Name: visualization of germinosomes and the inner membrane in bacillus subtilis spores
Uploaded: 2019-04-15T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores at JoVE.com

המחברים מודים כריסטיאן Zeelenberg על העזרה שלו במהלך ההדמיה SIM. JW מודה המועצה מלגה סין מלגת הדוקטורט ותודה איירין Stellingwerf עזרה במהלך השלב הראשוני של הדמיה.

1. subtillis דרב הנבגה (תזמון: 7 ימים לפני תצפית מיקרוסקופית)
<ol><li>
יום 1
	<ol>
<li>פסים של התרבות חיידקי על צלחת (1% טריפטון תמצית שמרים 0.5%, 1% NaCl, 1% אגר) אגר לוריא-Bertani מרק (LB)13 , דגירה בין לילה ב 37 ° C כדי להשיג אחת המושבות. המתח (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry החתול, גרד-gfp קאן) KGB80 B. subtilis<...

<ol>
	<li>Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germination+of+spores+of+Bacillus+species:+what+we+know+and+do+not+know.">Germination of spores of Bacillus species: what we know and do not know.</a> Journal of Bacteriology. 196 (7), 1297-1305 (2014).</li><li>Setlow, P., Wang, S., Li, Y. -. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germination+of+spores+of+the+orders+Bacillales+and+Clostridiales.">Germination of spores of the orders Bacillales and Clostridiales.</a> Annual Review of Microbiology. 71 (1), (2017).</li><li>Vepachedu, V. R., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+interactions+between+nutrient+germinant+receptors+and+SpoVA+proteins+of+Bacillus+subtilis+spores.">Analysis of interactions between nutrient germinant receptors and SpoVA proteins of Bacillus subtilis spores.</a> FEMS Microbiology Letters. 274 (1), 42-47 (2007).</li><li>Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Summer+meeting+2013&#8211;when+the+sleepers+wake:+the+germination+of+spores+of+Bacillus+species.">Summer meeting 2013&#8211;when the sleepers wake: the germination of spores of Bacillus species.</a> Journal of Applied Microbiology. 115 (6), 1251-1268 (2013).</li><li>Cowan, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipids+in+the+inner+membrane+of+dormant+spores+of+Bacillus+species+are+largely+immobile.">Lipids in the inner membrane of dormant spores of Bacillus species are largely immobile.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (20), 7733-7738 (2004).</li><li>Loison, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+investigation+of+viscosity+of+an+atypical+inner+membrane+of+Bacillus+spores:+a+molecular+rotor/FLIM+study.">Direct investigation of viscosity of an atypical inner membrane of Bacillus spores: a molecular rotor/FLIM study.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1828 (11), 2436-2443 (2013).</li><li>Griffiths, K. K., Zhang, J., Cowan, A. E., Yu, J., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germination+proteins+in+the+inner+membrane+of+dormant+Bacillus+subtilis+spores+colocalize+in+a+discrete+cluster.">Germination proteins in the inner membrane of dormant Bacillus subtilis spores colocalize in a discrete cluster.</a> Molecular Microbiology. 81 (4), 1061-1077 (2011).</li><li>Troiano, A. J., Zhang, J., Cowan, A. E., Yu, J., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+dynamics+of+a+Bacillus+subtilis+spore+germination+protein+complex+during+spore+germination+and+outgrowth.">Analysis of the dynamics of a Bacillus subtilis spore germination protein complex during spore germination and outgrowth.</a> Journal of Bacteriology. 197 (2), 252-261 (2015).</li><li>Wegel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cellular+structures+in+super-resolution+with+SIM,+STED+and+Localisation+Microscopy:+A+practical+comparison.">Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison.</a> Scientific Reports. 6, 27290 (2016).</li><li>Pandey, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+imaging+of+germination+and+outgrowth+of+individual+Bacillus+subtilis+spores;+the+effect+of+heat+stress+quantitatively+analyzed+with+SporeTracker.">Live cell imaging of germination and outgrowth of individual Bacillus subtilis spores; the effect of heat stress quantitatively analyzed with SporeTracker.</a> PloS One. 8 (3), e58972 (2013).</li><li>Demmerle, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategic+and+practical+guidelines+for+successful+structured+illumination+microscopy.">Strategic and practical guidelines for successful structured illumination microscopy.</a> Nature Protocols. 12 (5), 988-1010 (2017).</li><li>Ball, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SIMcheck:+a+toolbox+for+successful+super-resolution+structured+illumination+microscopy.">SIMcheck: a toolbox for successful super-resolution structured illumination microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 15915 (2015).</li><li>Bertani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STUDIES+ON+LYSOGENESIS+I.:+The+Mode+of+Phage+Liberation+by+Lysogenic+Escherichia+coli1.">STUDIES ON LYSOGENESIS I.: The Mode of Phage Liberation by Lysogenic Escherichia coli1.</a> Journal of Bacteriology. 62 (3), 293 (1951).</li><li>Pandey, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+the+effect+of+specific+tea+compounds+on+germination+and+outgrowth+of+Bacillus+subtilis+spores+at+single+cell+resolution.">Quantitative analysis of the effect of specific tea compounds on germination and outgrowth of Bacillus subtilis spores at single cell resolution.</a> Food Microbiology. 45, 63-70 (2015).</li><li>Zheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacillus+subtilis+spore+inner+membrane+proteome.">Bacillus subtilis spore inner membrane proteome.</a> Journal of Proteome Research. 15 (2), 585-594 (2016).</li><li>Vepachedu, V. R., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+SpoVAD+to+the+inner+membrane+of+spores+of+Bacillus+subtilis.">Localization of SpoVAD to the inner membrane of spores of Bacillus subtilis.</a> Journal of Bacteriology. 187 (16), 5677-5682 (2005).</li><li>Schouten, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+dendritic+spines+of+rat+primary+hippocampal+neurons+using+structured+illumination+microscopy.">Imaging dendritic spines of rat primary hippocampal neurons using structured illumination microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), (2014).</li><li>Mukaka, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+appropriate+use+of+correlation+coefficient+in+medical+research.">A guide to appropriate use of correlation coefficient in medical research.</a> Malawi Medical Journal. 24 (3), 69-71 (2012).</li><li>Stewart, K. A., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Numbers+of+individual+nutrient+germinant+receptors+and+other+germination+proteins+in+spores+of+Bacillus+subtilis.">Numbers of individual nutrient germinant receptors and other germination proteins in spores of Bacillus subtilis.</a> Journal of Bacteriology. 195 (16), 3575-3582 (2013).</li><li>Laflamme, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+analysis+of+germinating+Bacillus+spores,+using+membrane+potential+dye.">Flow cytometry analysis of germinating Bacillus spores, using membrane potential dye.</a> Archives of Microbiology. 183 (2), 107-112 (2005).</li><li>Magge, A., Setlow, B., Cowan, A. E., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+dye+binding+by+and+membrane+potential+in+spores+of+Bacillus+species.">Analysis of dye binding by and membrane potential in spores of Bacillus species.</a> Journal of Applied Microbiology. 106 (3), 814-824 (2009).</li><li>Ghosh, S., Scotland, M., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Levels+of+germination+proteins+in+dormant+and+superdormant+spores+of+Bacillus+subtilis.">Levels of germination proteins in dormant and superdormant spores of Bacillus subtilis.</a> Journal of Bacteriology. 194 (9), 2221-2227 (2012).</li><li>Abhyankar, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+sporulation+conditions+on+the+spore+coat+protein+composition+of+Bacillus+subtilis+Spores.">The influence of sporulation conditions on the spore coat protein composition of Bacillus subtilis Spores.</a> Frontiers in microbiology. 7, 1636 (2016).</li><li>Rose, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+properties+of+Bacillus+subtilis+spores+made+in+liquid+or+on+agar+plates.">Comparison of the properties of Bacillus subtilis spores made in liquid or on agar plates.</a> Journal of Applied Microbiology. 103 (3), 691-699 (2007).</li><li>Stewart, K. A., Yi, X., Ghosh, S., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germination+protein+levels+and+rates+of+germination+of+spores+of+Bacillus+subtilis+with+overexpressed+or+deleted+genes+encoding+germination+proteins.">Germination protein levels and rates of germination of spores of Bacillus subtilis with overexpressed or deleted genes encoding germination proteins.</a> J Bacteriol. 194 (12), 3156-3164 (2012).</li><li>Ramirez-Peralta, A., Zhang, P., Li, Y. -. q., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+sporulation+conditions+on+the+germination+and+germination+protein+levels+of+Bacillus+subtilis+spores.">Effects of sporulation conditions on the germination and germination protein levels of Bacillus subtilis spores.</a> Applied and Environmental Microbiology. 78 (8), 2689-2697 (2012).</li><li>Laue, M., Han, H. -. M., Dittmann, C., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+membranes+of+bacterial+endospores+are+reservoirs+for+spore+core+membrane+expansion+during+spore+germination.">Intracellular membranes of bacterial endospores are reservoirs for spore core membrane expansion during spore germination.</a> Scientific Reports. 8, 11388 (2018).</li><li>Strahl, H., B&#252;rmann, F., Hamoen, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+actin+homologue+MreB+organizes+the+bacterial+cell+membrane.">The actin homologue MreB organizes the bacterial cell membrane.</a> Nature Communications. 5, (2014).</li><li>Strahl, H., Hamoen, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+potential+is+important+for+bacterial+cell+division.">Membrane potential is important for bacterial cell division.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (27), 12281-12286 (2010).</li><li>Swarge, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="One-Pot"+sample+processing+methodfor+proteome-wide+analysis+of+microbial+cells+and+spores.">"One-Pot" sample processing methodfor proteome-wide analysis of microbial cells and spores.</a> Proteomics Clinical Applications. (5), 1700169 (2018).</li></ol>

פרוטוקול שהוצג מכיל שגרה 3D סטנדרטי-SIM עבור ניתוח של FM4-64 צבעונית B. subtilis נבגים הכוללת הנבגה, הכנת שקופית, הדמיה תהליכים. בנוסף, הפרוטוקול מתאר ששונה SIMcheck (ImageJ)-בסיוע 3D הדמיה תהליך SIM מיקרוסקופיה של B. subtilis נבג germinosomes שכותרתו עם כתבים פלורסנט. ההליך האחרון אפשר לנו להתבונן זה בתיוג עמום...

נבגים של ההוראות Bacillales ו- Clostridiales סמויה רדום ועמיד בצורה יוצאת דופן בפני משטרים טיהור קשים, אבל אלא אם כן הם לנבוט, לא יכול לגרום השפעות מזיקות של בני אדם1. מזין germinant מופעלות נביטה של נבגים Bacillus subtilis (B. subtilis), הוא האירוע חניכה germinant קשירה לקולטנים germinant (GRs) הממוקם בקרום הפנימי של הנבג, (IM). לאחר מכן, GRs מגלי אותות אל החלבון ערוץ SpoVA ממוקם גם ההודעה. התוצאה היא תחילתה של חילופי נבג הליבה פירידין-2, 6-dicarboxylic (חומצה dipicolinic; DPA; הכוללת 20% של נבג הליבה יבש wt) עבור מים דרך תעלת SpoVA. לאחר מכן, מהדורת DPA מפעילה את ההפעלה של קליפת פפטידוגליקן הידרוליזה, ספיגת מים נוספת עוקב אחר2,3,4. אירועים אלה להוביל ללחץ מכני על הרבדים המעיל, קרע העוקבים שלה, תחילתה של תוצר ו, לבסוף, גידול וגטטיבי. עם זאת, הפרטים המדויקים מולקולרית של תהליך הנביטה מזוהים עדיין רחוק.
שאלה גדולה לגבי נבג נוגע המאפיינים ביופיזיקלי של ליפידים המקיפים את החלבונים נביטה IM, כמו גם את החלבונים ערוץ IM SpoVA. זה במידה רבה משותק שכבה ליפידית אים היא המכשול העיקרי חדירות של מולקולות קטנות רבות, כולל משמרים כימיים רעילים, אשר חלקם מפעילים פעולתם במרכז נבג או תא וגטטיבית הציטופלסמה5,6. אים שכבה ליפידית סביר במצב ג'ל, למרות שיש חלק משמעותי של ליפידים ניידים ב- IM5. אים של הנבג יש גם את פוטנציאל הרחבה משמעותית5. לפיכך, פני השטח של ההודעה מגדילה 1.6-fold על נביטה ללא ממברנה נוספים סינתזה מלווה אובדן זה קרום אופייני נמוכה חדירות ו ליפיד נייחות5,6.
בעוד הפרטים מולקולרית של ההפעלה של חלבונים נביטה וארגון של ליפידים IM בנבגים הם נושאים אטרקטיביים למחקר, גודל קטן של B. subtilis נבגים והשפע נמוכה יחסית של חלבונים נביטה, להוות אתגר כדי ניתוח מיקרוסקופי. גריפיתס ואח ' epifluorescence מיקרוסקופ ראיות משכנעות, באמצעות עיתונאים פלורסנט התמזגו חלבונים נביטה, מרמז כי בנבגים B. subtilis החלבון לגרדום GerD מארגן שלושה גרם subunits (A, B ו- C) עבור גארה, B K GRs, ב- אשכול7. הם טבע את המונח 'germinosome' עבור מקבץ של חלבונים נביטה, תיאר את המבנים ~ 300 ננומטר גדול IM חלבון foci8. באתחול של נבג, germinosome פלורסנט foci בסופו של דבר הופך גדול יותר לפזר דפוסי פלורסנט, עם > 75% של אוכלוסיות ספורה מציג את הדפוס הזה בנבגים מונבטים לשעה עם-ואלין8. שימו לב כי העיתון הנ ל משמש בממוצע תמונות מתוך עשרות תמונות פלורסנט רצופים, כדי לצבור עוצמה סטטיסטית להתגבר על המשוכה של אותות פלואורסצנט נמוך ציין במהלך דימות. הדמיה זו של המבנים הללו בנבגים בקטריאלי הייתה בקצהו של מה זה אפשרי מבחינה טכנית עם כלים מיקרוסקופיים קלאסית, גם הערכה של כמות מוקדים ב נבג יחיד ולא היה שלהם לוקליזציה subcellular מפורט יותר אפשרי עם גישה זו.
. הנה, נדגים את השימוש של מובנים תאורה מיקרוסקופ (SIM) כדי להשיג פריט חזותי נתונים היסטוריים, כימות germinosome(s) בנבגים B. subtilis, כמו גם תחומים שלהם השומנים IM9. הפרוטוקול מכיל גם הוראות הנבגה, הכנת שקופית וניתוח התמונה על-ידי SIMcheck (v 1.0, תוסף imageJ) כמו גם ImageJ10,11,12.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Air dried glass slides</td>
			<td>Menzel Gl&#228;ser</td>
			<td>630-2870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APO TIRF N20R8 100&#215; oil objective (NA=1.49)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B. subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry cat, gerD-gfp kan)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B. subtilis PS4150 (PS832 &#916;gerE::spc, &#916;cotE::tet)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flasks 1 L</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z567868</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flasks 250 mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z723088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoSpheres carboxylate-modified microspheres</td>
			<td>Invitrogen, 0.1 &#956;m</td>
			<td>F8803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM4-64</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F34653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histodenz nonionic density gradient medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iXON3 DU-897 X-6515 CCD camera</td>
			<td>Andor Technology</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.net/Welcome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge tubes 1.5 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>3451PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope imaging software</td>
			<td>Nikon, Japan</td>
			<td>NIS-Element AR 4.51.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliQ Ultrapure Deminerilzed Water</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Milli-Q IQ 7003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Screw Cap Bottle 180 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75003800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Coverslips</td>
			<td>Paul Marienfeld</td>
			<td>117650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round Bottom tubes 15 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Nunc TM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap tubes 50 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Nunc TM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of germinosomes and the inner membrane in bacillus subtilis spores

גודל קטן של נבגים שפע נמוכה יחסית של חלבונים נביטה, לגרום קשיים שלהם ניתוח מיקרוסקופי באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence. סופר רזולוציה תלת מימדי מובנים תאורה מיקרוסקופ (3D-SIM) הוא כלי מבטיח כדי להתגבר על המכשול הזה ולחשוף את הפרטים מולקולרית של תהליך הנביטה של נבגים Bacillus subtilis (B. subtilis). כאן, אנו מתארים את השימוש SIMcheck שונה (ImageJ)-תהליך ההדמיה התלת-ממד עוזר וחלבונים פלורסנט כתב על ה-SIM מיקרוסקופיה של germinosomes B. subtilis נבגים, cluster(s) של חלבונים נביטה. אנו מציגים גם שגרה הדמיה תלת-ממד (רגיל)-SIM עבור FM4-64 מכתים של B. subtilis נבג ממברנות. באמצעות הליכים אלה, אנו להשיג רזולוציה מתחרות בלוקאליזציה germinosome ולהראות כי > 80% KGB80 B. subtilis נבגים רדום שהושג לאחר הנבגה באמצעי MOPS מינימלי מוגדר יש אחד או שניים GerD-GFP, GerKB-mCherry מוקדים. מוקדים בהיר היו גם FM4 נצפתה ב- 64 צבעונית תמונות 3D-SIM של נבגים רומז כי הממברנה הפנימית השומנים תחומי סביר שונים נזילות קיימים. בהמשך לימודי המשתמשות כפול תיוג הליכים עם ממברנה צבע ו germinosome כתב חלבונים כדי להעריך משותף לשפות אחרות, ובכך לקבל סקירה אופטימלית של הארגון של חלבונים נביטה Bacillus ממברנה הנבג הפנימי נמצאים אפשרי.

בפרוטוקול הנוכחי מציג SIM מיקרוסקופ הדמיה הליך של נבגים של חיידקים. ההליכים הכנה הנבגה והחלק בוצעו כפי שמוצג באיור 1 לפני הדמיה. מאוחר יותר, ההליכים הדמיה וניתוח הוחלו הן עבור עמעם (חלבון פלואורסצנטי שכותרתו נביטה חלבונים) ובהיר נבג (lipophilic העצמית צבעונית IM) ...

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores at JoVE.com

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

ויזואליזציה של Germinosomes, את הקרום הפנימי בנבגים Bacillus subtilis

קולטן germinant אשכול חלבונים ב- 'germinosomes' בתוך הקרומית הפנימית של Bacillus subtilis נבגים. אנו מתארים פרוטוקול באמצעות מיקרוסקופ ברזולוציה סופר כתב פלורסנט חלבונים כדי להמחיש germinosomes. הפרוטוקול מזהה החולקות הממברנה הפנימית נבג מוכתמים מעדיפים לצבוע הממברנה FM4-64.

The small size of spores and the relatively low abundance of germination proteins, cause difficulties in their microscopic analyses using epifluorescence ...

מיקרוסקופ תאורה מובנה ברזולוציית-על, 3D-SIM, היא טכניקה חדשנית להדמיה של חלבוני כתב פלואורסצנטיים של אשכולות קולטני נביטה בממברנות נבגים. באמצעות הליכים אלה, פתרון ללא תחרות של לוקליזציה נביט ונבגים פנימיים השומנים ניתן להשיג. הטכניקה תוכח על ידי דוקטורנט חואן וון וסטודנט לתואר שני במדעים ריימונד פסקמן מהמעבדה שלנו.לפני תחילת ההליך, לנקות כיסויים דיוק גבוה עם חומצה הידרוכלורית טוחה אחת במשך 30 דקות באמבט מים רועד בעדינות, ואחריו שתיים, חמש דקות שוטף במים מסוג אולטרה 1. לאחר הכביסה השנייה, מניחים את הכיסויים ב 100% אתנול במשך כשלוש דקות לפני ייבוש כיסויים ואימות הבהירות שלהם. לאחר מכן, מיקרוסקופ זכוכית נקי מחליק עם 70% אתנול למשך דקה אחת לפני שהוא מאפשר לשקופיות להתייבש ולאמת את הבהירות שלהן.להדמיית מיקרוספרה ונבגים פלואורסצנטיים, תחילה שתי שקופיות חמות מראש על בלוק חימום של 70 מעלות צלזיוס למשך מספר שניות לפני הוספת צלזיוס של 70 מעלות, טיפה של 65 מיקרוליטר של 2% מעוקרות על אחת השקופיות. מקם את השקופית האחרת למעלה כדי להפיץ את ההתעוררות בין השקופיות. לאחר חמש דקות, להסיר את אחת השקופיות לחתוך את אגת מיובש לתוך קטע אחד על אחד סנטימטר.הוסיפו 10 פעמים למיקרוספרות או הנבגים הפלורסנטיים השמיניים ב-0.4 מיקרוליטרים של מים סטריליים ואל-יציבים מסוג 1 לאגורוז, והנחו כיסוי בדיוק גבוה על התיקון באמצעות המכסה כדי להחליק את הטלאי מהמגלשה אל משטח הכיסוי. לאחר מכן, תקן מסגרת ג'ין של 65 מיקרוליטר, 1.5 על 1.6 ס"מ על שקופית מיובשת, והצב את הכיסוי על המסגרת, וסגור את כל פינות המסגרת. להדמיה של הדגימות, מקם את השקופית על מיקרוסקופ תאורה מובנה המצויד במטרה של שמן 100X, והתמקד במיקרוספרות הפלואורסצנטיות של 100 ננומטר.כוונן את טבעת התיקון על המטרה 100x עד שתתקבל פונקציית התפשטות נקודה סימטרית כדי למזער את טשטוש התמונות, ובחר שדה ראייה עם כ- 10 מיקרוספרות פלואורסצנטיות עגולות. החל התאמת מיקוד צורם עבור אורכי גל העירור המיועדים, במקרה זה, 561 ו 488 ננומטר, כמדריך עבור תוכנת ניתוח תמונה לפני התמקדות נבגים עם אור השידור. לכוד תמונת אור שידור במצב ממוצע של פי 16 עם חשיפות של 20 אלפיות שנייה לכל תמונה.לאחר מכן, לכוד תמונות פלואורסצנטיות גולמיות של מיקרוסקופ תאורה תלת-מימדי של הנבגים באמצעות מצב תאורת 3D-SIM. לשחזור פרוסה, לחצו על Param בגיליון לשונית משטח התאורה מובנה לפתיחת החלון 'שחזור פרוסת N-SIM'. בצע את ההוראות המוצעות, ולחץ על הפקדים המתאימים כדי להגדיר את ניגודיות אפנון התאורה לאוטואי, את דיכוי הרעש ברזולוציה גבוהה לאחד, ואת הדיכוי טשטוש מחוץ למוקד ל 0.05 כנקודות התחלה.לאחר מכן, לחצו על 'בנייה מחדש של פרוסה' כדי לבנות מחדש את התמונה ולהעריך את איכות התמונות ששוחזרו באמצעות התמונות המהירות שעברו שינוי צורה של פורייה וציון השחזור המוצגים לאחר השחזור. כוונן את הרעש ברזולוציה גבוהה מ- 0.1 לחמישה ואת ההעלמה של טשטוש המוקד מ- 0.01 ל- 0.5 עד להגדרות הפרמטרים הטובות ביותר. לאחר מכן, לחץ על החל כדי להחיל את השינויים.לחץ על סגור כדי לסגור את החלון. פתח תמונה גולמית של נבגים מוכתמים FM4-64 PS4150. לאחר מכן, לחצו על 'בנייה מחדש של פרוסה' לביצוע שחזור הפרוסה, ושמור את התמונה ששוחזרה.כדי להמיר את התמונות הגולמיות 3D-SIM של geminosome KGB80 לתוך תמונות פסאודו רחב שדה, לחץ שמאלה על תוסף ImageJ SIMcheck ובחר SI נתונים גולמיים ו Pseudo Widefield. בחר באופן אקראי כ-25 נבגים בכל תמונת שידור הפוכה לניתוח נבטים מאוחר יותר בתמונות הפסאודו-רחבות-שדה הפלואורסצנטיות עד שנבחרו כ-350 נבגים. לאחר מכן, השתמש ב- ImageJ כדי להעריך את העוצמה המרבית עבור כל אות פלואורסצנטי המובע על ידי כל קבוצת נבגים ואת העוצמה המשולבת של כל תמונת נבג תלת-מימדית.כדי לנתח את התמונות הפסאודו-רחבות של החיידק KGB80, השתמש בערך העוצמה המשולב הממוצע של שבע ערימות כעוצמת האות המשולבת של נבג הקג"ב80. לאחר מכן, לקבוע את התעצמות הרקע על ידי הדמיה זן הרקע PS4150 באמצעות הגדרות זהות, ולהתייחס כתמים פלואורסצנטיים נבגים קג"ב80 בודדים כמו מוקדי נביט כאשר הם נבדלים בבירור מן הרקע. בניסוי מייצג זה, שני מוקדים של נבגים פלואורסצנטיים GerD-GFP הופיעו בערימות שונות עם שלושה מוקדי GerD-GFP סה"כ שנצפו בערימה Z3 קומפוזיטיבי.כאן נצפה נבג עם מוקד אחד בלבד של GerD-GFP. בסך הכל, בסביבות 40 עד 50% מהנבגים היו שניים או אחד GerD-GFP ו GerKB-mCherry אשכול, בהתאמה. בעוד שהעוצמה המשולבת של חלבון הפיגומים GerD-GFP הייתה שונה בין אוכלוסיות שונות, העוצמה המשולבת של GerKB-mCherry הייתה בערך אותו הדבר באוכלוסיות שונות.כאשר לנבג היו מוקדים מרובים, עוצמת הפלואורסצנטיות המרבית של Foci GerD-GFP ו- GerKB-mCherry נטו לרדת, והפלואורסצנטיות המרבית של כל הנקודות הבהירות, הנחשבות למוקד הנביטה, הייתה גבוהה יותר מהפלואורסצנטיות האוטומטית המרבית של נבגים PS4150. יש לציין, כתמי FM4-64 בהירים יותר הדומים למסוקים נביטיים מופיעים בשני נבגי PS4150 שלמים ומפענחים, מה שמרמז על כך שנקודות FM4-64 בהירות אלה עשויות להיות מעורבות בקיבוץ חלבונים נביטיים בממברנה הפנימית. הוספת נבגים אגרוז והצבת אגרוז לתוך המסגרת דורש תנועה נוזלית רציפה וזהיר עבור חומרים אלה minis.ההמרה של תמונות גולמיות 3D-SIM של החיידק KGB80 לתוך תמונות פסאודו רחב שדה ואת הפרשנות שלהם דורש ידע מומחה על ביולוגיה נבגים. ניתן ליישם את הליך המיקרוסקופיה של התאורה הבנויה שלנו על הדמיה של חלבונים בשפע נמוך או כתבי פלואורסצנטיות עמומים בחיידקים שונים או בחומרי רצועה אחרים. הארגון של germinosome כעת ניתן ללמוד באמצעות הליכי תיוג כפול כדי להעריך לוקליזציה שותף של חלבוני נביטת Bacillus ותחומי קרום ספציפיים.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

מיפוי אופטי של פוטנציאלים פעולה ו הארעית סידן בלב מאוס

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

ויזואליזציה של קליפת הארגון ואת הדינמיקה של מיקרואורגניזמים, באמצעות Fluorescence סה&quot;כ פנימי מיקרוסקופית השתקפות

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

קרום עמוד שדרה: ביוכימית כלי לזיהוי חלבונים אינטראקציות של חלבונים בממברנה<em&gt; בVivo</em

Membrane proteins are essential for cell viability and are therefore important therapeutic targets1-3. Since they function in complexes4, methods to ...

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

כימות של פונקציה הגלובלית הדיאסטולי על ידי ניתוח המבוסס על דוגמנות Kinematic של Transmitral זרימה באמצעות הפורמליזם מילוי Parametrized הדיאסטולי

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Analysis of Tubular Membrane Networks in Cardiac Myocytes from Atria and Ventricles

ניתוח של Tubular ממברנה רשתות בלב myocytes מאטרייה וחדרי לב

In cardiac myocytes a complex network of membrane tubules - the transverse-axial tubule system (TATS) - controls deep intracellular signaling functions. ...

Luminescence Resonance Energy Transfer to Study Conformational Changes in Membrane Proteins Expressed in Mammalian Cells

הארה תהודת אנרגיה העבר לחקר שינויי קונפורמציה בחלבונים בממברנה שבאו לידי ביטוי בתאי יונקים

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range ...

Three-Dimensionally Printed Microfluidic Cross-flow System for Ultrafiltration/Nanofiltration Membrane Performance Testing

בתלת ממד המודפס Microfluidic מערכת חוצת זרימה עבור Ultrafiltration / nanofiltration ממברנה בדיקות ביצועים

Minimization and management of membrane fouling is a formidable challenge in diverse industrial processes and other practices that utilize membrane ...

Treatment of Ligament Constructs with Exercise-conditioned Serum: A Translational Tissue Engineering Model

טיפול של רצועות ליגמנט עם תרגיל ממוזג בסרום: רקמות תרגום הנדסה דגם

In vitro experiments are essential to understand biological mechanisms; however, the gap between monolayer tissue culture and human physiology is large, ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם תרבות איברים של הדיסק הבין חולייתי Murine

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

A Protocol for Decellularizing Mouse Cochleae for Inner Ear Tissue Engineering

פרוטוקול עבור Decellularizing Cochleae העכבר עבור הנדסת רקמות האוזן הפנימית

In mammals, mechanosensory hair cells that facilitate hearing lack the ability to regenerate, which has limited treatments for hearing loss. Current ...