Name: single-molecule tracking microscopy - a tool for determining the diffusive states of cytosolic molecules
Uploaded: 2019-09-05T12:30:00
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Wir danken Alecia Achimovich und Ting Yan für die kritische Lektüre des Manuskripts. Wir danken Ed Hall, Senior Staff Scientist in der Advanced Research Computing Services Gruppe an der University of Virginia, für die Hilfe bei der Einrichtung der Optimierungsroutinen, die bei dieser Arbeit verwendet werden. Die Finanzierung dieser Arbeit wurde von der University of Virginia bereitgestellt.

1. Doppelhelix Punkt-Spread-Funktionskalibrierung
HINWEIS: Die in diesem und den folgenden Abschnitten beschriebenen Bilder werden mit einem kundenspezifischen invertierten Fluoreszenzmikroskop, wie in Rocha et al.23beschrieben, erstellt. Das gleiche Verfahren gilt für verschiedene Mikroskop-Implementierungen für die Ein-Molekül-Lokalisierung und Tracking-Mikroskopie2,3,4. All...

Ein entscheidender Faktor für die erfolgreiche Anwendung des vorgestellten Protokolls ist es, sicherzustellen, dass einmolekulare Signale gut voneinander getrennt sind (d.h. sie müssen räumlich und zeitlich spärlich sein (Ergänzende Mov. 1)). Wenn es mehr als ein Fluoreszenzmolekül in einer Zelle gleichzeitig gibt, dann könnte die Lokalisierung fälschlicherweise der Flugbahn eines anderen Moleküls zugeordnet werden. Dies wird als Verknüpfungsproblem30bezeichnet. Experime...

Die Untersuchung des diffusiven Verhaltens von Biomolekülen gibt Einblick in ihre biologischen Funktionen. Fluoreszenzmikroskopie-basierte Techniken sind zu wertvollen Werkzeugen für die Beobachtung von Biomolekülen in ihrer nativen Zellumgebung geworden. Fluoreszenzrückgewinnung nach Photobleichung (FRAP) und Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS)1 bieten ensemble-gemittelte diffusive Verhaltensweisen. Umgekehrt ermöglicht die Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie die Beobachtung einzelner fluoreszierend markierter Moleküle mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung2,3,4. Die Beobachtung einzelner Moleküle ist von Vorteil, da ein Protein von Interesse in verschiedenen diffusiven Zuständen existieren kann. Beispielsweise entstehen zwei leicht zu unterscheidende diffusive Zustände, wenn ein Transkriptionsregulator, wie CueR in Escherichia coli,frei im Zytosol diffundiert oder an eine DNA-Sequenz bindet und auf der Zeitskala der Messung immobilisiert wird5 . Ein-Molekül-Tracking bietet ein Werkzeug, um diese verschiedenen Zustände direkt zu beobachten, und anspruchsvolle Analysen sind nicht erforderlich, um sie zu lösen. Allerdings wird es schwieriger, mehrere diffusive Staaten und ihre Bevölkerungsfraktionen in Fällen zu lösen, in denen ihre diffusiven Raten ähnlicher sind. Aufgrund der Größenabhängigkeit des Diffusionskoeffizienten manifestieren sich z. B. unterschiedliche Oligomerisierungszustände eines Proteins als verschiedene diffusive Zustände6,7,8,9 , 10. Solche Fälle erfordern einen integrierten Ansatz in Bezug auf Datenerfassung, -verarbeitung und -analyse.
Ein kritischer Faktor, der die diffusiven Raten von zytosolischen Molekülen beeinflusst, ist die Wirkung der Eingrenzung durch die Zellgrenze. Die Beschränkungen für die molekulare Bewegung durch eine bakterielle Zellgrenze führen dazu, dass die gemessene Diffusionsrate eines zytosolischen Moleküls langsamer erscheint, als wenn dieselbe Bewegung in einem nicht begrenzten Raum aufgetreten wäre. Bei sehr langsam diffundierenden Molekülen ist die Wirkung der zellulären Einschließung aufgrund fehlender Kollisionen mit der Grenze vernachlässigbar. In solchen Fällen kann es möglich sein, diffusive Zustände genau aufzulösen, indem die Verteilungen von molekularen Verschiebungen, roder scheinbaren Diffusionskoeffizienten, D*,mithilfe analytischer Modelle, die auf den Gleichungen für die Brownsche Bewegung basieren ( zufällige Diffusion)11,12,13. Für schnell diffundierende zytosolische Moleküle ähneln die experimentellen Verteilungen jedoch nicht mehr denen, die aufgrund von Kollisionen von diffundierenden Molekülen mit den Zellgrenzen für eine unbeschränkte Brownsche Bewegung erhalten wurden. Die Eingrenzungseffekte müssen berücksichtigt werden, um die nicht begrenzten Diffusionskoeffizienten der fluoreszierend markierten Moleküle genau zu bestimmen. In jüngster Zeit wurden mehrere Ansätze entwickelt, um Die eingrenzende Wirkung entweder (halb-)analytisch 5,14,15,16 oder numerisch durch Monte-Carlo-Simulationen von Braune Diffusion6,10,16,17,18,19.
Hier bieten wir ein integriertes Protokoll zum Sammeln und Analysieren von Single-Molekül-Lokalisierungsmikroskopiedaten mit besonderem Fokus auf Single-Molekül-Tracking. Das Endziel des Protokolls ist es, diffusive Zustände von fluoreszierend markierten zytosolischen Proteinen in diesem Fall stabförmigen Bakterienzellen aufzulösen. Unsere Arbeit baut auf einem früheren Protokoll zur Einzelmolekülverfolgung auf, in dem eine DNA-Polymerase, PolI, durch Diffusionsanalyse20in einem DNA-gebundenen und ungebundenen Zustand nachgewiesen wurde. Hier erweitern wir die Einzelmolekül-Tracking-Analyse auf 3D-Messungen und führen realistischere Rechensimulationen durch, um mehrere diffusive Zustände gleichzeitig in Zellen aufzulösen und zu quantifizieren. Die Daten werden mit einem selbst gebauten 3D-Superauflösungsfluoreszenzmikroskop erfasst, das in der Lage ist, die 3D-Position von Fluoreszenzstrahlern durch Bildgebung mit der Doppelhelix-Punkt-Spread-Funktion (DHPSF)21,22zu bestimmen. Die rohen Einzelmolekülbilder werden mit individueller Software verarbeitet, um die 3D-Einzelmolekül-Lokalisationen zu extrahieren, die dann zu Einmolekül-Trajektorien kombiniert werden. Tausende von Flugbahnen werden gebündelt, um Verteilungen von scheinbaren Diffusionskoeffizienten zu erzeugen. In einem letzten Schritt passen die experimentellen Verteilungen zu numerisch generierten Verteilungen, die durch Monte-Carlo-Simulationen der Brownschen Bewegung in einem begrenzten Volumen erhalten werden. Wir wenden dieses Protokoll an, um die diffusiven Zustände des Typ-3-Sekretionssystemproteins YscQ in lebenden Yersinia enterocoliticazu lösen. Aufgrund seines modularen Charakters ist unser Protokoll allgemein auf jede Art von Einzelmolekül- oder Einzelpartikel-Tracking-Experiment in beliebigen Zellgeometrien anwendbar.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2,6-diaminopimelic acid</td>
			<td>Chem Impex International</td>
			<td>5411</td>
			<td>Necessary for growth of Y. enterocolitica cells used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4f lenses</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC508-080-A</td>
			<td>f = 80mm, 2&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>514 nm laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>Genesis MX514 MTM</td>
			<td>Use for fluorescence excitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>agarose</td>
			<td>Inivtrogen</td>
			<td>16520100</td>
			<td>Used to make gel pads to mount liquid bacterial sample on microscope.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9434</td>
			<td>M2G ingredient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bandpass filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET510/bp</td>
			<td>Excitation pathway.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain Heart Infusion</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>53286</td>
			<td>Growth media for Y. enterocolitica.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>223506</td>
			<td>M2G ingredient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>camera</td>
			<td>Imaging Source</td>
			<td>DMK 23UP031</td>
			<td>Camera for phase contrast imaging.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dielectric phase mask</td>
			<td>Double Helix, LLC</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Produces DHPSF signal.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>disodium phosphate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>795410</td>
			<td>M2G ingredient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S311-100</td>
			<td>Chelates Ca2+. Induces secretion in the T3SS.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flip mirror</td>
			<td>Newport</td>
			<td>8892-K</td>
			<td>Allows for switching between fluorescence and phase contrast pathways.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fluospheres</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8792</td>
			<td>Fluorescent beads. 540/560 exication and emission wavelengths. 40 nm diameter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass cover slip</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-302</td>
			<td>#1.5, 22mmx22mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose</td>
			<td>Chem Impex International</td>
			<td>811</td>
			<td>M2G ingredient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>immersion oil</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Z-81025</td>
			<td>Placed on objective lens.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iron(II) sulfate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F0518</td>
			<td>M2G ingredient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>long pass filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>LP02-514RU-25</td>
			<td>Emission pathway.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnesium sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S25414A</td>
			<td>M2G ingredient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope platform</td>
			<td>Mad City Labs</td>
			<td>custom</td>
			<td>Platform for inverted microscope.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nalidixic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N4382</td>
			<td>Y. enterocolitica cells used are resistant to nalidixic acid.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>objective lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>1-U2B991</td>
			<td>60X, 1.4 NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ozone cleaner</td>
			<td>Novascan</td>
			<td>PSD-UV4</td>
			<td>Used to eliminate background fluorescence on glass cover slips.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium phosphate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>795488</td>
			<td>M2G ingredient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red LED</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>M625L3</td>
			<td>Illuminates sample for phase contrast imaging. 625nm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>ORCA-Flash 4.0 V2</td>
			<td>Camera for fluorescence imaging.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>short pass filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET700SP-2P8</td>
			<td>Emission pathway.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube lens</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC508-180-A</td>
			<td>f=180 mm, 2&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yersinia enterocolitica dHOPEMTasd</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Strain AD4442, eYFP-YscQ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>zero-order quarter-wave plate</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>WPQ05M-514</td>
			<td>Excitation pathway.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-molecule tracking microscopy - a tool for determining the diffusive states of cytosolic molecules

Die Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie untersucht die Position und Bewegungen einzelner Moleküle in lebenden Zellen mit einer räumlichen und Millisekunden-Zeitlichen Auflösung von Zehnmetern Nanometer. Diese Fähigkeiten machen die Einmolekül-Lokalisationsmikroskopie ideal geeignet, um biologische Funktionen auf molekularer Ebene in physiologisch relevanten Umgebungen zu untersuchen. Hier zeigen wir ein integriertes Protokoll zur Erfassung und Verarbeitung/Analyse von Single-Molekül-Tracking-Daten, um die verschiedenen diffusiven Zustände zu extrahieren, die ein Protein von Interesse aufweisen kann. Diese Informationen können verwendet werden, um molekulare komplexe Bildung in lebenden Zellen zu quantifizieren. Wir bieten eine detaillierte Beschreibung eines kamerabasierten 3D-Einzelmolekül-Lokalisierungsexperiments sowie der nachfolgenden Datenverarbeitungsschritte, die die Bahnen einzelner Moleküle ergeben. Diese Bahnen werden dann mit hilfe eines numerischen Analyserahmens analysiert, um die vorherrschenden diffusiven Zustände der fluoreszierend markierten Moleküle und die relative Häufigkeit dieser Zustände zu extrahieren. Das Analyseframework basiert auf stochastischen Simulationen intrazellulärer Brownianer Diffusionsbahnen, die durch eine beliebige Zellgeometrie räumlich begrenzt sind. Basierend auf den simulierten Flugbahnen werden rohe Einzelmolekülbilder auf die gleiche Weise erzeugt und analysiert wie experimentelle Bilder. Auf diese Weise werden experimentelle Präzisions- und Genauigkeitseinschränkungen, die experimentell schwer zu kalibrieren sind, explizit in den Analyse-Workflow integriert. Der Diffusionskoeffizient und die relativen Bevölkerungsfraktionen der vorherrschenden diffusiven Zustände werden bestimmt, indem die Verteilungen der experimentellen Werte mithilfe linearer Kombinationen simulierter Verteilungen einzupassen sind. Wir demonstrieren den Nutzen unseres Protokolls, indem wir die diffusiven Zustände eines Proteins auflösen, das bei der Bildung von homo- und heterooligomeren Komplexen im Zytosol eines bakteriellen Erregers unterschiedliche diffusive Zustände aufweist.

Unter den hier beschriebenen Experimentellen Bedingungen (20.000 Frames, Trajektollänge mindestens 4 Lokalisationen) und je nach Expressionsniveau der fluoreszierend markierten Fusionsproteine, ergeben ca. 200-3.000 Lokalisationen 10-150 Pro Zelle können Flugbahnen erzeugt werden (Abbildung 2a,b). Eine große Anzahl von Flugbahnen ist notwendig, um eine gut beprobte Verteilung der scheinbaren Diffusionskoeffizienten zu erzeugen. Die Größe...

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Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules

Die 3D-Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie wird verwendet, um die räumlichen Positionen und Bewegungsbahnen fluoreszierend markierter Proteine in lebenden Bakterienzellen zu untersuchen. Das hier beschriebene experimentelle und Datenanalyseprotokoll bestimmt das vorherrschende diffusive Verhalten von zytosolischen Proteinen auf der Grundlage gepoolter Einzelmolekülbahnen.

Single-Molecule Tracking-Mikroskopie - Ein Werkzeug zur Bestimmung der diffusiven Zustände von zytosolischen Molekülen

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and ...

3D-Einzelmolekül-Tracking kann die subzellulären Lokalisierungen und Bewegungsverhalten einzelner Proteine bestimmen. Die Beobachtung der Bewegung eines Proteins in einer lebenden Zelle liefert wichtige Einblicke in die Interaktion mit Bindungspartnern in seiner heimischen Umgebung. Die hier vorgestellte Methode bietet einen allgemeinen Rahmen für die Analyse von Tracking-Daten mit einzelnen Molekülen, um die diffusiven Zustände biologischer Moleküle aufzulösen.Es kann sowohl auf 2D- als auch auf 3D-Trajektorien angewendet werden, die auf beliebig geformte Zellvolumen beschränkt sind. Nach der Ablagerung von fluoreszierender Perle in einem vorgefertigten Agarose-Pad, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben, legen Sie es auf einen Mikroskopdeckel-Slip und befestigen Sie den Deckelschlupf am Mikroskopprobenhalter. Der Probenhalter wird dann auf ein invertiertes Fluoreszenzmikroskop montiert.Dann initialisieren Sie die grafische Benutzeroberfläche des Mikroskops; hier wird kundenspezifische Software in MATLAB zur Instrumentensteuerung verwendet. Initialisieren Sie die Kamerasoftware HCImage Live. Legen Sie auf der Registerkarte Aufnahme unter dem Abschnitt Kamerasteuerung die Belichtungszeit auf 0,03 Sekunden fest, und klicken Sie dann auf Live, um einen Live-Feed der Kamera zu starten.Klicken Sie auf die entsprechende Schaltfläche Laser öffnen auf der GUI-Schnittstelle, um den Laser zu entsperren und die fluoreszierenden Perlen auf dem Agarose-Pad zu erregen. Zeigen Sie die Fluoreszenzemission auf der Kamera im Livestream-Modus an. Passen Sie die X- und Y-Positionen der Mikroskopstufe an, indem Sie auf die XY-Positionspfeile unter dem Abschnitt Mikro-Positionierungsstufe der Benutzeroberfläche klicken, um mindestens eine fluoreszierende Perle in der Mitte des Sichtfeldes zu positionieren.Ändern Sie ggf. die Schrittgröße, indem Sie auf das Dropdown-Feld unter den Pfeilen klicken. Passen Sie als nächstes die Z-Position der Mikroskopstufe an, indem Sie auf die Z-Positionspfeile unter dem Abschnitt Nano-Positionierungsstufe klicken. Legen Sie die Ausrichtung der Doppelhelix-Punkt-Spread-Funktion der fluoreszierenden Perle vertikal fest.Diese vertikale Ausrichtung wird als Ausgangspunkt in der Z-Kalibrierung definiert. Scannen Sie 30 Schritte über und unter der Start-Z-Position in 50 Nanometer-Schritten. Zeichnen Sie 10 Frames bei jedem Schritt mit einer Belichtungszeit von 0,03 Sekunden auf.Um die automatisierte Datenerfassung zu starten, klicken Sie unter Z-Kalibrierung auf Gehen. Zentrifugieren Sie einen Milliliter hitzegeschockter Yersinia enterocolitica Kultur bei 5.000-facher Schwerkraft für drei Minuten bei Raumtemperatur, entfernen Sie dann die Kultur und entsorgen Sie den Überstand. Waschen Sie das Pellet dreimal mit einem Milliliter M2G-Medien.Nach der endgültigen Spülung, setzen Sie die pelletierten Bakterien in 250 Mikroliter M2G-Medien. Als nächstes fügen Sie fluoreszierende Perlen als Treuhandmarker zu verwenden. Die fluoreszierende Perlenlösung sollte so hinzugefügt werden, dass es nur ein bis zwei Perlen pro Sichtfeld gibt, wenn man sie im Mikroskop betrachtet.Mischen Sie die Suspension vorsichtig durch Wirbeln, um alle aggregierten Zellen zu trennen und 1,5 Mikroliter der Suspension auf ein 1,5 bis 2%Agarose-Pad aus M2G zu legen, dann das Pad invertieren und auf einen ozongereinigten Mikroskopdeckel legen. Fügen Sie einen Tropfen Tauchöl auf das Mikroskopobjektiv und legen Sie den Probenhalter auf die Mikroskopstufe und sichern Sie ihn an Ort und Stelle. Initialisieren Sie die grafische Benutzeroberfläche, um die Kamera, die Probenphase und die Anregungslaser des Mikroskops zu steuern, und initialisieren Sie dann die Kamerasoftware.Legen Sie auf der Registerkarte Aufnahme unter dem Abschnitt Kamerasteuerung die Belichtungszeit auf 0,025 Sekunden fest, und klicken Sie dann auf Live, um einen Live-Feed der Kamera zu starten. Passen Sie die X- und Y-Positionen der Mikroskopstufe an, indem Sie auf die XY-Positionspfeile unter dem Abschnitt Mikropositionierstufe klicken, um die Probe zu scannen und ein Sichtfeld mit einer entsprechend dichten Population von Bakterienzellen zu finden. Um den Datendurchsatz zu maximieren, sollte die Zelldichte auf dem Abdeckzettel so hoch wie möglich sein, ohne dass sich die Zellen überlappen oder berühren.Das Sichtfeld sollte auch mindestens eine fluoreszierende Perle als Treuhandmarker enthalten, damit die Stufenverschiebung gemessen werden kann, während die Daten erfasst werden. Passen Sie als nächstes die Z-Position der Mikroskopstufe an, indem Sie auf die Z-Positionspfeile unter dem Abschnitt Nano-Positionierungsstufe klicken, so dass die doppelhelixischen Punkt-Spread-Funktionslappen der fluoreszierenden Perlen vertikal sind. Gehen Sie dann zu Sequenz und wählen Sie Scan-Einstellungen aus.Ändern Sie die Anzahl der Frameanzahl in 20.000. Wählen Sie als Nächstes einen Speicherzielordner aus, indem Sie auf die Schaltfläche mit drei Punkten klicken. Klicken Sie schließlich auf Start, um bis zu 20.000 Kamerabilder mit einer kurzen Belichtungszeit von 0,025 Sekunden zu sammeln.Wenn Sie fertig sind, blockieren Sie die Laserbeleuchtung, indem Sie auf die entsprechende Schaltfläche Laser schließen in der grafischen Benutzeroberfläche klicken. Dann sammeln Sie 200 Bilder mit dunklen Bildern mit der gleichen Belichtungszeit. Aktivieren Sie das Kästchen neben Thorlabs LED und klicken Sie dann auf Mirror Up umschalten. Dies schaltet das LED-Licht über der Probe ein und schaltet das Mikroskop vom Fluoreszenzweg auf den Phasenkontrastweg um.Initialisieren Sie die Datenerfassungssoftware auf dem Phasenkontrastpfad und drücken Sie die Schaltfläche Start/Stop Live Display, um einen Live-Feed von der Kamera anzuzeigen. Klicken Sie dann auf Erfassen und Gehe, um das Bild zu speichern, um ein Phasenkontrastbild der Zellen im aktuellen Ansichtsfeld zu sammeln. Passen Sie die fluoreszierende Perle für den Einsatz als Treuhandmarker an.Suchen und Passen aller Lokalisierungen und aller Kamerarahmen mithilfe der Vorlagenschwellenwerte, wie im Textprotokoll beschrieben. Klicken Sie im Abschnitt Lokalisieren von DHPSF SM in der Easy-DHPSF-GUI auf Ausführen, um einzelne Molekülsignale anzupassen, und klicken Sie dann auf OK in den folgenden Popupfenstern, um die Standardeinstellungen beizubehalten. Die Software findet einmolekulare Fluoreszenzsignale, die der Doppelhelix-Punkt-Spread-Funktion ähneln und dann versuchen, sie mit einem Doppel-Gauß-Modell zu passen.Während das Skript ausgeführt wird, wird der Benutzer eine Anzeige der Rohbilddaten sowie ein rekonstruiertes Bild der erfolgreich angepassten Einzelmolekülsignale sehen. Verwenden Sie benutzerdefinierte Software in MATLAB, indem Sie manuell fünf Kontrollpunktpaare im Pop-up-Fenster auswählen, indem Sie grob schätzen und auf die Zellpole der gleichen fünf Zellen sowohl in den Einzelmolekül-Lokalisierungsdaten als auch auf Zellumrisse klicken. Löschen Sie Zellen mit weniger als 10 Lokalisierungen, und entfernen Sie Zellen, die teilweise außerhalb des Ansichtsfelds positioniert sind, und löschen Sie dann alle zusätzlichen unerwünschten Zellen im Popupfenster, indem Sie in die Gliederung ihrer Zellen klicken.Weisen Sie schließlich Lokalisierungen zu, die sich innerhalb der Grenze der Gliederung einer Zelle befinden, zu dieser Zelle. Verwerfen Sie alle Lokalisierungen, die sich nicht innerhalb einer Zellumrisslinie befinden. Ein entscheidender Faktor für die erfolgreiche Anwendung dieses Protokolls ist es, sicherzustellen, dass die Einmolekülsignale gut voneinander getrennt sind.Wenn sich mehr als ein Fluoreszenzmolekül gleichzeitig in einer Zelle befindet, kann die Lokalisierung der Flugbahn eines anderen Moleküls falsch zugeordnet werden. Dieses Protokoll wird das Verknüpfungsproblem beseitigt, indem alle Flugbahnen verworfen werden, für die zwei oder mehr Lokalisierungen gleichzeitig in derselben Zelle vorhanden sind. Wenn also einmolekulare Signale zu dicht sind, wird eine große Menge dieser Daten während der Verarbeitung automatisch verworfen.Je nach Expressionsniveau der fluoreszierend markierten Fusionsproteine können pro Zelle etwa 200 bis 3 000 Lokalisationen erzeugt werden. Diese Lokalisierungen können zwischen 10 und 150 Flugbahnen ergeben. Eine große Anzahl von Flugbahnen ist notwendig, um gut beprobte Verteilungen zu erzeugen.Hier ist das Histogramm der scheinbaren Diffusionskoeffizienten für fast 80.000 Einzelmolekül-Trajektorien des Yersinia Enterocolitica Typ 3 Sekretionsproteins YscQ mit fluoreszierendem Protein eYFP gekennzeichnet. YscQ bindet an membranintegrierte Injektionen, was zu einem Bruchteil von Molekülen führt, etwa 24%, die nicht diffundieren, wie die in Schwarz gezeigte Verteilung zeigt. Die restlichen YscQ-Moleküle diffundieren frei im Zytosol.Während der hier beschriebenen Methode wird festgestellt, dass ungebundene YscQ-Moleküle in mindestens drei unterschiedlichen diffusiven Zuständen existieren. Zu dieser Schlussfolgerung wurde die Verteilung der scheinbaren Diffusionskoeffizienten mit einer Bibliothek simulierter Verteilungen mit bekannten Diffusionskoeffizienten gebracht. Beim Versuch, mehrere diffusive Zustände aufzulösen, sollten mehrere tausend Einzelmolekülbahnen gesammelt werden, um sicherzustellen, dass die scheinbaren Diffusionskoeffizientenverteilungen sehr gut beprobt werden.Ein-Molekül-Tracking kann in Wildtypzellen oder in genetischen Deletionsmutanten durchgeführt werden, um festzustellen, ob bestimmte diffusive Zustände nur manifestieren, wenn ein molekularer Bindungspartner vorhanden ist. Durch die Auflösung der diffusiven Zustände von zytosolischen Proteinen und Proteinkomplexen mittels 3D-Einzelmolekül-Tracking können Forscher bestimmen, wo, wann und wie sich oligomere Proteinkomplexe in lebenden Zellen bilden. Die Arbeit mit Hochleistungslaserquellen und lebenden menschlichen Krankheitserregern kann extrem gefährlich sein.Angemessene Lasersicherheits- und Biosicherheitsprotokolle sollten immer befolgt werden.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

Hochpräzisions-FRET auf Einzelmolekül-Niveau für die Bestimmung der Biomolekülstruktur

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Forschung

Biochemie

A Simple, Robust, and High Throughput Single Molecule Flow Stretching Assay Implementation for Studying Transport of Molecules Along DNA

Einfach, Robust und hohen Durchsatz Molekül fließen Stretching Assay-Implementierung für das Studium Transport von Molekülen entlang DNA

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, ...

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

Einzelmolekül-Manipulation von G-Quadruplexe von magnetischen Pinzette

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Kovalente Immobilisierung von Proteinen für die Einzelmolekül-Spektroskopie Kraft

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Proteom-weite Quantifizierung des Benennens Homogenität auf der Ebene des einzelnen Moleküls

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Produktion von Dynein und Kinesin Motor Ensembles auf DNA Origami Nanostrukturen für die Einzelmolekülbeobachtung

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Conventional BODIPY Conjugates for Live-Cell Super-Resolution Microscopy and Single-Molecule Tracking

Konventionelle BODIPY-Konjugate für Live-Cell Super-Resolution-Mikroskopie und Single-Molecule Tracking

Single molecule localization microscopy (SMLM) techniques overcome the optical diffraction limit of conventional fluorescence microscopy and can resolve ...

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

Ein In Vitro Single-Molecule Imaging Assay zur Analyse von cap-dependent Translation Kinetics

Cap-dependent protein synthesis is the predominant translation pathway in eukaryotic cells. While various biochemical and genetic approaches have allowed ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Einzelzellanalyse transkriptionell aktiver Allele mittels Einzelmolekül FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Making Precise and Accurate Single-Molecule FRET Measurements using the Open-Source smfBox

Präzise und genaue Einzelmolekül-FRET-Messungen mit der Open-Source-smfBox

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes ...