Name: single-molecule tracking microscopy - a tool for determining the diffusive states of cytosolic molecules
Uploaded: 2019-09-05T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules at JoVE.com

El yazmasının eleştirel okuması için Alecia Achimovich ve Ting Yan'a teşekkür ederiz. Biz Ed Hall, Virginia Üniversitesi'nde İleri Araştırma Bilgi İşlem Hizmetleri grubunda kıdemli personel bilim adamı, bu çalışmada kullanılan optimizasyon rutinleri kurma konusunda yardım için teşekkür ederiz. Bu çalışma için finansman Virginia Üniversitesi tarafından sağlanmıştır.

1. Çift sarlak noktası-yayma fonksiyonu kalibrasyonu
NOT: Bu ve aşağıdaki bölümlerde açıklanan görüntüler, Rocha ve ark.23'teaçıklandığı gibi, özel olarak oluşturulmuş ters floresan mikroskobu kullanılarak elde edilir. Aynı prosedür tek moleküllü lokalizasyon ve izleme mikroskobu 2,3,4için tasarlanmış farklı mikroskop uygulamaları için geçerlidir. ...

Sunulan protokolün başarılı bir şekilde uygulanması için kritik bir faktör, tek moleküllü sinyallerin birbirinden iyi ayrılmasını sağlamaktır (yani, uzayda ve zamanda seyrek olmaları gerekir(Ek Mov. 1)). Bir hücrede aynı anda birden fazla floresan molekül varsa, lokalizasyon başka moleküllerin yörüngesine yanlış atanabilir. Bu bağlantı sorunu30olarak adlandırılır. Bağlanma problemini önlemek için protein ekspresyonu düzeyleri ve uyarma lazer yoğu...

Biyomoleküllerin diffüzif davranışlarının incelenmesi biyolojik işlevlerihakkında bilgi sağlar. Floresan mikroskobu tabanlı teknikler kendi doğal hücre ortamında biyomolekülleri gözlemlemek için değerli araçlar haline gelmiştir. Fotobeyazrlama (FRAP) ve floresan korelasyon spektroskopisi (FCS) 1 sonrası floresan iyileşme1 topluluk ortalama difüzif davranışlar sağlar. Tersine, tek moleküllü lokalizasyon mikroskopisi yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlük2,3,4ile bireysel floresan etiketli moleküllerin gözlem sağlar. İlgi çekici bir protein farklı diffüzive durumlarda var olabileceğinden, moleküllerin tek tek gözlemlemesi avantajlıdır. Örneğin, escherichia coli'dekiCueR gibi transkripsiyonel regülatörün sitosolda serbestçe dağıldığında veya DNA dizisine bağlandığında ve ölçüm zaman ölçeğinde hareketsiz hale geldiğinde, kolayca ayırt edilebilir iki difüzif durum ortaya çıkar5 . Tek moleküllü izleme, bu farklı durumları doğrudan gözlemlemek için bir araç sağlar ve bunları çözmek için karmaşık analizler gerekmez. Ancak, diffusive oranları daha benzer olduğu durumlarda birden fazla diffusive durumları ve nüfus fraksiyonları çözmek için daha zor hale gelir. Örneğin, difüzyon katsayısının boyut bağımlılığı nedeniyle, bir proteinin farklı oligomerizasyon durumları farklı diffusive durumları olarak kendini gösterir6,7,8,9 , 10. Bu gibi durumlarda veri toplama, işleme ve analiz açısından entegre bir yaklaşım gerektirir.
Sitosolik moleküllerin diffüzive oranlarını etkileyen kritik bir faktör hücre sınırı tarafından hapsedilmesinin etkisidir. Bir bakteri hücresi sınırının moleküler hareketine konan kısıtlamalar, sitosolik moleküllerin ölçülen difüzyon hızının, aynı hareketin sınırlandırılmamış bir alanda meydana gelmemiş olduğundan daha yavaş görünmesine neden olur. Çok yavaş difüzyon molekülleriçin, hücresel hapsi etkisi sınır ile çarpışma eksikliği nedeniyle ihmal edilebilir. Bu gibi durumlarda, brown hareketi denklemlerine dayalı analitik modeller kullanarak moleküler yer değiştirme, rveya belirgin difüzyon katsayıları, D*dağılımlarını uygun olarak diffüz durumlarını doğru bir şekilde çözmek mümkün olabilir ( rastgele difüzyon)11,12,13. Ancak, hızlı difüzyon sitosolik moleküller için, deneysel dağılımları artık hücre sınırları ile difüzyon moleküllerin çarpışmaları nedeniyle sınırsız Brownhareketi için elde edilen benzer. Floresan etiketli moleküllerin sınırlandırılmamış difüzyon katsayılarını doğru bir şekilde belirlemek için hapsedilme etkileri göz önünde bulundurulmalıdır. Çeşitli yaklaşımlar son zamanlarda hapsi etkileri ya (yarı-) analitik 5,14,15,16 veya sayısal Monte Carlo simülasyonları aracılığıyla hesap geliştirilmiştir Browndifüzyon6,10,16,17,18,19.
Burada, tek moleküllü lokalizasyon mikroskobu verilerinin toplanması ve analiz iã§in tek moleküllü izleme ã1/4zerinde durularak entegre bir protokol saÄ lÄ±k edeÄ izdir. Protokolün nihai amacı, bu durumda, çubuk şeklindeki bakteri hücrelerinin içinde floresan etiketli sitosolik proteinlerin diffüzif durumları çözmektir. Çalışmalarımız tek moleküllü izleme için bir önceki protokol üzerine inşa, hangi bir DNA polimeraz, PolI, difüzyon analizi20ile DNA bağlı ve bağlı olmayan durumda var olduğu gösterilmiştir. Burada, tek moleküllü izleme analizini 3B ölçümlere genişletiyoruz ve hücrelerde aynı anda bulunan birden fazla diffüzive durumu çözmek ve ölçmek için daha gerçekçi hesaplamalı simülasyonlar gerçekleştiriyoruz. Veriler çift sarmal nokta-yayma fonksiyonu (DHPSF)21,22ile görüntüleme ile floresan yayıcıların 3D konumunu belirleme yeteneğine sahip bir ev yapımı 3D süper çözünürlüklü floresan mikroskop kullanılarak elde edilir. Ham tek moleküllü görüntüler, 3B tek moleküllü yerelleştirmeleri ayıklamak için özel yazılmış yazılım kullanılarak işlenir ve bunlar daha sonra tek moleküllü yörüngelerde birleştirilir. Binlerce yörünge, görünürdidifüzyon katsayıları dağılımları oluşturmak için bir araya toplandı. Son bir adımda, deneysel dağılımlar sınırlı bir hacimde Brown hareketinin Monte-Carlo simülasyonları yoluyla elde edilen sayısal olarak oluşturulan dağılımlarla uyum sağlar. Biz yaşayan Yersinia enterocoliticaTip 3 salgı sistemi protein YscQ diffüzif durumları çözmek için bu protokolü uygulamak. Modüler yapısı nedeniyle, protokolümüz genellikle rasgele hücre geometrilerinde her türlü tek moleküllü veya tek parçacık izleme deneyi için geçerlidir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2,6-diaminopimelic acid</td>
			<td>Chem Impex International</td>
			<td>5411</td>
			<td>Necessary for growth of Y. enterocolitica cells used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4f lenses</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC508-080-A</td>
			<td>f = 80mm, 2&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>514 nm laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>Genesis MX514 MTM</td>
			<td>Use for fluorescence excitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>agarose</td>
			<td>Inivtrogen</td>
			<td>16520100</td>
			<td>Used to make gel pads to mount liquid bacterial sample on microscope.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9434</td>
			<td>M2G ingredient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bandpass filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET510/bp</td>
			<td>Excitation pathway.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain Heart Infusion</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>53286</td>
			<td>Growth media for Y. enterocolitica.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>223506</td>
			<td>M2G ingredient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>camera</td>
			<td>Imaging Source</td>
			<td>DMK 23UP031</td>
			<td>Camera for phase contrast imaging.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dielectric phase mask</td>
			<td>Double Helix, LLC</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Produces DHPSF signal.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>disodium phosphate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>795410</td>
			<td>M2G ingredient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S311-100</td>
			<td>Chelates Ca2+. Induces secretion in the T3SS.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flip mirror</td>
			<td>Newport</td>
			<td>8892-K</td>
			<td>Allows for switching between fluorescence and phase contrast pathways.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fluospheres</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8792</td>
			<td>Fluorescent beads. 540/560 exication and emission wavelengths. 40 nm diameter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass cover slip</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-302</td>
			<td>#1.5, 22mmx22mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose</td>
			<td>Chem Impex International</td>
			<td>811</td>
			<td>M2G ingredient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>immersion oil</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Z-81025</td>
			<td>Placed on objective lens.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iron(II) sulfate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F0518</td>
			<td>M2G ingredient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>long pass filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>LP02-514RU-25</td>
			<td>Emission pathway.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnesium sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S25414A</td>
			<td>M2G ingredient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope platform</td>
			<td>Mad City Labs</td>
			<td>custom</td>
			<td>Platform for inverted microscope.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nalidixic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N4382</td>
			<td>Y. enterocolitica cells used are resistant to nalidixic acid.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>objective lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>1-U2B991</td>
			<td>60X, 1.4 NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ozone cleaner</td>
			<td>Novascan</td>
			<td>PSD-UV4</td>
			<td>Used to eliminate background fluorescence on glass cover slips.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium phosphate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>795488</td>
			<td>M2G ingredient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red LED</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>M625L3</td>
			<td>Illuminates sample for phase contrast imaging. 625nm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>ORCA-Flash 4.0 V2</td>
			<td>Camera for fluorescence imaging.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>short pass filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET700SP-2P8</td>
			<td>Emission pathway.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube lens</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC508-180-A</td>
			<td>f=180 mm, 2&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yersinia enterocolitica dHOPEMTasd</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Strain AD4442, eYFP-YscQ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>zero-order quarter-wave plate</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>WPQ05M-514</td>
			<td>Excitation pathway.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-molecule tracking microscopy - a tool for determining the diffusive states of cytosolic molecules

Tek moleküllü lokalizasyon mikroskopisi, onlarca nanometre uzamsal ve milisaniye zamansal çözünürlükle canlı hücrelerdeki tek tek moleküllerin pozisyonunu ve hareketlerini inceler. Bu yetenekler, fizyolojik olarak ilgili ortamlarda moleküler düzeydebiyolojik fonksiyonları incelemek için tek moleküllü lokalizasyon mikroskobu ideal hale getirmektedir. Burada, ilgi çekici bir proteinin sergileneebileceği farklı difüzif durumları ayıklamak için tek moleküllü izleme verilerinin hem elde edilmesi hem de işlenmesi/analizi için entegre bir protokol gösteriyoruz. Bu bilgiler canlı hücrelerdeki moleküler karmaşık oluşumu ölçmek için kullanılabilir. Kamera tabanlı 3D tek moleküllü yerelleştirme deneyinin ayrıntılı bir açıklamasını ve tek tek moleküllerin yörüngelerini sağlayan sonraki veri işleme adımlarını salıyoruz. Bu yörüngeler daha sonra floresan etiketli moleküllerin yaygın diffusive durumları ve bu devletlerin göreceli bolluk ayıklamak için sayısal bir analiz çerçevesi kullanılarak analiz edilir. Analiz çerçevesi, rasgele hücre geometrisi ile uzaysal olarak sınırlı olan hücre içi Browndifüzyon yörüngelerinin stokakstik simülasyonlarına dayanmaktadır. Simüle edilen yörüngelere dayanarak, ham tek moleküllü görüntüler deneysel görüntülerle aynı şekilde üretilir ve analiz edilir. Bu şekilde, deneysel olarak kalibre edilmesi zor olan deneysel hassasiyet ve doğruluk sınırlamaları, analiz iş akışına açıkça dahil edilir. Yaygın difüzyon katsayısı ve yaygın diffüzif durumların göreli popülasyon fraksiyonları, simüle edilmiş dağılımların doğrusal kombinasyonları kullanılarak deneysel değerlerin dağılımları uygun hale alınarak belirlenir. Bakteriyel bir patojenin sitosolunda homo- ve hetero-oligomerik kompleksler oluşturarak farklı diffusive durumları sergileyen bir proteinin diffüzif durumlarını çözerek protokolümüzün yararını gösteriyoruz.

Burada açıklanan deneysel koşullar altında (20.000 kare, yörünge uzunluğu en az 4 lokalizasyon) ve floresan etiketli füzyon proteinlerinin ifade düzeylerine bağlı olarak, yaklaşık 200-3.000 lokalizasyon 10-150 verim yörüngeler hücre başına oluşturulabilir (Şekil 2a,b). Belirgin difüzyon katsayıları iyi örneklenmiş bir dağılım üretmek için çok sayıda yörünge gereklidir. Burada toplanan FOV boyutu ~ 55 x 55 μm...

Watch this Scientific Journal Video about Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules at JoVE.com

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules

3D tek moleküllü lokalizasyon mikroskopisi, yaşayan bakteri hücrelerinde floresan olarak etiketlenmiş proteinlerin mekansal konumlarını ve hareket yörüngelerini araştırmak için kullanılır. Burada açıklanan deneysel ve veri analizi protokolü, sitosolik proteinlerin havuzhalinde ki tek moleküllü yörüngelere dayalı yaygın diffüzif davranışlarını belirler.

Tek Moleküllü İzleme Mikroskobu - Sitosolik Moleküllerin Diffüz Durumlarını Belirlemede Bir Araç

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and ...

3D tek moleküllü izleme, bireysel proteinlerin hücre altı lokalizasyonlarını ve hareket davranışlarını belirleyebilir. Bir proteinin canlı hücredeki hareketini gözlemlemek, proteinin doğal ortamında bağlayıcı ortaklarla etkileşimi hakkında önemli bilgiler sağlar. Burada sunulan yöntem, biyolojik moleküllerin difüzif durumlarını çözmek için tek moleküllü izleme verilerini analiz etmek için genel bir çerçeve sağlar.Rasgele biçimli hücre hacimleri ile sınırlı hem 2B hem de 3B yörüngelere uygulanabilir. Floresan boncuk, ekteki metin protokolünde açıklandığı şekilde önceden hazırlanmış bir agarose pede yatırdıktan sonra, bir mikroskop kapağı nasibini yerleştirin ve kapak fişini mikroskop numune tutucusuna sabitleyin. Örnek tutucu daha sonra ters floresan mikroskobuna monte edilir.Daha sonra mikroskobun grafik kullanıcı arabirimini başlangıç;burada, MATLAB'da özel olarak yazılmış yazılım, enstrüman kontrolü için kullanılır. Kamera yazılımı HCImage Live'ı hayata geçirin. Kamera Denetimi bölümünün altındaki Yakalama sekmesinde, pozlama süresini 0,03 saniyeye ayarlayın ve kameranın canlı yayınına başlamak için Canlı'yı tıklatın.Lazerin engelini kaldırmak ve agarose pedüzerindeki floresan boncukları heyecanlandırmak için GUI arayüzündeki uygun Açık Lazer düğmesini tıklatın. Canlı akış modunu kullanarak kameradaki floresan emisyonunu görüntüleyin. Kullanıcı arabiriminin Mikro Konumlandırma Aşaması bölümünün altındaki XY-Position oklarını tıklatarak mikroskop aşamasının X ve Y pozisyonlarını ayarlayarak görüş alanının merkezinde en az bir floresan boncuk yerleştirin.Gerekirse, okların altındaki açılır kutuya tıklayarak adım boyutunu değiştirin. Daha sonra Nano-Konumlandırma Aşaması bölümünün altındaki Z-Pozisyon oklarını tıklatarak mikroskop aşamasının Z konumunu ayarlayın. Floresan boncuğun çift saraklı nokta-yayılma fonksiyonunun yönünü dikey olarak ayarlayın.Bu dikey yönlendirme Z kalibrasyonunda başlangıç noktası olarak tanımlanır. 50 nanometrelik artışlarla başlangıç Z konumunun 30 adım yukarısını ve altında tarayıp tayın. 0,03 saniyelik pozlama süresini kullanarak her adımda 10 kare kaydedin.Otomatik veri toplamayı başlatmak için Z-Calibration altında Git'i tıklatın. Bir mililitre ısı şoku olan Yersinia enterocolitica kültürünü oda sıcaklığında üç dakika boyunca 5,000 kat yerçekiminde santrifüj edin, sonra kültürü çıkarın ve süpernatantı atın. Bir mililitre M2G ortamla peleti üç kez yıkayın.Son durulandıktan sonra, m2G media 250 mikrolitre peletli bakterileri yeniden askıya alın. Sonraki fiducial belirteçleri olarak kullanmak için floresan boncuk ekleyin. Floresan boncuk çözeltisi, mikroskopta görüntülendiğinde görüş alanı başına sadece bir ila iki boncuk olacak şekilde eklenmelidir.Yavaşça herhangi bir toplu hücreleri ve plaka 1.5 mikrolitre süspansiyon ayırmak için girdap tarafından karıştırın 1.5% m2G ile yapılan agarose ped üzerine, sonra ped ters ve ozon temizlenmiş mikroskop kapağı üzerine yerleştirin. Mikroskop hedefi üzerine daldırma yağı bir damla ekleyin ve mikroskop aşamasına örnek tutucu yerleştirin ve yerinde güvenli. Mikroskobun kamerasını, örnek sahnesini ve uyarma lazerlerini kontrol etmek ve ardından kamera yazılımını ortaya çıkarmak için grafik kullanıcı arabirimini başlangıç olarak verin.Kamera Denetimi bölümünün altındaki Yakalama sekmesinde, pozlama süresini 0,025 saniyeye ayarlayın ve kameranın canlı yayınına başlamak için Canlı'yı tıklatın. Mikroskop aşamasının X ve Y pozisyonlarını, numunenin etrafında tarayıp uygun derecede yoğun bakteri hücresi popülasyonuna sahip bir görüş alanı bulmak için Mikro Konumlandırma Aşaması bölümünün altındaki XY-Position oklarını tıklatarak ayarlayın. Veri veri sini en üst düzeye çıkarmak için, kapak fişindeki hücre yoğunluğu, hücreler çakışmadan veya birbirine dokunmadan mümkün olduğunca yüksek olmalıdır.Veri elde edilirken sahne kayması ölçülebilir, böylece görüş alanı da bir fiducial marker olarak en az bir floresan boncuk içermelidir. Daha sonra, floresan boncukların çift sarilik noktası-yayma fonksiyonu loblarının dikey olması için Nano-Positioning Stage bölümünün altındaki Z-Pozisyon oklarını tıklatarak mikroskop aşamasının Z konumunu ayarlayın. Ardından Sıra'ya gidin ve Ayarları Ton'u seçin.Kare sayısı sayısını 20,000 olarak değiştirin. Ardından, üç noktayla etiketlenmiş düğmeye tıklayarak hedef klasörü kaydet'i seçin. Son olarak 0,025 saniyelik kısa pozlama süresini kullanarak 20.000 kamera karesine kadar toplamak için Başlat'ı tıklatın.Bittiğinde, grafik kullanıcı arabirimindeki uygun Lazeri Kapat düğmesini tıklatarak lazer aydınlatmasını engelleyin. Ardından aynı pozlama süresini kullanarak 200 kare karanlık görüntü toplayın. Thorlabs LED yanındaki kutuyu işaretleyin ve sonra Toggle Mirror Up.This'i tıklatın ve numunenin üzerindeki LED ışığını açın ve mikroskobu floresan yolundan faz kontrast yoluna çevirin.Faz kontrast ı sevesindeki veri toplama yazılımını başlatın ve kameradan canlı yayını görüntülemek için Canlı Ekranı Başlat/Durdur düğmesine basın. Ardından, geçerli görüş alanındaki hücrelerin faz kontrastı görüntüsünü toplamak için görüntüyü kaydetmek için Görüntü kaydet ve Kaydet'i tıklatın. Bir fiducial marker olarak kullanmak için floresan boncuk uygun.Metin protokolünde açıklandığı gibi şablon eşeklerini kullanarak tüm yerelleştirmeleri ve tüm kamera çerçevelerini bulun ve sığdırın. Easy-DHPSF GUI'nin Yerelleştir DHPSF SM bölümü altında, tek moleküllü sinyalleri sığdırmak için Çalıştır'ı tıklatın ve ardından varsayılan ayarları korumak için aşağıdaki açılır pencerelerde Tamam'ı tıklatın. Yazılım çift sarmalı nokta-spread-fonksiyonu benzer tek moleküllü floresan sinyalleri bulacaksınız ve daha sonra bir çift Gaussian modeli kullanarak onları sığdırmak için çalışacağız.Komut dosyası çalışırken, kullanıcı ham görüntü verilerinin bir görüntüsünün yanı sıra başarıyla takılan tek moleküllü sinyallerin yeniden oluşturulmuş görüntüsünü görür. MATLAB'da özel yazılmış yazılım kullanarak, tek moleküllü yerelleştirme verilerinde ve hücre ana hatlarında aynı beş hücrenin hücre kutuplarını kabaca tahmin ederek ve tıklatarak açılır penceredeki beş kontrol noktası çiftini el ile seçerek başlayın. 10'dan az yerelleştirme içeren hücreleri silin ve görünüm alanının dışında kısmen konumlandırılmış hücreleri kaldırın, ardından hücre anahattının içine tıklayarak açılır penceredeki diğer istenmeyen hücreleri silin.Son olarak, bir hücrenin anahat sınırı içinde bulunan yerelleştirmeleri bu hücreye atayın. Herhangi bir hücre anahattı içinde bulunmayan tüm yerelleştirmeleri atın. Bu protokolün başarılı bir şekilde uygulanması için önemli bir faktör, tek moleküllü sinyallerin birbirinden iyi ayrılmasını sağlamaktır.Bir hücrede aynı anda birden fazla floresan molekül varsa, yerelleştirme başka bir molekülün yörüngesine yanlış atanabilir. Bu protokol, aynı hücrede aynı anda iki veya daha fazla yerelleştirmenin bulunduğu yörüngeleri atarak bağlantı sorununu ortadan kaldırmaya çalışır. Böylece, tek moleküllü sinyaller çok yoğunsa, bu verilerin büyük bir kısmı işleme sırasında otomatik olarak atılır.Floresan etiketli füzyon proteinlerinin ekspresyon düzeylerine bağlı olarak, hücre başına yaklaşık 200 ila 3 000 lokalizasyon oluşturulabilir. Bu yerelleştirmeler 10 ila 150 yörüngede olabilir. İyi örneklenmiş dağılımlar üretmek için çok sayıda yörünge gereklidir.Burada gösterilen 80'e yakın belirgin difüzyon katsayıları histogram, yersinia enterocolitica Tip 3 sekresyon proteini YscQ floresan protein eYFP ile etiketlenmiş tek moleküllü yörüngeleri. YscQ, siyah renkte gösterilen dağılımda belirtildiği gibi, yaklaşık %24'ü dağılmayan moleküllerin bir kısmıyla sonuçlanan membrana gömülü enjektif enjektüre bağlanır. Kalan YscQ molekülleri sitosolda serbestçe yayılır.Burada açıklanan yöntem sırasında, bağlı olmayan YscQ moleküllerinin en az üç farklı difüzif durumda var olduğu belirlenmiştir. Bu sonuca, bilinen difüzyon katsayıları ile simüle edilmiş dağılımların bir kütüphanesi ile belirgin difüzyon katsayıları dağılımı nın uygun olarak gerçekleştirilmesi ile ulaşıldı. Birden fazla diffüzive durumları çözmeye çalışırken, görünen difüzyon katsayısı dağılımlarının çok iyi örneklendiğinden emin olmak için binlerce tek moleküllü yörünge toplanmalıdır.Tek moleküllü izleme yabani tip hücrelerde veya genetik deletion mutantlarda belirli diffusive durumların sadece moleküler bağlayıcı bir ortak bulunduğunda ortaya olup olmadığını belirlemek için yapılabilir. 3D tek molekül izleme kullanarak sitosolik proteinlerin ve protein komplekslerinin diffüzdurumlarını çözerek, araştırmacılar canlı hücrelerde oligomerik protein komplekslerinin nerede, ne zaman ve nasıl oluştuğunu belirleyebilirler. Yüksek güçlü lazer kaynakları ve canlı insan patojenleri ile çalışmak son derece tehlikeli olabilir.Uygun lazer güvenlik ve biyogüvenlik protokolleri her zaman takip edilmelidir.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

Biyomolekül Yapısının Belirlenmesi İçin Tek Molekül Seviyesinde Yüksek Hassasiyetteki FRET

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

A Simple, Robust, and High Throughput Single Molecule Flow Stretching Assay Implementation for Studying Transport of Molecules Along DNA

Basit, sağlam ve yüksek üretilen iş tek bir molekül akışı germe tahlil uygulama boyunca DNA moleküllerinin taşıma eğitimi için

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, ...

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

G-quadruplexes manyetik cımbız tarafından manipülasyon tek molekül

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Proteinler kovalent immobilizasyon için tek molekül kuvvet spektroskopisi

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Proteom çapında Quantification maddelerinin homojenliği tek molekül düzeyinde etiketlenmesi

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Tek Molekülgözlem için DNA Origami Nanoyapılar üzerinde Dynein ve Kinesin Motor Toplulukları üretimi

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Conventional BODIPY Conjugates for Live-Cell Super-Resolution Microscopy and Single-Molecule Tracking

Canlı Hücresüper çözünürlüklü mikroskopi ve Tek Moleküllü İzleme için Konvansiyonel BODIPY Konjugeleri

Single molecule localization microscopy (SMLM) techniques overcome the optical diffraction limit of conventional fluorescence microscopy and can resolve ...

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

Kapak Bağımlı Çeviri Kinetiğinin Analizi için Bir In Vitro Tek Moleküllü Görüntüleme Tahlili

Cap-dependent protein synthesis is the predominant translation pathway in eukaryotic cells. While various biochemical and genetic approaches have allowed ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Transkripsiyonel Aktif Alellerin Tek Molekül FISH ile Tek Hücre Analizi

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Making Precise and Accurate Single-Molecule FRET Measurements using the Open-Source smfBox

Açık Kaynaklı smfBox kullanarak Hassas ve Doğru Tek Moleküllü FRET Ölçümleri Yapma

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes ...