Name: single-molecule tracking microscopy - a tool for determining the diffusive states of cytosolic molecules
Uploaded: 2019-09-05T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules at JoVE.com

אנו מודים אלישה אחמוביץ ' וטינג יאן על הקריאה הקריטית של כתב היד. אנו מודים לאד הול, מדען סגל בכיר בקבוצת שירותי המחשוב המתקדם באוניברסיטת וירג, לקבלת עזרה בהקמת רוטינות האופטימיזציה המשמשות בעבודה זו. המימון לעבודה זו סופק על ידי אוניברסיטת וירג.

1. כיול כפולה של נקודת-הכפולה
הערה: התמונות המתוארות בסעיף זה והסעיפים הבאים נרכשים באמצעות מיקרוסקופ הפוך מותאם אישית מובנה, כפי שמתואר ברוצ'ה ואח '23. אותו הליך חל על יישומי מיקרוסקופ שונים המיועדים ללוקליזציה של מולקולה אחת ולמעקב אחר מיקרוסקופ2...

גורם קריטי ליישום המוצלח של הפרוטוקול המוצג הוא לוודא שאותות מולקולות בודדות מופרדים היטב זה מזה (כלומר, הם צריכים להיות דלילים בחלל ובזמן (Mov משלימים 1)). אם יש יותר ממולקולה רואה אחת בתא באותו זמן, לוקליזציה ניתן להקצות באופן שגוי מסלול אחר של מולקולות. הדבר נקרא בעיית הקישור<sup class...

בחינת ההתנהגות הbiomolecules מספקת תובנה לתפקודים הביולוגיים. מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית מבוססי הפכו כלים יקרי ערך להתבוננות biomolecules בסביבת התא יליד שלהם. התאוששות פלואורסצנטית לאחר photobleaching לבנה (FRAP) ו ספקטרוסקופיית מתאם פלואורסצנטית (FCS)1 לספק התנהגויות ממוצעים של הרכב. לעומת זאת, מיקרוסקופ חד-מולקולות לוקליזציה מאפשר התבוננות של מולקולות מתויגות בודדות עם שתייגת מרחבית גבוהה וברזולוציה טמפורלית2,3,4. התבוננות במולקולות בודדות היא יתרון מאחר שחלבון של עניין עשוי להתקיים במצבים מפזרים שונים. לדוגמה, שני מצבים מפזרים בקלות מופיעים כאשר מווסת משתנה, כגון CueR ב- es,מפזר באופן חופשי בציטוזול, או נקשר לרצף דנ א והופך להיות מאוגד על ציר הזמן של מדידה5 . מעקב באמצעות מולקולה בודדת מספק כלי להתבוננות ישירה במצבים שונים אלה, וניתוחים מתוחכמים אינם נדרשים לפתרונן. עם זאת, הוא הופך ליותר מאתגר לפתור מצבים מפזרים מרובים ושברי האוכלוסייה שלהם במקרים שבהם שיעורי התפוצתם דומים יותר. לדוגמה, בשל התלות בגודל של מקדם הדיפוזיה, מדינות האויגמרים שונות של חלבון מתגלשות את עצמן כמצבים מפזרים שונים6,7,8,9 , 10. מקרים כאלה דורשים גישה משולבת במונחים של רכישת נתונים, עיבוד וניתוח.
גורם קריטי המשפיע על שיעורי התפוצו של מולקולות ציטוסולג היא השפעת הכליאה בגבול התא. ההגבלות המוטלות על תנועה מולקולרית על ידי גבול תא חיידקי לגרום מולקולות ציטוסולריות נמדד שיעור דיפוזיה להופיע איטי יותר מאשר אם התנועה אותה התרחשה בחלל לא סגור. עבור מולקולות מאוד איטיות, ההשפעה של הכליאה התאית היא זניחה עקב חוסר התנגשויות עם הגבול. במקרים כאלה, ייתכן שיהיה אפשר לפתור במדויק מצבים מפזרים על ידי התאמת ההפצות של displacements מולקולרית, rאו מקדמי דיפוזיה לכאורה, D *, באמצעות מודלים אנליטיים המבוססים על המשוואות לתנועה בראונית ( דיפוזיה אקראית)11,12,13. עם זאת, לצורך הפצת מולקולות ציטוסוליות מהירות, ההפצות הנסיוניות כבר אינן דומות לאלה שהתקבלו לתנועה בראונית לא מוגבלת עקב התנגשויות של מולקולות מדומות עם גבולות התא. יש לבדוק את השפעות הכליאה כדי לקבוע במדויק את מקדמי הדיפוזיה הבלתי מוגבל של המולקולות המסומנות בתווית הפלואורוסקופים. מספר גישות פותחו לאחרונה לחשבון עבור הכליאה השפעות או (semi-) באופן אנליסטי 5,14,15,16 או מספרית דרך סימולציות מונטה קרלו של דיפוזיה בראונית6,10,16,17,18,19.
כאן, אנו מספקים פרוטוקול משולב לאיסוף וניתוח נתוני מיקרוסקופ לוקליזציה של מולקולה אחת בדגש מסוים על מעקב יחיד-מולקולה. המטרה הסופית של הפרוטוקול היא לפתור מצבים מפזרים של חלבונים ציטוסקופים בעלי שם התווית בתוך, במקרה זה, תאים חיידקיים בצורת מוט. העבודה שלנו בונה על פרוטוקול קודם עבור מעקב חד מולקולות, שבו DNA פולימראז, PolI, הוכח להתקיים ב-DNA מאוגד ומצב לא מאוגד על ידי ניתוח דיפוזיה20. כאן, אנו מרחיבים ניתוח מעקב חד-מולקולות למדידות תלת-ממדית ומבצעים סימולציות חישוביות ריאליות יותר כדי לפתור ולכמת מספר רב של מצבים מפזרים בו המצויים בתאים. הנתונים נרכשים באמצעות ביתי בנוי 3d ברזולוציה גבוהה מיקרוסקופ פלורסנט אשר מסוגל לקבוע את מיקום 3d של הפולטים פלואורסצנט על ידי הדמיה עם הסליל כפול הפריסה-פונקציה (dhpsf)21,22. התמונות raw-מולקולה בודדת מעובדות באמצעות תוכנה כתובה מותאמת אישית כדי לחלץ את 3D מולקולה חד-ממדית לוקליזציה, אשר משולבים אז לתוך המולקולה יחיד מסלולים. אלפי מסלולים ממאגר להפקת הפצות של מקדמי דיפוזיה לכאורה. בשלב האחרון, ההפצות הנסיוניות מתאימות להפצות שהופקו באמצעות מספרים שהתקבלו באמצעות סימולציות מונטה-קרלו של תנועה בראונית בכרך מוגבל. אנו מיישמים פרוטוקול זה כדי לפתור את המצבים המפזרים של הפרשה סוג 3 חלבון מערכת YscQ בחיים Yersinia בידור. בשל אופיו המודולרי, הפרוטוקול שלנו מתאים בדרך כלל לכל סוג של ניסוי מעקב יחיד או חלקיק בודד, באמצעות מערכות שרירותיות המתאימות לתאים.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2,6-diaminopimelic acid</td>
			<td>Chem Impex International</td>
			<td>5411</td>
			<td>Necessary for growth of Y. enterocolitica cells used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4f lenses</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC508-080-A</td>
			<td>f = 80mm, 2&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>514 nm laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>Genesis MX514 MTM</td>
			<td>Use for fluorescence excitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>agarose</td>
			<td>Inivtrogen</td>
			<td>16520100</td>
			<td>Used to make gel pads to mount liquid bacterial sample on microscope.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9434</td>
			<td>M2G ingredient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bandpass filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET510/bp</td>
			<td>Excitation pathway.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain Heart Infusion</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>53286</td>
			<td>Growth media for Y. enterocolitica.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>223506</td>
			<td>M2G ingredient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>camera</td>
			<td>Imaging Source</td>
			<td>DMK 23UP031</td>
			<td>Camera for phase contrast imaging.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dielectric phase mask</td>
			<td>Double Helix, LLC</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Produces DHPSF signal.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>disodium phosphate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>795410</td>
			<td>M2G ingredient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S311-100</td>
			<td>Chelates Ca2+. Induces secretion in the T3SS.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flip mirror</td>
			<td>Newport</td>
			<td>8892-K</td>
			<td>Allows for switching between fluorescence and phase contrast pathways.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fluospheres</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8792</td>
			<td>Fluorescent beads. 540/560 exication and emission wavelengths. 40 nm diameter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass cover slip</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-302</td>
			<td>#1.5, 22mmx22mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose</td>
			<td>Chem Impex International</td>
			<td>811</td>
			<td>M2G ingredient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>immersion oil</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Z-81025</td>
			<td>Placed on objective lens.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iron(II) sulfate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F0518</td>
			<td>M2G ingredient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>long pass filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>LP02-514RU-25</td>
			<td>Emission pathway.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnesium sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S25414A</td>
			<td>M2G ingredient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope platform</td>
			<td>Mad City Labs</td>
			<td>custom</td>
			<td>Platform for inverted microscope.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nalidixic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N4382</td>
			<td>Y. enterocolitica cells used are resistant to nalidixic acid.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>objective lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>1-U2B991</td>
			<td>60X, 1.4 NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ozone cleaner</td>
			<td>Novascan</td>
			<td>PSD-UV4</td>
			<td>Used to eliminate background fluorescence on glass cover slips.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium phosphate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>795488</td>
			<td>M2G ingredient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red LED</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>M625L3</td>
			<td>Illuminates sample for phase contrast imaging. 625nm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>ORCA-Flash 4.0 V2</td>
			<td>Camera for fluorescence imaging.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>short pass filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET700SP-2P8</td>
			<td>Emission pathway.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube lens</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC508-180-A</td>
			<td>f=180 mm, 2&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yersinia enterocolitica dHOPEMTasd</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Strain AD4442, eYFP-YscQ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>zero-order quarter-wave plate</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>WPQ05M-514</td>
			<td>Excitation pathway.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-molecule tracking microscopy - a tool for determining the diffusive states of cytosolic molecules

מיקרוסקופ חד-מולקולות לוקליזציה מטפל בעמדה ובתנועות של מולקולות בודדות בתאים חיים עם עשרות ברזולוציה מרחבית ומאלפית שניה של נאנמטר. יכולות אלה הופכים מיקרוסקופ חד-מולקולות לוקליזציה מתאים באופן אידיאלי לחקר פונקציות ביולוגיות ברמה המולקולרית בסביבות רלוונטיות מבחינה פיזיולוגית. כאן, אנו מדגימים פרוטוקול משולב עבור רכישת ועיבוד/ניתוח של מולקולה בודדת מעקב נתונים כדי לחלץ את המצבים המפזרים שונים חלבון הריבית עשוי להפגין. מידע זה ניתן להשתמש כדי לכמת היווצרות קומפלקס מולקולרי בתאי החיים. אנו מספקים תיאור מפורט של ניסוי לוקליזציה של מולקולה בודדת תלת-ממד המבוסס על המצלמה, כמו גם את הצעדים הבאים עיבוד נתונים התשואה מסלולים של מולקולות בודדות. מסלולים אלה נותחו לאחר מכן באמצעות מסגרת ניתוח מספרית כדי לחלץ את המצבים המפזרים הנפוצים של מולקולות המסומנות באמצעות פלואורוסקופים ואת השפע היחסי של מצבים אלה. מסגרת הניתוח מתבססת על סימולציות סטוכסטיים של מסלולים בראוניים מתחום הדיפוזיה התאית, אשר מוגבלים בגיאומטריה של תאים שרירותיים. בהתבסס על מסלולים מדומים, תמונות raw מולקולה אחת נוצרות ונותחו באותו אופן כמו תמונות ניסיוני. בדרך זו, מגבלות דיוק ודיוק נסיוניות, שקשה לכייל את הניסוי, משולבים באופן מפורש בתהליך הניתוח. מקדם הדיפוזיה ושברי האוכלוסיה היחסיים של מדינות הפיזור הנפוצות נקבעים על-ידי התאמת הפצות הערכים הניסיוניים באמצעות שילובים ליניאריים של הפצות מדומה. אנו מדגימים את השירות של הפרוטוקול שלנו על ידי פתרון המצבים המפזרים של חלבון אשר מציג מצבים מפזרים שונים על יצירת הומו-והטרוסקסואל מתחמים oligomeric ב ציטוסול של פתוגן חיידקי.

תחת התנאים הניסיוניים המתוארים כאן (20,000 מסגרות, אורך מסלול מינימום של 4 לוקליזציה) ובהתאם לרמות הביטוי של חלבונים היתוך בעלי תוויות פיוז'ן, כ 200-3000 לוקליזציה מניב 10-150 ניתן ליצור מסלולים לכל תא (איור 2a, b). יש צורך במספר רב של מסלולים כדי ליצור התפלגות...

Watch this Scientific Journal Video about Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules at JoVE.com

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules

3D מיקרוסקופ לוקליזציה יחיד מולקולה מנוצל כדי לחקור את המיקומים מרחבי ומסלולי תנועה של חלבונים המסומנים באנרגיה בתאי בקטריאלי חיים. פרוטוקול ניתוח הנתונים הניסיוני והמידע המתואר להלן קובע את ההתנהגויות התפוצזות הנפוצות של חלבונים ציטוסולמים בהתבסס על מסלולים בעלי מולקולה בודדת.

מיקרוסקופ מעקב חד-מולקולה-כלי לקביעת המדינות התפוצבניות של מולקולות ציטוסולג

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and ...

מעקב תלת-מימדי אחר מולקולה אחת יכול לקבוע את לוקליזציה תת-תאית והתנהגויות תנועה של חלבונים בודדים. התבוננות בתנועה של חלבון בתא חי מספקת תובנות חשובות על האינטראקציה שלו עם שותפים מחייבים בסביבתו הטבעית. השיטה המוצגת כאן מספקת מסגרת כללית לניתוח נתוני מעקב של מולקולה אחת כדי לפתור את המצבים המפזורים של מולקולות ביולוגיות.ניתן להחיל אותו הן על מסלולים תלת-מימדיים והן על מסלולים תלת-מימדיים המוגבלים לאמצעי אחסון של תאים בצורה שרירותית. לאחר הפקדת חרוז פלואורסצנטי במשטח אגרוז שהוכן מראש כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה, מניחים אותו על פתק כיסוי מיקרוסקופ ומאבטחים את החלקת המכסה למחזיק דגימת המיקרוסקופ. לאחר מכן, מחזיק הדגימה מותקן על מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך.לאחר מכן אתחל את ממשק המשתמש הגרפי של המיקרוסקופ;כאן, תוכנה כתובה בהתאמה אישית ב- MATLAB משמשת לבקרת מכשירים. אתחל את תוכנת המצלמה HCImage Live. בכרטיסיה לכידה תחת המקטע בקרת מצלמה, הגדר את זמן החשיפה ל- 0.03 שניות ולאחר מכן לחץ על שידור חי כדי להתחיל הזנה חיה של המצלמה.לחץ על כפתור לייזר פתוח המתאים בממשק GUI כדי לבטל את חסימת הלייזר ולרגש את חרוזים פלואורסצנטיים על כרית אגרוז. הצג את פליטת הפלואורסצנטיות במצלמה באמצעות מצב שידור חי. התאם את מיקומי ה- X וה- Y של שלב המיקרוסקופ על-ידי לחיצה על החצים XY-Position מתחת למקטע שלב מיקום מיקרו של ממשק המשתמש כדי למקם לפחות חרוז פלואורסצנטי אחד במרכז שדה המבט.במידת הצורך, לשנות את גודל הצעד על ידי לחיצה על התיבה הנפתחת מתחת החצים. לאחר מכן התאימו את מיקום Z של שלב המיקרוסקופ על-ידי לחיצה על החצים Z-Position מתחת למקטע שלב מיקום ננו. הגדר את הכיוון של פונקציית כפולת ההפצה של נקודת הסליל של חרוז הפלואורסצנט לאנכית.כיוון אנכי זה מוגדר כנקודת ההתחלה בכיול Z. סרוק 30 שלבים מעל ומתחת למיקום Z ההתחלתי במרווחים של 50 ננומטר. הקלט 10 מסגרות בכל שלב תוך זמן חשיפה של 0.03 שניות.כדי להתחיל את רכישת הנתונים האוטומטית, לחץ על עבור תחת כיול Z. צנטריפוגה מיליליטר אחד של תרבות Yersinia enterocolitica בהלם חום ב 5, 000 פעמים כוח הכבידה במשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר ואז להסיר את התרבות ולהשליך את העל טבעי. לשטוף את גלולה שלוש פעמים עם מיליליטר אחד של מדיה M2G.לאחר שטיפה הסופית, תן שימוש חוזר בחיידקים גלולה ב 250 microliters של מדיה M2G. לאחר מכן להוסיף חרוזי פלואורסצנט להשתמש כמו סמנים נאמנות. יש להוסיף את פתרון חרוז הפלואורסצנט כך שיהיו רק 1-2 חרוזים לכל שדה מבט כאשר הם נצפו במיקרוסקופ.מערבבים בעדינות את ההשעיה על ידי מערבולת כדי להפריד את כל התאים המצטברים ואת הצלחת 1.5 microliters של ההשעיה על כרית 1.5 עד 2% agarose עשה עם M2G, ואז להפוך את הפנקס ולהניח אותו על פתק כיסוי מיקרוסקופ ניקה אוזון. מוסיפים טיפת שמן טבילה על מטרת המיקרוסקופ ומ מניחים את מחזיק הדגימה על שלב המיקרוסקופ ומאבטחים אותו במקומו. אתחל את ממשק המשתמש הגרפי כדי לשלוט במצלמת המיקרוסקופ, שלב הדגימה ולייזר העירור ולאחר מכן אתחל את תוכנת המצלמה.בכרטיסיה לכידה תחת המקטע בקרת מצלמה, הגדר את זמן החשיפה ל- 0.025 שניות ולאחר מכן לחץ על שידור חי כדי להתחיל הזנה חיה של המצלמה. התאם את מיקומי ה- X וה- Y של שלב המיקרוסקופ על-ידי לחיצה על החצים XY-Position מתחת למקטע שלב מיקום מיקרו כדי לסרוק סביב המדגם ולמצוא שדה תצוגה עם אוכלוסייה צפופה כראוי של תאים חיידקיים. כדי למקסם את תפוקת הנתונים, צפיפות התאים בפתק הכיסוי צריכה להיות גבוהה ככל האפשר מבלי שהתאים יחפפו או יגעו זה בזה.שדה המבט צריך לכלול לפחות חרוז פלואורסצנטי אחד כסמן נאמנות, כך שניתן יהיה למדוד את שינוי הבמה בזמן שהנתונים נרכשים. לאחר מכן התאימו את מיקום ה-Z של שלב המיקרוסקופ על-ידי לחיצה על החצים Z-Position מתחת למקטע שלב מיקום הננו כך שאונות פונקציית פיזור הנקודות של חרוזי הפלואורסצנט יהיו אנכיות. לאחר מכן עבור אל רצף ובחר הגדרות סריקה.שנה את מספר ספירות המסגרות ל- 20, 000. לאחר מכן בחר תיקיית יעד שמירה על-ידי לחיצה על הלחצן המסווים בשלוש נקודות. לבסוף לחץ על התחל כדי לאסוף עד 20,000 מסגרות מצלמה תוך זמן חשיפה קצר של 0.025 שניות.בסיום, חסום את תאורת הלייזר על-ידי לחיצה על לחצן Close Laser המתאים בממשק המשתמש הגרפי. לאחר מכן לאסוף 200 מסגרות של תמונות כהות באמצעות אותו זמן חשיפה. סמן את התיבה ליד Thorlabs LED ולאחר מכן לחץ על החלף מצב מראה למעלה.פעולה זו תדליק אתנורית ה- LED מעל הדגימה ותחליף את המיקרוסקופ ממסלול הפלואורסצנטיות לתוואי ניגוד הפאזה.אתחל את התוכנה לרכישת נתונים במסלול ניגודיות הפאזה ולחץ על לחצן התחל/עצור תצוגה חיה כדי להציג הזנה חיה מהמצלמה. לאחר מכן לחץ על לכידה ולך כדי לשמור את התמונה כדי לאסוף תמונת ניגודיות פאזה של התאים בשדה התצוגה הנוכחי. התאם את חרוז הפלואורסצנט לשימוש כסמן נאמנות.חפש והתאים את כל ההתאמות המקומיות ואת כל מסגרות המצלמה באמצעות ספי התבנית כמתואר בפרוטוקול הטקסט. תחת המקטע DHPSF SM של Easy-DHPSF, לחץ על הפעל כדי להתאים לאותות של מולקולה בודדת ולאחר מכן לחץ על אישור בחלונות המוקפצים הבאים כדי לשמור על הגדרות ברירת המחדל. התוכנה תמצא אותות פלואורסצנטיים של מולקולה אחת הדומים לתפקוד כפול-סליל-נקודת-התפשטות ולאחר מכן ינסו להתאים אותם באמצעות מודל גאוסיאני כפול.כאשר הסקריפט פועל, המשתמש יראה תצוגה של נתוני התמונה הגולמית, כמו גם תמונה משוחזרת של אותות מולקולה אחת מצויד בהצלחה. באמצעות תוכנה שנכתבה בהתאמה אישית ב- MATLAB, התחל בבחירה ידנית של חמישה זוגות נקודות בקרה בחלון המוקפץ על-ידי הערכה ולחיצה בערך על עמודי התא של אותם חמישה תאים הן בנתונים של לוקליזציה של מולקולה אחת והן בקווי מתאר של תאים. מחק תאים המכילים פחות מ- 10 לוקליזציה והסר תאים המוצבים בחלקם מחוץ לשדה התצוגה ולאחר מכן מחק תאים לא רצויים נוספים בחלון המוקפץ על-ידי לחיצה בתוך קו המיתאר של התא שלהם.לבסוף, הקצה לוקליזציה הנמצאת בגבול המיתאר של תא לתא זה. בטל לוקליזציה שלא ממוקמת בחלוקה לרמות של תא. גורם קריטי ליישום המוצלח של פרוטוקול זה הוא להבטיח כי אותות מולקולה אחת מופרדים היטב אחד מהשני.אם יש יותר ממולקולת פלואורסצנטיות אחת בתא בו זמנית, ניתן להקצות לוקליזציה באופן שגוי למסלול של מולקולה אחרת. פרוטוקול זה פועל כדי למנוע את בעיית הקישור על-ידי מחיקת מסלולים שעבורם שתי לוקליזיות או יותר נמצאות בו-זמנית באותו תא. לכן, אם אותות מולקולה אחת צפופים מדי, כמות גדולה של נתונים אלה נמחקים באופן אוטומטי במהלך העיבוד.בהתאם לרמות הביטוי של חלבוני ההיתוך המסווים בפלורסנט, ניתן ליצור כ-200 עד 3,000 לוקליזציה לכל תא. לוקליזיות אלה יכולות להניב בין 10 ל -150 מסלולים. מספר רב של מסלולים נחוצים כדי לייצר הפצות שנדגמו היטב.מוצג כאן הוא היסטוגרמה של מקדמי דיפוזיה לכאורה עבור קרוב ל 80, 000 מסלולים מולקולה אחת של Yersinia enterocolitica סוג 3 הפרשת חלבון YscQ שכותרתו עם חלבון פלואורסצנטי eYFP. YscQ נקשר להזרקות משובצות קרום וכתוצאה מכך שבריר של מולקולות, כ -24% שאינן מתפזרות, כפי שמצוין על ידי ההתפלגות המוצגת בשחור. מולקולות YscQ הנותרות מפוזרות בחופשיות בציטוזול.במהלך השיטה המתוארת כאן, נקבע כי מולקולות YscQ לא מאוגדות קיימות בלפחות שלושה מצבי פיזור שונים. מסקנה זו הושגה על ידי התאמת התפלגות מקדמי דיפוזיה לכאורה עם ספרייה של הפצות מדומה עם מקדמי דיפוזיה ידועים. כאשר מנסים לפתור מספר רב של מצבי דיפוזיה, יש לאסוף כמה אלפי מסלולים של מולקולה אחת כדי להבטיח שהתפלגות מקדם ההתפזרות לכאורה תידגום היטב.מעקב אחר מולקולה אחת יכול להתבצע בתאי סוג בר או במוטנטים למחיקה גנטית כדי לקבוע אם מצבים מפזרים ספציפיים באים לידי ביטוי רק כאשר שותף מחייב מולקולרי קיים. על ידי פתרון מצבים מפוזרים של חלבונים ציטוסוליים ותסביכים חלבון באמצעות מעקב מולקולה אחת 3D, החוקרים יכולים לקבוע היכן, מתי, וכיצד קומפלקסים חלבון אוליגומרי נוצרים בתאים חיים. עבודה עם מקורות לייזר בה הספק גבוה ופתוגנים אנושיים חיים יכולה להיות מסוכנת ביותר.יש לעקוב תמיד אחר פרוטוקולי בטיחות לייזר וביו-בטיחות מתאימים.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

דיוק גבוהה סריג ברמת מולקולה בודדת עבור קביעת מבנה ביומולקולה

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

A Simple, Robust, and High Throughput Single Molecule Flow Stretching Assay Implementation for Studying Transport of Molecules Along DNA

מולקולה בודדת פשוטה, חסון וגבוה התפוקה זרימה מתיחה Assay יישום לימוד התחבורה של מולקולות לאורך הדנ א

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, ...

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

מולקולה בודדת מניפולציה של G-quadruplexes על ידי פינצטה מגנטי

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

קיבעון קוולנטיות של חלבונים על ספקטרוסקופיה כוח מולקולה בודדת

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

פרוטאום ברוחב כימות של תיוג הומוגניות ברמת מולקולה בודדת

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

ייצור Dynein וקינסין הרכבים מוטוריים ב-DNA אוריגמי ננו מבנים עבור תצפית מולקולה אחת

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Conventional BODIPY Conjugates for Live-Cell Super-Resolution Microscopy and Single-Molecule Tracking

קונבנציונלי BODIPY מעלה שערים עבור מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה ומעקב יחיד מולקולה

Single molecule localization microscopy (SMLM) techniques overcome the optical diffraction limit of conventional fluorescence microscopy and can resolve ...

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

מבחני הדמיה של מולקולות בודדות במבחנה לניתוח קינטיקה של תרגום תלוי-כובע

Cap-dependent protein synthesis is the predominant translation pathway in eukaryotic cells. While various biochemical and genetic approaches have allowed ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

ניתוח תא יחיד של אללים פעילים בתעתיק על ידי מולקולה אחת FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Making Precise and Accurate Single-Molecule FRET Measurements using the Open-Source smfBox

ביצוע מדידות FRET מדויקות ומדויקות באמצעות smfBox קוד פתוח

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes ...