Name: visualization of germinosomes and the inner membrane in bacillus subtilis spores
Uploaded: 2019-04-15T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores at JoVE.com

Die Autoren danken Christiaan Zeelenberg für seine Unterstützung während der SIM-Bildgebung. JW anerkennt der China Scholarship Council für ein Promotionsstipendium und Dank Irene Stellingwerf für ihre Hilfe in der primären Phase der Bildgebung.

1. B. Subtillis Sporenbildung (Timing: 7 Tage vor der mikroskopischen Beobachtung)
<ol><li>
Tag1
	<ol>
<li>Eine Bakterienkultur auf ein Luria-Bertani Brühe (LB) Agar-Platte (1 % Tryptone, Hefeextrakt 0,5 %, 1 % NaCl, 1 % Agar)13 Streifen und Inkubation über Nacht bei 37 ° C, einzelne Kolonien zu erhalten. Verwenden der B. Subtilis -KGB80 (PS4150 GerKA GerKC GerKB-mCherry Katze, GerD-Gfp kan) Stamm und seinen Hintergrund Elternstamm B. Subtilis <...

<ol>
	<li>Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germination+of+spores+of+Bacillus+species:+what+we+know+and+do+not+know.">Germination of spores of Bacillus species: what we know and do not know.</a> Journal of Bacteriology. 196 (7), 1297-1305 (2014).</li><li>Setlow, P., Wang, S., Li, Y. -. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germination+of+spores+of+the+orders+Bacillales+and+Clostridiales.">Germination of spores of the orders Bacillales and Clostridiales.</a> Annual Review of Microbiology. 71 (1), (2017).</li><li>Vepachedu, V. R., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+interactions+between+nutrient+germinant+receptors+and+SpoVA+proteins+of+Bacillus+subtilis+spores.">Analysis of interactions between nutrient germinant receptors and SpoVA proteins of Bacillus subtilis spores.</a> FEMS Microbiology Letters. 274 (1), 42-47 (2007).</li><li>Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Summer+meeting+2013&#8211;when+the+sleepers+wake:+the+germination+of+spores+of+Bacillus+species.">Summer meeting 2013&#8211;when the sleepers wake: the germination of spores of Bacillus species.</a> Journal of Applied Microbiology. 115 (6), 1251-1268 (2013).</li><li>Cowan, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipids+in+the+inner+membrane+of+dormant+spores+of+Bacillus+species+are+largely+immobile.">Lipids in the inner membrane of dormant spores of Bacillus species are largely immobile.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (20), 7733-7738 (2004).</li><li>Loison, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+investigation+of+viscosity+of+an+atypical+inner+membrane+of+Bacillus+spores:+a+molecular+rotor/FLIM+study.">Direct investigation of viscosity of an atypical inner membrane of Bacillus spores: a molecular rotor/FLIM study.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1828 (11), 2436-2443 (2013).</li><li>Griffiths, K. K., Zhang, J., Cowan, A. E., Yu, J., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germination+proteins+in+the+inner+membrane+of+dormant+Bacillus+subtilis+spores+colocalize+in+a+discrete+cluster.">Germination proteins in the inner membrane of dormant Bacillus subtilis spores colocalize in a discrete cluster.</a> Molecular Microbiology. 81 (4), 1061-1077 (2011).</li><li>Troiano, A. J., Zhang, J., Cowan, A. E., Yu, J., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+dynamics+of+a+Bacillus+subtilis+spore+germination+protein+complex+during+spore+germination+and+outgrowth.">Analysis of the dynamics of a Bacillus subtilis spore germination protein complex during spore germination and outgrowth.</a> Journal of Bacteriology. 197 (2), 252-261 (2015).</li><li>Wegel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cellular+structures+in+super-resolution+with+SIM,+STED+and+Localisation+Microscopy:+A+practical+comparison.">Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison.</a> Scientific Reports. 6, 27290 (2016).</li><li>Pandey, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+imaging+of+germination+and+outgrowth+of+individual+Bacillus+subtilis+spores;+the+effect+of+heat+stress+quantitatively+analyzed+with+SporeTracker.">Live cell imaging of germination and outgrowth of individual Bacillus subtilis spores; the effect of heat stress quantitatively analyzed with SporeTracker.</a> PloS One. 8 (3), e58972 (2013).</li><li>Demmerle, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategic+and+practical+guidelines+for+successful+structured+illumination+microscopy.">Strategic and practical guidelines for successful structured illumination microscopy.</a> Nature Protocols. 12 (5), 988-1010 (2017).</li><li>Ball, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SIMcheck:+a+toolbox+for+successful+super-resolution+structured+illumination+microscopy.">SIMcheck: a toolbox for successful super-resolution structured illumination microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 15915 (2015).</li><li>Bertani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STUDIES+ON+LYSOGENESIS+I.:+The+Mode+of+Phage+Liberation+by+Lysogenic+Escherichia+coli1.">STUDIES ON LYSOGENESIS I.: The Mode of Phage Liberation by Lysogenic Escherichia coli1.</a> Journal of Bacteriology. 62 (3), 293 (1951).</li><li>Pandey, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+the+effect+of+specific+tea+compounds+on+germination+and+outgrowth+of+Bacillus+subtilis+spores+at+single+cell+resolution.">Quantitative analysis of the effect of specific tea compounds on germination and outgrowth of Bacillus subtilis spores at single cell resolution.</a> Food Microbiology. 45, 63-70 (2015).</li><li>Zheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacillus+subtilis+spore+inner+membrane+proteome.">Bacillus subtilis spore inner membrane proteome.</a> Journal of Proteome Research. 15 (2), 585-594 (2016).</li><li>Vepachedu, V. R., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+SpoVAD+to+the+inner+membrane+of+spores+of+Bacillus+subtilis.">Localization of SpoVAD to the inner membrane of spores of Bacillus subtilis.</a> Journal of Bacteriology. 187 (16), 5677-5682 (2005).</li><li>Schouten, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+dendritic+spines+of+rat+primary+hippocampal+neurons+using+structured+illumination+microscopy.">Imaging dendritic spines of rat primary hippocampal neurons using structured illumination microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), (2014).</li><li>Mukaka, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+appropriate+use+of+correlation+coefficient+in+medical+research.">A guide to appropriate use of correlation coefficient in medical research.</a> Malawi Medical Journal. 24 (3), 69-71 (2012).</li><li>Stewart, K. A., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Numbers+of+individual+nutrient+germinant+receptors+and+other+germination+proteins+in+spores+of+Bacillus+subtilis.">Numbers of individual nutrient germinant receptors and other germination proteins in spores of Bacillus subtilis.</a> Journal of Bacteriology. 195 (16), 3575-3582 (2013).</li><li>Laflamme, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+analysis+of+germinating+Bacillus+spores,+using+membrane+potential+dye.">Flow cytometry analysis of germinating Bacillus spores, using membrane potential dye.</a> Archives of Microbiology. 183 (2), 107-112 (2005).</li><li>Magge, A., Setlow, B., Cowan, A. E., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+dye+binding+by+and+membrane+potential+in+spores+of+Bacillus+species.">Analysis of dye binding by and membrane potential in spores of Bacillus species.</a> Journal of Applied Microbiology. 106 (3), 814-824 (2009).</li><li>Ghosh, S., Scotland, M., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Levels+of+germination+proteins+in+dormant+and+superdormant+spores+of+Bacillus+subtilis.">Levels of germination proteins in dormant and superdormant spores of Bacillus subtilis.</a> Journal of Bacteriology. 194 (9), 2221-2227 (2012).</li><li>Abhyankar, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+sporulation+conditions+on+the+spore+coat+protein+composition+of+Bacillus+subtilis+Spores.">The influence of sporulation conditions on the spore coat protein composition of Bacillus subtilis Spores.</a> Frontiers in microbiology. 7, 1636 (2016).</li><li>Rose, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+properties+of+Bacillus+subtilis+spores+made+in+liquid+or+on+agar+plates.">Comparison of the properties of Bacillus subtilis spores made in liquid or on agar plates.</a> Journal of Applied Microbiology. 103 (3), 691-699 (2007).</li><li>Stewart, K. A., Yi, X., Ghosh, S., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germination+protein+levels+and+rates+of+germination+of+spores+of+Bacillus+subtilis+with+overexpressed+or+deleted+genes+encoding+germination+proteins.">Germination protein levels and rates of germination of spores of Bacillus subtilis with overexpressed or deleted genes encoding germination proteins.</a> J Bacteriol. 194 (12), 3156-3164 (2012).</li><li>Ramirez-Peralta, A., Zhang, P., Li, Y. -. q., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+sporulation+conditions+on+the+germination+and+germination+protein+levels+of+Bacillus+subtilis+spores.">Effects of sporulation conditions on the germination and germination protein levels of Bacillus subtilis spores.</a> Applied and Environmental Microbiology. 78 (8), 2689-2697 (2012).</li><li>Laue, M., Han, H. -. M., Dittmann, C., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+membranes+of+bacterial+endospores+are+reservoirs+for+spore+core+membrane+expansion+during+spore+germination.">Intracellular membranes of bacterial endospores are reservoirs for spore core membrane expansion during spore germination.</a> Scientific Reports. 8, 11388 (2018).</li><li>Strahl, H., B&#252;rmann, F., Hamoen, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+actin+homologue+MreB+organizes+the+bacterial+cell+membrane.">The actin homologue MreB organizes the bacterial cell membrane.</a> Nature Communications. 5, (2014).</li><li>Strahl, H., Hamoen, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+potential+is+important+for+bacterial+cell+division.">Membrane potential is important for bacterial cell division.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (27), 12281-12286 (2010).</li><li>Swarge, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="One-Pot"+sample+processing+methodfor+proteome-wide+analysis+of+microbial+cells+and+spores.">"One-Pot" sample processing methodfor proteome-wide analysis of microbial cells and spores.</a> Proteomics Clinical Applications. (5), 1700169 (2018).</li></ol>

Das Protokoll präsentiert enthält ein standard-3D-SIM-Verfahren zur Analyse von FM4-64 gebeizt B. Subtilis Sporen, die Sporenbildung, Folie Vorbereitung und bildgebende Verfahren enthält. Darüber hinaus beschreibt das Protokoll eine modifizierte SIMcheck (ImageJ)-unterstützt 3D imaging-Prozess für die SIM-Mikroskopie von B. Subtilis Spore Germinosomes beschriftet mit fluoreszierenden Reportern. Die letztere Vorgehensweise konnten wir diese dim Unterkonstruktion mit verbesserten Kontrast zu beobach...

Sporen der Aufträge Bacillales und Clostridiales sind metabolisch ruhenden und außerordentlich widerstandsfähig gegen raue Dekontamination Regime, aber es sei denn, sie Keimen, können nicht dazu führen, dass schädliche Auswirkungen im Menschen1. In nährstoffreichen germinant ausgelöste Keimung der Sporen von Bacillus Subtilis (B. Subtilis) ist die Einleitung Veranstaltung germinant Bindung an germinant Rezeptoren (GRs) befindet sich in der Spore innere Membran (IM). Anschließend transduzieren die GRs Signale an den SpoVA-Kanal-Protein befindet sich auch in der IM. Dies führt bei der Entstehung des Austauschs von Spore Kern Pyridin-2,6-dicarboxylic Säure (Dipicolinic Säure; DPA; bestehend aus 20 % der Spore Kern trocken wt) für Wasser über den SpoVA Kanal. Anschließend die DSG-Version löst die Aktivierung der Hirnrinde Peptidoglycan Hydrolyse und zusätzliche Wasseraufnahme folgt2,3,4. Diese Ereignisse führen zu mechanischen Belastungen auf die Schichten, seine spätere Ruptur, Beginn der Auswuchs und schließlich vegetative Wachstum. Die genauen molekularen Details der Keimungsprozess werden jedoch noch weit von aufgelöst.
Eine wichtige Frage zu Spore Keimung betrifft die biophysikalischen Eigenschaften der Lipide IM Keimung Proteine sowie die IM SpoVA-Kanal-Proteine. Diese weitgehend unbeweglich IM Lipid Bilayer ist die wichtigste Permeabilitätsbarriere für viele kleine Moleküle, einschließlich giftige chemische Konservierungsmittel, von die einige ihr Handeln in die Spore Kern oder vegetativen Zelle Zytoplasma5,6ausüben. IM Lipid Bilayer dürfte in einem Gel-Zustand gibt es zwar ein erheblicher Anteil der mobilen Lipide in der IM5. Die Spore IM hat auch das Potenzial für signifikante Erweiterung5. Somit erhöht sich die Fläche der IM 1,6-fache bei der Keimung ohne zusätzliche Membran Synthese und geht einher mit dem Verlust dieser Membran charakteristische niedrige Permeabilität und Lipid Unbeweglichkeit5,6.
Während die molekularen Details der Aktivierung von Proteinen, Keimung und Organisation IM Lipide in Sporen sind attraktive Themen für das Studium, Herausforderung die geringe Größe von B. Subtilis Sporen und die relativ geringen Fülle der Keimung Proteine, eine mikroskopische Analysen. Griffiths Et Al. zwingende Beweise dafür Epifluoreszenz Mikroskop, mit fluoreszierenden Reporter verschmolzen zu Keimung Proteine, legt nahe, dass das Gerüst Protein GerD B. Subtilis Sporen drei GR-Untereinheiten (A, B und C) für GerA, B und K GRs organisiert, in einer Cluster-7. Sie prägte den Begriff "Germinosome" für diesen Cluster der Keimung Proteine und die Strukturen als ~ 300 nm großen IM Protein Brennpunkte8beschrieben. Bei der Initiation der Spore Keimung, fluoreszierende Germinosome Brennpunkte letztlich verwandeln sich in größeren disperse fluoreszierende Muster mit > 75 % der Spore Bevölkerungen Anzeigen dieses Muster in Sporen gekeimt für 1 h mit L-Valin-8. Beachten Sie, dass das Papier oben verwendeten genannten Bilder aus Dutzenden von aufeinander folgenden fluoreszierenden Bilder gemittelt, um statistische Aussagekraft gewinnen und die Hürde niedrig fluoreszierende Signale beobachtet während der Bildgebung. Diese Visualisierung dieser Strukturen in Bakteriensporen war am Rande des technisch mit klassischen mikroskopischen Tools und weder eine Bewertung der Höhe der Herde in einem einzigen Spore Machbaren auch ihre ausführlichere subzelluläre Lokalisation mit diesem Ansatz möglich.
Hier zeigen wir den Einsatz von strukturierten Beleuchtung Mikroskopie (SIM), eine detaillierte Visualisierung zu erhalten und Quantifizierung der Germinosome(s) in Sporen von B. Subtilissowie ihre IM Lipid Domänen9. Das Protokoll enthält auch Anleitungen für die Sporenbildung, Folie Vorbereitung und Bildanalyse von SIMcheck (v1. 0, eine ImageJ-Plugin) sowie ImageJ10,11,12.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Air dried glass slides</td>
			<td>Menzel Gl&#228;ser</td>
			<td>630-2870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APO TIRF N20R8 100&#215; oil objective (NA=1.49)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B. subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry cat, gerD-gfp kan)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B. subtilis PS4150 (PS832 &#916;gerE::spc, &#916;cotE::tet)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flasks 1 L</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z567868</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flasks 250 mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z723088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoSpheres carboxylate-modified microspheres</td>
			<td>Invitrogen, 0.1 &#956;m</td>
			<td>F8803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM4-64</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F34653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histodenz nonionic density gradient medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iXON3 DU-897 X-6515 CCD camera</td>
			<td>Andor Technology</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.net/Welcome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge tubes 1.5 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>3451PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope imaging software</td>
			<td>Nikon, Japan</td>
			<td>NIS-Element AR 4.51.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliQ Ultrapure Deminerilzed Water</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Milli-Q IQ 7003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Screw Cap Bottle 180 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75003800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Coverslips</td>
			<td>Paul Marienfeld</td>
			<td>117650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round Bottom tubes 15 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Nunc TM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap tubes 50 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Nunc TM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of germinosomes and the inner membrane in bacillus subtilis spores

Die geringe Größe der Sporen und der relativ geringen Fülle der Keimung Proteine, Schwierigkeiten in ihrer mikroskopischen Analysen mittels Epifluoreszenz Mikroskopie. Höchstauflösung dimensional Structured Illumination Microscopy (3D-SIM) ist ein viel versprechendes Instrument, diese Hürde zu überwinden und die molekularen Details den Prozess der Keimung der Sporen von Bacillus Subtilis (B. Subtilis) zeigen. Hier beschreiben wir die Verwendung einer modifizierten SIMcheck (ImageJ)-Assistent 3D imaging-Prozess und fluoreszierende Reporter Proteine für SIM-Mikroskopie von B. Subtilis Sporen Germinosomes, Transaktionskonflikten der Keimung Proteine. Außerdem präsentieren wir ein (standard) 3D-SIM bildgebendes Verfahren für FM4-64 Färbung von B. Subtilis Sporen Membranen. Mithilfe dieser Verfahren wir unübertroffene Auflösung für die Lokalisierung der Germinosome erhalten und zeigen, dass > 80 % der B. Subtilis KGB80 Sporen nach der Sporenbildung auf definierten minimalen MOPS Medium erhalten haben, ein oder zwei GerD-GFP und GerKB-mCherry Brennpunkte. Helle Herde waren auch bei FM4-64 gefärbten Sporen 3D-SIM Bilder darauf hindeutet, dass innere Membran Lipid Domänen wahrscheinlich unterschiedliche Flüssigkeit vorhanden sein. Sind weitere Studien, mit denen doppelte Kennzeichnung Verfahren mit Membran Farbstoffe und Germinosome Reporter Proteine Co Lokalisierung zu bewerten und erhalten so einen optimalen Überblick über die Organisation des Bacillus Keimung Proteine in der inneren Spore-Membran möglich.

Das aktuelle Protokoll stellt ein SIM-Mikroskop bildgebendes Verfahren für bakterielle Sporen. Die Sporenbildung und Folie Vorbereitung Verfahren wurden durchgeführt, wie in Abbildung 1 gezeigt, vor der Bildgebung. Später wurden die Bildverarbeitung und Analyse Verfahren angewandt sowohl für dim (fluoreszierendes Protein mit der Bezeichnung Keimung Proteine) und hell (lipophile Sonde IM gebeizt) Spore zu Proben, wie im folgenden Text dargestellt.
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Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

Visualisierung von Germinosomes und die innere Membran in Bacillus Subtilis Sporen

Germinant Rezeptor-Proteine-Cluster in "Germinosomes" in der inneren Membran der Bacillus Subtilis Sporen. Wir beschreiben ein Protokoll mit Superresolution Mikroskopie und Leuchtstoffröhren Reporter Proteine, um Germinosomes zu visualisieren. Das Protokoll zeigt auch Spore innere Membrandomänen, die bevorzugt mit dem Membran-Farbstoff FM4-64 gefärbt sind.

The small size of spores and the relatively low abundance of germination proteins, cause difficulties in their microscopic analyses using epifluorescence ...

Die superauflösende strukturierte Beleuchtungsmikroskopie 3D-SIM ist eine innovative Technik zur Visualisierung fluoreszierender Reporterproteine von Keimrezeptorclustern in Sporenmembranen. Mit diesen Verfahren, unübertroffene Auflösung der germinosome Lokalisation und Sporen innere Membran Lipid Domänen erreicht werden können. Die Technik wird von Doktorand Juan Wen und Master of Science Student Raymond Pasman von unserem Labor demonstriert werden.Reinigen Sie vor Beginn des Verfahrens hochpräzise Abdeckungen mit ein-molaren Salzsäure für 30 Minuten in einem sanft schüttelnden Wasserbad, gefolgt von zwei, fünfminütigen Wärern in reinem Typ 1 Wasser. Nach der zweiten Wäsche die Deckellipsen etwa drei Minuten in 100%Ethanol geben, bevor Sie die Deckellipsen trocknen und ihre Klarheit überprüfen. Anschließend gleitet das Glasmikroskop eine Minute lang mit 70% Ethanol, bevor die Dias trocknen und deren Klarheit überprüft wird.Für die fluoreszierende Mikrosphäre und Sporenbildgebung werden zunächst zwei Dias auf einem 70-Grad-Celsius-Heizblock für einige Sekunden vorwärmen, bevor ein 70-Grad-Celsius-, 65-Mikroliter-Tröpfchen sterilisierter 2%Agarose auf einen der Dias hinzugefügt wird. Platzieren Sie die andere Folie oben, um die Agarose zwischen den Folien zu verteilen. Nach fünf Minuten eines der Dias entfernen und die getrocknete Agarose in einen Ein-mal-Ein-Zentimeter-Abschnitt schneiden.Fügen Sie der Agarose ein mal 10 zu den achten fluoreszierenden Mikrosphären oder Sporen in 0,4 Mikroliter nsterilem, ultrareinem Typ-1-Wasser hinzu, und legen Sie einen hochpräzisen Deckelaufschlag auf den Patch, indem Sie den Deckelrutsch verwenden, um den Patch von der Rutsche auf die Deckslip-Oberfläche zu schieben. Fixieren Sie dann einen 65-Mikroliter, 1,5 mal 1,6-Zentimeter-Genrahmen auf einem getrockneten Schlitten, und legen Sie den Deckelrutsch auf den Rahmen, indem Sie alle Ecken des Rahmens schließen. Legen Sie den Dia für die Bildgebung der Proben auf ein strukturiertes Beleuchtungsmikroskop, das mit einem 100-fachen Ölobjektiv ausgestattet ist, und konzentrieren Sie sich auf die 100-Nanometer-Fluoreszenzmikrosphären.Passen Sie den Korrekturring am 100x-Objektiv an, bis eine symmetrische Punktstreufunktion erhalten ist, um die Unschärfe der Bilder zu minimieren, und wählen Sie ein Sichtfeld mit ca. 10 runden fluoreszierenden Mikrosphären aus. Wenden Sie eine Gitterfokuseinstellung für die angegebenen Anregungswellenlängen, in diesem Fall 561 und 488 Nanometer, als Richtschnur für die Bildanalysesoftware an, bevor Sie sich mit dem Transmissionslicht auf die Sporen konzentrieren. Erfassen Sie ein Übertragungslichtbild im 16-fachen Durchschnittsmodus mit 20-Millisekunden-Belichtungen für jedes Bild.Erfassen Sie dann mit dem 3D-SIM-Beleuchtungsmodus rohfluoreszierende Bilder der Sporen mit 3D-strukturiertem Beleuchtungsmikroskop. Für die Slice-Rekonstruktion klicken Sie auf Param auf dem Registerkartenblatt für strukturierte Beleuchtungspads, um das Fenster N-SIM Slice Reconstruction zu öffnen. Befolgen Sie die vorgeschlagenen Anweisungen, und klicken Sie auf die entsprechenden Steuerelemente, um den Kontrast zur Beleuchtungsmodulation auf Auto, die hochauflösende Rauschunterdrückung auf eine und die Ausblendungsunterdrückung auf 0,05 als Ausgangspunkt festzulegen.Klicken Sie dann auf Slice rekonstruieren, um das Bild zu rekonstruieren und die Qualität der rekonstruierten Bilder anhand der schnellen Fourier-transformierten Bilder und der Rekonstruktionspartitur zu bewerten, die nach der Rekonstruktion angezeigt werden. Passen Sie das hochauflösende Rauschen von 0,1 bis fünf und die Ausblendungsunterdrückung von 0,01 bis 0,5 an, bis die besten Parametereinstellungen erreicht sind. Klicken Sie dann auf Anwenden, um die Änderungen anzuwenden.Klicken Sie auf Schließen, um das Fenster zu schließen. Öffnen Sie ein FM4-64 gebeizt PS4150 Sporen Rohbild. Klicken Sie dann auf Slice rekonstruieren, um die Slice-Rekonstruktion auszuführen, und speichern Sie das rekonstruierte Bild.Um die 3D-SIM-Rohbilder des KGB80-Geminosomes in Pseudo-Weitfeldbilder umzuwandeln, klicken Sie mit der linken Maustaste auf das ImageJ SIMcheck Plugin und wählen Raw Data SI und Pseudo Widefield aus. Wählen Sie zufällig etwa 25 Sporen in jedem invertierten Übertragungsbild für eine spätere Germinosomenanalyse in den fluoreszierenden Pseudo-Weitfeldbildern aus, bis etwa 350 Sporen ausgewählt wurden. Verwenden Sie dann ImageJ, um die maximale Intensität für jedes fluoreszierende Signal, das von jeder Gruppe von Sporen ausgedrückt wird, und die integrierte Intensität jedes 3D-Sporenbildes zu bewerten.Um die Pseudo-Weitfeldbilder des KGB80 Germinosom zu analysieren, verwenden Sie den mittleren integrierten Intensitätswert von sieben Stapeln als integrierte Signalintensität der KGB80 Sporen. Bestimmen Sie dann die Hintergrundintensitäten, indem Sie die PS4150-Hintergrunddehnung mit identischen Einstellungen abbilden, und betrachten Sie die fluoreszierenden Flecken in einzelnen KGB80-Sporen als germinosome-Foci, wenn sie sich deutlich vom Hintergrund unterscheiden. In diesem repräsentativen Experiment traten zwei Brennpunkte der GerD-GFP-Fluoreszensporen in verschiedenen Stapeln auf, wobei im kompositiven Z3-Stack insgesamt drei GerD-GFP-Schwerpunkte beobachtet wurden.Hier wurde eine Sporenmitenmit nur einem GerD-GFP-Schwerpunkt im Sporen beobachtet. Insgesamt hatten etwa 40 bis 50% der Sporen zwei bzw. einen GerD-GFP- bzw. GerKB-mCherry-Cluster. Während die integrierte Intensität des GerD-GFP Gerüstproteins zwischen verschiedenen Populationen unterschiedlich war, war die integrierte Intensität von GerKB-mCherry in verschiedenen Populationen ungefähr gleich.Wenn die Sporen mehrere Brennpunkte hatten, verringerte sich die maximale Fluoreszenzintensität von GerD-GFP und GerKB-mCherry-Brennpunkten, und die maximale Fluoreszenz aller hellen Flecken, die als germinosome-foci angesehen wurden, war höher als die maximale Autofluoreszenz der PS4150-Sporen. Bemerkenswert ist, hellerFM4-64 Flecken ähnlich germinosome foci erscheinen sowohl in intakten und decoated PS4150 Sporen, was darauf hindeutet, dass diese helleren FM4-64 Flecken in der Clustering von Germinosomen Proteinen in der inneren Membran beteiligt sein könnte. Das Hinzufügen von Sporen zur Agarose und das Platzieren von Agarose in den Rahmen erfordert eine kontinuierliche und sorgfältige Flüssigkeitsbewegung für diese Minis-Materialien.Die Umwandlung von 3D-SIM-Rohbildern des KGB80-Germinosomen in Pseudo-Weitfeldbilder und deren Interpretation erfordert Expertenwissen über Sporenbiologie. Unser strukturiertes Beleuchtungsmikroskopieverfahren kann auf die Bildgebung von schwach endizierten Proteinen oder dim Fluoreszenz-Reportern in verschiedenen Bakterien oder anderen Bandmaterialien angewendet werden. Die Organisation des Germinosom kann nun mit Doppeletikettierungsverfahren untersucht werden, um die Kolokalisierung von Bacillus-Keimproteinen und spezifischen Membrandomänen zu bewerten.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

Optische Mapping von Aktionspotentialen und Calcium Transienten in der Maus Herz

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

Forschung

Biotechnik

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Visualisierung von Cortex Organisation und Dynamik in Mikroorganismen, mit Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

Membran-DORN: Ein Tool, um biochemische Protein-Protein-Interaktionen von Membranproteinen Identifizieren<em&gt; In Vivo</em

Membrane proteins are essential for cell viability and are therefore important therapeutic targets1-3. Since they function in complexes4, methods to ...

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

Quantifizierung der globalen diastolischen Funktion durch kinematische Modellierung basierende Analyse der transmitralen Fluss über die diastolische Füllung Parametrisierte Formalismus

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Analysis of Tubular Membrane Networks in Cardiac Myocytes from Atria and Ventricles

Analyse von Membranrohrnetze in Herzmuskelzellen von Vorhöfe und Kammern

In cardiac myocytes a complex network of membrane tubules - the transverse-axial tubule system (TATS) - controls deep intracellular signaling functions. ...

Luminescence Resonance Energy Transfer to Study Conformational Changes in Membrane Proteins Expressed in Mammalian Cells

Lumineszenz-Resonanzenergietransfer zu Konformationsänderungen in Membranproteinen in Säugerzellen exprimiert Studieren

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range ...

Three-Dimensionally Printed Microfluidic Cross-flow System for Ultrafiltration/Nanofiltration Membrane Performance Testing

Dreidimensional gedruckt Mikrofluidik-Cross-Flow-System für Ultrafiltration / Nanofiltrationsmembran Performance Testing

Minimization and management of membrane fouling is a formidable challenge in diverse industrial processes and other practices that utilize membrane ...

Treatment of Ligament Constructs with Exercise-conditioned Serum: A Translational Tissue Engineering Model

Behandlung von Ligamentenkonstrukten mit ausüberschüssigem Serum: Ein Translations-Gewebe-Engineering-Modell

In vitro experiments are essential to understand biological mechanisms; however, the gap between monolayer tissue culture and human physiology is large, ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Ein<em&gt; In Vitro</em&gt; Organ Culture Modell der Murine Bandscheiben

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

A Protocol for Decellularizing Mouse Cochleae for Inner Ear Tissue Engineering

Ein Protokoll für einem Maus Cochleae für das Innenohr Tissue Engineering

In mammals, mechanosensory hair cells that facilitate hearing lack the ability to regenerate, which has limited treatments for hearing loss. Current ...