر فوق زر إغلاق الليزر المناسب في واجهة المستخدم الرسومية. ثم جمع 200 لقطة من الصور المظلمة باستخدام نفس الوقت التعرض. حدد المربع بجوار Thorlabs LED ثم انقر فوق تبديل مرآة Up.This سوف تتحول على ضوء LED فوق العينة والتبديل المجهر من مسار الفلوريسين إلى مسار النقيض المرحلة.تهيئة برنامج الحصول على البيانات في مسار النقيض المرحلة واضغط على زر بدء / إيقاف عرض لايف لعرض تغذية حية من الكاميرا. ثم انقر فوق التقاط والذهاب لحفظ الصورة لجمع صورة النقيض من المرحلة من الخلايا في مجال العرض الحالي. تناسب حبة الفلورسنت لاستخدامها كعلامة فيدوسي.البحث عن كافة التعريبات وكافة إطارات الكاميرا باستخدام عتبات القالب كما هو موضح في بروتوكول النص. ضمن المقطع "محلي DHPSF SM" GUI سهل DHPSF انقر فوق تشغيل لاحتواء إشارات جزيء واحد ثم انقر فوق موافق على الإطارات المنبثقة التالية للحفاظ على الإعدادات الافتراضية. سوف يجد البرنامج إشارات الفلورانس أحادية الجزيء التي تشبه وظيفة انتشار نقطة الحلزون المزدوجة ثم محاولة احتوائها باستخدام نموذج غاوسي مزدوج.كما يعمل السيناريو، وسوف نرى المستخدم عرض بيانات الصورة الخام، فضلا عن صورة أعيد بناؤها من الإشارات جزيء واحد تركيبها بنجاح. باستخدام البرامج المكتوبة حسب الطلب في MATLAB، ابدأ يدويًا بتحديد خمسة أزواج نقطة تحكم في النافذة المنبثقة عن طريق تقدير أعمدة الخلايا من الخلايا الخمس نفسها والنقر عليها في كل من بيانات تعريب الجزيء الواحد والخطوط العريضة للخلية. حذف الخلايا التي تحتوي على أقل من 10 التعريب وإزالة الخلايا التي يتم وضعها جزئيا خارج مجال العرض، ثم حذف أي خلايا إضافية غير المرغوب فيها في الإطار المنبثقة عن طريق النقر داخل من حدود الخلية الخاصة بهم.وأخيراً، قم بتعيين التعريبات الموجودة ضمن حدود المخطط التفصيلي للخلية إلى تلك الخلية. تجاهل أي تعريب غير موجود ضمن أي مخطط تفصيلي للخلية. ومن العوامل الحاسمة لنجاح تطبيق هذا البروتوكول ضمان فصل إشارات الجزيء الواحد عن بعضها البعض.إذا كان هناك أكثر من جزيء الفلوريسينغ في الخلية في نفس الوقت، ثم توطين يمكن أن تسند بشكل غير صحيح إلى مسار جزيء آخر. يعمل هذا البروتوكول على إزالة مشكلة الارتباط عن طريق تجاهل أي مسارات التي يوجد لها تعريبين أو أكثر في نفس الخلية. وهكذا، إذا كانت إشارات الجزيء الواحد كثيفة جداً، يتم تجاهل كمية كبيرة من هذه البيانات تلقائياً أثناء المعالجة.اعتمادا على مستويات التعبير من البروتينات الانصهار الفلورسنت المسمى، ما يقرب من 200 إلى 3،000 التعريب يمكن أن تنشأ في الخلية الواحدة. يمكن أن تسفر هذه التعريبات عن ما بين 10 إلى 150 مسارًا. وهناك عدد كبير من المسارات اللازمة لإنتاج توزيعات عينات جيدة.يظهر هنا هو الرسم البياني لمعاملات الانتشار الظاهرة لما يقرب من 80،000 مسار جزيء واحد من Yersinia enterocolitica نوع 3 إفراز البروتين YscQ المسمى مع البروتين الفلوري eYFP. YscQ يرتبط عن طريق الحقن الغشاء جزءا مما أدى إلى جزء من الجزيئات، حوالي 24٪ التي لا تنتشر، كما هو مبين من قبل التوزيع هو مبين في الأسود. الجزيئات YscQ المتبقية تنتشر بحرية في السيتوبول.خلال الطريقة الموصوفة هنا ، تقرر أن جزيئات YscQ غير المنضمة موجودة في ثلاث حالات منفصلة على الأقل. وتم التوصل إلى هذا الاستنتاج عن طريق تركيب توزيع معاملات الانتشار الظاهرة مع مكتبة من التوزيعات المحاكاة مع معاملات الانتشار المعروفة. عند محاولة حل حالات متعددة من الإنتشار، ينبغي جمع عدة آلاف من مسارات الجزيء الواحد لضمان أخذ عينات جيدة جداً من توزيعات معامل الانتشار الظاهر.يمكن إجراء تتبع جزيء واحد في خلايا من النوع البري أو في المسوخ الوراثية لتحديد ما إذا كانت الدول الناشرية محددة تظهر فقط عندما يكون شريك الربط الجزيئي موجودًا. من خلال حل الحالات الناشرية للبروتينات السيتوسوليك ومجمعات البروتين باستخدام تتبع 3D أحادي الجزيء ، يمكن للباحثين تحديد أين ومتى وكيف تتشكل مجمعات البروتين القلوية في الخلايا الحية. يمكن أن يكون العمل مع مصادر الليزر عالية الطاقة ومسببات الأمراض البشرية الحية خطرًا للغاية.وينبغي دائما اتباع البروتوكولات المناسبة للسلامة بالليزر والسلامة البيولوجية.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

عالية الدقة حنق في مستوى جزيء واحد لجزيء الجزيئي تحديد هيكل

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

A Simple, Robust, and High Throughput Single Molecule Flow Stretching Assay Implementation for Studying Transport of Molecules Along DNA

جزيء واحد بسيطة وقوية وعالية إنتاجية تدفق تمتد مقايسة التنفيذ لدراسة نقل جزيئات على طول الحمض النووي

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, ...

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

التلاعب جزيء واحد من كوادروبليكسيس ز بملاقط مغناطيسية

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

تجميد التساهمية من البروتينات للتحليل الطيفي قوة جزيء واحد

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

تحديد كمية البروتين على نطاق المنظومة وسم التجانس على مستوى جزيء واحد

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

إنتاج Dynein و Kinesin موتور الفرق علي الحمض النووي اوريغامي النانو لرصد جزيء واحد

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Conventional BODIPY Conjugates for Live-Cell Super-Resolution Microscopy and Single-Molecule Tracking

التقليدية BODIPY Conjugates ليعيش الخلية فائقة القرار المجهر وتتبع جزيء واحد

Single molecule localization microscopy (SMLM) techniques overcome the optical diffraction limit of conventional fluorescence microscopy and can resolve ...

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

اختبار تصوير أحادي الجزيء في المختبر لتحليل حركية الترجمة المعتمدة على الغطاء

Cap-dependent protein synthesis is the predominant translation pathway in eukaryotic cells. While various biochemical and genetic approaches have allowed ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

تحليل خلية واحدة من الأليل النشطة نسخيا بواسطة جزيء واحد FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Making Precise and Accurate Single-Molecule FRET Measurements using the Open-Source smfBox

إجراء قياسات دقيقة ودقيقة أحادية الجزيء FRET باستخدام smfBox مفتوح المصدر

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes ...