Name: single-molecule tracking microscopy - a tool for determining the diffusive states of cytosolic molecules
Uploaded: 2019-09-05T12:30:00
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Nous remercions Alecia Achimovich et Ting Yan pour la lecture critique du manuscrit. Nous remercions Ed Hall, scientifique principal du groupe Advanced Research Computing Services de l'Université de Virginie, pour son aide à mettre en place les routines d'optimisation utilisées dans ce travail. Le financement de ces travaux a été fourni par l'Université de Virginie.

1. Calibrage point-spread-fonction double-hélice
REMARQUE : Les images décrites dans cette section et les sections suivantes sont acquises à l'aide d'un microscope à fluorescence inversée construit sur mesure, tel que décrit dans Rocha et al.23. La même procédure s'applique aux différentes implémentations de microscope conçues pour la localisation à molécule unique et le suivi de la microscopie2,3<sup...

Un facteur critique pour l'application réussie du protocole présenté est de s'assurer que les signaux d'une seule molécule sont bien séparés les uns des autres (c.-à-d., ils doivent être clairsemés dans l'espace et dans le temps (Mov supplémentaire. 1)). S'il y a plus d'une molécule fluorante dans une cellule en même temps, alors la localisation pourrait être incorrectement assignée à la trajectoire d'une autre molécule. C'est ce qu'on appelle le problème de liaison30</...

L'examen du comportement diffusif des biomolécules donne un aperçu de leurs fonctions biologiques. Les techniques basées sur la microscopie à fluorescence sont devenues des outils précieux pour observer les biomolécules dans leur environnement cellulaire indigène. Le rétablissement de fluorescence après le photoblanchiment (FRAP) et la spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS)1 fournissent des comportements diffusifs ensemble-moyens. Inversement, la microscopie de localisation à molécule unique permet l'observation de molécules fluorescentes individuelles à haute résolution spatiale et temporelle2,3,4. L'observation de molécules individuelles est avantageuse puisqu'une protéine d'intérêt peut exister dans différents états diffusifs. Par exemple, deux états diffusables facilement reconnaissables surgissent lorsqu'un régulateur transcriptionnel, tel que CueR dans Escherichia coli, se diffuse librement dans le cytosol ou se lie à une séquence d'ADN et devient immobilisé sur l'échelle de temps de la mesure5 . Le suivi à molécule unique fournit un outil pour observer ces différents états directement, et des analyses sophistiquées ne sont pas nécessaires pour les résoudre. Cependant, il devient plus difficile de résoudre plusieurs états diffusifs et leurs fractions de population dans les cas où leurs taux de diffusion sont plus semblables. Par exemple, en raison de la dépendance de taille du coefficient de diffusion, différents états d'oligomerisation d'une protéine se manifestent comme différents états diffusifs6,7,8,9 , 10. De tels cas nécessitent une approche intégrée en termes d'acquisition, de traitement et d'analyse des données.
Un facteur critique influençant les taux de diffusion des molécules cytosoliques est l'effet de confinement par la limite cellulaire. Les restrictions imposées au mouvement moléculaire par une limite cellulaire bactérienne font apparaître le taux de diffusion mesuré d'une molécule cytoslique plus lent que si le même mouvement s'était produit dans un espace non confiné. Pour les molécules qui diffusent très lentement, l'effet du confinement cellulaire est négligeable en raison de l'absence de collisions avec la limite. Dans de tels cas, il peut être possible de résoudre avec précision les états diffusifs en adaptant les distributions des déplacements moléculaires, r, ou des coefficients de diffusion apparents, D ,en utilisant des modèles analytiques basés sur les équations pour le mouvement Brownian ( diffusion aléatoire)11,12,13. Cependant, pour la diffusion rapide des molécules cytosoliques, les distributions expérimentales ne ressemblent plus à celles obtenues pour le mouvement Brownien non confiné en raison des collisions de molécules diffusantes avec les limites cellulaires. Les effets de confinement doivent être pris en compte pour déterminer avec précision les coefficients de diffusion non confinés des molécules étiquetées fluorescentes. Plusieurs approches ont récemment été développées pour tenir compte des effets de confinement soit (semi-)analytiquement 5,14,15,16 ou numériquement grâce à des simulations de Monte Carlo de Diffusion Brownian6,10,16,17,18,19.
Ici, nous fournissons un protocole intégré pour la collecte et l'analyse des données de microscopie de localisation à molécule unique avec un accent particulier sur le suivi d'une seule molécule. L'objectif final du protocole est de résoudre les états diffusifs des protéines cytosoliques étiquetées fluorescentes à l'intérieur, dans ce cas, des cellules bactériennes en forme de tige. Notre travail s'appuie sur un protocole précédent pour le suivi d'une seule molécule, dans lequel une polymérase d'ADN, PolI, a été montrée pour exister dans un état lié et non lié d'ADN par l'analyse de diffusion20. Ici, nous étendons l'analyse de suivi d'une seule molécule aux mesures 3D et effectuons des simulations de calcul plus réalistes pour résoudre et quantifier les états diffusifs multiples simultanément présents dans les cellules. Les données sont acquises à l'aide d'un microscope à fluorescence 3D maison qui est capable de déterminer la position 3D des émetteurs fluorescents par l'imagerie avec la double hélice point-spread-fonction (DHPSF)21,22. Les images brutes à molécule unique sont traitées à l'aide d'un logiciel écrit sur mesure pour extraire les localisations 3D à molécule unique, qui sont ensuite combinées en trajectoires monomolécules. Des milliers de trajectoires sont mises en commun pour générer des distributions de coefficients de diffusion apparents. Dans une dernière étape, les distributions expérimentales s'adaptent aux distributions générées numériquement obtenues grâce aux simulations De Monte-Carlo du mouvement Brownian dans un volume confiné. Nous appliquons ce protocole pour résoudre les états diffusifs de la protéine de système de sécrétion de type 3 YscQ dans la vie Yersinia enterocolitica. En raison de sa nature modulaire, notre protocole s'applique généralement à tout type d'expérience de suivi à une molécule ou à une seule particule dans des géométries cellulaires arbitraires.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2,6-diaminopimelic acid</td>
			<td>Chem Impex International</td>
			<td>5411</td>
			<td>Necessary for growth of Y. enterocolitica cells used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4f lenses</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC508-080-A</td>
			<td>f = 80mm, 2&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>514 nm laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>Genesis MX514 MTM</td>
			<td>Use for fluorescence excitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>agarose</td>
			<td>Inivtrogen</td>
			<td>16520100</td>
			<td>Used to make gel pads to mount liquid bacterial sample on microscope.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9434</td>
			<td>M2G ingredient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bandpass filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET510/bp</td>
			<td>Excitation pathway.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain Heart Infusion</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>53286</td>
			<td>Growth media for Y. enterocolitica.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>223506</td>
			<td>M2G ingredient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>camera</td>
			<td>Imaging Source</td>
			<td>DMK 23UP031</td>
			<td>Camera for phase contrast imaging.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dielectric phase mask</td>
			<td>Double Helix, LLC</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Produces DHPSF signal.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>disodium phosphate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>795410</td>
			<td>M2G ingredient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S311-100</td>
			<td>Chelates Ca2+. Induces secretion in the T3SS.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flip mirror</td>
			<td>Newport</td>
			<td>8892-K</td>
			<td>Allows for switching between fluorescence and phase contrast pathways.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fluospheres</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8792</td>
			<td>Fluorescent beads. 540/560 exication and emission wavelengths. 40 nm diameter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass cover slip</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-302</td>
			<td>#1.5, 22mmx22mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose</td>
			<td>Chem Impex International</td>
			<td>811</td>
			<td>M2G ingredient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>immersion oil</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Z-81025</td>
			<td>Placed on objective lens.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iron(II) sulfate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F0518</td>
			<td>M2G ingredient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>long pass filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>LP02-514RU-25</td>
			<td>Emission pathway.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnesium sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S25414A</td>
			<td>M2G ingredient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope platform</td>
			<td>Mad City Labs</td>
			<td>custom</td>
			<td>Platform for inverted microscope.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nalidixic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N4382</td>
			<td>Y. enterocolitica cells used are resistant to nalidixic acid.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>objective lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>1-U2B991</td>
			<td>60X, 1.4 NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ozone cleaner</td>
			<td>Novascan</td>
			<td>PSD-UV4</td>
			<td>Used to eliminate background fluorescence on glass cover slips.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium phosphate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>795488</td>
			<td>M2G ingredient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red LED</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>M625L3</td>
			<td>Illuminates sample for phase contrast imaging. 625nm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>ORCA-Flash 4.0 V2</td>
			<td>Camera for fluorescence imaging.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>short pass filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET700SP-2P8</td>
			<td>Emission pathway.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube lens</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC508-180-A</td>
			<td>f=180 mm, 2&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yersinia enterocolitica dHOPEMTasd</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Strain AD4442, eYFP-YscQ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>zero-order quarter-wave plate</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>WPQ05M-514</td>
			<td>Excitation pathway.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-molecule tracking microscopy - a tool for determining the diffusive states of cytosolic molecules

La microscopie de localisation à molécule unique sonde la position et les mouvements des molécules individuelles dans les cellules vivantes avec des dizaines de nanomètres de résolution spatiale et milliseconde temporelle. Ces capacités font de la microscopie de localisation à une molécule idéalement adaptée pour étudier les fonctions biologiques de niveau moléculaire dans des environnements physiologiquement pertinents. Ici, nous démontrons un protocole intégré pour l'acquisition et le traitement/analyse des données de suivi d'une seule molécule pour extraire les différents états diffusifs qu'une protéine d'intérêt peut montrer. Ces informations peuvent être utilisées pour quantifier la formation complexe moléculaire dans les cellules vivantes. Nous fournissons une description détaillée d'une expérience de localisation simple molécule 3D basée sur la caméra, ainsi que les étapes ultérieures de traitement des données qui donnent les trajectoires de molécules individuelles. Ces trajectoires sont ensuite analysées à l'aide d'un cadre d'analyse numérique pour extraire les états diffusifs répandus des molécules étiquetées fluorescentes et l'abondance relative de ces états. Le cadre d'analyse est basé sur des simulations stochastiques de trajectoires intracellulaires de diffusion brownienne qui sont spatialement confinées par une géométrie cellulaire arbitraire. Sur la base des trajectoires simulées, les images brutes à molécule unique sont générées et analysées de la même manière que les images expérimentales. De cette façon, les limites expérimentales de précision et de précision, qui sont difficiles à étalonner expérimentalement, sont explicitement incorporées dans le flux de travail d'analyse. Le coefficient de diffusion et les fractions de population relatives des états diffusifs prédominants sont déterminés en adaptant les distributions des valeurs expérimentales à l'aide de combinaisons linéaires de distributions simulées. Nous démontrons l'utilité de notre protocole en résolvant les états diffusifs d'une protéine qui présente différents états diffusifs en formant des complexes homo- et hétéro-oligomeric dans le cytosol d'un agent pathogène bactérien.

Dans les conditions expérimentales décrites ici (20 000 images, longueur de trajectoire minimum de 4 localisations) et selon les niveaux d'expression des protéines de fusion étiquetées fluorescentes, environ 200 à 3 000 localisations donnant entre 10 et 150 trajectoires peuvent être générées par cellule (Figure 2a,b). Un grand nombre de trajectoires est nécessaire pour produire une distribution bien échantillonnée des coefficient...

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Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules

La microscopie de localisation simple molécule 3D est utilisée pour sonder les positions spatiales et les trajectoires de mouvement des protéines étiquetées fluorescentes dans les cellules bactériennes vivantes. Le protocole expérimental et d'analyse de données décrit ci-dessus détermine les comportements diffusifs répandus des protéines cytosoliques basées sur des trajectoires monomolécules mises en commun.

Microscopie de suivi à molécule unique - Outil pour déterminer les états diffusifs des molécules cytosoliques

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and ...

Le suivi 3D d’une molécule unique peut déterminer les localisations subcellulaires et les comportements de mouvement des protéines individuelles. L’observation du mouvement d’une protéine dans une cellule vivante fournit des informations importantes sur son interaction avec les partenaires liants dans son environnement naturel. La méthode présentée ici fournit un cadre général pour l’analyse des données de suivi d’une molécule unique pour résoudre les états diffusifs des molécules biologiques.Il peut être appliqué à la fois sur les trajectoires 2D et 3D qui sont confinées à des volumes cellulaires de forme arbitraire. Après avoir déposé la perle fluorescente dans un tampon d’agarose pré-préparé tel que décrit dans le protocole de texte qui l’accompagne, placez-le sur un glissement de couverture de microscope et fixez le bordereau de couverture au porte-échantillon de microscope. Le porte-échantillon est ensuite monté sur un microscope à fluorescence inversé.Ensuite, initialisez l’interface utilisateur graphique du microscope;ici, un logiciel écrit sur mesure dans MATLAB est utilisé pour le contrôle des instruments. Initialisez le logiciel de caméra HCImage Live. Dans l’onglet Capture sous la section Contrôle de la caméra, réglez le temps d’exposition à 0,03 seconde, puis cliquez sur Live pour commencer un flux en direct de la caméra.Cliquez sur le bouton Laser ouvert approprié sur l’interface GUI pour débloquer le laser et exciter les perles fluorescentes sur le pad agarose. Affichez l’émission de fluorescence sur la caméra en mode live-stream. Ajustez les positions X et Y de l’étape microscope en cliquant sur les flèches XY-Position sous la section Étape de micro-positionnement de l’interface utilisateur pour positionner au moins une perle fluorescente au centre du champ de vision.Si nécessaire, modifiez la taille de l’étape en cliquant sur la boîte de dropdown sous les flèches. Ajustez ensuite la position Z de l’étape microscope en cliquant sur les flèches Z-Position sous la section Nano-Positioning Stage. Réglez l’orientation de la fonction de propagation de point à double hélice de la perle fluorescente pour être verticale.Cette orientation verticale est définie comme le point de départ de l’étalonnage Z. Scannez 30 marches au-dessus et au-dessous de la position Z de départ par incréments de 50 nanomètres. Enregistrez 10 images à chaque étape en utilisant un temps d’exposition de 0,03 seconde.Pour démarrer l’acquisition automatisée de données, cliquez sur Go under Z-Calibration. Centrifugeuse d’un millilitre de culture yersinia enterocolitica choquée par la chaleur à 5000 fois la gravité pendant trois minutes à température ambiante, puis enlever la culture et jeter le supernatant. Lavez la pastille trois fois avec un millilitre de médias M2G.Après le rinçage final, resuspendez les bactéries granulées dans 250 microlitres de médias M2G. Ajoutez ensuite des perles fluorescentes à utiliser comme marqueurs fiduciaux. La solution de perle fluorescente doit être ajoutée de sorte qu’il n’y ait qu’une à deux perles par champ de vision lorsqu’elles sont vues au microscope.Mélanger délicatement la suspension en tourbillonnant pour séparer les cellules agrégées et la plaque 1,5 microlitres de la suspension sur un tampon d’agarose de 1,5 à 2 % fait de M2G, puis inverser la garniture et la placer sur un glissement de couvercle de microscope nettoyé à l’ozone. Ajouter une goutte d’huile d’immersion sur l’objectif du microscope et placer le porte-échantillon sur le stade du microscope et le fixer en place. Initialisez l’interface utilisateur graphique pour contrôler la caméra du microscope, l’étape de l’échantillon et les lasers d’excitation, puis initialisez le logiciel de la caméra.Dans l’onglet Capture sous la section Contrôle de la caméra, réglez le temps d’exposition à 0,025 seconde, puis cliquez en direct pour commencer un flux en direct de la caméra. Ajustez les positions X et Y de l’étape du microscope en cliquant sur les flèches XY-Position sous la section Étape de micro-positionnement pour numériser autour de l’échantillon et trouver un champ de vision avec une population suffisamment dense de cellules bactériennes. Pour maximiser le débit des données, la densité cellulaire sur le glissement de couverture doit être aussi élevée que possible sans que les cellules se chevauchent ou se touchent.Le champ de vision devrait également inclure au moins une perle fluorescente comme marqueur fiducial de sorte que le décalage d’étape puisse être mesuré pendant que les données sont acquises. Ajustez ensuite la position Z de l’étape du microscope en cliquant sur les flèches Z-Position sous la section Nano-Positioning Stage de sorte que les lobes de fonction à double hélice des perles fluorescentes soient verticaux. Ensuite, passez à Séquence et sélectionnez Paramètres d’analyse.Changez le nombre de nombres d’images à 20 000. Choisissez ensuite un dossier de destination enregistrer en cliquant sur le bouton marqué de trois points. Enfin cliquez sur Démarrer pour collecter jusqu’à 20.000 images de caméra en utilisant un court temps d’exposition de 0,025 secondes.Une fois terminé, bloquez l’éclairage laser en cliquant sur le bouton Laser proche approprié dans l’interface utilisateur graphique. Puis collecter 200 images sombres en utilisant le même temps d’exposition. Cochez la case à côté de Thorlabs LED, puis cliquez sur Toggle Mirror Up.This va allumer la lumière LED au-dessus de l’échantillon et passer le microscope de la voie de fluorescence à la voie de contraste de phase.Initialisez le logiciel d’acquisition de données sur la voie de contraste de phase et appuyez sur le bouton Démarrer/Arrêter l’affichage en direct pour afficher un flux en direct depuis la caméra. Cliquez ensuite sur Capture et Allez enregistrer l’image pour collecter une image de contraste de phase des cellules dans le champ de vision actuel. Adaptez la perle fluorescente pour une utilisation comme marqueur fiducial.Trouvez et adaptez toutes les localisations et tous les cadres de caméra à l’aide des seuils de modèle décrits dans le protocole texte. Sous la section Localiser DHPSF SM de l’interface graphique Easy-DHPSF, cliquez sur Exécuter pour s’adapter aux signaux d’une molécule unique, puis cliquez sur OK sur les fenêtres contexturées suivantes pour conserver les paramètres par défaut. Le logiciel trouvera des signaux de fluorescence à molécule unique qui ressemblent à la fonction de propagation des points à double hélice, puis tenteront de les adapter à l’aide d’un modèle double-gaussien.Au fur et à mesure que le script s’exécute, l’utilisateur verra un affichage des données d’image brutes ainsi qu’une image reconstruite des signaux mono molécule s’entisé avec succès. À l’aide d’un logiciel écrit sur mesure dans MATLAB, commencez par sélectionner manuellement cinq paires de points de contrôle dans la fenêtre contexturée en estimant et en cliquant approximativement sur les pôles cellulaires des cinq mêmes cellules dans les données de localisation à molécule unique et les contours cellulaires. Supprimez les cellules contenant moins de 10 localisations et supprimez les cellules qui sont placées partiellement en dehors du champ de vision, puis supprimez les cellules indésirables supplémentaires dans la fenêtre contexturée en cliquant à l’intérieur de leur contour cellulaire.Enfin, attribuez à cette cellule des localisations qui se trouvent à l’intérieur des limites du contour d’une cellule. Jetez les localisations qui ne se trouvent dans aucun contour cellulaire. Un facteur essentiel pour l’application réussie de ce protocole est de s’assurer que les signaux d’une molécule unique sont bien séparés les uns des autres.S’il y a plus d’une molécule de fluoration dans une cellule en même temps, alors la localisation peut être incorrectement assignée à la trajectoire d’une autre molécule. Ce protocole permet d’éliminer le problème de liaison en rejetant les trajectoires pour lesquelles deux localisations ou plus sont simultanément présentes dans la même cellule. Ainsi, si les signaux d’une molécule unique sont trop denses, une grande quantité de ces données sont automatiquement rejetées pendant le traitement.Selon les niveaux d’expression des protéines de fusion étiquetées fluorescentes, environ 200 à 3000 localisations peuvent être générées par cellule. Ces localisations peuvent donner entre 10 et 150 trajectoires. Un grand nombre de trajectoires sont nécessaires pour produire des distributions bien échantillonnées.On voit ici l’histogramme des coefficients de diffusion apparents pour près de 80 000 trajectoires mono molécule de la protéine de sécrétion YscQ de type 3 YscQ de type Yersinia étiquetée avec de la protéine fluorescente eYFP. L’YscQ se lie aux injectisomes intégrés à la membrane, ce qui entraîne une fraction des molécules, environ 24 % qui ne diffusent pas, comme l’indique la distribution indiquée en noir. Les molécules restantes d’YscQ diffusent librement dans le cytosol.Au cours de la méthode décrite ici, il est déterminé que les molécules yscQ non liées existent dans au moins trois états diffusifs distincts. Cette conclusion a été tirée en adaptant la distribution des coefficients de diffusion apparents à une bibliothèque de distributions simulées avec des coefficients de diffusion connus. Lorsqu’on tente de résoudre plusieurs états diffusifs, plusieurs milliers de trajectoires à molécule unique devraient être recueillies pour s’assurer que les distributions apparentes du coefficient de diffusion sont très bien échantillonnées.Le suivi d’une molécule unique peut être effectué dans des cellules de type sauvage ou chez des mutants de suppression génétique afin de déterminer si des états diffusifs spécifiques ne se manifestent que lorsqu’un partenaire de liaison moléculaire est présent. En résolvant les états diffusifs des protéines cytosoliques et des complexes protéiques à l’aide du suivi 3D d’une molécule unique, les chercheurs peuvent déterminer où, quand et comment les complexes de protéines oligomériques se forment dans les cellules vivantes. Travailler avec des sources laser de haute puissance et des agents pathogènes humains vivants peut être extrêmement dangereux.Les protocoles appropriés de sécurité au laser et de biosécurité doivent toujours être respectés.

Research

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Biochemistry

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FRET de haute précision au niveau d&#39;une molécule pour la détermination de la structure biomoléculaire

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