Name: visualization of germinosomes and the inner membrane in bacillus subtilis spores
Uploaded: 2019-04-15T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores at JoVE.com

De auteurs bedanken Christiaan Zeelenberg voor zijn hulp tijdens de SIM beeldvorming. JW erkent de China Scholarship Council for een PhD fellowship en Irene Stellingwerf Bedankt voor haar hulp tijdens de primaire fase van de beeldvorming.

1. B. subtillis sporevorming (Timing: 7 dagen vóór de microscopische observatie)
<ol><li>
Dag 1
	<ol>
<li>Strijk een bacteriële cultuur op een Luria Bertani Bouillon (LB) agar plaat (1% trypton gistextract 0,5%, 1% NaCl, 1% agar)13 en na een nacht bebroeden bij 37 ° C te verkrijgen van enkele kolonies. Gebruik de B. subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry kat, gerD-gfp kan) stam en zijn achtergrond ouderstam B. subtilis PS4150 (PS...

<ol>
	<li>Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germination+of+spores+of+Bacillus+species:+what+we+know+and+do+not+know.">Germination of spores of Bacillus species: what we know and do not know.</a> Journal of Bacteriology. 196 (7), 1297-1305 (2014).</li><li>Setlow, P., Wang, S., Li, Y. -. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germination+of+spores+of+the+orders+Bacillales+and+Clostridiales.">Germination of spores of the orders Bacillales and Clostridiales.</a> Annual Review of Microbiology. 71 (1), (2017).</li><li>Vepachedu, V. R., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+interactions+between+nutrient+germinant+receptors+and+SpoVA+proteins+of+Bacillus+subtilis+spores.">Analysis of interactions between nutrient germinant receptors and SpoVA proteins of Bacillus subtilis spores.</a> FEMS Microbiology Letters. 274 (1), 42-47 (2007).</li><li>Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Summer+meeting+2013&#8211;when+the+sleepers+wake:+the+germination+of+spores+of+Bacillus+species.">Summer meeting 2013&#8211;when the sleepers wake: the germination of spores of Bacillus species.</a> Journal of Applied Microbiology. 115 (6), 1251-1268 (2013).</li><li>Cowan, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipids+in+the+inner+membrane+of+dormant+spores+of+Bacillus+species+are+largely+immobile.">Lipids in the inner membrane of dormant spores of Bacillus species are largely immobile.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (20), 7733-7738 (2004).</li><li>Loison, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+investigation+of+viscosity+of+an+atypical+inner+membrane+of+Bacillus+spores:+a+molecular+rotor/FLIM+study.">Direct investigation of viscosity of an atypical inner membrane of Bacillus spores: a molecular rotor/FLIM study.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1828 (11), 2436-2443 (2013).</li><li>Griffiths, K. K., Zhang, J., Cowan, A. E., Yu, J., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germination+proteins+in+the+inner+membrane+of+dormant+Bacillus+subtilis+spores+colocalize+in+a+discrete+cluster.">Germination proteins in the inner membrane of dormant Bacillus subtilis spores colocalize in a discrete cluster.</a> Molecular Microbiology. 81 (4), 1061-1077 (2011).</li><li>Troiano, A. J., Zhang, J., Cowan, A. E., Yu, J., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+dynamics+of+a+Bacillus+subtilis+spore+germination+protein+complex+during+spore+germination+and+outgrowth.">Analysis of the dynamics of a Bacillus subtilis spore germination protein complex during spore germination and outgrowth.</a> Journal of Bacteriology. 197 (2), 252-261 (2015).</li><li>Wegel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cellular+structures+in+super-resolution+with+SIM,+STED+and+Localisation+Microscopy:+A+practical+comparison.">Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison.</a> Scientific Reports. 6, 27290 (2016).</li><li>Pandey, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+imaging+of+germination+and+outgrowth+of+individual+Bacillus+subtilis+spores;+the+effect+of+heat+stress+quantitatively+analyzed+with+SporeTracker.">Live cell imaging of germination and outgrowth of individual Bacillus subtilis spores; the effect of heat stress quantitatively analyzed with SporeTracker.</a> PloS One. 8 (3), e58972 (2013).</li><li>Demmerle, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategic+and+practical+guidelines+for+successful+structured+illumination+microscopy.">Strategic and practical guidelines for successful structured illumination microscopy.</a> Nature Protocols. 12 (5), 988-1010 (2017).</li><li>Ball, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SIMcheck:+a+toolbox+for+successful+super-resolution+structured+illumination+microscopy.">SIMcheck: a toolbox for successful super-resolution structured illumination microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 15915 (2015).</li><li>Bertani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STUDIES+ON+LYSOGENESIS+I.:+The+Mode+of+Phage+Liberation+by+Lysogenic+Escherichia+coli1.">STUDIES ON LYSOGENESIS I.: The Mode of Phage Liberation by Lysogenic Escherichia coli1.</a> Journal of Bacteriology. 62 (3), 293 (1951).</li><li>Pandey, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+the+effect+of+specific+tea+compounds+on+germination+and+outgrowth+of+Bacillus+subtilis+spores+at+single+cell+resolution.">Quantitative analysis of the effect of specific tea compounds on germination and outgrowth of Bacillus subtilis spores at single cell resolution.</a> Food Microbiology. 45, 63-70 (2015).</li><li>Zheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacillus+subtilis+spore+inner+membrane+proteome.">Bacillus subtilis spore inner membrane proteome.</a> Journal of Proteome Research. 15 (2), 585-594 (2016).</li><li>Vepachedu, V. R., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+SpoVAD+to+the+inner+membrane+of+spores+of+Bacillus+subtilis.">Localization of SpoVAD to the inner membrane of spores of Bacillus subtilis.</a> Journal of Bacteriology. 187 (16), 5677-5682 (2005).</li><li>Schouten, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+dendritic+spines+of+rat+primary+hippocampal+neurons+using+structured+illumination+microscopy.">Imaging dendritic spines of rat primary hippocampal neurons using structured illumination microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), (2014).</li><li>Mukaka, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+appropriate+use+of+correlation+coefficient+in+medical+research.">A guide to appropriate use of correlation coefficient in medical research.</a> Malawi Medical Journal. 24 (3), 69-71 (2012).</li><li>Stewart, K. A., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Numbers+of+individual+nutrient+germinant+receptors+and+other+germination+proteins+in+spores+of+Bacillus+subtilis.">Numbers of individual nutrient germinant receptors and other germination proteins in spores of Bacillus subtilis.</a> Journal of Bacteriology. 195 (16), 3575-3582 (2013).</li><li>Laflamme, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+analysis+of+germinating+Bacillus+spores,+using+membrane+potential+dye.">Flow cytometry analysis of germinating Bacillus spores, using membrane potential dye.</a> Archives of Microbiology. 183 (2), 107-112 (2005).</li><li>Magge, A., Setlow, B., Cowan, A. E., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+dye+binding+by+and+membrane+potential+in+spores+of+Bacillus+species.">Analysis of dye binding by and membrane potential in spores of Bacillus species.</a> Journal of Applied Microbiology. 106 (3), 814-824 (2009).</li><li>Ghosh, S., Scotland, M., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Levels+of+germination+proteins+in+dormant+and+superdormant+spores+of+Bacillus+subtilis.">Levels of germination proteins in dormant and superdormant spores of Bacillus subtilis.</a> Journal of Bacteriology. 194 (9), 2221-2227 (2012).</li><li>Abhyankar, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+sporulation+conditions+on+the+spore+coat+protein+composition+of+Bacillus+subtilis+Spores.">The influence of sporulation conditions on the spore coat protein composition of Bacillus subtilis Spores.</a> Frontiers in microbiology. 7, 1636 (2016).</li><li>Rose, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+properties+of+Bacillus+subtilis+spores+made+in+liquid+or+on+agar+plates.">Comparison of the properties of Bacillus subtilis spores made in liquid or on agar plates.</a> Journal of Applied Microbiology. 103 (3), 691-699 (2007).</li><li>Stewart, K. A., Yi, X., Ghosh, S., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germination+protein+levels+and+rates+of+germination+of+spores+of+Bacillus+subtilis+with+overexpressed+or+deleted+genes+encoding+germination+proteins.">Germination protein levels and rates of germination of spores of Bacillus subtilis with overexpressed or deleted genes encoding germination proteins.</a> J Bacteriol. 194 (12), 3156-3164 (2012).</li><li>Ramirez-Peralta, A., Zhang, P., Li, Y. -. q., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+sporulation+conditions+on+the+germination+and+germination+protein+levels+of+Bacillus+subtilis+spores.">Effects of sporulation conditions on the germination and germination protein levels of Bacillus subtilis spores.</a> Applied and Environmental Microbiology. 78 (8), 2689-2697 (2012).</li><li>Laue, M., Han, H. -. M., Dittmann, C., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+membranes+of+bacterial+endospores+are+reservoirs+for+spore+core+membrane+expansion+during+spore+germination.">Intracellular membranes of bacterial endospores are reservoirs for spore core membrane expansion during spore germination.</a> Scientific Reports. 8, 11388 (2018).</li><li>Strahl, H., B&#252;rmann, F., Hamoen, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+actin+homologue+MreB+organizes+the+bacterial+cell+membrane.">The actin homologue MreB organizes the bacterial cell membrane.</a> Nature Communications. 5, (2014).</li><li>Strahl, H., Hamoen, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+potential+is+important+for+bacterial+cell+division.">Membrane potential is important for bacterial cell division.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (27), 12281-12286 (2010).</li><li>Swarge, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="One-Pot"+sample+processing+methodfor+proteome-wide+analysis+of+microbial+cells+and+spores.">"One-Pot" sample processing methodfor proteome-wide analysis of microbial cells and spores.</a> Proteomics Clinical Applications. (5), 1700169 (2018).</li></ol>

Het protocol gepresenteerd bevat een procedure van de standaard 3D-SIM voor analyse van FM4-64 gekleurd van B. subtilis sporen die sporevorming, prepareren van objectglaasjes en imaging processen omvat. Bovendien, het protocol beschrijft een gemodificeerde SIMcheck (ImageJ)-3D-imaging proces voor SIM microscopie van B. subtilis spore germinosomes gelabeld met de fluorescerende verslaggevers bijgestaan. De laatste procedure konden we observeren deze dim substructuur met verbeterde contrast. Door de koppe...

Sporen van de orders, Bacillales en Clostridiales zijn metabolisch slapende en buitengewoon resistent tegen harde decontaminatie regimes, maar tenzij ze ontkiemen, geen schadelijke effecten in mens1. In voedende germinant geactiveerde kieming van sporen van Bacillus subtilis (B. subtilis) is de inleiding gebeurtenis germinant binding aan germinant receptoren (GRs) gelegen in de spore binnenste membraan (IM). Vervolgens transduce de GRs signalen aan de SpoVA kanaal proteïne ook gelegen in de IM. Dit resulteert in het begin van de uitwisseling van spore kern pyridine-2,6-dicarbon zuur (dipicolinic zuur; DPA; bestaande uit 20% van de spore kern dry wt) voor water via het SpoVA-kanaal. Vervolgens de release DPA activeert de activering van de cortex peptidoglycaan hydrolyse en extra water opname volgt2,3,4. Deze gebeurtenissen leiden tot mechanische belasting op de vacht lagen, zijn latere breuk, het begin van de uitgroei en, ten slotte, vegetatieve groei. De exacte moleculaire details van het proces van ontkieming zijn echter nog lang niet opgelost.
Een belangrijke vraag over spore kiemkracht betreft de biofysische eigenschappen van de vetten rondom de IM kiemkracht eiwitten evenals de IM SpoVA kanaal eiwitten. Deze grotendeels immobiel IM lipide dubbelgelaagde is de belangrijkste permeabiliteit barrière voor vele kleine molecules, met inbegrip van toxische chemische conserveringsmiddelen, waarvan sommige hun optreden in de kern van de spore of vegetatieve cel cytoplasma5,6 oefenen. De IM lipide dubbelgelaagde is waarschijnlijk in een gel staat, hoewel er een significante fractie van mobiele lipiden in de IM-5. De spore IM heeft ook het potentieel voor aanzienlijke uitbreiding5. Dus, de oppervlakte van de IM 1.6-fold verhoogt op kiemkracht zonder extra membraan synthese en gepaard gaat met het verlies van dit membraan de karakteristieke lage permeabiliteit en lipide immobiliteit5,6.
Hoewel de moleculaire details van de activering van kiemkracht eiwitten en organisatie van IM lipiden in sporen zijn aantrekkelijke onderwerpen voor studie, vormen de geringe omvang van B. subtilis sporen en de relatief lage overvloed van kiemkracht eiwitten, een uitdaging voor microscopische analyses. Griffiths et al. dwingende epifluorescence Microscoop bewijs, suggereert met behulp van fluorescerende verslaggevers aan kiemkracht eiwitten, gesmolten dat in B. subtilis sporen de steiger proteïne GerD organiseert drie GR subeenheden (A, B en C) voor de GerA, B en K GRs, in een cluster7. Zij bedacht de term 'germinosome' voor dit cluster van kiemkracht eiwitten en de structuren als ~ 300 nm groot IM eiwit foci8beschreven. Na de inleiding van spore kiemkracht, dispergeren fluorescerende germinosome foci uiteindelijk veranderen in grotere fluorescerende patronen, met > 75% van de populaties van de spore weergeven van dit patroon in sporen ontkiemd voor 1 h met L-valine8. Merk op dat het papier bovengenoemde gebruikte gemiddeld beelden uit tientallen opeenvolgende fluorescerende afbeeldingen, tot statistische macht bezaten en overwinnen van de horde van lage fluorescerende signalen waargenomen tijdens de beeldvorming. Deze visualisatie van deze structuren in bacteriële sporen was aan de rand van wat technisch haalbaar met klassieke microscopische tools en noch een evaluatie van de hoeveelheid foci in een enkele spore is noch hun meer gedetailleerde subcellular localisatie was mogelijk met deze aanpak.
Wij tonen hier, het gebruik van gestructureerde verlichting microscopie (SIM) te verkrijgen van een gedetailleerde visualisatie en kwantificering van de germinosome(s) in de sporen van B. subtilis, alsmede van hun IM lipide domeinen9. Het protocol bevat ook instructies voor de sporevorming, prepareren van objectglaasjes en beeldanalyse door SIMcheck (v1.0, een imageJ plugin) evenals ImageJ10,11,12.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Air dried glass slides</td>
			<td>Menzel Gl&#228;ser</td>
			<td>630-2870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APO TIRF N20R8 100&#215; oil objective (NA=1.49)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B. subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry cat, gerD-gfp kan)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B. subtilis PS4150 (PS832 &#916;gerE::spc, &#916;cotE::tet)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flasks 1 L</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z567868</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flasks 250 mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z723088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoSpheres carboxylate-modified microspheres</td>
			<td>Invitrogen, 0.1 &#956;m</td>
			<td>F8803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM4-64</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F34653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histodenz nonionic density gradient medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iXON3 DU-897 X-6515 CCD camera</td>
			<td>Andor Technology</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.net/Welcome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge tubes 1.5 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>3451PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope imaging software</td>
			<td>Nikon, Japan</td>
			<td>NIS-Element AR 4.51.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliQ Ultrapure Deminerilzed Water</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Milli-Q IQ 7003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Screw Cap Bottle 180 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75003800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Coverslips</td>
			<td>Paul Marienfeld</td>
			<td>117650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round Bottom tubes 15 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Nunc TM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap tubes 50 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Nunc TM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of germinosomes and the inner membrane in bacillus subtilis spores

De geringe omvang van de sporen en de relatief lage abundantie van kiemkracht eiwitten, veroorzaken moeilijkheden in hun microscopische analyses met behulp van microscopie van epifluorescence. Super resolutie driedimensionale gestructureerde verlichting microscopie (3D-SIM) is een veelbelovende instrument om deze hindernis overwinnen en onthullen de moleculaire details van het proces van ontkieming van sporen van Bacillus subtilis (B. subtilis). Hier beschrijven we het gebruik van een gemodificeerde SIMcheck (ImageJ)-Assistent 3D imaging proces en fluorescerende verslaggever eiwitten voor SIM microscopie van B. subtilis sporen germinosomes, cluster (s) van kiemkracht eiwitten. Ook presenteren wij een procedure (standaard) 3D-SIM imaging voor FM4-64 kleuring van B. subtilis spore membranen. Met behulp van deze procedures, we verkregen onovertroffen resolutie voor germinosome lokalisatie en tonen aan dat > 80% van B. subtilis KGB80 slapende sporen na sporevorming op een gedefinieerde minimale MOPS voedingsbodem verkregen hebben één of twee GerD-GFP en GerKB-mCherry Foci. Heldere foci werden ook waargenomen in FM4-64 gekleurd sporen 3D-SIM beelden suggereren dat binnenste membraan lipide domeinen van verschillende vloeibaarheid waarschijnlijk bestaan. Verdere zijn studies die dubbele etikettering procedures met membraan kleurstoffen en germinosome verslaggever eiwitten gebruiken om te beoordelen co lokalisatie en dus krijgt een optimaal overzicht van de organisatie van Bacillus kiemkracht eiwitten in het membraan van de innerlijke spore mogelijk.

Het huidige protocol presenteert een SIM Microscoop imaging procedure voor bacteriële sporen. De voorbereiding van de procedures sporevorming en dia werden uitgevoerd zoals aangegeven in Figuur 1 voor imaging. Later, de beeldvorming en analyse procedures werden toegepast zowel voor dim (fluorescent proteïne label kiemkracht eiwitten) en lichte (lipofiele sonde gekleurd IM) spore monsters zoals in de volgende tekst wordt weergegeven.
<p class="jove_conte...

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores at JoVE.com

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

Visualisatie van Germinosomes en het binnenste membraan in sporen van Bacillus subtilis

Germinant receptor eiwitten cluster in 'germinosomes' in het binnenste membraan van sporen van Bacillus subtilis . We beschrijven een protocol met behulp van super resolutie microscopie en TL verslaggever eiwitten om te visualiseren van germinosomes. Het protocol geeft ook spore binnenste membraan domeinen die zijn bij voorkeur gekleurd met de membraan kleurstof FM4-64.

The small size of spores and the relatively low abundance of germination proteins, cause difficulties in their microscopic analyses using epifluorescence ...

Super-resolutie gestructureerde verlichting microscopie, 3D-SIM, is een innovatieve techniek voor de visualisatie van fluorescerende reporter eiwitten van kiemreceptor clusters in sporenmembranen. Met behulp van deze procedures kan een onovertroffen oplossing van germinosome lokalisatie en sporen binnenmembraan lipide domeinen worden bereikt. De techniek wordt gedemonstreerd door promovendus Juan Wen en Master of Science student Raymond Pasman van ons laboratorium.Voordat u met de procedure begint, moet u hoge precisie coverslips met één-molaire zoutzuur gedurende 30 minuten reinigen in een zacht schuddend waterbad, gevolgd door twee, vijf minuten wasbeurten in ultrazuiver type 1-water. Na de tweede wasbeurt, plaats de coverslips in 100% ethanol gedurende ongeveer drie minuten voor het drogen van de coverslips en het verifiëren van hun helderheid. Vervolgens, schoon glas microscoop dia's met 70% ethanol voor een minuut voordat de dia's te drogen en het verifiëren van hun helderheid.Voor fluorescerende microsfeer en sporenbeeldvorming, eerst pre-warm twee dia's op een 70-graden Celsius verwarming blok voor een paar seconden voor het toevoegen van een 70-graden Celsius, 65-microliter druppel van gesteriliseerde 2%agarose op een van de dia's. Plaats de andere dia op de top om de agarose tussen de dia's te verspreiden. Verwijder na vijf minuten een van de glijbanen en snijd de gedroogde agarose in een sectie van één voor één centimeter.Voeg een keer 10 toe aan de achtste fluorescerende microsferen of sporen in 0,4 microliter steriel, ultrazuiver type 1-water aan de agarose en plaats een hoge precisie coverslip op de patch met behulp van de coverslip om de patch van de dia op het coverslipoppervlak te schuiven. Bevestig vervolgens een 65-microliter, 1,5 bij 1,6 centimeter Gen Frame op een gedroogde dia, en plaats de coverslip op het frame, het sluiten van alle hoeken van het frame. Voor beeldvorming van de monsters, plaats de dia op een gestructureerde verlichting microscoop uitgerust met een 100X olie doelstelling, en focus op de 100-nanometer fluorescerende microsferen.Pas de correctiering op de 100x-doelstelling aan totdat een symmetrische puntspreadfunctie is verkregen om vervaging van de beelden te minimaliseren en selecteer een gezichtsveld met ongeveer 10 ronde fluorescerende microsferen. Breng een roosterfocusaanpassing toe voor de aangewezen excitatiegolflengten, in dit geval 561 en 488 nanometer, als een leidraad voor de beeldanalysesoftware voordat u zich richt op de sporen met het transmissielicht. Leg een transmissielichtbeeld vast in de 16x gemiddelde modus met belichtingen van 20 milliseconden voor elke afbeelding.Leg vervolgens 3D-gestructureerde verlichtingsmicroscoop ruwe fluorescerende beelden van de sporen vast met de 3D-SIM-verlichtingsmodus. Klik voor segmentreconstructie op Param op het tabblad gestructureerde verlichtingsblok om het venster N-SIM-segmentreconstructie te openen. Volg de voorgestelde instructies en klik op de juiste besturingselementen om het contrast van de verlichtingsmodulatie in te stellen op automatisch, de ruisonderdrukking met hoge resolutie op één en de onscherpteonderdrukking van de focus op 0,05 als uitgangspunten.Klik vervolgens op Slice reconstrueren om de afbeelding te reconstrueren en de kwaliteit van de gereconstrueerde afbeeldingen te evalueren aan de hand van de snelle door Fourier getransformeerde afbeeldingen en reconstructiescore die na de reconstructie worden weergegeven. Pas de ruis met hoge resolutie aan van 0,1 naar 5 en de onscherpteonderdrukking van 0,01 naar 0,5 totdat de beste parameterinstellingen zijn verkregen. Klik vervolgens op Toepassen om de wijzigingen toe te passen.Klik op Sluiten om het venster te sluiten. Open een FM4-64 bevlekte PS4150 sporen ruwe beeld. Klik vervolgens op Slice reconstrueren om de segmentreconstructie uit te voeren en sla de gereconstrueerde afbeelding op.Om de 3D-SIM raw afbeeldingen van de KGB80 geminosome om te zetten in pseudo-widefield afbeeldingen, klik links op de ImageJ SIMcheck plugin en selecteer Raw Data SI en Pseudo Widefield. Selecteer willekeurig ongeveer 25 sporen in elk omgekeerd transmissiebeeld voor een latere kiemachtige analyse in de fluorescerende pseudo-widefield beelden tot ongeveer 350 sporen zijn geselecteerd. Gebruik vervolgens ImageJ om de maximale intensiteit te beoordelen voor elk fluorescerend signaal uitgedrukt door elke groep sporen en de geïntegreerde intensiteit van elk 3D-sporenbeeld.Om de pseudo-widefield beelden van de KGB80 germinosome te analyseren, gebruik de gemiddelde geïntegreerde intensiteitswaarde van zeven stapels als de geïntegreerde signaalintensiteit van de KGB80 spore. Bepaal vervolgens de achtergrondintensiteiten door de PS4150-achtergrondstam te imagingen met behulp van identieke instellingen en beschouw de fluorescerende vlekken in individuele KGB80-sporen als germinosome foci wanneer ze duidelijk van de achtergrond te onderscheiden zijn. In dit representatieve experiment verschenen twee foci van de GerD-GFP fluorescerende sporen in verschillende stapels met drie totale GerD-GFP foci waargenomen in de compositive Z3 stack.Hier werd een spore waargenomen met slechts één GerD-GFP brandpunt in de spore. In totaal had ongeveer 40 tot 50% van de sporen respectievelijk twee of één GerD-GFP en GerKB-mCherry-cluster. Terwijl de geïntegreerde intensiteit van het GerD-GFP steigereiwit tussen verschillende populaties verschilde, was de geïntegreerde intensiteit van GerKB-mCherry ongeveer hetzelfde in verschillende populaties.Toen de sporen meerdere foci hadden, was de maximale fluorescentieintensiteit van GerD-GFP en GerKB-mCherry foci de neiging om te verminderen, en de maximale fluorescentie van alle lichtpuntjes, beschouwd als de germinosome foci, was hoger dan de maximale autofluorescentie van de PS4150 sporen. Met name helderder FM4-64 vlekken vergelijkbaar met germinosome foci verschijnen in zowel intacte als gedecoated PS4150 sporen, wat suggereert dat deze helderdere FM4-64 vlekken betrokken kunnen zijn bij de clustering van germinosome eiwitten in het binnenste membraan. Het toevoegen van sporen aan de agarose en het plaatsen van agarose in het frame vereist een continue en zorgvuldige vloeiende beweging voor deze mini's materialen.De omzetting van 3D-SIM ruwe beelden van de KGB80 germinosome in pseudo-widefield beelden en hun interpretatie vereist deskundige kennis over sporenbiologie. Onze gestructureerde verlichting microscopie procedure kan worden toegepast op de beeldvorming van lage overvloedige eiwitten of dim fluorescentie verslaggevers in verschillende bacteriën of andere band materialen. De organisatie van het germinosome kan nu worden bestudeerd met behulp van dubbele etikettering procedures om co-lokalisatie van Bacillus kiemeiwitten en specifieke membraandomeinen te beoordelen.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

Optische kaart brengen van actiepotentialen en Calcium Transiënten in de muis Hart

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Visualisatie van Cortex Organisatie en Dynamiek in Micro-organismen, met behulp van Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

Membraan-STEKEL: een biochemische Tool om eiwit-eiwit interacties van membraaneiwitten Identificeer<em&gt; In Vivo</em

Membrane proteins are essential for cell viability and are therefore important therapeutic targets1-3. Since they function in complexes4, methods to ...

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

Kwantificering van Global diastolische functie door Kinematisch Modeling-gebaseerde analyse van transmitraal Flow via de Geparameteriseerde diastolische Vullen formalisme

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Analysis of Tubular Membrane Networks in Cardiac Myocytes from Atria and Ventricles

Analyse van buisvormig membraan Netwerken in hartspiercellen van boezems en kamers

In cardiac myocytes a complex network of membrane tubules - the transverse-axial tubule system (TATS) - controls deep intracellular signaling functions. ...

Luminescence Resonance Energy Transfer to Study Conformational Changes in Membrane Proteins Expressed in Mammalian Cells

Luminescentie Resonance Energy Transfer om te studeren vormveranderingen in membraaneiwitten Uitgedrukt in zoogdiercellen

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range ...

Three-Dimensionally Printed Microfluidic Cross-flow System for Ultrafiltration/Nanofiltration Membrane Performance Testing

Driedimensionaal Printed microfluïdische Cross-flow-systeem voor Ultrafiltratie / nanofiltratiemembraan Performance Testing

Minimization and management of membrane fouling is a formidable challenge in diverse industrial processes and other practices that utilize membrane ...

Treatment of Ligament Constructs with Exercise-conditioned Serum: A Translational Tissue Engineering Model

Behandeling van ligamentconstructen met uitoefening geconditioneerd serum: een translatie weefsel techniek model

In vitro experiments are essential to understand biological mechanisms; however, the gap between monolayer tissue culture and human physiology is large, ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Een<em&gt; In Vitro</em&gt; Organ Culture Model van het Muizen tussenwervelschijf

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

A Protocol for Decellularizing Mouse Cochleae for Inner Ear Tissue Engineering

Een Protocol voor Decellularizing muis Cochleae voor binnenoor Tissue Engineering

In mammals, mechanosensory hair cells that facilitate hearing lack the ability to regenerate, which has limited treatments for hearing loss. Current ...