Name: single-molecule tracking microscopy - a tool for determining the diffusive states of cytosolic molecules
Uploaded: 2019-09-05T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules at JoVE.com

We danken Alecia Achimovich en ting Yan voor de kritische lezing van het manuscript. We bedanken Ed Hall, senior staff Scientist in de Advanced Research Computing Services Group van de University of Virginia, voor hulp bij het opzetten van de optimalisatie routines die in dit werk worden gebruikt. De financiering van dit werk werd verzorgd door de Universiteit van Virginia.

1. Double-Helix Point-spread-functie kalibratie
Opmerking: afbeeldingen die in deze en de volgende secties worden beschreven, worden verkregen met behulp van een op maat gemaakte omgekeerde fluorescentiemicroscoop, zoals beschreven in Rocha et al.23. Dezelfde procedure is van toepassing op verschillende Microscoop implementaties die zijn ontworpen voor lokalisatie van single-molecule en tracking microscopie2,3<sup...

Een cruciale factor voor de succesvolle toepassing van het gepresenteerde protocol is om ervoor te zorgen dat signalen van één molecuul goed van elkaar gescheiden zijn (d.w.z. dat ze schaars moeten zijn in de ruimte en in de tijd (aanvullende MOV. 1)). Als er meer dan één fluorescerende molecuul in een cel tegelijkertijd is, dan kan de lokalisatie onjuist worden toegewezen aan een ander traject van de moleculen. Dit wordt het koppelingsprobleem30genoemd. Experimentele omstandi...

Het onderzoeken van het diffusieve gedrag van biomoleules geeft inzicht in hun biologische functies. Fluorescentiemicroscopie gebaseerde technieken zijn waardevolle hulpmiddelen geworden voor het observeren van biomoleules in hun inheemse celomgeving. Fluorescentie herstel na photobleaching (FRAP) en fluorescentie correlatie spectroscopie (FCS)1 bieden ensemble-gemiddeld diffusief gedrag. Omgekeerd, single-molecuul lokalisatie microscopie maakt observatie van individuele fluorescently gelabelde moleculen met hoge ruimtelijke en temporele resolutie2,3,4. Het observeren van individuele moleculen is voordelig omdat er een eiwit van belang kan bestaan in verschillende diffusieve toestanden. Twee gemakkelijk te onderscheiden diffusie toestanden ontstaan bijvoorbeeld wanneer een transcriptionele regulator, zoals CueR in Escherichia coli, vrij verspreidt in de cytosol of zich bindt aan een DNA-sequentie en wordt geïmmobiliseerd op de tijdschaal van meting5 . Single-molecule tracking biedt een hulpmiddel voor het observeren van deze verschillende toestanden direct, en geavanceerde analyses zijn niet vereist om ze op te lossen. Het wordt echter uitdagender om meerdere diffusieve toestanden en hun bevolkings fracties op te lossen in gevallen waarin hun diffusieve percentages meer vergelijkbaar zijn. Bijvoorbeeld, als gevolg van de grootte afhankelijkheid van de diffusiecoëfficiënt, verschillende oligomerisatie toestanden van een eiwit manifesteren zich als verschillende diffusieve toestanden6,7,8,9 , 10. dergelijke gevallen vereisen een geïntegreerde aanpak op het gebied van gegevensverzameling,-verwerking en-analyse.
Een kritische factor die de diffusie graad van cytosolische moleculen beïnvloedt, is het effect van de opsluiting door de celgrens. De beperkingen op moleculaire beweging door een bacteriële celgrens zorgen ervoor dat de gemeten diffusiesnelheid van een cytosolische moleculen langzamer lijkt dan wanneer dezelfde beweging in een niet-afgesloten ruimte had plaatsgevonden. Voor zeer langzaam verstrooi moleculen is het effect van cellulaire opsluiting verwaarloosbaar als gevolg van het gebrek aan botsingen met de grens. In dergelijke gevallen kan het mogelijk zijn om de diffusieve toestanden nauwkeurig op te lossen door de verdelingen van moleculaire verplaatsingen, rof schijnbare diffusie coëfficiënten, D *, te gebruiken met behulp van analytische modellen op basis van de vergelijkingen voor de Brownse beweging ( willekeurige diffusie)11,12,13. Echter, voor snelle diffuus cytosolische moleculen lijken de experimentele distributies niet langer op die verkregen voor onbegrensde Brownse bewegingen als gevolg van botsingen met diffusen van moleculen met de celgrenzen. Opsluiting effecten moeten administratief worden verantwoord om nauwkeurig de niet-ingeperste diffusie coëfficiënten van de fluorescently gelabelde moleculen te bepalen. Er zijn recentelijk verschillende benaderingen ontwikkeld voor de opsluiting van effecten (semi-) analytisch 5,14,15,16 of numeriek via Monte Carlo simulaties van Brownian Diffusion6,10,16,17,18,19.
Hier bieden we een geïntegreerd protocol voor het verzamelen en analyseren van single-molecuul lokalisatie microscopie gegevens met een specifieke focus op single-molecule tracking. Het uiteindelijke doel van het protocol is het oplossen van diffusieve toestanden van fluorescently gelabelde cytosolische eiwitten binnen, in dit geval, staafvormige bacteriële cellen. Ons werk bouwt voort op een eerder protocol voor single-molecule tracking, waarbij een DNA-polymerase, PolI, werd aangetoond in een DNA gebonden en ongebonden toestand te bestaan door diffusie analyse20. Hier breiden we single-molecule tracking analyse uit naar 3D-metingen en voeren realistischer computationele simulaties uit om meerdere diffusieve toestanden tegelijk in cellen op te lossen en te kwantificeren. De gegevens worden verkregen met behulp van een huisgemaakte 3D super-resolution fluorescentiemicroscoop die in staat is om de 3D positie van fluorescerende stralers te bepalen door beeldvorming met de Double-Helix punt-spread-functie (dhpsf)21,22. De RAW-beelden van één molecuul worden verwerkt met behulp van op maat gemaakte software om de lokalisaties van de 3D-single-molecule te extraheren, die vervolgens worden gecombineerd in trajecten met één molecuul. Duizenden trajecten worden samengevoegd om distributies van schijnbare diffusie coëfficiënten te genereren. In een laatste stap, de experimentele distributies zijn fit met numeriek gegenereerde distributies verkregen door Monte-Carlo simulaties van de Brownian beweging in een beperkt volume. We passen dit protocol toe om de diffusieve toestanden van het type 3-secretie systeem proteïne YscQ in levende Yersinia enterocoliticaop te lossen. Vanwege de modulaire aard ervan, is ons protocol algemeen toepasbaar op elk type Single-molecule of één-deeltje tracking experiment in willekeurige celgeometrieën.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2,6-diaminopimelic acid</td>
			<td>Chem Impex International</td>
			<td>5411</td>
			<td>Necessary for growth of Y. enterocolitica cells used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4f lenses</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC508-080-A</td>
			<td>f = 80mm, 2&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>514 nm laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>Genesis MX514 MTM</td>
			<td>Use for fluorescence excitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>agarose</td>
			<td>Inivtrogen</td>
			<td>16520100</td>
			<td>Used to make gel pads to mount liquid bacterial sample on microscope.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9434</td>
			<td>M2G ingredient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bandpass filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET510/bp</td>
			<td>Excitation pathway.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain Heart Infusion</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>53286</td>
			<td>Growth media for Y. enterocolitica.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>223506</td>
			<td>M2G ingredient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>camera</td>
			<td>Imaging Source</td>
			<td>DMK 23UP031</td>
			<td>Camera for phase contrast imaging.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dielectric phase mask</td>
			<td>Double Helix, LLC</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Produces DHPSF signal.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>disodium phosphate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>795410</td>
			<td>M2G ingredient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S311-100</td>
			<td>Chelates Ca2+. Induces secretion in the T3SS.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flip mirror</td>
			<td>Newport</td>
			<td>8892-K</td>
			<td>Allows for switching between fluorescence and phase contrast pathways.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fluospheres</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8792</td>
			<td>Fluorescent beads. 540/560 exication and emission wavelengths. 40 nm diameter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass cover slip</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-302</td>
			<td>#1.5, 22mmx22mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose</td>
			<td>Chem Impex International</td>
			<td>811</td>
			<td>M2G ingredient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>immersion oil</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Z-81025</td>
			<td>Placed on objective lens.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iron(II) sulfate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F0518</td>
			<td>M2G ingredient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>long pass filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>LP02-514RU-25</td>
			<td>Emission pathway.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnesium sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S25414A</td>
			<td>M2G ingredient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope platform</td>
			<td>Mad City Labs</td>
			<td>custom</td>
			<td>Platform for inverted microscope.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nalidixic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N4382</td>
			<td>Y. enterocolitica cells used are resistant to nalidixic acid.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>objective lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>1-U2B991</td>
			<td>60X, 1.4 NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ozone cleaner</td>
			<td>Novascan</td>
			<td>PSD-UV4</td>
			<td>Used to eliminate background fluorescence on glass cover slips.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium phosphate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>795488</td>
			<td>M2G ingredient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red LED</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>M625L3</td>
			<td>Illuminates sample for phase contrast imaging. 625nm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>ORCA-Flash 4.0 V2</td>
			<td>Camera for fluorescence imaging.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>short pass filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET700SP-2P8</td>
			<td>Emission pathway.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube lens</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC508-180-A</td>
			<td>f=180 mm, 2&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yersinia enterocolitica dHOPEMTasd</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Strain AD4442, eYFP-YscQ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>zero-order quarter-wave plate</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>WPQ05M-514</td>
			<td>Excitation pathway.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-molecule tracking microscopy - a tool for determining the diffusive states of cytosolic molecules

Enkele molecuul lokalisatie microscopie meet de positie en de bewegingen van individuele moleculen in levende cellen met tientallen nanometer ruimtelijke en temporele resolutie van de milliseconde. Deze mogelijkheden maken single-molecuul lokalisatie microscopie bij uitstek geschikt voor het bestuderen van de biologische functies van moleculaire niveaus in fysiologisch relevante omgevingen. Hier demonstreren we een geïntegreerd protocol voor zowel acquisitie en verwerking/analyse van single-molecule trackinggegevens om de verschillende diffusieve toestanden te extraheren die een eiwit van belang kan vertonen. Deze informatie kan worden gebruikt om moleculaire complexe vorming in levende cellen te kwantificeren. We bieden een gedetailleerde beschrijving van een op camera's gebaseerd 3D-single-molecuul lokalisatie-experiment, evenals de daaropvolgende gegevensverwerkings stappen die de trajecten van individuele moleculen opleveren. Deze trajecten worden vervolgens geanalyseerd met behulp van een numeriek analysekader om de heersende diffusieve toestanden van de fluorescently gelabelde moleculen en de relatieve overvloed van deze toestanden te extraheren. Het analysekader is gebaseerd op stochastische simulaties van intracellulaire Brownian-diffusie trajecten die ruimtelijk worden beperkt door een willekeurige celgeometrie. Op basis van de gesimuleerde trajecten worden RAW-beelden van één molecuul gegenereerd en op dezelfde manier geanalyseerd als experimentele afbeeldingen. Op deze manier worden experimentele precisie-en nauwkeurigheids beperkingen, die experimenteel moeilijk te kalibreren zijn, expliciet opgenomen in de analyse-workflow. De diffusiecoëfficiënt en de relatieve bevolkings fracties van de heersende diffusieve toestanden worden bepaald door de verdelingen van experimentele waarden te monteren met behulp van lineaire combinaties van gesimuleerde verdelingen. We demonstreren het nut van ons protocol door het oplossen van de diffusieve toestanden van een eiwit dat verschillende diffusieve toestanden vertoont bij de vorming van homo-en hetero-oligomere complexen in de cytosol van een bacteriële pathogeen.

Onder de hier beschreven experimentele omstandigheden (20.000 frames, trajectlengte minimaal 4 lokalisaties) en afhankelijk van de expressieniveaus van de fluorescently gelabelde fusie eiwitten, ongeveer 200-3000 lokalisaties opleveren 10-150 trajecten kunnen per cel worden gegenereerd (Figuur 2a, b). Een groot aantal trajecten is nodig om een goed gesamplede verdeling van schijnbare diffusie coëfficiënten te produceren. De grootte van FOV ...

Watch this Scientific Journal Video about Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules at JoVE.com

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules

3D single-molecuul lokalisatie microscopie wordt gebruikt om de ruimtelijke posities en bewegings trajecten van fluorescently gelabelde eiwitten in levende bacteriële cellen te sonde. Het experimentele en data-analyse protocol dat hierin wordt beschreven, bepaalt het heersende diffusieve gedrag van cytosolische eiwitten op basis van gegroepeerde enkelvoudige molecuul trajecten.

Single-molecule tracking microscopie-een hulpmiddel voor het bepalen van de Diffusieve toestanden van cytosolische moleculen

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and ...

3D single-molecule tracking kan de subcellulaire lokalisaties en bewegingsgedrag van individuele eiwitten bepalen. Het observeren van de beweging van een eiwit in een levende cel geeft belangrijke inzichten over de interactie met bindende partners in zijn eigen omgeving. De hier gepresenteerde methode biedt een algemeen kader voor het analyseren van trackinggegevens van één molecuul om de verspreidingstoestanden van biologische moleculen op te lossen.Het kan worden toegepast op zowel 2D- als 3D-trajecten die beperkt zijn tot willekeurig gevormde celvolumes. Na het storten van fluorescerende kraal in een vooraf voorbereid agarosepad zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol, plaats het op een microscoopdeksel en zet u de afdekbrief vast aan de houder van het microscoopmonster. De monsterhouder wordt vervolgens op een omgekeerde fluorescentiemicroscoop gemonteerd.Initialiseer vervolgens de grafische gebruikersinterface van de microscoop;hier wordt op maat geschreven software in MATLAB gebruikt voor instrumentcontrole. Initialiseer de camerasoftware HCImage Live. Stel op het tabblad Vastleggen onder de sectie Camerabesturingselement de belichtingstijd in op 0,03 seconden en klik vervolgens op Live om een live-feed van de camera te starten.Klik op de juiste knop Laser openen op de GUI-interface om de laser te deblokkeren en de tl-kralen op het agarosepad op te wekken. Bekijk de fluorescentie emissie op de camera met behulp van live-stream-modus. Pas de X- en Y-posities van de microscoopfase aan door op de XY-Position-pijlen onder het gedeelte Micro-Positioning Stage van de gebruikersinterface te klikken om ten minste één fluorescerende kraal in het midden van het gezichtsveld te plaatsen.Wijzig indien nodig de stapgrootte door op het vervolgkeuzevak onder de pijlen te klikken. Pas vervolgens de Z-positie van de microscoopfase aan door op de Z-Position pijlen te klikken onder de sectie Nano-Positioning Stage. Stel de oriëntatie van de dubbele helix point-spread-functie van de fluorescerende kraal verticaal.Deze verticale richting wordt gedefinieerd als het uitgangspunt in de Z-kalibratie. Scan 30 stappen boven en onder de startende Z-positie in stappen van 50 nanometer. Neem 10 frames op bij elke stap met een belichtingstijd van 0,03 seconden.Om de geautomatiseerde gegevensverwerving te starten, klikt u op Ga onder Z-Kalibratie. Centrifuge een milliliter van warmte-geschokte Yersinia enterocolitica cultuur op 5,000 keer de zwaartekracht gedurende drie minuten bij kamertemperatuur verwijder dan de cultuur en gooi de supernatant. Was de pellet drie keer met een milliliter M2G-media.Na de laatste spoeling, resuspend de pelleted bacteriën in 250 microliters van M2G media. Voeg vervolgens fluorescerende kralen toe om te gebruiken als fiduciale markers. De fluorescerende kraaloplossing moet worden toegevoegd, zodat er slechts één tot twee kralen per gezichtsveld zijn wanneer deze in de microscoop wordt bekeken.Meng voorzichtig de suspensie door vortexing te scheiden geaggregeerde cellen en plaat 1,5 microliter van de suspensie op een 1,5 tot 2% agarose pad gemaakt met M2G, dan omkeren van de pad en plaats het op een ozon-gereinigde microscoop deksel slip. Voeg een druppel onderdompelingsolie toe aan de microscoopdoelstelling en plaats de monsterhouder op het microscoopstadium en zet deze op zijn plaats. Initialiseer de grafische gebruikersinterface om de camera, monsterfase en excitatielasers van de microscoop te bedienen en initialiseer vervolgens de camerasoftware.Stel op het tabblad Vastleggen onder de sectie Camerabesturingselement de belichtingstijd in op 0,025 seconden en klik vervolgens op Live om een live-feed van de camera te starten. Pas de X- en Y-posities van de microscoopfase aan door op de XY-Position pijlen onder de sectie Micro-Positioning Stage te klikken om rond het monster te scannen en een gezichtsveld te vinden met een passend dichte populatie bacteriële cellen. Om de gegevensdoorvoer te maximaliseren, moet de celdichtheid op de afdekslip zo hoog mogelijk zijn zonder dat de cellen elkaar overlappen of aanraken.Het gezichtsveld moet ook ten minste één fluorescerende kraal als fiduciale markering bevatten, zodat de verschuiving van het stadium kan worden gemeten terwijl de gegevens worden verkregen. Pas vervolgens de Z-positie van de microscoopfase aan door op de Z-Position pijlen onder de sectie Nano-Positioning Stage te klikken, zodat de dubbel-helix point-spread-functie lobben van de fluorescerende kralen verticaal zijn. Ga vervolgens naar Reeks en selecteer Scaninstellingen.Wijzig het aantal frames in 20.000. Kies vervolgens een map met opslaan-bestemming door op de knop te klikken met drie puntjes. Klik tot slot op Start om maximaal 20.000 cameraframes te verzamelen met een korte belichtingstijd van 0,025 seconden.Wanneer u klaar bent, blokkeert u de laserverlichting door op de juiste knop Laser sluiten in de grafische gebruikersinterface te klikken. Verzamel vervolgens 200 frames donkere beelden met dezelfde belichtingstijd. Schakel het vakje naast Thorlabs LED in en klik vervolgens op Spiegel omhoog schakelen.Dit zal het LED-licht boven het monster inschakelen en de microscoop van de fluorescentieroute naar het fasecontrastpad schakelen.Initialiseer de software voor gegevenswerving op het fasecontrasttraject en druk op de knop Live Display starten/stoppen om een live feed van de camera te bekijken. Klik vervolgens op Vastleggen en gaan om de afbeelding op te slaan om een fasecontrastafbeelding van de cellen in het huidige gezichtsveld te verzamelen. Plaats de fluorescerende kraal voor gebruik als fiduciale marker.Vind en pas alle lokalisaties en alle cameraframes aan met behulp van de sjabloondrempels zoals beschreven in het tekstprotocol. Klik onder de sectie DHPSF SM van de Easy-DHPSF GUI lokaliseren op Uitvoeren om signalen met één molecuul aan te passen en klik vervolgens op OK op de volgende pop-upvensters om de standaardinstellingen te behouden. De software vindt fluorescentiesignalen met één molecuul die lijken op de dubbele helix-point-spread-functie en vervolgens proberen ze te passen met behulp van een dubbel-Gaussian model.Als het script wordt uitgevoerd, ziet de gebruiker een weergave van de ruwe beeldgegevens en een gereconstrueerd beeld van de met succes gemonteerde signalen van één molecuul. Met behulp van op maat geschreven software in MATLAB, beginnen met het handmatig selecteren van vijf controlepuntparen in het pop-upvenster door ruwweg te schatten en te klikken op de celpolen van dezelfde vijf cellen in zowel de single-molecule lokalisatie gegevens en cel contouren. Verwijder cellen met minder dan 10 lokalisaties en verwijder cellen die gedeeltelijk buiten het gezichtsveld zijn geplaatst en verwijder eventuele extra ongewenste cellen in het pop-upvenster door in hun celcontour te klikken.Ten slotte wijzen lokalisaties die zich binnen de rand van het overzicht van een cel bevinden, toe aan die cel. Verwijder alle lokalisaties die zich niet in een celoverzicht bevinden. Een kritische factor voor de succesvolle toepassing van dit protocol is ervoor te zorgen dat de signalen van één molecuul goed van elkaar gescheiden zijn.Als er meer dan één fluorescerend molecuul in een cel tegelijkertijd is, kan lokalisatie ten onrechte worden toegewezen aan de baan van een ander molecuul. Dit protocol werkt om het koppelingsprobleem te elimineren door trajecten waarvoor twee of meer lokalisaties tegelijkertijd in dezelfde cel aanwezig zijn, te verwijderen. Als signalen met één molecuul te dicht zijn, wordt een grote hoeveelheid van deze gegevens automatisch weggegooid tijdens de verwerking.Afhankelijk van de expressieniveaus van de fluorescerende fusie-eiwitten kunnen ongeveer 200 tot 3,000 lokalisaties per cel worden gegenereerd. Deze lokalisaties kunnen tussen de 10 en 150 trajecten opleveren. Een groot aantal trajecten zijn nodig om goed bemonsterde distributies te produceren.Hier is het histogram van schijnbare diffusiecoëfficiënten voor bijna 80, 000 single-molecule trajecten van de Yersinia enterocolitica Type 3 secretie eiwit YscQ gelabeld met fluorescerende eiwit eYFP. YscQ bindt zich aan membraaninjectisomen wat resulteert in een fractie van moleculen, ongeveer 24%die niet diffuus zijn, zoals blijkt uit de in het zwart weergegeven verdeling. De resterende YscQ moleculen vrij diffuus in de cytosol.Tijdens de hier beschreven methode wordt vastgesteld dat niet-gebonden YscQ-moleculen bestaan in ten minste drie verschillende diffusieve toestanden. Deze conclusie werd getrokken door de verdeling van de schijnbare diffusiecoëfficiënten te voorzien van een bibliotheek van gesimuleerde distributies met bekende diffusiecoëfficiënten. Bij een poging om meerdere diffusive staten op te lossen, moeten enkele duizenden single-molecule trajecten worden verzameld om ervoor te zorgen dat de schijnbare diffusiecoëfficiënt verdelingen zeer goed worden bemonsterd.Single-molecule tracking kan worden uitgevoerd in wild type cellen of in genetische schrapping mutanten om te bepalen of specifieke diffusieve toestanden manifesteren alleen wanneer een moleculaire binding partner aanwezig is. Door het oplossen van de diffusieve toestanden van cytosolische eiwitten en eiwitcomplexen met behulp van 3D single-molecule tracking, onderzoekers kunnen bepalen waar, wanneer en hoe oligomeric eiwit complexen vormen in levende cellen. Werken met krachtige laserbronnen en levende menselijke ziekteverwekkers kan zeer gevaarlijk zijn.Er moeten altijd passende laserveiligheids- en bioveiligheidsprotocollen worden gevolgd.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

High Precision FRET op single-molecuul niveau voor biomolecule structuur bepaling

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

A Simple, Robust, and High Throughput Single Molecule Flow Stretching Assay Implementation for Studying Transport of Molecules Along DNA

Een eenvoudige, robuuste en hoge doorvoer enkel molecuul Flow uitrekkende Assay uitvoering voor de studie van vervoer van moleculen langs DNA

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, ...

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

Single-molecuul manipulatie van G-quadruplexes door magnetische pincet

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Covalente immobilisatie van eiwitten voor de enkel molecuul Force spectroscopie

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Proteoom bestrijkende kwantificering van Labeling homogeniteit op het niveau van één molecuul

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Productie van Dynein en Kinesin motor ensembles op DNA origami nanostructuren voor observatie van enkelvoudige moleculen

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Conventional BODIPY Conjugates for Live-Cell Super-Resolution Microscopy and Single-Molecule Tracking

Conventionele BODIPY Conjugates voor Live-Cell Super-Resolution Microscopie en Single-Molecule Tracking

Single molecule localization microscopy (SMLM) techniques overcome the optical diffraction limit of conventional fluorescence microscopy and can resolve ...

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

Een in vitro single-molecule imaging assay voor de analyse van cap-afhankelijke vertaalkinetiek

Cap-dependent protein synthesis is the predominant translation pathway in eukaryotic cells. While various biochemical and genetic approaches have allowed ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Single cell analyse van transcriptioneel actieve allelen door single molecule FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Making Precise and Accurate Single-Molecule FRET Measurements using the Open-Source smfBox

Nauwkeurige en nauwkeurige FRET-metingen met één molecuul uitvoeren met behulp van de Open-Source smfBox

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes ...