Name: single-molecule tracking microscopy - a tool for determining the diffusive states of cytosolic molecules
Uploaded: 2019-09-05T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules at JoVE.com

Vi tackar Alecia Achimovich och ting Yan för kritisk läsning av manuskriptet. Vi tackar Ed Hall, Senior personal forskare i Advanced Research Computing Services Group vid University of Virginia, för hjälp med att inrätta optimerings rutiner som används i detta arbete. Finansiering för detta arbete tillhandahölls av University of Virginia.

1. dubbel-Helix punkt-spread-funktion Kalibrering
Obs: bilder som beskrivs i detta och följande avsnitt förvärvas med hjälp av ett specialbyggt inverterat fluorescens-Mikroskop, som beskrivs i Rocha et al.23. Samma förfarande gäller för olika Mikroskop implementeringar avsedda för enkel molekyl lokalisering och spårning mikroskopi2,3,4. All programvara för bild anskaffn...

En kritisk faktor för en framgångsrik tillämpning av det presenterade protokollet är att säkerställa att enmolekylens signaler är väl åtskilda från varandra (dvs. de måste vara glesa i rymden och i tid (kompletterande MOV. 1)). Om det finns mer än en fluorescerande molekyl i en cell på samma gång, kan lokaliseringen felaktigt tilldelas en annan molekylers bana. Detta kallas det länkade problemet30. Experimentella förhållanden, såsom protein uttrycks nivåer och e...

Att undersöka de diffusiva beteendet hos biomolekyler ger insikt i deras biologiska funktioner. Fluorescensmikroskopi-baserade tekniker har blivit värdefulla verktyg för observation av biomolekyler i sin naturliga cell miljö. Fluorescens återhämtning efter photoblekning (FRAP) och fluorescens korrelation spektroskopi (FCS)1 ger Ensemble-genomsnitt diffusiva beteenden. Omvänt, Single-molekylen lokalisering mikroskopi möjliggör observation av enskilda Fluorescent märkta molekyler med hög rumslig och temporala upplösning2,3,4. Observation enskilda molekyler är fördelaktigt eftersom ett protein av intresse kan existera i olika diffusiva stater. Till exempel, två lätt urskiljbara diffusiva stater uppstår när en transkriptionell regulator, såsom CueR i Escherichia coli, difsar fritt i Cytosol eller binder till en DNA-sekvens och blir immobiliserade på tidsskalan för mätning5 . Single-molekyl tracking ger ett verktyg för att observera dessa olika stater direkt, och sofistikerade analyser krävs inte för att lösa dem. Emellertid, det blir mer utmanande att lösa flera diffusiva stater och deras befolknings fraktioner i fall där deras diffusa priser är mer likartade. Till exempel på grund av storleksanpassa beroendet av diffusions koefficienten, påstår olik oligomerisering av ett protein manifesterar sig som olik diffusiv påstår6,7,8,9 , 10. sådana fall kräver ett integrerat förhållningssätt när det gäller datainsamling, behandling och analys.
En kritisk faktor som påverkar diffusiva frekvenser av cytosoliska molekyler är effekten av instängdhet av cellgränsen. De restriktioner som ställs på molekylär rörelse av en bakteriecell gräns orsaka en cytosoliska molekyler uppmätta diffusionshastighet att visas långsammare än om samma rörelse hade inträffat i ett oinskränkt utrymme. För mycket långsamt diffusa molekyler, effekten av cellulära instängdhet är försumbar på grund av bristen på kollisioner med gränsen. I sådana fall kan det vara möjligt att korrekt lösa diffusions tillstånd genom att montera fördelningarna av molekylära förskjutningar, reller skenbara diffusions koefficienter, D *, med hjälp av analytiska modeller baserade på ekvationerna för Brownsk rörelse ( slumpmässig diffusion)11,12,13. Men för snabba diffusa cytosoliska molekyler, de experimentella distributioner inte längre likna de som erhållits för oinskränkt Brownsk rörelse på grund av kollisioner av diffuserande molekyler med cell gränser. Nedsättningseffekter måste redovisas för att exakt bestämma de oinskränkta diffusions koefficienterna för de fluorescerande molekyler som är märkta. Flera metoder har nyligen utvecklats för att ta hänsyn till instängning antingen (semi-) analytiskt 5,14,15,16 eller numeriskt genom Monte Carlo-simuleringar av Brownian diffusion6,10,16,17,18,19.
Här ger vi ett integrerat protokoll för att samla in och analysera Single-molekylen lokalisering mikroskopi data med ett särskilt fokus på Single-molekyl spårning. Slutmålet med protokollet är att lösa diffusa tillstånd av fluorescerande märkta cytosoliska proteiner inuti, i detta fall, stavformade bakterieceller. Vårt arbete bygger på ett tidigare protokoll för Single-molekyl spårning, där en DNA-polymeras, PolI, visades att existera i en DNA-bunden och obunden stat genom diffusion analys20. Här expanderar vi Single-molekyl spårningsanalys till 3D mätningar och utföra mer realistiska beräknings simuleringar för att lösa och kvantifiera flera diffusiva stater samtidigt närvarande i celler. Datan är förvärvat användande en hem-bygget 3D toppen-beslutsamhet fluorescens Mikroskop vilken är skicklig av beslutande den 3D position av fluorescerande sändare vid tänkbar med det dubbel-Helix punkt-breda-funktion (dhpsf)21,22. RAW Single-molekylen bilder bearbetas med hjälp av skräddarsydda program för att extrahera 3D Single-molekyl lokaliseringar, som sedan kombineras till enmolekyl banor. Tusentals banor slås samman för att generera fördelningar av skenbara diffusions koefficienter. I ett sista steg är de experimentella distributionerna lämpade med numeriskt genererade fördelningar erhållna genom Monte-Carlo-simuleringar av Brownian-rörelse i en begränsad volym. Vi tillämpar detta protokoll för att lösa diffusiva stater av typ 3 sekretion system protein YscQ i levande yersinia enterocolitica. På grund av sin modulära natur, är vårt protokoll i allmänhet gäller för alla typer av Single-molekyl eller Single-partikel tracking experiment i godtyckliga cell geometrier.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2,6-diaminopimelic acid</td>
			<td>Chem Impex International</td>
			<td>5411</td>
			<td>Necessary for growth of Y. enterocolitica cells used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4f lenses</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC508-080-A</td>
			<td>f = 80mm, 2&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>514 nm laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>Genesis MX514 MTM</td>
			<td>Use for fluorescence excitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>agarose</td>
			<td>Inivtrogen</td>
			<td>16520100</td>
			<td>Used to make gel pads to mount liquid bacterial sample on microscope.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9434</td>
			<td>M2G ingredient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bandpass filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET510/bp</td>
			<td>Excitation pathway.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain Heart Infusion</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>53286</td>
			<td>Growth media for Y. enterocolitica.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>223506</td>
			<td>M2G ingredient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>camera</td>
			<td>Imaging Source</td>
			<td>DMK 23UP031</td>
			<td>Camera for phase contrast imaging.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dielectric phase mask</td>
			<td>Double Helix, LLC</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Produces DHPSF signal.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>disodium phosphate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>795410</td>
			<td>M2G ingredient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S311-100</td>
			<td>Chelates Ca2+. Induces secretion in the T3SS.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flip mirror</td>
			<td>Newport</td>
			<td>8892-K</td>
			<td>Allows for switching between fluorescence and phase contrast pathways.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fluospheres</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8792</td>
			<td>Fluorescent beads. 540/560 exication and emission wavelengths. 40 nm diameter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass cover slip</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-302</td>
			<td>#1.5, 22mmx22mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose</td>
			<td>Chem Impex International</td>
			<td>811</td>
			<td>M2G ingredient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>immersion oil</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Z-81025</td>
			<td>Placed on objective lens.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iron(II) sulfate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F0518</td>
			<td>M2G ingredient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>long pass filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>LP02-514RU-25</td>
			<td>Emission pathway.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnesium sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S25414A</td>
			<td>M2G ingredient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope platform</td>
			<td>Mad City Labs</td>
			<td>custom</td>
			<td>Platform for inverted microscope.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nalidixic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N4382</td>
			<td>Y. enterocolitica cells used are resistant to nalidixic acid.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>objective lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>1-U2B991</td>
			<td>60X, 1.4 NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ozone cleaner</td>
			<td>Novascan</td>
			<td>PSD-UV4</td>
			<td>Used to eliminate background fluorescence on glass cover slips.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium phosphate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>795488</td>
			<td>M2G ingredient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red LED</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>M625L3</td>
			<td>Illuminates sample for phase contrast imaging. 625nm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>ORCA-Flash 4.0 V2</td>
			<td>Camera for fluorescence imaging.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>short pass filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET700SP-2P8</td>
			<td>Emission pathway.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube lens</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC508-180-A</td>
			<td>f=180 mm, 2&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yersinia enterocolitica dHOPEMTasd</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Strain AD4442, eYFP-YscQ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>zero-order quarter-wave plate</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>WPQ05M-514</td>
			<td>Excitation pathway.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-molecule tracking microscopy - a tool for determining the diffusive states of cytosolic molecules

Single-molekylen lokalisering mikroskopi sonder ställning och rörelser enskilda molekyler i levande celler med tiotals nanometer rumsliga och millisekund temporal upplösning. Dessa funktioner gör Single-molekylen lokalisering mikroskopi idealisk för att studera molekylär nivå biologiska funktioner i fysiologiskt relevanta miljöer. Här visar vi ett integrerat protokoll för både förvärv och bearbetning/analys av Single-molekyl spårningsdata för att extrahera de olika diffusiva staterna ett protein av intresse kan uppvisa. Denna information kan användas för att kvantifiera molekylär komplex formation i levande celler. Vi ger en detaljerad beskrivning av en Kamerabaserad 3D Single-molekyl lokalisering experiment, samt de efterföljande databehandling steg som ger banor av enskilda molekyler. Dessa banor analyseras sedan med hjälp av en numerisk analysram för att extrahera de utbredda diffusiva staterna av fluorescerande märkta molekyler och den relativa överflöd av dessa stater. Analysramen är baserad på stokastiska simuleringar av intracellulära Brownian diffusion banor som är rumsligt begränsas av en godtycklig cell geometri. Baserat på de simulerade banor, RAW Single-molekylen bilder genereras och analyseras på samma sätt som experimentella bilder. På så sätt införlivas experimentella precisions-och noggrannhets begränsningar, som är svåra att kalibrera experimentellt, uttryckligen i analys arbetsflödet. Diffusion koefficienten och relativa befolknings fraktioner av de förhärskande diffusiva staterna bestäms genom att montera distributioner av experimentella värden med hjälp av linjära kombinationer av simulerade distributioner. Vi visar nyttan av vårt protokoll genom att lösa de diffusiva staterna av ett protein som uppvisar olika diffusiva stater på att bilda homo-och hetero-oligomerska komplex i cytosolen av en bakteriell patogen.

Under de experimentella förhållanden som beskrivs här (20 000 ramar, bana längd minst 4 lokaliseringar) och beroende på uttrycket nivåer av fluorescerande märkta fusions proteiner, cirka 200-3000 lokaliseringar ger 10-150 banor kan genereras per cell (figur 2A, b). Ett stort antal banor är nödvändiga för att producera en väl samplad fördelning av skenbara diffusions koefficienter. Storleken på FOV samlas här är ~ 55 x 55 μm, ...

Watch this Scientific Journal Video about Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules at JoVE.com

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules

3D Single-molekylen lokalisering mikroskopi utnyttjas för att söka de rumsliga positioner och rörelsebanor av överföras märkta proteiner i levande bakterieceller. Den experimentella och dataanalys protokoll som beskrivs häri avgör de utbredda diffusiva beteenden av cytosoliska proteiner baserade på poolade enda molekyl Trajectories.

Single-molekyl tracking mikroskopi-ett verktyg för att bestämma Diffusiva stater cytosoliska molekyler

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and ...

3D single-molecule tracking kan bestämma subcellulära lokaliseringar och rörelsebeteenden hos enskilda proteiner. Observera ett protein rörelse i en levande cell ger viktiga insikter om dess interaktion med bindande partner i sin inhemska miljö. Den metod som presenteras här ger en allmän ram för att analysera enmolekylspårningsdata för att lösa de diffusiva tillstånden hos biologiska molekyler.Det kan appliceras på både 2D- och 3D-banor som är begränsade till godtyckligt formade cellvolymer. Efter att ha deponerat fluorescerande pärla i en färdigberedd agarospad enligt beskrivningen i det medföljande textprotokollet, placera den på ett mikroskopskyddssli och säkra täckslivan till mikroskopprovhållaren. Provhållaren monteras sedan på ett inverterat fluorescensmikroskop.Sedan initiera det grafiska användargränssnittet i mikroskopet;här används specialskrivna programvaror i MATLAB för instrumentkontroll. Initiera kamerans programvara HCImage Live. I fliken Fånga under avsnittet Kamerakontroll ställer du exponeringstiden till 0,03 sekunder och klickar sedan på Live för att påbörja en live-feed av kameran.Klicka på lämplig Öppna Laser knappen på GUI-gränssnittet för att häva blockeringen lasern och excitera lysrör pärlor på agarospaden. Visa fluorescensutsläppet på kameran med live-stream-läge. Justera X- och Y-positionerna för mikroskopstadiet genom att klicka på XY-Position-pilarna under avsnittet Mikro-Positioneringsstadium i användargränssnittet för att placera minst en fluorescerande pärla i mitten av synfältet.Om det behövs, ändra stegstorleken genom att klicka på dropdown rutan nedanför pilarna. Justera nästa Ö-position för mikroskopet scenen genom att klicka på Z-Position pilarna under Nano-Positionering Stage avsnitt. Ställ in orienteringen för den dubbel-helix punkt-sprid-funktion av fluorescerande pärla att vara vertikal.Denna vertikala orientering definieras som utgångspunkt i Z-kalibreringen. Skanna 30 steg över och under start Z-positionen i 50 nanometersteg. Spela in 10 bildrutor vid varje steg med hjälp av en exponeringstid på 0,03 sekunder.För att starta den automatiserade datainhämtningen, klicka på Gå under Z-Kalibrering. Centrifugera en milliliter av värmechockade Yersinia enterocolitica kultur vid 5, 000 gånger gravitationen i tre minuter vid rumstemperatur sedan ta bort kulturen och kasta supernatant. Tvätta pelleten tre gånger med en milliliter M2G-media.Efter den slutliga sköljningen, resuspend de pelleterade bakterierna i 250 mikroliter av M2G-media. Nästa lägga fluorescerande pärlor att använda som fiducial markörer. Den fluorescerande pärllösningen bör läggas till så att det bara finns en till två pärlor per synfält när de ses i mikroskopet.Blanda försiktigt suspensionen genom att virvelning för att separera eventuella aggregerade celler och plåt 1,5 mikroliter av suspensionen på en 1,5 till 2%agarose pad gjord med M2G, sedan invertera dynan och placera den på en ozonrenad mikroskop täcka slip. Tillsätt en droppe nedsänkning olja på mikroskop objektiv och placera provhållaren på mikroskopet scenen och säkra den på plats. Initiera det grafiska användargränssnittet för att styra mikroskopets kamera, provsteg och excitationslasrar och sedan initiera kameraprogramvaran.I fliken Fånga under avsnittet Kamerakontroll ställer du exponeringstiden till 0,025 sekunder och klickar sedan på Live för att påbörja en live-feed av kameran. Justera X- och Y-positionerna för mikroskopstadiet genom att klicka på XY-Position-pilarna under avsnittet Mikro-positioneringsstadium för att skanna runt provet och hitta ett synfält med en lämpligt tät population av bakterieceller. För att maximera datagenomströmningen bör celltätheten på omslagsslien vara så hög som möjligt utan att cellerna överlappar varandra eller rör vid varandra.Synfältet bör också omfatta minst en fluorescerande pärla som fiducialmarkör så att scenförskjutningen kan mätas medan uppgifterna förvärvas. Justera nästa ö-position för mikroskopet scenen genom att klicka på Z-Position pilarna under Nano-Positionering Stage avsnitt så att fluorescerande pärlor'dubbel-helix punkt-spread-funktion lober är vertikala. Gå sedan till Sekvens och välj Skanna inställningar.Ändra antalet bildruteantal till 20 000. Nästa välja en spara destination mapp genom att klicka på knappen märkt med tre punkter. Klicka slutligen på Start för att samla upp till 20, 000 kameraramar med hjälp av en kort exponeringstid på 0,025 sekunder.När du är klar, blockera laserbelysningen genom att klicka på lämplig Stäng Laser-knappen i det grafiska användargränssnittet. Samla sedan in 200 bildrutor med hjälp av samma exponeringstid. Markera rutan bredvid Thorlabs LED och klicka sedan på Växla spegel Up.This kommer att slå på LED-ljuset ovanför preparatet och växla mikroskopet från fluorescensvägen till faskontrastvägen.Initiera dataanskaffningsprogramvaran vid faskontrastvägen och tryck på start/stopp-livevisningsknappen för att visa ett liveflöde från kameran. Klicka sedan på Fånga och gå för att spara bilden för att samla in en faskontrastbild av cellerna i det aktuella synfältet. Montera fluorescerande pärla för användning som fiducial markör.Hitta och passa alla lokaliseringar och alla kameraramar med hjälp av malltrösklarna enligt beskrivningen i textprotokollet. Under avsnittet Localize DHPSF SM i Easy-DHPSF GUI klickar du på Kör för att passa enmolekylsignaler, klicka sedan på OK på följande popupfönster för att behålla standardinställningarna. Programvaran kommer att hitta enmolekyl fluorescens signaler som liknar dubbel-helix punkt-spread-funktion och sedan försöka passa dem med hjälp av en dubbel-Gaussian modell.När skriptet körs, kommer användaren att se en visning av den råa bilddata samt en rekonstruerad bild av framgångsrikt monterade enmolekylsignaler. Med hjälp av egenskrivna programvaror i MATLAB, börja med att manuellt välja fem kontrollpunktspar i popup-fönstret genom att grovt uppskatta och klicka på cellpolerna i samma fem celler i både enmolekyllokaliseringsdata och cellkonturerna. Ta bort celler som innehåller färre än 10 lokaliseringar och ta bort celler som är delvis placerade utanför synfältet, ta sedan bort eventuella ytterligare oönskade celler i popup-fönstret genom att klicka inuti deras cellkontur.Slutligen tilldela lokaliseringar som finns inom gränsen för en cells kontur till den cellen. Kassera eventuella lokaliseringar som inte finns inom någon celldisposition. En kritisk faktor för en framgångsrik tillämpning av detta protokoll är att säkerställa att signalerna med en molekyl är väl åtskilda från varandra.Om det finns mer än en fluorescerande molekyl i en cell samtidigt, då lokalisering kan felaktigt tilldelas en annan molekyl bana. Detta protokoll fungerar för att eliminera länkningsproblemet genom att kassera eventuella banor för vilka två eller flera lokaliseringar samtidigt förekommer i samma cell. Om enmolekylsignaler är för täta kasseras således en stor mängd av dessa data automatiskt under bearbetningen.Beroende på uttrycksnivåerna för de fluorescerande fusionsproteinerna kan ungefär 200 till 3, 000 lokaliseringar genereras per cell. Dessa lokaliseringar kan ge mellan 10 och 150 banor. Ett stort antal banor är nödvändiga för att producera välprovade fördelningar.Visas här är histogram av uppenbara diffusion koefficienter för nära 80, 000 single-molecule banor av Yersinia enterocolitica Typ 3 utsöndring protein YscQ märkt med fluorescerande protein eYFP. YscQ binder till membraninbäddade insprutningssomer vilket resulterar i en fraktion av molekyler, ca 24%som inte sprider sig, vilket indikeras av fördelningen som visas i svart. De resterande YscQ-molekylerna sprider fritt i cytosolen.Under den metod som beskrivs här, är det fastställt att obundna YscQ molekyler finns i minst tre distinkta diffusiva tillstånd. Denna slutsats nåddes genom att man passade fördelningen av skenbara diffusionskoefficienter med ett bibliotek med simulerade fördelningar med kända diffusionskoefficienter. Vid försök att lösa flera diffusiva tillstånd bör flera tusen enmolekylbanor samlas in för att säkerställa att de skenbara diffusionskoefficientfördelningarna provtas mycket väl.Single-molecule spårning kan utföras i vilda typ celler eller i genetiska borttagning mutanter att avgöra om specifika diffusiva tillstånd manifesterar endast när en molekylär bindande partner är närvarande. Genom att lösa de diffusiva tillstånden hos cytosoliska proteiner och proteinkomplex med hjälp av 3D-single-molecule tracking kan forskare avgöra var, när och hur oligomeriska proteinkomplex bildas i levande celler. Att arbeta med högeffektslaserkällor och levande mänskliga patogener kan vara extremt farligt.Lämpliga lasersäkerhets- och biosäkerhetsprotokoll bör alltid följas.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

Hög precision FRET vid en-molekylnivå för biomolekylstrukturbestämning

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

A Simple, Robust, and High Throughput Single Molecule Flow Stretching Assay Implementation for Studying Transport of Molecules Along DNA

En enkel, Robust och hög genomströmning enda molekyl Flow Stretching Assay genomförandet för att studera Transport av molekyler längs DNA

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, ...

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

Singel-molekyl Manipulation av G-quadruplexes av magnetisk pincett

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Kovalent immobilisering av proteiner för den enda molekyl kraft spektroskopin

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Proteom-wide kvantifiering av märkning homogenitet på nivån enda molekyl

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Produktion av dynein och Kinesin motor ensembler på DNA origami nanostrukturer för enkel molekyl observation

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Conventional BODIPY Conjugates for Live-Cell Super-Resolution Microscopy and Single-Molecule Tracking

Konventionella BODIPY konjugat för Live-Cell Super-Resolution Mikroskopi och single-molecule tracking

Single molecule localization microscopy (SMLM) techniques overcome the optical diffraction limit of conventional fluorescence microscopy and can resolve ...

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

En in vitro-analys för enmolekylsavbildning för analys av cap-beroende översättningskinetik

Cap-dependent protein synthesis is the predominant translation pathway in eukaryotic cells. While various biochemical and genetic approaches have allowed ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Encellsanalys av transkriptionellt aktiva alleler med enmolekylig FISK

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Making Precise and Accurate Single-Molecule FRET Measurements using the Open-Source smfBox

Göra exakta och exakta enmolekyliga FRET-mätningar med hjälp av SmfBox med öppen källkod

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes ...