Name: visualization of germinosomes and the inner membrane in bacillus subtilis spores
Uploaded: 2019-04-15T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores at JoVE.com

Forfatterne takke Christiaan Zeelenberg for hans hjælp under SIM-billeddannelse. JW erkender at Kina stipendium Rådet for et ph.d.-stipendium og tak Irene Stellingwerf for hendes hjælp i den primære fase af billedbehandling.

1. B. subtillis sporulering (Timing: 7 dage før mikroskopiske Observation)
<ol><li>
Dag 1
	<ol>
<li>Streak en bakteriel kultur på en Luria-Bertani bouillon (LB) agar plade (1% trypton, 0,5% gærekstrakt, 1% NaCl, 1% agar)13 og der inkuberes natten over ved 37 ° C til indhente enkelt kolonier. Bruge B. subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry kat, gerD-normal god landbrugspraksis kan) stamme og dens baggrund stamkulturen B. subtilis ...

<ol>
	<li>Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germination+of+spores+of+Bacillus+species:+what+we+know+and+do+not+know.">Germination of spores of Bacillus species: what we know and do not know.</a> Journal of Bacteriology. 196 (7), 1297-1305 (2014).</li><li>Setlow, P., Wang, S., Li, Y. -. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germination+of+spores+of+the+orders+Bacillales+and+Clostridiales.">Germination of spores of the orders Bacillales and Clostridiales.</a> Annual Review of Microbiology. 71 (1), (2017).</li><li>Vepachedu, V. R., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+interactions+between+nutrient+germinant+receptors+and+SpoVA+proteins+of+Bacillus+subtilis+spores.">Analysis of interactions between nutrient germinant receptors and SpoVA proteins of Bacillus subtilis spores.</a> FEMS Microbiology Letters. 274 (1), 42-47 (2007).</li><li>Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Summer+meeting+2013&#8211;when+the+sleepers+wake:+the+germination+of+spores+of+Bacillus+species.">Summer meeting 2013&#8211;when the sleepers wake: the germination of spores of Bacillus species.</a> Journal of Applied Microbiology. 115 (6), 1251-1268 (2013).</li><li>Cowan, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipids+in+the+inner+membrane+of+dormant+spores+of+Bacillus+species+are+largely+immobile.">Lipids in the inner membrane of dormant spores of Bacillus species are largely immobile.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (20), 7733-7738 (2004).</li><li>Loison, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+investigation+of+viscosity+of+an+atypical+inner+membrane+of+Bacillus+spores:+a+molecular+rotor/FLIM+study.">Direct investigation of viscosity of an atypical inner membrane of Bacillus spores: a molecular rotor/FLIM study.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1828 (11), 2436-2443 (2013).</li><li>Griffiths, K. K., Zhang, J., Cowan, A. E., Yu, J., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germination+proteins+in+the+inner+membrane+of+dormant+Bacillus+subtilis+spores+colocalize+in+a+discrete+cluster.">Germination proteins in the inner membrane of dormant Bacillus subtilis spores colocalize in a discrete cluster.</a> Molecular Microbiology. 81 (4), 1061-1077 (2011).</li><li>Troiano, A. J., Zhang, J., Cowan, A. E., Yu, J., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+dynamics+of+a+Bacillus+subtilis+spore+germination+protein+complex+during+spore+germination+and+outgrowth.">Analysis of the dynamics of a Bacillus subtilis spore germination protein complex during spore germination and outgrowth.</a> Journal of Bacteriology. 197 (2), 252-261 (2015).</li><li>Wegel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cellular+structures+in+super-resolution+with+SIM,+STED+and+Localisation+Microscopy:+A+practical+comparison.">Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison.</a> Scientific Reports. 6, 27290 (2016).</li><li>Pandey, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+imaging+of+germination+and+outgrowth+of+individual+Bacillus+subtilis+spores;+the+effect+of+heat+stress+quantitatively+analyzed+with+SporeTracker.">Live cell imaging of germination and outgrowth of individual Bacillus subtilis spores; the effect of heat stress quantitatively analyzed with SporeTracker.</a> PloS One. 8 (3), e58972 (2013).</li><li>Demmerle, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategic+and+practical+guidelines+for+successful+structured+illumination+microscopy.">Strategic and practical guidelines for successful structured illumination microscopy.</a> Nature Protocols. 12 (5), 988-1010 (2017).</li><li>Ball, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SIMcheck:+a+toolbox+for+successful+super-resolution+structured+illumination+microscopy.">SIMcheck: a toolbox for successful super-resolution structured illumination microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 15915 (2015).</li><li>Bertani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STUDIES+ON+LYSOGENESIS+I.:+The+Mode+of+Phage+Liberation+by+Lysogenic+Escherichia+coli1.">STUDIES ON LYSOGENESIS I.: The Mode of Phage Liberation by Lysogenic Escherichia coli1.</a> Journal of Bacteriology. 62 (3), 293 (1951).</li><li>Pandey, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+the+effect+of+specific+tea+compounds+on+germination+and+outgrowth+of+Bacillus+subtilis+spores+at+single+cell+resolution.">Quantitative analysis of the effect of specific tea compounds on germination and outgrowth of Bacillus subtilis spores at single cell resolution.</a> Food Microbiology. 45, 63-70 (2015).</li><li>Zheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacillus+subtilis+spore+inner+membrane+proteome.">Bacillus subtilis spore inner membrane proteome.</a> Journal of Proteome Research. 15 (2), 585-594 (2016).</li><li>Vepachedu, V. R., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+SpoVAD+to+the+inner+membrane+of+spores+of+Bacillus+subtilis.">Localization of SpoVAD to the inner membrane of spores of Bacillus subtilis.</a> Journal of Bacteriology. 187 (16), 5677-5682 (2005).</li><li>Schouten, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+dendritic+spines+of+rat+primary+hippocampal+neurons+using+structured+illumination+microscopy.">Imaging dendritic spines of rat primary hippocampal neurons using structured illumination microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), (2014).</li><li>Mukaka, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+appropriate+use+of+correlation+coefficient+in+medical+research.">A guide to appropriate use of correlation coefficient in medical research.</a> Malawi Medical Journal. 24 (3), 69-71 (2012).</li><li>Stewart, K. A., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Numbers+of+individual+nutrient+germinant+receptors+and+other+germination+proteins+in+spores+of+Bacillus+subtilis.">Numbers of individual nutrient germinant receptors and other germination proteins in spores of Bacillus subtilis.</a> Journal of Bacteriology. 195 (16), 3575-3582 (2013).</li><li>Laflamme, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+analysis+of+germinating+Bacillus+spores,+using+membrane+potential+dye.">Flow cytometry analysis of germinating Bacillus spores, using membrane potential dye.</a> Archives of Microbiology. 183 (2), 107-112 (2005).</li><li>Magge, A., Setlow, B., Cowan, A. E., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+dye+binding+by+and+membrane+potential+in+spores+of+Bacillus+species.">Analysis of dye binding by and membrane potential in spores of Bacillus species.</a> Journal of Applied Microbiology. 106 (3), 814-824 (2009).</li><li>Ghosh, S., Scotland, M., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Levels+of+germination+proteins+in+dormant+and+superdormant+spores+of+Bacillus+subtilis.">Levels of germination proteins in dormant and superdormant spores of Bacillus subtilis.</a> Journal of Bacteriology. 194 (9), 2221-2227 (2012).</li><li>Abhyankar, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+sporulation+conditions+on+the+spore+coat+protein+composition+of+Bacillus+subtilis+Spores.">The influence of sporulation conditions on the spore coat protein composition of Bacillus subtilis Spores.</a> Frontiers in microbiology. 7, 1636 (2016).</li><li>Rose, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+properties+of+Bacillus+subtilis+spores+made+in+liquid+or+on+agar+plates.">Comparison of the properties of Bacillus subtilis spores made in liquid or on agar plates.</a> Journal of Applied Microbiology. 103 (3), 691-699 (2007).</li><li>Stewart, K. A., Yi, X., Ghosh, S., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germination+protein+levels+and+rates+of+germination+of+spores+of+Bacillus+subtilis+with+overexpressed+or+deleted+genes+encoding+germination+proteins.">Germination protein levels and rates of germination of spores of Bacillus subtilis with overexpressed or deleted genes encoding germination proteins.</a> J Bacteriol. 194 (12), 3156-3164 (2012).</li><li>Ramirez-Peralta, A., Zhang, P., Li, Y. -. q., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+sporulation+conditions+on+the+germination+and+germination+protein+levels+of+Bacillus+subtilis+spores.">Effects of sporulation conditions on the germination and germination protein levels of Bacillus subtilis spores.</a> Applied and Environmental Microbiology. 78 (8), 2689-2697 (2012).</li><li>Laue, M., Han, H. -. M., Dittmann, C., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+membranes+of+bacterial+endospores+are+reservoirs+for+spore+core+membrane+expansion+during+spore+germination.">Intracellular membranes of bacterial endospores are reservoirs for spore core membrane expansion during spore germination.</a> Scientific Reports. 8, 11388 (2018).</li><li>Strahl, H., B&#252;rmann, F., Hamoen, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+actin+homologue+MreB+organizes+the+bacterial+cell+membrane.">The actin homologue MreB organizes the bacterial cell membrane.</a> Nature Communications. 5, (2014).</li><li>Strahl, H., Hamoen, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+potential+is+important+for+bacterial+cell+division.">Membrane potential is important for bacterial cell division.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (27), 12281-12286 (2010).</li><li>Swarge, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="One-Pot"+sample+processing+methodfor+proteome-wide+analysis+of+microbial+cells+and+spores.">"One-Pot" sample processing methodfor proteome-wide analysis of microbial cells and spores.</a> Proteomics Clinical Applications. (5), 1700169 (2018).</li></ol>

Protokollen præsenteret indeholder en standard 3D-SIM procedure for analyse af FM4-64 farves B. subtilis sporer, der omfatter sporulering, dias forberedelse og imaging processer. Derudover protokollen beskriver en modificeret SIMcheck (ImageJ)-assisteret 3D imaging proces for SIM-mikroskopi af B. subtilis spore germinosomes mærket med fluorescerende journalister. Den sidstnævnte procedure tillod os at observere denne dim Underskabet med øget kontrast. Ved at koble to billeddiagnostiske procedurer, e...

Sporerne af ordrerne, Bacillales og Clostridiales er metabolisk inaktive og usædvanlig modstandsdygtig over for barske dekontaminering regimer, men medmindre de spire, ikke kan forårsage skadelige virkninger i mennesker1. I næringsstof germinant udløste spiring af Bacillus subtilis (B. subtilis) sporer er hændelsen indledning germinant binding til germinant receptorer (GRs) placeret i den spore indre membran (IM). Efterfølgende, transduce GRs signaler til den SpoVA kanal protein også placeret i IM. Dette resulterer i fremkomsten af udveksling af spore core pyridin-2,6-dicarboxylsyrer syre (dipicolinic syre; DPA; bestående af 20% af spore core tør wt) for vand via SpoVA kanal. Efterfølgende, DPA release udløser aktivering af cortex peptidoglycan hydrolyse, og ekstra vand optagelse følger2,3,4. Disse begivenheder medfører mekanisk stress på coat lag, dets efterfølgende brud, udbrud af udvækst og endelig vegetativ vækst. Men de præcise molekylære detaljer af spireevne processen er stadig langt fra løst.
En større spørgsmål om sporespiring vedrører de biofysiske egenskaber af lipider omkring IM spiring proteiner samt IM SpoVA kanal proteiner. Denne stort set ubevægelige IM lipid tolagede er den vigtigste permeabilitet barriere for mange små molekyler, herunder giftige kemiske konserveringsmidler, hvoraf nogle øve deres aktion i spore core eller vegetativt cellen cytoplasma5,6. IM lipid tolagede forventes i en gel, selv om der er en betydelig brøkdel af mobile lipider i IM5. Spore's IM har også potentiale for betydelig udvidelse5. Således er arealet af IM øger 1.6-fold efter spiring uden yderligere membran syntese og er ledsaget af tabet af denne membran karakteristiske lav permeabilitet og lipid immobilitet5,6.
Mens de Molekylær oplysninger om aktivering af spiring proteiner og organisation af IM lipider i sporer er attraktive emner til undersøgelse, udgør den lille størrelse af B. subtilis sporer og den relativt lave overflod af spiring proteiner, en udfordring mikroskopiske analyser. Griffiths et al. overbevisende epifluorescensmikroskop mikroskop beviser, tyder ved hjælp af fluorescerende reportere smeltet til spiring proteiner, på, at i B. subtilis sporer stillads protein GerD arrangerer tre GR underenheder (A, B og C) for GerA, B og K GRs, i en klynge7. De opfandt udtrykket 'germinosome' for denne klynge af spiring proteiner og beskrevet strukturerne som ~ 300 nm store IM protein foci8. Ved indledningen af sporespiring, fluorescerende germinosome foci i sidste ende ændre i større sprede fluorescerende mønstre, med > 75% af spore populationer vise dette mønster i sporer spirede i 1 time med L-valin8. Bemærk, at papiret nævnt ovenfor brugte i gennemsnit billeder fra snesevis af på hinanden følgende fluorescerende billeder, at få statistiske magt og overvinde forhindring af lav fluorescerende signaler observeret under imaging. Denne visualisering af disse strukturer i bakteriesporer var på kanten af hvad der er teknisk gennemførligt med klassisk mikroskopiske værktøjer og hverken en vurdering af mængden af foci i en enkelt spore var heller ikke deres mere detaljerede subcellulært lokalisering muligt med denne tilgang.
Her, demonstrere vi brugen af strukturerede belysning mikroskopi (SIM) at opnå en detaljeret visualisering og kvantificering af germinosome(s) i sporer af B. subtilissamt deres IM lipid domæner9. Protokollen indeholder også instruktioner til sporulering, dias forberedelse og billedanalyse af SIMcheck (v1.0, en imageJ plugin) samt ImageJ10,11,12.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Air dried glass slides</td>
			<td>Menzel Gl&#228;ser</td>
			<td>630-2870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APO TIRF N20R8 100&#215; oil objective (NA=1.49)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B. subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry cat, gerD-gfp kan)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B. subtilis PS4150 (PS832 &#916;gerE::spc, &#916;cotE::tet)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flasks 1 L</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z567868</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flasks 250 mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z723088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoSpheres carboxylate-modified microspheres</td>
			<td>Invitrogen, 0.1 &#956;m</td>
			<td>F8803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM4-64</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F34653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histodenz nonionic density gradient medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iXON3 DU-897 X-6515 CCD camera</td>
			<td>Andor Technology</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.net/Welcome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge tubes 1.5 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>3451PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope imaging software</td>
			<td>Nikon, Japan</td>
			<td>NIS-Element AR 4.51.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliQ Ultrapure Deminerilzed Water</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Milli-Q IQ 7003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Screw Cap Bottle 180 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75003800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Coverslips</td>
			<td>Paul Marienfeld</td>
			<td>117650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round Bottom tubes 15 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Nunc TM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap tubes 50 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Nunc TM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of germinosomes and the inner membrane in bacillus subtilis spores

Den lille størrelse af sporer og den relativt lave overflod af spiring proteiner, forårsage vanskeligheder i deres mikroskopiske analyser ved hjælp af epifluorescensmikroskop mikroskopi. Super-opløsning tredimensional struktureret belysning mikroskopi (3D-SIM) er et lovende redskab til at overvinde denne forhindring og afsløre de molekylære detaljer af processen for spiring af Bacillus subtilis (B. subtilis) sporer. Her, vi beskriver brugen af en modificeret SIMcheck (ImageJ)-assistent 3D billedprocessen og fluorescerende reporter proteiner til SIM-mikroskopi af B. subtilis sporer germinosomes, clusters af spiring proteiner. Vi præsenterer også en (standard) 3D-SIM imaging procedure for FM4-64 farvning af B. subtilis spore membraner. Ved hjælp af disse procedurer, vi opnåede uovertruffen opløsning for germinosome lokalisering og viser, at > 80% af B. subtilis KGB80 hvilende sporer fremstillet efter sporulering på definerede minimal MOPS medium har en eller to GerD-normal god landbrugspraksis og GerKB-mCherry Foci. Lyse foci blev også observeret i FM4-64 farves sporer 3D-SIM billeder tyder på, at indre membran lipid domæner af forskellige fluiditet sandsynligvis findes. Yderligere er undersøgelser, der bruger dobbelt mærkning procedurer med membran farvestoffer og germinosome reporter proteiner til at vurdere Co lokalisering og dermed få et optimalt overblik over organiseringen af Bacillus spiring proteiner i indre spore membran muligt.

Den nuværende protokol præsenterer en SIM mikroskop imaging procedure for bakteriesporer. Sporedannelse og dias forberedelse procedurer blev gennemført som vist i figur 1 før billeddannelse. Senere, procedurerne, billedbehandling og analyse blev anvendt både for dim (fluorescerende proteiner mærket spiring proteiner) og lyse (lipofile sonde farves IM) spore prøver som vist i følgende tekst.
...

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores at JoVE.com

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

Visualisering af Germinosomes og den indre membran i Bacillus subtilis sporer

Germinant receptor proteiner klynge i 'germinosomes' i den indre membran af Bacillus subtilis sporer. Vi beskriver en protokol bruger super opløsning mikroskopi og lysstofrør reporter proteiner til at visualisere germinosomes. Protokollen identificerer også spore indre membran domæner, der fortrinsvis farves med membran farvestof FM4-64.

The small size of spores and the relatively low abundance of germination proteins, cause difficulties in their microscopic analyses using epifluorescence ...

Super-opløsning struktureret belysning mikroskopi, 3D-SIM, er en innovativ teknik til visualisering af fluorescerende reporter proteiner af spiring receptor klynger i spore membraner. Ved hjælp af disse procedurer, uovertruffen opløsning af kiminosom lokalisering og spore indre membran lipid domæner kan opnås. Teknikken vil blive demonstreret af ph.d.-studerende Juan Wen og Master of Science studerende Raymond Pasman af vores laboratorium.Før proceduren påbegyndes, rengøres højpræcisionsdæksletæber med en-molar saltsyre i 30 minutter i et forsigtigt rystende vandbad efterfulgt af to, fem minutters vaske i ultrarent type 1-vand. Efter den anden vask, placeres dækslerne i 100% ethanol i ca. tre minutter, før dækslerne tørres, og de er tydelige. Derefter rense glas mikroskop dias med 70% ethanol i et minut, før du lader dias til at tørre og kontrollere deres klarhed.For fluorescerende microsphere og spore imaging, første pre-varme to dias på en 70-graders Celsius varmeblok i et par sekunder, før du tilføjer en 70-graders Celsius, 65-mikroliter dråbe steriliseret 2% agarose på en af dias. Placer det andet dias øverst for at sprede agarose mellem objektglassene. Efter fem minutter fjernes et af objektglassene og skæres i en sektion på en en efter en centimeter.Tilføj en gange 10 til den ottende fluorescerende mikrosfærer eller sporer i 0,4 mikroliter af sterilt, ultrapurt type 1 vand til agarose, og læg en højpræcisions coverslip på plasteret ved hjælp af dækslet til at skubbe plasteret ud af diaset på coverslip overfladen. Derefter fastgør en 65-mikroliter, 1,5-by-1,6-centimeter Gene Frame på et tørret dias, og placer dækslæd på rammen og lukker alle hjørner af rammen. Til billeddannelse af prøverne skal du placere rutsjebanen på et struktureret belysningsmikroskop udstyret med et 100X oliemål og fokusere på 100-nanometerets fluorescerende mikrosfærer.Juster korrektionsringen på 100x-målet, indtil der opnås en symmetrisk punktspredningsfunktion for at minimere sløring af billederne, og vælg et synsfelt med ca. 10 runde fluorescerende mikrosfærer. Anvend en rist fokus justering for de udpegede excitation bølgelængder, i dette tilfælde, 561 og 488 nanometer, som en guide til billedet analyse software, før du fokuserer på sporer med transmission lys. Optag et billede af transmissionslys i den gennemsnitlige 16x-tilstand med 20 millisekundeksponeringer for hvert billede.Derefter fange 3D-struktureret belysning mikroskop rå fluorescerende billeder af sporer med 3D-SIM belysning tilstand. Klik på Param på fanarket for struktureret belysningspude for at åbne vinduet N-SIM Slice Reconstruction for at finde en gennembygning af udsnit. Følg de foreslåede instruktioner, og klik på de relevante kontroller for at indstille belysningsmoduleringskontrasten til automatisk støjdæmpning af høj opløsning til en og undertrykkelsen af fokussløring til 0,05 som udgangspunkt.Klik derefter på Reconstruct Slice for at rekonstruere billedet og evaluere kvaliteten af de rekonstruerede billeder ved hjælp af de hurtige Fourier-transformerede billeder og genopbygningsscore, der vises efter rekonstruktionen. Juster støjen med høj opløsning fra 0,1 til fem og undertrykkelsen af fokussløringen fra 0,01 til 0,5, indtil de bedste parameterindstillinger er opnået. Klik derefter på Anvend for at anvende ændringerne.Klik på Luk for at lukke vinduet. Åbn et FM4-64-farvet PS4150-sporsporer råt billede. Klik derefter på Rekonstruktion af udsnit for at udføre genopbygningen af udsnittet, og gem det rekonstruerede billede.For at konvertere 3D-SIM rå billeder af KGB80 geminosome i pseudo-widefield billeder, venstre-klik på ImageJ SIMcheck plugin og vælg Raw Data SI og Pseudo Widefield. Tilfældigt vælge omkring 25 sporer i hver omvendt transmission billede til en senere germinosome analyse i fluorescerende pseudo-widefield billeder, indtil ca 350 sporer er blevet valgt. Brug derefter ImageJ til at vurdere den maksimale intensitet for hvert lysstofrør, der udtrykkes af hver gruppe sporer, og den integrerede intensitet af hvert 3D-sporebillede.For at analysere pseudo-widefield billederne af KGB80 kiminosom, skal du bruge den gennemsnitlige integrerede intensitetsværdi af syv stakke som den integrerede signalintensitet af KGB80 spore. Derefter bestemme baggrunden intensiteter ved at billedre ps4150 baggrund stamme ved hjælp af identiske indstillinger, og betragter fluorescerende pletter i de enkelte KGB80 sporer som kiminosom foci, når de er klart skelnes fra baggrunden. I dette repræsentative eksperiment, to foci af GerD-GFP fluorescerende sporer dukkede op i forskellige stakke med tre samlede GerD-GFP foci observeret i compositive Z3 stack.Her blev der observeret en spore med kun ét GerD-GFP omdrejningspunkt i sporeen. I alt havde omkring 40 til 50% af sporerne to eller en GerD-GFP og GerKB-mCherry klynge, hhv. Mens den integrerede intensitet af GerD-GFP stilladsprotein var forskellig mellem forskellige populationer, var gerkb-mCherrys integrerede intensitet omtrent den samme i forskellige populationer.Når spore havde flere foci, den maksimale fluorescens intensitet af GerD-GFP og GerKB-mCherry foci tendens til at falde, og den maksimale fluorescens af alle de lyse pletter, betragtes som germinosome foci, var højere end den maksimale auto-fluorescens af PS4150 sporer. Især, lysere FM4-64 pletter svarende til kiminosom foci vises i både intakt og decoated PS4150 sporer, hvilket tyder på, at disse lysere FM4-64 pletter kan være involveret i klyngedannelse af kiminosom proteiner i den indre membran. Tilføjelse sporer til agarose og placere agarose i rammen kræver en kontinuerlig og omhyggelig væskebevægelse for disse minis materialer.Omdannelsen af 3D-SIM rå billeder af KGB80 kiminosom til pseudo-widefield billeder og deres fortolkning kræver ekspertviden om spore biologi. Vores strukturerede belysning mikroskopi procedure kan anvendes på billeddannelse af lavt rigelige proteiner eller dim fluorescens reportere i forskellige bakterier eller andre band materialer. Organiseringen af germinosom kan nu studeres ved hjælp af dobbelt mærkning procedurer til at vurdere co-lokalisering af Bacillus spiring proteiner og specifikke membran domæner.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Visualisering af Cortex Organisation og Dynamics i mikroorganismer, ved hjælp af total indre refleksion Fluorescens Mikroskopi

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

Membran-SPINE: en biokemisk redskab til at identificere protein-protein interaktioner membranproteiner<em&gt; In Vivo</em

Membrane proteins are essential for cell viability and are therefore important therapeutic targets1-3. Since they function in complexes4, methods to ...

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

Kvantificering af Global diastolisk funktion ved Kinematisk Modeling-baseret analyse af Transmitral Flow via parametriserede diastolisk Filling Formalisme

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Analysis of Tubular Membrane Networks in Cardiac Myocytes from Atria and Ventricles

Analyse af Tubular Membrane Networks i hjertemyocytter fra Atria og hjertekamre

In cardiac myocytes a complex network of membrane tubules - the transverse-axial tubule system (TATS) - controls deep intracellular signaling functions. ...

Luminescence Resonance Energy Transfer to Study Conformational Changes in Membrane Proteins Expressed in Mammalian Cells

Luminescence resonansenergioverførsel at studere konformationsændringer i Membranproteiner udtrykkes i pattedyrceller

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range ...

Three-Dimensionally Printed Microfluidic Cross-flow System for Ultrafiltration/Nanofiltration Membrane Performance Testing

Tredimensionalt trykte Mikrofluid Cross-flow System for Ultrafiltrering / nanofiltreringsmembran Performance Test

Minimization and management of membrane fouling is a formidable challenge in diverse industrial processes and other practices that utilize membrane ...

Treatment of Ligament Constructs with Exercise-conditioned Serum: A Translational Tissue Engineering Model

Behandling af ligamentkonstruktioner med træningskonditioneret serum: en translational tissue engineering model

In vitro experiments are essential to understand biological mechanisms; however, the gap between monolayer tissue culture and human physiology is large, ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

en<em&gt; In vitro</em&gt; Orgel Kultur Model af muse diskusprolaps

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

A Protocol for Decellularizing Mouse Cochleae for Inner Ear Tissue Engineering

En protokol til Decellularizing musen Cochleae for indre øre vævsmanipulering

In mammals, mechanosensory hair cells that facilitate hearing lack the ability to regenerate, which has limited treatments for hearing loss. Current ...