Name: single-molecule tracking microscopy - a tool for determining the diffusive states of cytosolic molecules
Uploaded: 2019-09-05T12:30:00
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我们感谢阿列西亚·阿希莫维奇和丁燕对手稿的批判性阅读。我们感谢弗吉尼亚大学高级研究计算服务小组的高级职员科学家Ed Hall帮助建立这项工作中使用的优化例程。这项工作的资金由弗吉尼亚大学提供。

1. 双螺旋点扩散功能校准
注：本部分和以下各节中描述的图像是使用定制内向荧光显微镜获取的，如Rocha等人23所述。相同的程序适用于不同的显微镜实现设计单分子定位和跟踪显微镜2，3，4。本文中描述的所有图像采集和数据处理软件均可用（https://github.com/GahlmannLab2014/Single-Molecule-Tracking...

成功应用所提出的协议的一个关键因素是确保单分子信号彼此很好地分离（即，它们需要在空间和时间上稀疏（补充Mov.1）。如果同时细胞中有多个荧光分子，则定位可能错误地分配给另一个分子的轨迹。这称为链接问题30。可以选择蛋白质表达水平和激发激光强度等实验条件，以避免连接问题。然而，应注意获得野生型蛋白质表达水平，以确保有代表性的结果。在?...

研究生物分子的扩散行为可以深入了解其生物功能。基于荧光显微镜的技术已成为观察其原生细胞环境中的生物分子的宝贵工具。光漂白 （FRAP） 和荧光相关光谱 （FCS）1之后的荧光恢复提供整体平均扩散行为。相反，单分子定位显微镜能够观察具有高空间和时间分辨率2、3、4的单个荧光标记分子。观察单个分子是有利的，因为感兴趣的蛋白质可能存在于不同的扩散状态。例如，当转录调节器（如大肠杆菌中的 CueR）在细胞醇中自由扩散或与DNA序列结合，并在测量时间尺度上固定时，会出现两种易于区分的扩散状态。.单分子跟踪为直接观察这些不同状态提供了工具，并且不需要复杂的分析来解析它们。然而，在扩散率更相似的情况下，解决多种扩散状态及其人口分数就变得更加困难。例如，由于扩散系数的大小依赖性，蛋白质的不同寡聚状态表现为不同的扩散状态6、7、8、9,10.这类案件需要在数据采集、处理和分析方面采取综合办法。
影响细胞分子扩散率的一个关键因素是细胞边界约束的影响。细菌细胞边界对分子运动的限制导致细胞分子的测量扩散速率看起来比在未封闭空间中发生相同运动时要慢。对于非常缓慢的扩散分子，由于没有与边界碰撞，细胞禁闭的影响可以忽略不计。在这种情况下，可以使用基于布朗运动方程的分析模型，通过拟合分子位移、r或表观扩散系数D+的分布，可以准确求解扩散状态（随机扩散）11，12，13。然而，对于快速扩散的细胞分子，由于扩散分子与细胞边界的碰撞，实验分布不再类似于未限制的布朗运动。必须考虑约束效应，以准确确定荧光标记分子的未封闭扩散系数。最近已经开发出几种方法，通过蒙特卡罗模拟，从分析上解释5、14、15、16或数字的禁闭效果。布朗扩散6，10，16，17，18，19。
在这里，我们提供一个集成协议，用于收集和分析单分子定位显微镜数据，特别注重单分子跟踪。该协议的最终目标是解决荧光标记的细胞蛋白内部（本例中为棒状细菌细胞）的扩散状态。我们的工作建立在以前的单分子跟踪协议之上，其中DNA聚合酶PolI通过扩散分析20证明存在于DNA结合和未结合状态。在这里，我们将单分子跟踪分析扩展到 3D 测量，并执行更逼真的计算模拟，以解决和量化同时存在于细胞中的多种扩散状态。这些数据是使用自制3D超分辨率荧光显微镜获取的，该显微镜能够通过双螺旋点扩散功能（DHPSF）21、22的成像来确定荧光发射器的3D位置。使用定制软件处理原始单分子图像，提取 3D 单分子定位，然后组合成单分子轨迹。数千个轨迹被汇集在一起，以产生表观扩散系数的分布。在最后一步中，实验分布与通过蒙特卡洛模拟布朗运动在密闭体积中获得的数值生成的分布相得一拟。我们应用这个协议来解决3型分泌系统蛋白YscQ在活叶尔西尼亚肠胆病中扩散状态。由于其模块化性质，我们的协议通常适用于任意细胞几何结构中的任何类型的单分子或单粒子跟踪实验。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2,6-diaminopimelic acid</td>
			<td>Chem Impex International</td>
			<td>5411</td>
			<td>Necessary for growth of Y. enterocolitica cells used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4f lenses</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC508-080-A</td>
			<td>f = 80mm, 2&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>514 nm laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>Genesis MX514 MTM</td>
			<td>Use for fluorescence excitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>agarose</td>
			<td>Inivtrogen</td>
			<td>16520100</td>
			<td>Used to make gel pads to mount liquid bacterial sample on microscope.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9434</td>
			<td>M2G ingredient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bandpass filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET510/bp</td>
			<td>Excitation pathway.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain Heart Infusion</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>53286</td>
			<td>Growth media for Y. enterocolitica.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>223506</td>
			<td>M2G ingredient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>camera</td>
			<td>Imaging Source</td>
			<td>DMK 23UP031</td>
			<td>Camera for phase contrast imaging.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dielectric phase mask</td>
			<td>Double Helix, LLC</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Produces DHPSF signal.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>disodium phosphate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>795410</td>
			<td>M2G ingredient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S311-100</td>
			<td>Chelates Ca2+. Induces secretion in the T3SS.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flip mirror</td>
			<td>Newport</td>
			<td>8892-K</td>
			<td>Allows for switching between fluorescence and phase contrast pathways.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fluospheres</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8792</td>
			<td>Fluorescent beads. 540/560 exication and emission wavelengths. 40 nm diameter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass cover slip</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-302</td>
			<td>#1.5, 22mmx22mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose</td>
			<td>Chem Impex International</td>
			<td>811</td>
			<td>M2G ingredient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>immersion oil</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Z-81025</td>
			<td>Placed on objective lens.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iron(II) sulfate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F0518</td>
			<td>M2G ingredient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>long pass filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>LP02-514RU-25</td>
			<td>Emission pathway.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnesium sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S25414A</td>
			<td>M2G ingredient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope platform</td>
			<td>Mad City Labs</td>
			<td>custom</td>
			<td>Platform for inverted microscope.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nalidixic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N4382</td>
			<td>Y. enterocolitica cells used are resistant to nalidixic acid.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>objective lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>1-U2B991</td>
			<td>60X, 1.4 NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ozone cleaner</td>
			<td>Novascan</td>
			<td>PSD-UV4</td>
			<td>Used to eliminate background fluorescence on glass cover slips.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium phosphate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>795488</td>
			<td>M2G ingredient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red LED</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>M625L3</td>
			<td>Illuminates sample for phase contrast imaging. 625nm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>ORCA-Flash 4.0 V2</td>
			<td>Camera for fluorescence imaging.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>short pass filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET700SP-2P8</td>
			<td>Emission pathway.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube lens</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC508-180-A</td>
			<td>f=180 mm, 2&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yersinia enterocolitica dHOPEMTasd</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Strain AD4442, eYFP-YscQ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>zero-order quarter-wave plate</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>WPQ05M-514</td>
			<td>Excitation pathway.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-molecule tracking microscopy - a tool for determining the diffusive states of cytosolic molecules

单分子定位显微镜可探测活细胞中单个分子的位置和运动，具有几十纳米空间和毫秒的时间分辨率。这些功能使单分子定位显微镜非常适合研究生理相关环境中的分子级生物功能。在这里，我们演示了单分子跟踪数据的采集和处理/分析的集成协议，以提取感兴趣的蛋白质可能表现出的不同扩散状态。这些信息可用于量化活细胞中的分子复合形成。我们详细介绍了基于摄像头的 3D 单分子定位实验，以及随后产生单个分子轨迹的数据处理步骤。然后，使用数值分析框架对这些轨迹进行分析，以提取荧光标记分子的普遍扩散状态和这些状态的相对丰度。分析框架基于细胞内布朗扩散轨迹的随机模拟，这些轨迹在空间上被任意细胞几何体所限制。基于模拟轨迹，以与实验图像相同的方式生成和分析原始单分子图像。通过这种方式，实验精度和精度限制被明确纳入分析工作流中，这些限制很难进行实验校准。使用模拟分布的线性组合拟合实验值的分布，确定普遍扩散状态的扩散系数和相对总体分数。通过解决在细菌病原体的细胞溶质中形成同质和异寡体复合物时表现出不同扩散状态的蛋白质，我们证明了我们的协议效用。

在此描述的实验条件下（20，000 帧，轨迹长度最小为 4 个定位），并根据荧光标记融合蛋白的表达水平，大约 200-3，000 个定位，产生 10-150每个细胞可以生成轨迹 （图 2a， b）。大量的轨迹是产生表观扩散系数的采样分布所必需的。这里收集的FOV大小为+55 x 55 μm，每个实验收集10个FOV。因此，要获得每个实验的 >5，000 个轨迹，每个 FOV 应?...

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Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules

3D 单分子定位显微镜用于探测活细菌细胞中荧光标记蛋白质的空间位置和运动轨迹。本文描述的实验和数据分析方案根据集合的单分子轨迹确定细胞蛋白的普遍扩散行为。

单分子跟踪显微镜 - 确定细胞分子扩散状态的工具

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and ...

3D单分子跟踪可以确定单个蛋白质的亚细胞定位和运动行为。观察活细胞中的蛋白质运动，可以提供有关蛋白质与原生环境中结合伙伴相互作用的重要见解。本文介绍的方法为分析单分子跟踪数据以解决生物分子扩散状态提供了一个通用框架。它可以应用于两个 2D 和 3D 轨迹，这些轨迹仅限于任意形状的单元格体积。将荧光珠沉积在随附的文本协议中描述的预先准备好的 agarose 垫中后，将其放在显微镜盖滑上，然后将盖滑固定到显微镜样品支架上。然后将样品支架安装在倒置荧光显微镜上。然后初始化显微镜的图形用户界面;在这里，MATLAB中定制编写的软件用于仪器控制。初始化相机软件HCImage实时。在"摄像机控制"部分下的"捕获"选项卡中，将曝光时间设置为 0.03 秒，然后单击"实时"以开始摄像机的实时馈送。单击 GUI 界面上相应的"打开激光"按钮以解除阻止激光并激发 agarose 垫上的荧光珠。使用实时流模式查看摄像机上的荧光发射。通过单击用户界面的微定位阶段部分下的 XY 位置箭头，在视野中心放置至少一个荧光珠，调整显微镜阶段的 X 和 Y 位置。如有必要，通过单击箭头下方的下拉框来更改步进大小。接下来，单击"纳米定位阶段"部分下的 Z 位置箭头，调整显微镜阶段的 Z 位置。将荧光珠的双螺旋点扩散功能的方向设置为垂直。此垂直方向定义为 Z 校准的起点。以 50 纳米的增量扫描起动 Z 位置上方和下方的 30 步。使用 0.03 秒的曝光时间在每个步骤中记录 10 帧。要开始自动数据采集，请单击"在 Z 校准下转到"。在室温下以5000倍重力将一毫升热震的Yersinia肠糖培养物离心3分钟，然后去除培养物并丢弃上清液。用一毫升的M2G介质清洗颗粒三次。最后冲洗后，在 M2G 介质的 250 微升中重新暂停颗粒细菌。接下来添加荧光珠用作基准标记。应添加荧光珠溶液，以便在显微镜中观察时，每个视野只有一到两个珠子。通过涡旋轻轻混合悬浮液，将悬浮液的任何聚集细胞和悬浮液的1.5微升板分离到用M2G制造的1.5至2%的气糖垫上，然后反转垫，并放在臭氧清洁的显微镜盖上。将一滴浸入油添加到显微镜目标上，并将样品支架放在显微镜舞台上并固定到位。初始化图形用户界面以控制显微镜的相机、采样阶段和激励激光器，然后初始化相机软件。在"摄像机控制"部分下的"捕获"选项卡中，将曝光时间设置为 0.025 秒，然后单击"实时"以开始摄像机的实时馈送。通过单击微定位阶段部分下的 XY 位置箭头来调整显微镜阶段的 X 和 Y 位置，以扫描样品周围并找到具有适当密集细菌细胞群的视场。为了最大限度地提高数据吞吐量，盖滑单上的单元密度应尽可能高，不会使单元格重叠或相互接触。视野还应至少包括一个荧光珠作为基准标记，以便可以在获取数据时测量阶段移位。接下来，通过单击纳米定位阶段部分下的 Z 位置箭头来调整显微镜阶段的 Z 位置，使荧光珠的双螺旋点扩散功能叶垂直。然后转到"序列"并选择"扫描设置"。将帧数数更改为 20，000。接下来，单击标有三个点的按钮，选择保存目标文件夹。最后，单击"开始"以收集多达 20，000 个摄像机帧，使用 0.025 秒的短暂曝光时间。完成后，单击图形用户界面中相应的"关闭激光"按钮来阻止激光照明。然后使用相同的曝光时间收集 200 帧的深色图像。选中 Thorlabs LED 旁边的框，然后单击"向上切换镜像"。这将打开试样上方的 LED 指示灯，并将显微镜从荧光通路切换到相位对比通路。在相位对比度路径上初始化数据采集软件，然后按"开始/停止实时显示"按钮查看来自摄像机的实时源。然后单击"捕获"和"转到"以保存图像，以收集当前视野中单元格的相位对比度图像。将荧光珠安装以用作基准标记。使用文本协议中描述的模板阈值查找并适合所有本地化和所有摄像机帧。在 Easy-DHPSF GUI 的本地化 DHPSF SM 部分下，单击"运行"以适合单分子信号，然后单击以下弹出窗口上的"确定"以保留默认设置。该软件将发现单分子荧光信号，类似于双螺旋点传播功能，然后尝试使用双高斯模型来拟合它们。当脚本运行时，用户将看到原始图像数据的显示以及成功安装的单分子信号的重建图像。使用 MATLAB 中的自定义编写软件，首先在弹出窗口中手动选择五个控制点对，通过粗略估计和单击单分子定位数据和细胞轮廓中相同五个单元的细胞极。删除包含少于 10 个定位的单元格，并删除部分位于视图范围外的单元格，然后通过单击其单元格轮廓内部删除弹出窗口中任何其他不需要的单元格。最后，将驻留在单元格轮廓边界内的本地化分配给该单元格。放弃任何不在任何单元格轮廓内的本地化。成功应用本协议的一个关键因素是确保单分子信号彼此分离良好。如果一个细胞中同时有多个荧光分子，那么定位可以错误地分配给另一个分子的轨迹。该协议通过丢弃同一单元中同时存在两个或多个本地化的任何轨迹来消除链接问题。因此，如果单分子信号过于密集，在处理过程中会自动丢弃大量这些数据。根据荧光标记的融合蛋白的表达水平，每个细胞可生成大约200至3000个定位。这些定位可以产生 10 到 150 个轨迹。要产生样本良好的分布，需要大量的轨迹。这里展示的是Yersinia肠糖分泌蛋白YSCQ近8万个单分子轨迹的表观扩散系数的直方图，该分布图标有荧光蛋白eYFP。YscQ 与膜嵌入的注入体结合，产生一小部分分子，大约 24% 不扩散，如黑色所示的分布所示。剩余的YscQ分子在细胞胶中自由扩散。在本文所述方法中，确定未绑定的YscQ分子存在至少三种不同的扩散状态。通过将表观扩散系数的分布与已知扩散系数的模拟分布库进行拟合，得出了这一结论。在试图解决多个扩散状态时，应收集几千个单分子轨迹，以确保对明显的扩散系数分布进行很好采样。单分子跟踪可以在野生细胞或遗传缺失突变体中进行，以确定特定扩散状态是否仅在存在分子结合伙伴时显现出来。通过利用3D单分子跟踪解决细胞蛋白和蛋白质复合物的扩散状态，研究人员可以确定在活细胞中，寡聚蛋白复合物在何时、何时以及如何形成。使用大功率激光源和活的人类病原体可能极其危险。应始终遵循适当的激光安全和生物安全协议。

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