Name: visualization of germinosomes and the inner membrane in bacillus subtilis spores
Uploaded: 2019-04-15T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores at JoVE.com

Les auteurs remercient Christiaan Zeelenberg pour son aide durant l’imagerie SIM. JW reconnaît le China Scholarship Council pour une bourse de doctorat et remercie Irene Stellingwerf pour son aide pendant la phase principale de l’imagerie.

1. b. subtillis Sporulation (Timing : 7 jours avant l’Observation microscopique)
<ol><li>
Jour 1
	<ol>
<li>Ensemencer une culture bactérienne sur un bouillon Luria-Bertani (LB) agar plaque (tryptone 1 %, extrait de levure 0,5 %, 1 % de NaCl, 1 % d’agar)13 et incuber une nuit à 37 ° C pour obtenir des colonies individuelles. Utiliser la souche de b. subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry chat, gerD-gfp kan) et sa souche de fond parent ...

<ol>
	<li>Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germination+of+spores+of+Bacillus+species:+what+we+know+and+do+not+know.">Germination of spores of Bacillus species: what we know and do not know.</a> Journal of Bacteriology. 196 (7), 1297-1305 (2014).</li><li>Setlow, P., Wang, S., Li, Y. -. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germination+of+spores+of+the+orders+Bacillales+and+Clostridiales.">Germination of spores of the orders Bacillales and Clostridiales.</a> Annual Review of Microbiology. 71 (1), (2017).</li><li>Vepachedu, V. R., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+interactions+between+nutrient+germinant+receptors+and+SpoVA+proteins+of+Bacillus+subtilis+spores.">Analysis of interactions between nutrient germinant receptors and SpoVA proteins of Bacillus subtilis spores.</a> FEMS Microbiology Letters. 274 (1), 42-47 (2007).</li><li>Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Summer+meeting+2013&#8211;when+the+sleepers+wake:+the+germination+of+spores+of+Bacillus+species.">Summer meeting 2013&#8211;when the sleepers wake: the germination of spores of Bacillus species.</a> Journal of Applied Microbiology. 115 (6), 1251-1268 (2013).</li><li>Cowan, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipids+in+the+inner+membrane+of+dormant+spores+of+Bacillus+species+are+largely+immobile.">Lipids in the inner membrane of dormant spores of Bacillus species are largely immobile.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (20), 7733-7738 (2004).</li><li>Loison, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+investigation+of+viscosity+of+an+atypical+inner+membrane+of+Bacillus+spores:+a+molecular+rotor/FLIM+study.">Direct investigation of viscosity of an atypical inner membrane of Bacillus spores: a molecular rotor/FLIM study.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1828 (11), 2436-2443 (2013).</li><li>Griffiths, K. K., Zhang, J., Cowan, A. E., Yu, J., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germination+proteins+in+the+inner+membrane+of+dormant+Bacillus+subtilis+spores+colocalize+in+a+discrete+cluster.">Germination proteins in the inner membrane of dormant Bacillus subtilis spores colocalize in a discrete cluster.</a> Molecular Microbiology. 81 (4), 1061-1077 (2011).</li><li>Troiano, A. J., Zhang, J., Cowan, A. E., Yu, J., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+dynamics+of+a+Bacillus+subtilis+spore+germination+protein+complex+during+spore+germination+and+outgrowth.">Analysis of the dynamics of a Bacillus subtilis spore germination protein complex during spore germination and outgrowth.</a> Journal of Bacteriology. 197 (2), 252-261 (2015).</li><li>Wegel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cellular+structures+in+super-resolution+with+SIM,+STED+and+Localisation+Microscopy:+A+practical+comparison.">Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison.</a> Scientific Reports. 6, 27290 (2016).</li><li>Pandey, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+imaging+of+germination+and+outgrowth+of+individual+Bacillus+subtilis+spores;+the+effect+of+heat+stress+quantitatively+analyzed+with+SporeTracker.">Live cell imaging of germination and outgrowth of individual Bacillus subtilis spores; the effect of heat stress quantitatively analyzed with SporeTracker.</a> PloS One. 8 (3), e58972 (2013).</li><li>Demmerle, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategic+and+practical+guidelines+for+successful+structured+illumination+microscopy.">Strategic and practical guidelines for successful structured illumination microscopy.</a> Nature Protocols. 12 (5), 988-1010 (2017).</li><li>Ball, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SIMcheck:+a+toolbox+for+successful+super-resolution+structured+illumination+microscopy.">SIMcheck: a toolbox for successful super-resolution structured illumination microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 15915 (2015).</li><li>Bertani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STUDIES+ON+LYSOGENESIS+I.:+The+Mode+of+Phage+Liberation+by+Lysogenic+Escherichia+coli1.">STUDIES ON LYSOGENESIS I.: The Mode of Phage Liberation by Lysogenic Escherichia coli1.</a> Journal of Bacteriology. 62 (3), 293 (1951).</li><li>Pandey, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+the+effect+of+specific+tea+compounds+on+germination+and+outgrowth+of+Bacillus+subtilis+spores+at+single+cell+resolution.">Quantitative analysis of the effect of specific tea compounds on germination and outgrowth of Bacillus subtilis spores at single cell resolution.</a> Food Microbiology. 45, 63-70 (2015).</li><li>Zheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacillus+subtilis+spore+inner+membrane+proteome.">Bacillus subtilis spore inner membrane proteome.</a> Journal of Proteome Research. 15 (2), 585-594 (2016).</li><li>Vepachedu, V. R., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+SpoVAD+to+the+inner+membrane+of+spores+of+Bacillus+subtilis.">Localization of SpoVAD to the inner membrane of spores of Bacillus subtilis.</a> Journal of Bacteriology. 187 (16), 5677-5682 (2005).</li><li>Schouten, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+dendritic+spines+of+rat+primary+hippocampal+neurons+using+structured+illumination+microscopy.">Imaging dendritic spines of rat primary hippocampal neurons using structured illumination microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), (2014).</li><li>Mukaka, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+appropriate+use+of+correlation+coefficient+in+medical+research.">A guide to appropriate use of correlation coefficient in medical research.</a> Malawi Medical Journal. 24 (3), 69-71 (2012).</li><li>Stewart, K. A., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Numbers+of+individual+nutrient+germinant+receptors+and+other+germination+proteins+in+spores+of+Bacillus+subtilis.">Numbers of individual nutrient germinant receptors and other germination proteins in spores of Bacillus subtilis.</a> Journal of Bacteriology. 195 (16), 3575-3582 (2013).</li><li>Laflamme, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+analysis+of+germinating+Bacillus+spores,+using+membrane+potential+dye.">Flow cytometry analysis of germinating Bacillus spores, using membrane potential dye.</a> Archives of Microbiology. 183 (2), 107-112 (2005).</li><li>Magge, A., Setlow, B., Cowan, A. E., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+dye+binding+by+and+membrane+potential+in+spores+of+Bacillus+species.">Analysis of dye binding by and membrane potential in spores of Bacillus species.</a> Journal of Applied Microbiology. 106 (3), 814-824 (2009).</li><li>Ghosh, S., Scotland, M., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Levels+of+germination+proteins+in+dormant+and+superdormant+spores+of+Bacillus+subtilis.">Levels of germination proteins in dormant and superdormant spores of Bacillus subtilis.</a> Journal of Bacteriology. 194 (9), 2221-2227 (2012).</li><li>Abhyankar, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+sporulation+conditions+on+the+spore+coat+protein+composition+of+Bacillus+subtilis+Spores.">The influence of sporulation conditions on the spore coat protein composition of Bacillus subtilis Spores.</a> Frontiers in microbiology. 7, 1636 (2016).</li><li>Rose, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+properties+of+Bacillus+subtilis+spores+made+in+liquid+or+on+agar+plates.">Comparison of the properties of Bacillus subtilis spores made in liquid or on agar plates.</a> Journal of Applied Microbiology. 103 (3), 691-699 (2007).</li><li>Stewart, K. A., Yi, X., Ghosh, S., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germination+protein+levels+and+rates+of+germination+of+spores+of+Bacillus+subtilis+with+overexpressed+or+deleted+genes+encoding+germination+proteins.">Germination protein levels and rates of germination of spores of Bacillus subtilis with overexpressed or deleted genes encoding germination proteins.</a> J Bacteriol. 194 (12), 3156-3164 (2012).</li><li>Ramirez-Peralta, A., Zhang, P., Li, Y. -. q., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+sporulation+conditions+on+the+germination+and+germination+protein+levels+of+Bacillus+subtilis+spores.">Effects of sporulation conditions on the germination and germination protein levels of Bacillus subtilis spores.</a> Applied and Environmental Microbiology. 78 (8), 2689-2697 (2012).</li><li>Laue, M., Han, H. -. M., Dittmann, C., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+membranes+of+bacterial+endospores+are+reservoirs+for+spore+core+membrane+expansion+during+spore+germination.">Intracellular membranes of bacterial endospores are reservoirs for spore core membrane expansion during spore germination.</a> Scientific Reports. 8, 11388 (2018).</li><li>Strahl, H., B&#252;rmann, F., Hamoen, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+actin+homologue+MreB+organizes+the+bacterial+cell+membrane.">The actin homologue MreB organizes the bacterial cell membrane.</a> Nature Communications. 5, (2014).</li><li>Strahl, H., Hamoen, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+potential+is+important+for+bacterial+cell+division.">Membrane potential is important for bacterial cell division.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (27), 12281-12286 (2010).</li><li>Swarge, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="One-Pot"+sample+processing+methodfor+proteome-wide+analysis+of+microbial+cells+and+spores.">"One-Pot" sample processing methodfor proteome-wide analysis of microbial cells and spores.</a> Proteomics Clinical Applications. (5), 1700169 (2018).</li></ol>

Le protocole présenté contient une procédure standard 3D-SIM pour l’analyse de FM4-64 teinté de spores de b. subtilis qui inclut la sporulation, préparation et processus d’imagerie. En outre, le protocole décrit une mis à jour le SIMcheck (ImageJ)-assistée des processus pour la microscopie SIM de b. subtilis spore germinosomes marqués avec des journalistes fluorescents d’imagerie 3D. Cette dernière procédure nous a permis d’observer cette sous-structure dim avec un contraste amélior?...

Les spores de l’ordre des Bacillales et Clostridiales sont métaboliquement inactives et extraordinairement résistant à des régimes sévères de décontamination, mais à moins qu’elles germent, ne causent pas des effets délétères dans les humains1. En éléments nutritifs germinant déclenchée la germination des spores de Bacillus subtilis (b. subtilis), l’événement d’initiation est germinant liant aux récepteurs germinant (GRs) situé dans la membrane interne de la spore (IM). Par la suite, les GRs transmettre des signaux à la protéine de canal de SpoVA que se trouve également dans le IM. Cela se traduit par l’apparition de l’échange de spore noyau pyridine-2, 6-dicarboxylique (acide dipicolinique ; DPA ; composée de 20 % du poids sec de la spore core) pour l’eau via le canal de SpoVA. Par la suite, la libération DPA déclenche l’activation de l’hydrolyse du peptidoglycane cortex et l’absorption d’eau supplémentaire suit2,3,4. Ces événements conduisent à un stress mécanique sur les couches du manteau, sa rupture ultérieure, l’apparition de l’excroissance et, enfin, la croissance végétative. Toutefois, les détails moléculaires exacts de la germination sont encore loin d’être résolues.
Une question majeure pour la germination des spores concerne les propriétés biophysiques des lipides qui entourent les protéines de germination IM ainsi que les protéines de canal IM SpoVA. Cette couche lipidique en grande partie immobile IM est la barrière de perméabilité principal pour beaucoup de petites molécules, y compris des conservateurs chimiques toxiques, dont certains exercent leur action dans la base de spores ou de la cellule végétative cytoplasme5,6. La bicouche lipidique IM est probablement dans un état de gel, mais il y a une fraction importante des lipides mobiles dans l’IM5. IM de la spore a également le potentiel d’expansion considérable5. Ainsi, la superficie de la messagerie instantanée augmente de 1,6 fois à la germination sans synthèse membranaire supplémentaires et s’accompagne de la perte de cette membrane caractéristique faible perméabilité et lipides immobilité5,6.
Alors que les détails moléculaires de l’activation des protéines de la germination et organisation des lipides IM dans les spores sont des sujets attrayants pour l’étude, la petite taille des spores de b. subtilis et la relativement faible abondance des protéines de la germination, posent un défi analyses microscopiques. Griffiths et al une épifluorescence microscope preuve concluante, à l’aide de reporters fluorescents fusionnés aux protéines de la germination, donne à penser que dans les spores de b. subtilis , la protéine d’échafaudage GerD organise trois sous-unités GR (A, B et C) de GerA, B et K GRs, dans un cluster7. Ils a inventé le terme « germinosome » pour ce cluster des protéines de la germination et les structures qualifiées de ~ 300 nm grand IM protéine foyers8. Au début de la germination des spores, fluorescent germinosome foyers en fin de compte transforment en plus disperser modèles fluorescents, avec > 75 % des populations de spores affichant ce modèle dans les spores germent pendant 1 h avec la L-valine,8. Notez que le document mentionné ci-dessus utilisés en moyenne des images depuis des dizaines d’images fluorescentes consécutives, pour gagner la puissance statistique et surmonter l’obstacle des faibles signaux fluorescents observées en imagerie. Cette visualisation de ces structures dans les spores bactériennes était au bord de ce qui est techniquement faisable avec les outils classiques de microscopiques et ni une évaluation du montant des foyers dans une seule spore ni leur localisation subcellulaire plus détaillée possible avec cette approche.
Ici, nous montrons l’utilisation de microscopie de Illumination structurée (SIM) pour obtenir une visualisation détaillée et la quantification de le germinosome(s) dans les spores de b. subtilis, ainsi que de leurs IM lipides domaines9. Le protocole contient également des instructions pour la sporulation, la préparation et l’analyse d’image par SIMcheck (v1.0, un plugin d’imageJ) ainsi que de ImageJ10,11,12.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Air dried glass slides</td>
			<td>Menzel Gl&#228;ser</td>
			<td>630-2870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APO TIRF N20R8 100&#215; oil objective (NA=1.49)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B. subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry cat, gerD-gfp kan)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B. subtilis PS4150 (PS832 &#916;gerE::spc, &#916;cotE::tet)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flasks 1 L</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z567868</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flasks 250 mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z723088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoSpheres carboxylate-modified microspheres</td>
			<td>Invitrogen, 0.1 &#956;m</td>
			<td>F8803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM4-64</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F34653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histodenz nonionic density gradient medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iXON3 DU-897 X-6515 CCD camera</td>
			<td>Andor Technology</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.net/Welcome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge tubes 1.5 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>3451PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope imaging software</td>
			<td>Nikon, Japan</td>
			<td>NIS-Element AR 4.51.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliQ Ultrapure Deminerilzed Water</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Milli-Q IQ 7003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Screw Cap Bottle 180 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75003800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Coverslips</td>
			<td>Paul Marienfeld</td>
			<td>117650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round Bottom tubes 15 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Nunc TM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap tubes 50 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Nunc TM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of germinosomes and the inner membrane in bacillus subtilis spores

La petite taille des spores et la relativement faible abondance des protéines de la germination, causer des difficultés dans leurs analyses microscopiques à l’aide de la microscopie à épifluorescence. Super-résolution microscopie de Illumination structurée en trois dimensions (3D-SIM) est un outil prometteur pour surmonter cet obstacle et de révéler les détails moléculaires du processus de la germination des spores de Bacillus subtilis (b. subtilis). Nous décrivons ici l’utilisation d’un SIMcheck modifié (ImageJ)-processus d’imagerie 3D assistant et protéines fluorescentes journaliste pour la microscopie SIM de germinosomes des spores de b. subtilis , grappes des protéines de la germination. Nous présentons également une procédure d’imagerie 3D (standard)-SIM pour FM4-64 la souillure des membranes de spores de b. subtilis . Grâce à ces procédures, nous avons obtenu une résolution inégalable pour la localisation de germinosome et montrent que > 80 % des KGB80 de b. subtilis spores dormantes obtenues après la sporulation sur milieu minimal défini de MOPS ont un ou deux GerD-GFP et GerKB-mCherry foyers. Foyers lumineux ont été également observés dans FM4-64 colorées des images 3D-SIM des spores suggérant qu’il existe des domaines de lipides de membrane interne de fluidité différente susceptible. D’autres études qui utilisent double étiquetage des procédures avec des colorants de la membrane et germinosome protéines de journaliste pour évaluer la co-localisation et ainsi obtenir un aperçu optimal de l’organisation des protéines de la germination de bacille dans la membrane interne de spores sont possible.

Le protocole actuel présente une procédure d’imagerie de microscope SIM pour les spores bactériennes. Les procédures de préparation de la sporulation et la glissière ont été effectuées tel qu’indiqué dans la Figure 1 avant l’imagerie. Plus tard, les procédures d’imagerie et d’analyse ont été appliquées pour dim (protéine fluorescente étiqueté protéines de germination) et lumineux spore (sonde lipophiles coloré IM) échantillons co...

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Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

Visualisation de Germinosomes et de la Membrane interne dans les Spores de Bacillus subtilis

Amas de protéines récepteurs germinant dans « germinosomes » dans la membrane interne de spores de Bacillus subtilis . Les auteurs décrivent un protocole utilisant des protéines de super-résolution microscopie et fluorescentes de journaliste pour visualiser germinosomes. Le protocole précise également domaines de membrane interne de spores qui sont préférentiellement souillées avec le colorant de membrane FM4-64.

The small size of spores and the relatively low abundance of germination proteins, cause difficulties in their microscopic analyses using epifluorescence ...

La microscopie d’éclairage structuré à super résolution, 3D-SIM, est une technique novatrice pour la visualisation des protéines fluorescentes des récepteurs de germination dans les membranes des spores. À l’aide de ces procédures, une résolution inégalée de la localisation des germinosomes et des domaines lipidiques de la membrane interne des spores peut être obtenue. La technique sera démontrée par juan Wen, doctorant, et Raymond Pasman, étudiant à la maîtrise en sciences, de notre laboratoire.Avant de commencer l’intervention, nettoyez les couvre-chefs de haute précision avec de l’acide chlorhydrique d’une molaire pendant 30 minutes dans un bain d’eau qui tremble doucement, suivi de deux lavages de cinq minutes dans de l’eau ultrapure de type 1. Après le deuxième lavage, placez les coverslips dans 100% éthanol pendant environ trois minutes avant de sécher les coverslips et de vérifier leur clarté. Ensuite, le microscope en verre propre glisse avec 70% d’éthanol pendant une minute avant de permettre aux glissières de sécher et de vérifier leur clarté.Pour l’imagerie par microsphère fluorescente et spores, d’abord préchauffer deux diapositives sur un bloc chauffant de 70 degrés Celsius pendant quelques secondes avant d’ajouter une gouttelette de 70 degrés Celsius et de 65 microlitres de 2 % stérilisée sur l’une des diapositives. Placez l’autre glissière sur le dessus pour étendre l’agarose entre les glissières. Après cinq minutes, retirer l’une des glissières et couper l’agarose séchée en une section d’un centimètre par un.Ajouter une fois 10 aux huitièmes microsphères fluorescents ou spores dans 0,4 microlitres d’eau stérile et ultrapure de type 1 à l’agarose, et placer un coverslip de haute précision sur le patch à l’aide du coverslip pour glisser le patch hors de la diapositive sur la surface du coverslip. Ensuite, fixez un cadre gene de 65 microlitres de 1,5 par 1,6 centimètre sur une glissière séchée et placez le coverslip sur le cadre, fermant tous les coins du cadre. Pour l’imagerie des échantillons, placez la diapositive sur un microscope à éclairage structuré équipé d’un objectif d’huile 100X et concentrez-vous sur les microsphériques fluorescents de 100 nanomètres.Ajustez l’anneau de correction sur l’objectif 100x jusqu’à ce qu’une fonction de propagation de point symétrique soit obtenue pour minimiser le flou des images, et sélectionnez un champ de vision avec environ 10 microsphères fluorescents ronds. Appliquez un réglage de mise au point de grille pour les longueurs d’onde d’excitation désignées, dans ce cas, 561 et 488 nanomètres, comme guide pour le logiciel d’analyse d’image avant de se concentrer sur les spores avec la lumière de transmission. Capturez une image de lumière de transmission dans le mode 16x moyen avec des expositions de 20 millisecondes pour chaque image.Ensuite, capturez des images fluorescentes brutes au microscope à éclairage structuré en 3D des spores avec le mode d’éclairage 3D-SIM. Pour la reconstruction des tranches, cliquez sur Param sur la feuille d’onglets de la garniture d’éclairage structurée pour ouvrir la fenêtre de reconstruction des tranches N-SIM. Suivez les instructions suggérées, et cliquez sur les contrôles appropriés pour définir le contraste de modulation d’éclairage à l’auto, la suppression du bruit haute résolution à un, et la suppression floue hors de la mise au point à 0,05 comme points de départ.Ensuite, cliquez sur Reconstruire Slice pour reconstruire l’image et évaluer la qualité des images reconstruites par les images rapides transformées par Fourier et le score de reconstruction qui sont affichés après la reconstruction. Réglez le bruit haute résolution de 0,1 à cinq et la suppression floue hors de la mise au point de 0,01 à 0,5 jusqu’à ce que les meilleurs paramètres soient obtenus. Ensuite, cliquez sur Appliquer pour appliquer les modifications.Cliquez près pour fermer la fenêtre. Ouvrez une image brute tachée de SPORES PS4150 FM4-64. Ensuite, cliquez sur Reconstruire Slice pour exécuter la reconstruction de la tranche, et enregistrer l’image reconstruite.Pour convertir les images brutes 3D-SIM du geminosome KGB80 en images pseudo-widefield, cliquez à gauche sur le plugin ImageJ SIMcheck et sélectionnez Raw Data SI et Pseudo Widefield. Sélectionnez au hasard environ 25 spores dans chaque image de transmission inversée pour une analyse germinosome ultérieure dans les images fluorescentes pseudo-widefield jusqu’à ce qu’environ 350 spores aient été sélectionnées. Ensuite, utilisez ImageJ pour évaluer l’intensité maximale de chaque signal fluorescent exprimé par chaque groupe de spores et l’intensité intégrée de chaque image de spore 3D.Pour analyser les images pseudo-widefield du germinosome KGB80, utilisez la valeur moyenne d’intensité intégrée de sept piles comme intensité de signal intégrée de la spores du KGB80. Ensuite, déterminez les intensités de fond en imagerie de la souche de fond PS4150 à l’aide de paramètres identiques, et considérez les taches fluorescentes dans les spores individuelles du KGB80 comme des foyers germinants lorsqu’elles sont clairement distinguables de l’arrière-plan. Dans cette expérience représentative, deux foyers des spores fluorées GerD-GFP sont apparus dans différentes piles avec trois foyers GerD-GFP totaux observés dans la pile z3 compositive.Ici, une spore avec un seul point focal GerD-GFP dans la spore a été observée. Au total, environ 40 à 50 % des spores avaient respectivement deux ou un groupe GerD-GFP et GerKB-mCherry. Alors que l’intensité intégrée de la protéine d’échafaudage GerD-GFP était différente d’une population à l’autre, l’intensité intégrée de GerKB-mCherry était à peu près la même dans différentes populations.Lorsque la spore avait plusieurs foyers, l’intensité maximale de fluorescence des foyers GerD-GFP et GerKB-mCherry tendait à diminuer, et la fluorescence maximale de tous les points lumineux, considérés comme les foyers germinants, était plus élevée que l’auto fluorescence maximale des spores ps4150. Notamment, des taches FM4-64 plus brillantes semblables à des foyers germinants apparaissent dans les spores intactes et décodées de PS4150, ce qui suggère que ces taches FM4-64 plus brillantes pourraient être impliquées dans le regroupement des protéines germinales dans la membrane interne. L’ajout de spores à l’agarose et le placement de l’agarose dans le cadre nécessite un mouvement fluide continu et prudent pour ces minis matériaux.La conversion d’images brutes 3D-SIM du germinosome KGB80 en images pseudo-widefield et leur interprétation nécessite des connaissances spécialisées sur la biologie des spores. Notre procédure structurée de microscopie d’illumination peut être appliquée à l’imagerie des protéines basses abondantes ou des journalistes de fluorescence faible dans différentes bactéries ou d’autres matériaux de bande. L’organisation du germinosome peut maintenant être étudiée à l’aide de procédures d’étiquetage double pour évaluer la co-localisation des protéines de germination bacillus et des domaines membranaires spécifiques.

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