Name: single-molecule tracking microscopy - a tool for determining the diffusive states of cytosolic molecules
Uploaded: 2019-09-05T12:30:00
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私たちは、アレシア・アチモビッチとティン・ヤンに原稿を批判的に読んでくれたことに感謝します。バージニア大学の先端研究コンピューティングサービスグループのシニアスタッフサイエンティストであるエド・ホール氏に、この研究で使用される最適化ルーチンの設定を支援してくださったことに感謝します。この研究のための資金は、バージニア大学によって提供されました.

1. 二重らせんポイントスプレッド関数キャリブレーション
注:本および以下のセクションで説明する画像は、Rocha et al.23に記載されているように、カスタム構築された反転蛍光顕微鏡を使用して取得される。同じ手順は、単一分子局在化および追跡顕微鏡検査2、3、4用に設計された異なる顕微鏡実装に<su...

提示されたプロトコルの正常な適用のための重要な要因は、単一分子信号が互いに十分に分離されていることを確認することです(すなわち、それらは空間と時間内にまばらである必要があります(補足Mov. 1)。細胞内に複数の蛍光分子が同時に存在する場合、局在化が別の分子の軌道に誤って割り当てられる可能性があります。これをリンク問題30と呼ぶ。タンパ...

生体分子の拡散的な挙動を調べることは、その生物学的機能に関する洞察を提供する。蛍光顕微鏡ベースの技術は、生体分子をネイティブの細胞環境で観察するための貴重なツールとなっています。光漂白後の蛍光回収(FRAP)および蛍光相関分光法(FCS)1は、アンサンブル平均拡散行動を提供する。逆に、単一分子局在化顕微鏡は、高い空間および時間分解能2、3、4を有する個々の蛍光タグ付き分子の観察を可能にする。目的のタンパク質が異なる拡散状態に存在する可能性があるため、個々の分子を観察することは有利です。例えば、大腸菌のCueRのような転写レギュレータがサイトゾルで自由に拡散したり、DNA配列に結合したりすると、2つの容易に区別可能な拡散状態が生じ、測定5のタイムスケールで固定化される5.単一分子トラッキングは、これらの異なる状態を直接観察するためのツールを提供し、それらを解決するために高度な分析は必要ありません。ただし、拡散率が類似している場合は、複数の拡散状態とその母集団の割合を解決することがより困難になります。例えば、拡散係数の大きさ依存性のために、タンパク質の異なるオリゴマー化状態は、異なる拡散状態6、7、8、9として現れる,10.このような場合は、データの取得、処理、分析の面で統合されたアプローチが必要です。
サイトソリック分子の拡散率に影響を与える重要な因子は、細胞境界による閉じ込めの影響である。細菌細胞境界によって分子運動に対する制限により、細胞細胞分子の測定拡散速度は、同じ運動が閉じ込められていない空間で発生した場合よりも遅く見える。非常にゆっくりと拡散する分子の場合、細胞閉じ込めの効果は、境界との衝突の欠如のためにごくわずかです。このような場合、ブラウン運動の方程式に基づく解析モデルを使用して、分子変位、r、または明らかな拡散係数D*の分布を合わせることによって、拡散状態を正確に解決することができるかもしれません(ランダム拡散)11,12,13.しかし、細胞細胞分子の拡散が速い場合、実験分布は、細胞境界との拡散分子の衝突による非限定ブラウン運動のために得られたものに似なくなりました。蛍光標識分子の非限定拡散係数を正確に決定するためには、閉じ込め効果を考慮する必要があります。いくつかのアプローチは、最近、(半)解析的に5、14、15、16、またはモンテカルロシミュレーションを通じて、閉じ込め効果を説明するために開発されました。 ブラウン拡散 6,10,16,17,18,19.
ここでは、単一分子追跡に特に焦点を当てた単一分子局在顕微鏡データを収集および分析するための統合プロトコルを提供する。このプロトコルの最終目標は、内部の蛍光標識細胞質タンパク質の拡散状態を解決する(この場合は、棒状の細菌細胞)。我々の研究は、単一分子追跡のための以前のプロトコルに基づいて構築され、DNAポリメラーゼPolIは、拡散分析20によってDNA結合および非結合状態に存在することが示された。ここでは、単分子トラッキング解析を3D測定に拡張し、よりリアルな計算シミュレーションを実行して、細胞内に同時に存在する複数の拡散状態を解決・定量化します。このデータは、二重らせん点広がり関数(DHPSF)21,22を用いて撮像することにより蛍光発光器の3D位置を決定することができる自家製の3D超解像蛍光顕微鏡を用いて取得される。生の単一分子画像は、カスタム書き込みソフトウェアを使用して3D単分子ローカリゼーションを抽出して処理され、単一分子軌道に結合されます。何千もの軌道がプールされ、明らかな拡散係数の分布が生成されます。最後のステップでは、実験分布は、限られた体積でブラウン運動のモンテカルロシミュレーションを介して得られた数値生成分布に適合します。このプロトコルを適用して、生きているエルシニア・エンテロコリチカにおけるタイプ3分泌系タンパク質YscQの拡散状態を解決する。そのモジュラー性質のために、私達のプロトコルは、一般的に任意の細胞形状の単一分子または単一粒子追跡実験の任意のタイプに適用可能です。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2,6-diaminopimelic acid</td>
			<td>Chem Impex International</td>
			<td>5411</td>
			<td>Necessary for growth of Y. enterocolitica cells used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4f lenses</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC508-080-A</td>
			<td>f = 80mm, 2&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>514 nm laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>Genesis MX514 MTM</td>
			<td>Use for fluorescence excitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>agarose</td>
			<td>Inivtrogen</td>
			<td>16520100</td>
			<td>Used to make gel pads to mount liquid bacterial sample on microscope.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9434</td>
			<td>M2G ingredient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bandpass filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET510/bp</td>
			<td>Excitation pathway.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain Heart Infusion</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>53286</td>
			<td>Growth media for Y. enterocolitica.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>223506</td>
			<td>M2G ingredient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>camera</td>
			<td>Imaging Source</td>
			<td>DMK 23UP031</td>
			<td>Camera for phase contrast imaging.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dielectric phase mask</td>
			<td>Double Helix, LLC</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Produces DHPSF signal.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>disodium phosphate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>795410</td>
			<td>M2G ingredient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S311-100</td>
			<td>Chelates Ca2+. Induces secretion in the T3SS.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flip mirror</td>
			<td>Newport</td>
			<td>8892-K</td>
			<td>Allows for switching between fluorescence and phase contrast pathways.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fluospheres</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8792</td>
			<td>Fluorescent beads. 540/560 exication and emission wavelengths. 40 nm diameter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass cover slip</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-302</td>
			<td>#1.5, 22mmx22mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose</td>
			<td>Chem Impex International</td>
			<td>811</td>
			<td>M2G ingredient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>immersion oil</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Z-81025</td>
			<td>Placed on objective lens.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iron(II) sulfate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F0518</td>
			<td>M2G ingredient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>long pass filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>LP02-514RU-25</td>
			<td>Emission pathway.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnesium sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S25414A</td>
			<td>M2G ingredient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope platform</td>
			<td>Mad City Labs</td>
			<td>custom</td>
			<td>Platform for inverted microscope.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nalidixic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N4382</td>
			<td>Y. enterocolitica cells used are resistant to nalidixic acid.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>objective lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>1-U2B991</td>
			<td>60X, 1.4 NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ozone cleaner</td>
			<td>Novascan</td>
			<td>PSD-UV4</td>
			<td>Used to eliminate background fluorescence on glass cover slips.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium phosphate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>795488</td>
			<td>M2G ingredient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red LED</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>M625L3</td>
			<td>Illuminates sample for phase contrast imaging. 625nm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>ORCA-Flash 4.0 V2</td>
			<td>Camera for fluorescence imaging.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>short pass filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET700SP-2P8</td>
			<td>Emission pathway.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube lens</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC508-180-A</td>
			<td>f=180 mm, 2&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yersinia enterocolitica dHOPEMTasd</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Strain AD4442, eYFP-YscQ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>zero-order quarter-wave plate</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>WPQ05M-514</td>
			<td>Excitation pathway.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-molecule tracking microscopy - a tool for determining the diffusive states of cytosolic molecules

単一分子局在顕微鏡は、数十ナノメートルの空間的およびミリ秒の時間分解能を有する生細胞における個々の分子の位置と動きを調べた。これらの機能により、単分子局在顕微鏡は、生理学的に関連する環境での分子レベルの生物学的機能の研究に最適です。ここでは、単一分子トラッキングデータの取得と処理/分析の両方のための統合プロトコルを示し、目的のタンパク質が示す可能性のある異なる拡散状態を抽出する。この情報は、生細胞における分子複合体形成を定量化するために使用することができる。カメラベースの3D単一分子ローカリゼーション実験の詳細な説明と、個々の分子の軌跡を生み出すその後のデータ処理ステップについて説明します。これらの軌道は、数値解析フレームワークを使用して分析され、蛍光標識分子の一般的な拡散状態とこれらの状態の相対的な豊富さを抽出します。解析フレームワークは、任意のセル ジオメトリによって空間的に限定される細胞内ブラウン拡散軌道の確率シミュレーションに基づいています。シミュレートされた軌道に基づいて、生の単一分子画像が実験画像と同じように生成され、解析されます。このように、実験的に校正するのが難しい実験精度と精度の制限が、解析ワークフローに明示的に組み込まれます。一般的な拡散状態の拡散係数と相対母率は、シミュレートされた分布の線形組み合わせを使用して実験値の分布を適合することによって決定されます。我々は、細菌病原体のサイトソールにホモとヘテロオリゴマー複合体を形成する際に異なる拡散状態を示すタンパク質の拡散状態を解明することにより、我々のプロトコルの有用性を実証する。

ここで説明する実験条件(20,000フレーム、軌道長最小4局在)および蛍光標識融合タンパク質の発現レベルに応じて、約200〜3,000の局在化が10〜150を生み出す軌道は、セルごとに生成することができます (図 2a, b)。見かけの拡散係数の十分にサンプリングされた分布を生成するには、多数の軌道が必要です。ここで収集されるFOVのサイズ?...

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Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules

3D単分子局在顕微鏡は、生きた細菌細胞における蛍光標識タンパク質の空間位置および運動軌道をプローブするために利用される。本明細書に記載される実験およびデータ分析プロトコルは、プールされた単一分子軌道に基づいてサイトソリックタンパク質の一般的な拡散挙動を決定する。

単一分子トラッキング顕微鏡 - 細胞細胞分子の拡散状態を決定するツール

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and ...

3D単一分子トラッキングは、個々のタンパク質の細胞内局在および動作挙動を決定することができます。生きた細胞でタンパク質の動きを観察することは、そのネイティブ環境における結合パートナーとの相互作用に関する重要な洞察を提供します。ここで示す方法は、単一分子追跡データを分析して生体分子の拡散状態を解決するための一般的なフレームワークを提供する。任意の形状のセル体積に限定された 2D および 3D の両方の軌道に適用できます。付属のテキストプロトコルに記載されているように、あらかじめ用意されたアガロースパッドに蛍光ビーズを付着した後、それを顕微鏡カバースリップに置き、カバースリップを顕微鏡サンプルホルダーに固定します。サンプルホルダーは、次いで反転蛍光顕微鏡に取り付けられます。次に、顕微鏡のグラフィカルユーザーインターフェースを初期化し、ここでは、MATLABのカスタム書き込みソフトウェアを計測器制御に使用します。カメラソフトウェア HCImage ライブを初期化します。[カメラコントロール]セクションの[キャプチャ]タブで、露出時間を0.03秒に設定し、[Live]をクリックしてカメラのライブフィードを開始します。GUI インターフェースの適切な「オープン・レーザー」ボタンをクリックして、レーザーのブロックを解除し、アガロース・パッドの蛍光ビーズを励起します。ライブストリームモードを使用して、カメラの蛍光放出を表示します。顕微鏡ステージの X 位置と Y 位置を調整するには、ユーザーインターフェイスのマイクロポジショニング ステージ セクションの下にある XY 位置矢印をクリックして、少なくとも 1 つの蛍光ビーズを視野の中央に配置します。必要に応じて、矢印の下のドロップダウン ボックスをクリックして、ステップ サイズを変更します。次に、ナノポジショニングステージセクションの下にあるZ位置矢印をクリックして、顕微鏡ステージのZ位置を調整します。蛍光ビーズの二重らせん点拡散機能の向きを垂直に設定します。この垂直方向は、Zキャリブレーションの開始点として定義されます。開始Z位置の上下30ステップを50ナノメートル単位でスキャンします。露出時間 0.03 秒を使用して、各ステップで 10 フレームを記録します。自動データ収集を開始するには、[Zキャリブレーション]の下の[移動]をクリックします。遠心1ミリリットルの熱衝撃を受けたエルシニア・エンゴコリチカ培養を室温で3分間重力5,000倍で培養し、培養液を除去し、上清を捨てる。ペレットを1ミリリットルのM2G培地で3回洗います。最終リンスの後、M2G培地の250マイクロリットルにペレット化細菌を再懸濁します。次に、受託者マーカーとして使用する蛍光ビーズを追加します。蛍光ビーズ溶液は、顕微鏡で見たときに視野ごとに1〜2個のビーズが存在するように添加する必要があります。M2Gで作られた1.5〜2%のアガロースパッドに1.5〜2%のアガロースパッドに1.5マイクロリットルの凝集した細胞とプレートを分離するためにボルテックスで懸濁液をそっと混ぜ、その後、パッドを反転し、オゾンクリーニング顕微鏡カバースリップに置きます。浸漬油を顕微鏡の目的に加え、サンプルホルダーを顕微鏡のステージに置き、所定の位置に固定します。顕微鏡のカメラ、サンプルステージ、励起レーザーを制御するグラフィカルユーザーインターフェースを初期化し、カメラソフトウェアを初期化します。[カメラコントロール]セクションの[キャプチャ]タブで、露出時間を0.025秒に設定し、[Live]をクリックしてカメラのライブフィードを開始します。マイクロポジショニングステージセクションの下にある XY 位置矢印をクリックして、サンプルの周りをスキャンし、細菌細胞の適切に密集した集団を持つ視野を見つけることで、顕微鏡ステージの X 位置と Y 位置を調整します。データのスループットを最大化するには、カバースリップのセル密度を、重なり合ったり、互いに接したりすることなく、できるだけ高くする必要があります。視野には、データの取得中にステージシフトを測定できるように、少なくとも1つの蛍光ビーズを受託者マーカーとして含める必要があります。次に、蛍光ビーズの二重らせん点広がり機能ローブが垂直になるように、ナノポジショニングステージセクションの下のZ位置矢印をクリックして、顕微鏡ステージのZ位置を調整します。次に、[シーケンス] に移動して [スキャンの設定] を選択します。フレーム数を 20,000 に変更します。次に、3つのドットでラベル付けされたボタンをクリックして保存先フォルダを選択します。最後に[開始]をクリックして、0.025秒の短い露出時間を使用して最大20,000のカメラフレームを収集します。完了したら、グラフィカル ユーザー インターフェイスで適切な [レーザーを閉じる] ボタンをクリックして、レーザー照明をブロックします。その後、同じ露出時間を使用して暗い画像の200フレームを収集します。Thorlabs LEDの横にあるチェックボックスをオンにし、[ミラーアップの切り替え]をクリックします。位相コントラスト経路でデータ取得ソフトウェアを初期化し、[ライブディスプレイの開始/停止]ボタンを押してカメラからのライブフィードを表示します。次に、[キャプチャして移動] をクリックして画像を保存し、現在の視野内のセルの位相コントラスト 画像を収集します。受託マーカーとして使用するために蛍光ビーズを適合します。テキスト プロトコルで説明されているように、テンプレートのしきい値を使用して、すべてのローカリゼーションとすべてのカメラ フレームを検索して適合させます。Easy-DHPSF GUI の「DHPSF SM をローカライズ」セクションで、「実行」をクリックして単一分子信号に適合させ、次のポップアップ・ウィンドウで「OK」をクリックしてデフォルト設定を維持します。ソフトウェアは、二重らせん点広がり関数に似た単一分子蛍光信号を見つけ、二重ガウスモデルを使用してそれらを適合させようとします。スクリプトが実行されると、ユーザーは生画像データの表示と、正常に適合した単一分子信号の再構築された画像を見ることができます。MATLABでカスタム作成されたソフトウェアを使用して、ポップアップウィンドウで、単一分子ローカリゼーションデータとセルアウトラインの両方で同じ5つのセルのセル極を大まかに推定してクリックすることで、手動で5つのコントロールポイントペアを選択します。ローカライズが 10 未満のセルを削除し、部分的に視野外に配置されているセルを削除してから、セルのアウトラインの内側をクリックして、ポップアップ ウィンドウ内の不要なセルを削除します。最後に、セルのアウトラインの境界内にあるローカリゼーションをそのセルに割り当てます。セルのアウトライン内にないローカリゼーションを破棄します。このプロトコルをうまく適用するために重要な要因は、単一分子シグナルが互いに十分に分離されるようにすることです。細胞内に同時に複数の蛍光分子がある場合、局在化は別の分子の軌道に誤って割り当てられる可能性があります。このプロトコルは、2つ以上の局在が同時に同じセル内に存在する任意の軌道を破棄することによって、リンクの問題を排除するために働く。したがって、単一分子信号が高密度すぎると、大量のデータが処理時に自動的に破棄されます。蛍光標識融合タンパク質の発現レベルに応じて、細胞当たり約200~3,000の局在を生成できます。これらの局在化は、10から150の軌道の間で得ることができます。十分にサンプリングされた分布を生成するには、多数の軌道が必要です。ここに示されているのは、Yersiniaエンゴコリチカ型3型分泌タンパク質YscQの80,000近くの単一分子軌道に対する見かけの拡散係数のヒストグラムです。YscQは、黒色で示される分布によって示されるように、拡散しない分子の一部を生じる膜埋め込みインジェクティソームに結合する。残りのYscQ分子は、細胞質ゾルに自由に拡散します。ここで説明する方法の間に、少なくとも3つの異なる拡散状態に非結合YscQ分子が存在すると判断される。この結論は、既知の拡散係数を持つ模擬分布のライブラリを持つ見かけの拡散係数の分布を適合させることによって達成された。複数の拡散状態を解決しようとする場合、見かけの拡散係数分布が非常によくサンプリングされるように、数千個の単一分子軌道を収集する必要があります。単一分子追跡は、野生型細胞または遺伝的欠失変異体において、分子結合パートナーが存在する場合にのみ特定の拡散状態が現れるかどうかを判断するために行うことができる。3D単一分子追跡を用いて細胞質タンパク質とタンパク質複合体の拡散状態を解明することで、生細胞におけるオリゴマータンパク質複合体の形成場所、時期、方法を決定できます。高出力レーザー源と生きたヒト病原体の操作は、非常に危険です。適切なレーザー安全およびバイオセーフティプロトコルは、常に従う必要があります。

Research

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