Name: visualization of germinosomes and the inner membrane in bacillus subtilis spores
Uploaded: 2019-04-15T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores at JoVE.com

يشكر المؤلفون كريستيان زيلينبيرج لمساعدته أثناء تصوير سيم. جي دبليو يقر "مجلس المنح الدراسية الصيني" لزمالة درجة دكتوراه وشكرا إيرين ستيلينجويرف لمساعدة لها المرحلة الأولية من التصوير.

1- باء-سوبتيليس تبوغ (التوقيت: 7 أيام قبل الملاحظة المجهرية)
<ol><li>
1 يوم
	<ol>
<li>متتالية ثقافة بكتيرية في لوحة (تريبتوني 1%، استخراج الخميرة 0.5%، 1% كلوريد الصوديوم، 1% أجار) أجار مرق لوريا بيرتاني (رطل)13 واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية للحصول على مستعمرات واحدة. ا?...

<ol>
	<li>Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germination+of+spores+of+Bacillus+species:+what+we+know+and+do+not+know.">Germination of spores of Bacillus species: what we know and do not know.</a> Journal of Bacteriology. 196 (7), 1297-1305 (2014).</li><li>Setlow, P., Wang, S., Li, Y. -. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germination+of+spores+of+the+orders+Bacillales+and+Clostridiales.">Germination of spores of the orders Bacillales and Clostridiales.</a> Annual Review of Microbiology. 71 (1), (2017).</li><li>Vepachedu, V. R., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+interactions+between+nutrient+germinant+receptors+and+SpoVA+proteins+of+Bacillus+subtilis+spores.">Analysis of interactions between nutrient germinant receptors and SpoVA proteins of Bacillus subtilis spores.</a> FEMS Microbiology Letters. 274 (1), 42-47 (2007).</li><li>Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Summer+meeting+2013&#8211;when+the+sleepers+wake:+the+germination+of+spores+of+Bacillus+species.">Summer meeting 2013&#8211;when the sleepers wake: the germination of spores of Bacillus species.</a> Journal of Applied Microbiology. 115 (6), 1251-1268 (2013).</li><li>Cowan, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipids+in+the+inner+membrane+of+dormant+spores+of+Bacillus+species+are+largely+immobile.">Lipids in the inner membrane of dormant spores of Bacillus species are largely immobile.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (20), 7733-7738 (2004).</li><li>Loison, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+investigation+of+viscosity+of+an+atypical+inner+membrane+of+Bacillus+spores:+a+molecular+rotor/FLIM+study.">Direct investigation of viscosity of an atypical inner membrane of Bacillus spores: a molecular rotor/FLIM study.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1828 (11), 2436-2443 (2013).</li><li>Griffiths, K. K., Zhang, J., Cowan, A. E., Yu, J., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germination+proteins+in+the+inner+membrane+of+dormant+Bacillus+subtilis+spores+colocalize+in+a+discrete+cluster.">Germination proteins in the inner membrane of dormant Bacillus subtilis spores colocalize in a discrete cluster.</a> Molecular Microbiology. 81 (4), 1061-1077 (2011).</li><li>Troiano, A. J., Zhang, J., Cowan, A. E., Yu, J., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+dynamics+of+a+Bacillus+subtilis+spore+germination+protein+complex+during+spore+germination+and+outgrowth.">Analysis of the dynamics of a Bacillus subtilis spore germination protein complex during spore germination and outgrowth.</a> Journal of Bacteriology. 197 (2), 252-261 (2015).</li><li>Wegel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cellular+structures+in+super-resolution+with+SIM,+STED+and+Localisation+Microscopy:+A+practical+comparison.">Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison.</a> Scientific Reports. 6, 27290 (2016).</li><li>Pandey, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+imaging+of+germination+and+outgrowth+of+individual+Bacillus+subtilis+spores;+the+effect+of+heat+stress+quantitatively+analyzed+with+SporeTracker.">Live cell imaging of germination and outgrowth of individual Bacillus subtilis spores; the effect of heat stress quantitatively analyzed with SporeTracker.</a> PloS One. 8 (3), e58972 (2013).</li><li>Demmerle, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategic+and+practical+guidelines+for+successful+structured+illumination+microscopy.">Strategic and practical guidelines for successful structured illumination microscopy.</a> Nature Protocols. 12 (5), 988-1010 (2017).</li><li>Ball, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SIMcheck:+a+toolbox+for+successful+super-resolution+structured+illumination+microscopy.">SIMcheck: a toolbox for successful super-resolution structured illumination microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 15915 (2015).</li><li>Bertani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STUDIES+ON+LYSOGENESIS+I.:+The+Mode+of+Phage+Liberation+by+Lysogenic+Escherichia+coli1.">STUDIES ON LYSOGENESIS I.: The Mode of Phage Liberation by Lysogenic Escherichia coli1.</a> Journal of Bacteriology. 62 (3), 293 (1951).</li><li>Pandey, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+the+effect+of+specific+tea+compounds+on+germination+and+outgrowth+of+Bacillus+subtilis+spores+at+single+cell+resolution.">Quantitative analysis of the effect of specific tea compounds on germination and outgrowth of Bacillus subtilis spores at single cell resolution.</a> Food Microbiology. 45, 63-70 (2015).</li><li>Zheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacillus+subtilis+spore+inner+membrane+proteome.">Bacillus subtilis spore inner membrane proteome.</a> Journal of Proteome Research. 15 (2), 585-594 (2016).</li><li>Vepachedu, V. R., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+SpoVAD+to+the+inner+membrane+of+spores+of+Bacillus+subtilis.">Localization of SpoVAD to the inner membrane of spores of Bacillus subtilis.</a> Journal of Bacteriology. 187 (16), 5677-5682 (2005).</li><li>Schouten, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+dendritic+spines+of+rat+primary+hippocampal+neurons+using+structured+illumination+microscopy.">Imaging dendritic spines of rat primary hippocampal neurons using structured illumination microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), (2014).</li><li>Mukaka, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+appropriate+use+of+correlation+coefficient+in+medical+research.">A guide to appropriate use of correlation coefficient in medical research.</a> Malawi Medical Journal. 24 (3), 69-71 (2012).</li><li>Stewart, K. A., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Numbers+of+individual+nutrient+germinant+receptors+and+other+germination+proteins+in+spores+of+Bacillus+subtilis.">Numbers of individual nutrient germinant receptors and other germination proteins in spores of Bacillus subtilis.</a> Journal of Bacteriology. 195 (16), 3575-3582 (2013).</li><li>Laflamme, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+analysis+of+germinating+Bacillus+spores,+using+membrane+potential+dye.">Flow cytometry analysis of germinating Bacillus spores, using membrane potential dye.</a> Archives of Microbiology. 183 (2), 107-112 (2005).</li><li>Magge, A., Setlow, B., Cowan, A. E., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+dye+binding+by+and+membrane+potential+in+spores+of+Bacillus+species.">Analysis of dye binding by and membrane potential in spores of Bacillus species.</a> Journal of Applied Microbiology. 106 (3), 814-824 (2009).</li><li>Ghosh, S., Scotland, M., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Levels+of+germination+proteins+in+dormant+and+superdormant+spores+of+Bacillus+subtilis.">Levels of germination proteins in dormant and superdormant spores of Bacillus subtilis.</a> Journal of Bacteriology. 194 (9), 2221-2227 (2012).</li><li>Abhyankar, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+sporulation+conditions+on+the+spore+coat+protein+composition+of+Bacillus+subtilis+Spores.">The influence of sporulation conditions on the spore coat protein composition of Bacillus subtilis Spores.</a> Frontiers in microbiology. 7, 1636 (2016).</li><li>Rose, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+properties+of+Bacillus+subtilis+spores+made+in+liquid+or+on+agar+plates.">Comparison of the properties of Bacillus subtilis spores made in liquid or on agar plates.</a> Journal of Applied Microbiology. 103 (3), 691-699 (2007).</li><li>Stewart, K. A., Yi, X., Ghosh, S., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germination+protein+levels+and+rates+of+germination+of+spores+of+Bacillus+subtilis+with+overexpressed+or+deleted+genes+encoding+germination+proteins.">Germination protein levels and rates of germination of spores of Bacillus subtilis with overexpressed or deleted genes encoding germination proteins.</a> J Bacteriol. 194 (12), 3156-3164 (2012).</li><li>Ramirez-Peralta, A., Zhang, P., Li, Y. -. q., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+sporulation+conditions+on+the+germination+and+germination+protein+levels+of+Bacillus+subtilis+spores.">Effects of sporulation conditions on the germination and germination protein levels of Bacillus subtilis spores.</a> Applied and Environmental Microbiology. 78 (8), 2689-2697 (2012).</li><li>Laue, M., Han, H. -. M., Dittmann, C., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+membranes+of+bacterial+endospores+are+reservoirs+for+spore+core+membrane+expansion+during+spore+germination.">Intracellular membranes of bacterial endospores are reservoirs for spore core membrane expansion during spore germination.</a> Scientific Reports. 8, 11388 (2018).</li><li>Strahl, H., B&#252;rmann, F., Hamoen, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+actin+homologue+MreB+organizes+the+bacterial+cell+membrane.">The actin homologue MreB organizes the bacterial cell membrane.</a> Nature Communications. 5, (2014).</li><li>Strahl, H., Hamoen, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+potential+is+important+for+bacterial+cell+division.">Membrane potential is important for bacterial cell division.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (27), 12281-12286 (2010).</li><li>Swarge, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="One-Pot"+sample+processing+methodfor+proteome-wide+analysis+of+microbial+cells+and+spores.">"One-Pot" sample processing methodfor proteome-wide analysis of microbial cells and spores.</a> Proteomics Clinical Applications. (5), 1700169 (2018).</li></ol>

ويتضمن البروتوكول عرضت إجراء سيم 3D قياسية لتحليل الملون جراثيم نجحت 64 FM4 يتضمن تبوغ وإعداد الشرائح وعمليات التصوير. وبالإضافة إلى ذلك، وصف البروتوكول تعديل سيمتشيك (إيماجيج)-ساعدت 3D التصوير عملية مجهرية سيم من جيرمينوسوميس بوغ نجحت المسمى مع الصحفيين الفلورسنت. الإجراء الأخير ا...

جراثيم بأوامر باسيلاليس وكلوستريدياليس أيضي نائمة ومقاومة غير عادية لأنظمة تطهير قاسية، ولكن إلا إذا كانت تنبت، لا يمكن أن يسبب آثار ضارة بالبشر1. في المغذيات جيرمينانت المشغلة إنبات أبواغ عصيات نجحت (باء-نجحت)، الحدث بدء جيرمينانت ملزم لمستقبلات جيرمينانت (الموارد الوراثية) الموجود في الغشاء الداخلي بوغ (IM). وفي وقت لاحق، ترانسدوسي الموارد الوراثية إشارات للبروتين قناة سبوفا الموجود أيضا في الدردشة. وهذا يؤدي في بداية تبادل بوغ الأساسية حمض بيريدين-2, 6-ديكاربوكسيليك (حمض ديبيكولينيك؛ اتفاق دارفور للسلام؛ تضم 20 في المائة من بوغ الأساسية بالوزن الجاف) للمياه عن طريق قناة سبوفا. في وقت لاحق، الإفراج عن اتفاق دارفور للسلام يطلق تنشيط التحلل peptidoglycan اللحاء، وامتصاص كميات إضافية من الماء يتبع2،،من34. هذه الأحداث التي تؤدي إلى الإجهاد الميكانيكي على طبقات معطف، انفصامه اللاحقة، وظهور ثمرة، وأخيراً النمو الخضري. ومع ذلك، لا تزال بعيدة عن تحل التفاصيل الدقيقة الجزيئية لعملية الإنبات.
مسألة رئيسية حول إنبات بوغ تتعلق بالخصائص الفيزيائية الحيوية من الدهون المحيطة بالبروتينات إنبات الدردشة فضلا عن البروتينات قناة "الدردشة سبوفا". هذا بلير الدهن إيم غير متحرك إلى حد كبير هو الحاجز الرئيسي النفاذية للعديد من الجزيئات الصغيرة، بما في ذلك المواد الحافظة الكيميائية السامة، التي تمارس عملها في بوغ النواة أو الخلية النباتي السيتوبلازم5،6. Bilayer الدهن إيم من المرجح في حالة جل، على الرغم من أن هناك جزءا كبيرا من الدهون المتنقلة في التراسل الفوري5. وقد إيم بوغ أيضا إمكانات التوسع الكبير5. وبالتالي، يزيد من المساحة السطحية للدردشة 1.6-fold عند الإنبات دون تركيب غشاء إضافية ومصحوبا بفقدان هذا الغشاء مميزة منخفضة النفاذية والدهن الجمود5،6.
بينما التفاصيل الجزيئية تنشيط إنبات البروتينات وتنظيم الدهون إيم في جراثيم مواضيع جذابة للدراسة، صغر حجم الجراثيم ب-نجحت ووفرة منخفضة نسبيا من البروتينات الإنبات، تشكل تحديا أن التحليل المجهري. استخدام الصحفيين الفلورسنت تنصهر فيها البروتينات الإنبات، تقترح غريفيث et al ابيفلوريسسينسي المجهر أدلة دامغة، في جراثيم نجحت بروتين سقالة غيرد تنظم ثلاث مفارز غرام (ألف وباء وجيم) لغيرا وب ك الموارد الوراثية، في مجموعة7. مصطلح 'جيرمينوسومي' لهذه المجموعة من البروتينات الإنبات ووصفها الهياكل ~ 300 نانومتر كبير إيم البروتين البؤر8. عند بدء الإنبات بوغ، تفريق جيرمينوسومي نيون البؤر في نهاية المطاف تغيير إلى أكبر أنماط نيون، مع > 75% سكان بوغ عرض هذا النمط في جراثيم نامي على ح 1 مع لفالين8. لاحظ أن متوسط الورقة المذكورة أعلاه يستخدم الصور من عشرات الصور الفلورسنت على التوالي، للحصول على قوة إحصائية والتغلب على عقبة إشارات الفلورية منخفضة ولاحظ أثناء التصوير. لم هذا التصور لهذه الهياكل في الجراثيم البكتيرية على حافة ما هو ممكن من الناحية التقنية مع أدوات مجهرية الكلاسيكية ولا تقييم لمقدار البؤر في بوغ واحد لم يكن التعريب سوبسيلولار بهم أكثر تفصيلاً ممكن مع هذا النهج.
هنا، نحن توضح استخدام الإضاءة تنظيماً من (SIM) للحصول على مجموعة مرئيات تفصيلية مجهرية والتحديد الكمي ل germinosome(s) في جراثيم نجحت باء، فضلا عن تلك المجالات الدهن إيم9. ويتضمن البروتوكول أيضا تعليمات تبوغ وإعداد الشرائح وتحليل الصور التي سيمتشيك (v1.0، البرنامج المساعد إيماجيج) فضلا عن10،إيماجيج،من1112.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Air dried glass slides</td>
			<td>Menzel Gl&#228;ser</td>
			<td>630-2870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APO TIRF N20R8 100&#215; oil objective (NA=1.49)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B. subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry cat, gerD-gfp kan)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B. subtilis PS4150 (PS832 &#916;gerE::spc, &#916;cotE::tet)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flasks 1 L</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z567868</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flasks 250 mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z723088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoSpheres carboxylate-modified microspheres</td>
			<td>Invitrogen, 0.1 &#956;m</td>
			<td>F8803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM4-64</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F34653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histodenz nonionic density gradient medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iXON3 DU-897 X-6515 CCD camera</td>
			<td>Andor Technology</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.net/Welcome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge tubes 1.5 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>3451PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope imaging software</td>
			<td>Nikon, Japan</td>
			<td>NIS-Element AR 4.51.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliQ Ultrapure Deminerilzed Water</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Milli-Q IQ 7003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Screw Cap Bottle 180 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75003800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Coverslips</td>
			<td>Paul Marienfeld</td>
			<td>117650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round Bottom tubes 15 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Nunc TM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap tubes 50 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Nunc TM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of germinosomes and the inner membrane in bacillus subtilis spores

الحجم الصغير للجراثيم ووفرة منخفضة نسبيا من البروتينات الإنبات، يسبب صعوبات في تحليلاتها مجهرية باستخدام مجهر ابيفلوريسسينسي. القرار فائقة ثلاثي الأبعاد "المركبة إضاءة مجهرية" (3D-سيم) أداة واعدة للتغلب على هذه العقبة، وتكشف عن تفاصيل الجزيئية لعملية إنبات أبواغ عصيات نجحت (نجحت باء). هنا، يمكننا وصف استخدام سيمتشيك المعدلة (إيماجيج)-مساعد عملية التصوير ثلاثي الأبعاد والبروتينات الفلورية مراسل مجهرية سيم من جيرمينوسوميس جراثيم نجحت ، cluster(s) من البروتينات الإنبات. ونقدم أيضا إجراء تصوير سيم 3D (قياسية) لتلطيخ FM4-64 باء-نجحت بوغ الأغشية. باستخدام هذه الإجراءات، ونحن الحصول على قرار غير مسبوقة للتعريب جيرمينوسومي وتبين أن > 80% KGB80 باء-نجحت جراثيم نائمة تم الحصول عليها بعد تبوغ على المعرفة المتوسطة والمماسح الحد الأدنى لها واحد أو اثنين من غيرد-التجارة والنقل وجيركب-مشري البؤر. كما كانت البؤر مشرقة الملاحظة في FM4-64 الملون سيم 3D صور جراثيم مما يوحي بوجود مجالات الدهن الغشاء الداخلي لسيولة مختلفة يحتمل. مزيد من الدراسات أن استخدام مزدوج وسم الإجراءات مع الأصباغ الغشاء وجيرمينوسومي البروتينات مراسل لتقييم التعريب المشارك وهكذا الحصول على لمحة أمثل المنظمة عصيات إنبات البروتينات في الغشاء الداخلي بوغ ممكن.

ويقدم البروتوكول الحالي إجراء تصوير مجهر سيم للجراثيم البكتيرية. وأجريت إجراءات إعداد تبوغ والشريحة كما هو مبين في الشكل 1 قبل التصوير. في وقت لاحق، تم تطبيق إجراءات التصوير والتحليل سواء بالنسبة لتعتيم (الفلورسنت البروتين المسمى البروتينات الإنبات) ومش...

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores at JoVE.com

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

التصور جيرمينوسوميس و "الغشاء الداخلي" في الجراثيم العصوية نجحت

كتلة بروتينات مستقبلات جيرمينانت في 'جيرمينوسوميس' في الغشاء الداخلي للجراثيم العصوية نجحت . يمكننا وصف بروتوكول باستخدام القرار سوبر مجهرية وفلوري البروتينات مراسل لتصور جيرمينوسوميس. ويحدد البروتوكول أيضا مجالات الغشاء الداخلي بوغ ملطخة تفضيلي مع صبغ الغشاء FM4-64.

The small size of spores and the relatively low abundance of germination proteins, cause difficulties in their microscopic analyses using epifluorescence ...

Super-القرار المجهر الإضاءة منظم، 3D-SIM، هو تقنية مبتكرة لتصور البروتينات مراسل الفلورسنت من مجموعات مستقبلات الإنبات في أغشية البوغ. باستخدام هذه الإجراءات، يمكن تحقيق قرار غير مسبوقة من التعريب الجرثومي و بوغ مجالات الدهون الغشاء الداخلي. وسيتم إثبات هذه التقنية من قبل طالب الدكتوراه خوان وين وطالب ماجستير العلوم ريمون بسمان من مختبرنا.قبل البدء في الإجراء، تنظيف الأغطية عالية الدقة مع حمض الهيدروكلوريك واحد المولر لمدة 30 دقيقة في حمام مائي يهز بلطف، تليها اثنين، خمس دقائق يغسل في الماء من النوع 1 فائقة الخطورة. بعد الغسيل الثاني، ضع الغطاءات في 100٪ الإيثانول لمدة ثلاث دقائق قبل تجفيف الأغطية والتحقق من وضوحها. ثم، الشرائح مجهر الزجاج نظيفة مع 70٪ الإيثانول لمدة دقيقة واحدة قبل السماح للشرائح لتجف والتحقق من وضوحها.بالنسبة للميكروسفير الفلورسنت وتصوير البوغ ، أول شريحة قبل الدافئة على كتلة تسخين 70 درجة مئوية لبضع ثوان قبل إضافة 70 درجة مئوية ، 65 ميكرولتر قطرات من تعقيم 2 ٪ agarose على واحدة من الشرائح. ضع الشريحة الأخرى في الأعلى لنشر الأغاروز بين الشرائح. بعد خمس دقائق، قم بإزالة إحدى الشرائح وقطع الأغاروز المجفف إلى قسم واحد تلو الآخر.إضافة مرة واحدة 10 إلى الميكروسفيرات الفلورية الثامنة أو الجراثيم في 0.4 ميكرولترات من الماء العقيمة، فائقة الpure النوع 1 إلى agarose، ووضع غطاء عالية الدقة على التصحيح باستخدام غطاء لشريحة الشريحة من الشريحة على سطح الغطاء. ثم، إصلاح 65 ميكرولتر، 1.5-في-1.6 سنتيمتر جين الإطار على شريحة المجففة، ووضع غطاء على الإطار، وإغلاق جميع زوايا الإطار. لتصوير العينات، ضع الشريحة على مجهر إضاءة منظم مجهز بهدف زيتي 100X، وركز على 100 نانومتر فلوروستين فيض.ضبط حلقة التصحيح على الهدف 100x حتى يتم الحصول على وظيفة انتشار نقطة متماثلة لتقليل عدم وضوح الصور، وتحديد حقل الرؤية مع ما يقرب من 10 جولة الفلورسنت microspheres. تطبيق تعديل التركيز صريف لأطوال موجية الإثارة المعينة، في هذه الحالة، 561 و 488 نانومتر، كدليل لبرامج تحليل الصور قبل التركيز على الجراثيم مع ضوء الإرسال. التقاط صورة ضوء الإرسال في وضع متوسط 16x مع التعرض 20 مللي ثانية لكل صورة.ثم، التقاط 3D-هيكل المجهر الإضاءة الصور الفلورية الخام من الجراثيم مع وضع الإضاءة 3D-SIM. لإعادة بناء الشريحة، انقر فوق Param على ورقة علامة التبويب لوحة الإضاءة الهيكلية لفتح إطار إعادة بناء شريحة N-SIM. اتبع الإرشادات المقترحة، وانقر على عناصر التحكم المناسبة لتعيين تباين التضمين الإضاءة إلى السيارات، ومنع الضوضاء عالية الدقة إلى واحد، والخروج من طمس التركيز إلى 0.05 كنقاط انطلاق.ثم انقر فوق إعادة بناء شريحة لإعادة بناء الصورة وتقييم جودة الصور المعاد بناؤها من خلال الصور السريعة التي تم تحويلها فورييه و نقاط إعادة الإعمار التي يتم عرضها بعد إعادة الإعمار. ضبط الضوضاء عالية الدقة من 0.1 إلى خمسة والخروج من منع طمس التركيز من 0.01 إلى 0.5 حتى يتم الحصول على أفضل إعدادات المعلمة. ثم انقر فوق تطبيق لتطبيق التغييرات.انقر فوق إغلاق لإغلاق الإطار. فتح FM4-64 ملطخة PS4150 جراثيم صورة الخام. ثم انقر فوق إعادة بناء شريحة لتنفيذ إعادة إنشاء شريحة وحفظ الصورة المعاد بناؤها.لتحويل الصور الخام 3D-SIM من geminosome KGB80 إلى صور الزائفة widefield، انقر يسارا على البرنامج المساعد ImageJ SIMcheck وحدد البيانات الخام SI وSeded. عشوائيا اختيار حوالي 25 جراثيم في كل صورة نقل مقلوب لتحليل germinosome في وقت لاحق في الصور الفلورسنت الزائفة واسعة حتى تم اختيار ما يقرب من 350 الجراثيم. ثم استخدم ImageJ لتقييم أقصى كثافة لكل إشارة فلورية تعبر عنها كل مجموعة من الجراثيم والكثافة المتكاملة لكل صورة 3D بوغ.لتحليل الصور الزائفة واسعة النطاق من جهاز جرمينسوم KGB80، استخدم متوسط قيمة كثافة متكاملة من سبع اكدسات كما كثافة إشارة متكاملة من بوغ KGB80. ثم، تحديد كثافة الخلفية عن طريق تصوير سلالة خلفية PS4150 باستخدام إعدادات متطابقة، و تعتبر البقع الفلورية في جراثيم KGB80 الفردية مثل بؤر الجرثومية عندما تكون مميزة بوضوح عن الخلفية. في هذه التجربة التمثيلية، ظهرت بؤر اثنين من جراثيم الفلورية GerD-GFP في أكوام مختلفة مع ثلاثة بؤرة GFP-GerD-المجموع لوحظ في المكدس Z3 التركيبي.هنا ، لوحظ بوغ مع نقطة اتصال واحدة فقط GerD-GFP في بوغ. في المجموع، كان حوالي 40 إلى 50٪ من الجراثيم اثنين أو واحد GerD-GFP وGerKB-mCherry العنقودية، على التوالي. في حين أن الكثافة المتكاملة لبروتين سقالة GerD-GFP كانت مختلفة بين مجموعات سكانية مختلفة، فإن الكثافة المتكاملة لـ GerKB-mCherry كانت نفسها تقريباً في مختلف السكان.عندما كان بوغ بؤر متعددة، كانت أقصى كثافة الفلورنس من GerD-GFP وGerKB-mCherry بؤرية تميل إلى الانخفاض، والحد الأقصى للفلورس من جميع النقاط المضيئة، التي تعتبر بؤرة الجرثومية، كان أعلى من الحد الأقصى للفلوروس السيارات من الجراثيم PS4150. وتجدر الإشارة إلى أن أكثر إشراقا FM4-64 البقع مماثلة لsoci germinosome تظهر في كل من جراثيم PS4150 سليمة وفكها، مما يشير إلى أن هذه البقع FM4-64 أكثر إشراقا قد تشارك في تجميع البروتينات الجرثومية في الغشاء الداخلي. إضافة جراثيم إلى agarose ووضع agarose في الإطار يتطلب حركة السوائل المستمرة والدقيقة لهذه المواد المصغرة.تحويل الصور الخام 3D-SIM من KGB80 germinosome إلى صور الزائفة widefield وتفسيرها يتطلب معرفة الخبراء في علم الأحياء سبور. يمكن تطبيق إجراء المجهر الإنارة المنظم لدينا على تصوير البروتينات المنخفضة وفيرة أو المراسلين الخافتين في البكتيريا المختلفة أو غيرها من المواد الفرقة. تنظيم رثة يمكن الآن أن تدرس باستخدام إجراءات وضع العلامات المزدوجة لتقييم التوطين المشترك للبروتينات عصيات وغشاء مجالات محددة.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

رسم الخرائط البصرية إمكانيات العمل والعابرون الكالسيوم في القلب ماوس

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

تصور منظمة اللحاء وحيوية في الكائنات الدقيقة، وذلك باستخدام المجموع الإسفار التأمل الداخلي المجهر

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

غشاء العمود الفقري: أداة كيميائية حيوية لتحديد البروتين البروتين التفاعلات للبروتينات الغشاء<em&gt; في فيفو</em

Membrane proteins are essential for cell viability and are therefore important therapeutic targets1-3. Since they function in complexes4, methods to ...

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

الكمي لالعالمي الانبساطي وظيفة عن طريق تحليل يستند النمذجة-الحركية من Transmitral التدفق عبر الشكلية ملء Parametrized الانبساطي

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Analysis of Tubular Membrane Networks in Cardiac Myocytes from Atria and Ventricles

تحليل غشاء أنبوبي الشبكات في القلب Myocytes من أتريا والبطينات

In cardiac myocytes a complex network of membrane tubules - the transverse-axial tubule system (TATS) - controls deep intracellular signaling functions. ...

Luminescence Resonance Energy Transfer to Study Conformational Changes in Membrane Proteins Expressed in Mammalian Cells

نقل التلألؤ الرنين الطاقة لدراسة التغييرات بتكوين جزئي في غشاء البروتينات أعرب في خلايا الثدييات

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range ...

Three-Dimensionally Printed Microfluidic Cross-flow System for Ultrafiltration/Nanofiltration Membrane Performance Testing

ثلاثة بعدي مطبوعة ميكروفلويديك نظام الصليب لتدفق الترشيح الفائق / ميكن للترشيح النانوي غشاء اختبار الأداء

Minimization and management of membrane fouling is a formidable challenge in diverse industrial processes and other practices that utilize membrane ...

Treatment of Ligament Constructs with Exercise-conditioned Serum: A Translational Tissue Engineering Model

علاج الرباط ينشأ مع مصل مكيفة مكيفة: نموذج هندسة الأنسجة الانتقالية

In vitro experiments are essential to understand biological mechanisms; however, the gap between monolayer tissue culture and human physiology is large, ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

ل<em&gt; في المختبر</em&gt; نموذج الثقافة الجهاز من الفئران فقرات القرص

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

A Protocol for Decellularizing Mouse Cochleae for Inner Ear Tissue Engineering

بروتوكول ديسيلولاريزينج كوكليا الماوس لهندسة الأنسجة الإذن الداخلية

In mammals, mechanosensory hair cells that facilitate hearing lack the ability to regenerate, which has limited treatments for hearing loss. Current ...