Name: visualization of germinosomes and the inner membrane in bacillus subtilis spores
Uploaded: 2019-04-15T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores at JoVE.com

Gli autori ringraziano Christiaan Zeelenberg per la sua assistenza durante l'imaging di SIM. JW riconosce il Consiglio di borsa di studio di Cina per una borsa di dottorato e grazie Irene Stellingwerf per il suo aiuto durante la fase primaria di imaging.

1. b. subtillis sporulazione (Timing: 7 giorni prima dell'osservazione microscopica)
<ol><li>
1 ° giorno
	<ol>
<li>Inoculare una coltura batterica su una piastra (tryptone di 1%, 0,5% di Estratto di lievito, 1% NaCl, 1% agar) agar di brodo di Luria-Bertani (LB)13 ed incubare per una notte a 37 ° C per ottenere singole colonie. Utilizzare il ceppo di Bacillus subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry gatto, gerD-gfp kan) e ceppo parentale sfond...

<ol>
	<li>Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germination+of+spores+of+Bacillus+species:+what+we+know+and+do+not+know.">Germination of spores of Bacillus species: what we know and do not know.</a> Journal of Bacteriology. 196 (7), 1297-1305 (2014).</li><li>Setlow, P., Wang, S., Li, Y. -. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germination+of+spores+of+the+orders+Bacillales+and+Clostridiales.">Germination of spores of the orders Bacillales and Clostridiales.</a> Annual Review of Microbiology. 71 (1), (2017).</li><li>Vepachedu, V. R., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+interactions+between+nutrient+germinant+receptors+and+SpoVA+proteins+of+Bacillus+subtilis+spores.">Analysis of interactions between nutrient germinant receptors and SpoVA proteins of Bacillus subtilis spores.</a> FEMS Microbiology Letters. 274 (1), 42-47 (2007).</li><li>Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Summer+meeting+2013&#8211;when+the+sleepers+wake:+the+germination+of+spores+of+Bacillus+species.">Summer meeting 2013&#8211;when the sleepers wake: the germination of spores of Bacillus species.</a> Journal of Applied Microbiology. 115 (6), 1251-1268 (2013).</li><li>Cowan, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipids+in+the+inner+membrane+of+dormant+spores+of+Bacillus+species+are+largely+immobile.">Lipids in the inner membrane of dormant spores of Bacillus species are largely immobile.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (20), 7733-7738 (2004).</li><li>Loison, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+investigation+of+viscosity+of+an+atypical+inner+membrane+of+Bacillus+spores:+a+molecular+rotor/FLIM+study.">Direct investigation of viscosity of an atypical inner membrane of Bacillus spores: a molecular rotor/FLIM study.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1828 (11), 2436-2443 (2013).</li><li>Griffiths, K. K., Zhang, J., Cowan, A. E., Yu, J., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germination+proteins+in+the+inner+membrane+of+dormant+Bacillus+subtilis+spores+colocalize+in+a+discrete+cluster.">Germination proteins in the inner membrane of dormant Bacillus subtilis spores colocalize in a discrete cluster.</a> Molecular Microbiology. 81 (4), 1061-1077 (2011).</li><li>Troiano, A. J., Zhang, J., Cowan, A. E., Yu, J., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+dynamics+of+a+Bacillus+subtilis+spore+germination+protein+complex+during+spore+germination+and+outgrowth.">Analysis of the dynamics of a Bacillus subtilis spore germination protein complex during spore germination and outgrowth.</a> Journal of Bacteriology. 197 (2), 252-261 (2015).</li><li>Wegel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cellular+structures+in+super-resolution+with+SIM,+STED+and+Localisation+Microscopy:+A+practical+comparison.">Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison.</a> Scientific Reports. 6, 27290 (2016).</li><li>Pandey, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+imaging+of+germination+and+outgrowth+of+individual+Bacillus+subtilis+spores;+the+effect+of+heat+stress+quantitatively+analyzed+with+SporeTracker.">Live cell imaging of germination and outgrowth of individual Bacillus subtilis spores; the effect of heat stress quantitatively analyzed with SporeTracker.</a> PloS One. 8 (3), e58972 (2013).</li><li>Demmerle, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategic+and+practical+guidelines+for+successful+structured+illumination+microscopy.">Strategic and practical guidelines for successful structured illumination microscopy.</a> Nature Protocols. 12 (5), 988-1010 (2017).</li><li>Ball, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SIMcheck:+a+toolbox+for+successful+super-resolution+structured+illumination+microscopy.">SIMcheck: a toolbox for successful super-resolution structured illumination microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 15915 (2015).</li><li>Bertani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STUDIES+ON+LYSOGENESIS+I.:+The+Mode+of+Phage+Liberation+by+Lysogenic+Escherichia+coli1.">STUDIES ON LYSOGENESIS I.: The Mode of Phage Liberation by Lysogenic Escherichia coli1.</a> Journal of Bacteriology. 62 (3), 293 (1951).</li><li>Pandey, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+the+effect+of+specific+tea+compounds+on+germination+and+outgrowth+of+Bacillus+subtilis+spores+at+single+cell+resolution.">Quantitative analysis of the effect of specific tea compounds on germination and outgrowth of Bacillus subtilis spores at single cell resolution.</a> Food Microbiology. 45, 63-70 (2015).</li><li>Zheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacillus+subtilis+spore+inner+membrane+proteome.">Bacillus subtilis spore inner membrane proteome.</a> Journal of Proteome Research. 15 (2), 585-594 (2016).</li><li>Vepachedu, V. R., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+SpoVAD+to+the+inner+membrane+of+spores+of+Bacillus+subtilis.">Localization of SpoVAD to the inner membrane of spores of Bacillus subtilis.</a> Journal of Bacteriology. 187 (16), 5677-5682 (2005).</li><li>Schouten, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+dendritic+spines+of+rat+primary+hippocampal+neurons+using+structured+illumination+microscopy.">Imaging dendritic spines of rat primary hippocampal neurons using structured illumination microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), (2014).</li><li>Mukaka, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+appropriate+use+of+correlation+coefficient+in+medical+research.">A guide to appropriate use of correlation coefficient in medical research.</a> Malawi Medical Journal. 24 (3), 69-71 (2012).</li><li>Stewart, K. A., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Numbers+of+individual+nutrient+germinant+receptors+and+other+germination+proteins+in+spores+of+Bacillus+subtilis.">Numbers of individual nutrient germinant receptors and other germination proteins in spores of Bacillus subtilis.</a> Journal of Bacteriology. 195 (16), 3575-3582 (2013).</li><li>Laflamme, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+analysis+of+germinating+Bacillus+spores,+using+membrane+potential+dye.">Flow cytometry analysis of germinating Bacillus spores, using membrane potential dye.</a> Archives of Microbiology. 183 (2), 107-112 (2005).</li><li>Magge, A., Setlow, B., Cowan, A. E., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+dye+binding+by+and+membrane+potential+in+spores+of+Bacillus+species.">Analysis of dye binding by and membrane potential in spores of Bacillus species.</a> Journal of Applied Microbiology. 106 (3), 814-824 (2009).</li><li>Ghosh, S., Scotland, M., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Levels+of+germination+proteins+in+dormant+and+superdormant+spores+of+Bacillus+subtilis.">Levels of germination proteins in dormant and superdormant spores of Bacillus subtilis.</a> Journal of Bacteriology. 194 (9), 2221-2227 (2012).</li><li>Abhyankar, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+sporulation+conditions+on+the+spore+coat+protein+composition+of+Bacillus+subtilis+Spores.">The influence of sporulation conditions on the spore coat protein composition of Bacillus subtilis Spores.</a> Frontiers in microbiology. 7, 1636 (2016).</li><li>Rose, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+properties+of+Bacillus+subtilis+spores+made+in+liquid+or+on+agar+plates.">Comparison of the properties of Bacillus subtilis spores made in liquid or on agar plates.</a> Journal of Applied Microbiology. 103 (3), 691-699 (2007).</li><li>Stewart, K. A., Yi, X., Ghosh, S., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germination+protein+levels+and+rates+of+germination+of+spores+of+Bacillus+subtilis+with+overexpressed+or+deleted+genes+encoding+germination+proteins.">Germination protein levels and rates of germination of spores of Bacillus subtilis with overexpressed or deleted genes encoding germination proteins.</a> J Bacteriol. 194 (12), 3156-3164 (2012).</li><li>Ramirez-Peralta, A., Zhang, P., Li, Y. -. q., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+sporulation+conditions+on+the+germination+and+germination+protein+levels+of+Bacillus+subtilis+spores.">Effects of sporulation conditions on the germination and germination protein levels of Bacillus subtilis spores.</a> Applied and Environmental Microbiology. 78 (8), 2689-2697 (2012).</li><li>Laue, M., Han, H. -. M., Dittmann, C., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+membranes+of+bacterial+endospores+are+reservoirs+for+spore+core+membrane+expansion+during+spore+germination.">Intracellular membranes of bacterial endospores are reservoirs for spore core membrane expansion during spore germination.</a> Scientific Reports. 8, 11388 (2018).</li><li>Strahl, H., B&#252;rmann, F., Hamoen, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+actin+homologue+MreB+organizes+the+bacterial+cell+membrane.">The actin homologue MreB organizes the bacterial cell membrane.</a> Nature Communications. 5, (2014).</li><li>Strahl, H., Hamoen, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+potential+is+important+for+bacterial+cell+division.">Membrane potential is important for bacterial cell division.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (27), 12281-12286 (2010).</li><li>Swarge, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="One-Pot"+sample+processing+methodfor+proteome-wide+analysis+of+microbial+cells+and+spores.">"One-Pot" sample processing methodfor proteome-wide analysis of microbial cells and spores.</a> Proteomics Clinical Applications. (5), 1700169 (2018).</li></ol>

Il protocollo presentato contiene una procedura di 3D-SIM standard per l'analisi di FM4-64 macchiato di spore di Bacillus subtilis che include la sporulazione, preparazione del vetrino e processi di imaging. Inoltre, il protocollo descrive un SIMcheck modificato (ImageJ)-assistita processo per microscopia SIM di germinosomes di spore di Bacillus subtilis etichettati con reporter fluorescenti di imaging 3D. La procedura di quest'ultima ci ha permesso di osservare questa sottostruttura dim con maggiore co...

Spore degli ordini Bacillales e Clostridiales sono metabolicamente dormienti e straordinariamente resistente ai regimi di decontaminazione duro, ma a meno che non germinano, non possono causare effetti deleteri in esseri umani1. In nutrienti germinant innescata germinazione di spore di Bacillus subtilis (Bacillus subtilis), l'evento di iniziazione è germinant legame ai recettori germinant (GRs) situato nella membrana interna di spore (IM). Successivamente, il GRs trasdurre segnali alla proteina canale SpoVA anche situato nel IM. Questo provoca l'inizio dello scambio di spora core piridina-2,6-dicarbossilico (acido dipicolinico; DPA; composto da 20% di spora core asciutto wt) per l'acqua tramite il canale di SpoVA. Successivamente, il rilascio DPA innesca l'attivazione di idrolisi di peptidoglicano di corteccia, e l'assorbimento di acqua supplementare segue2,3,4. Questi eventi conducono allo sforzo meccanico degli strati di cappotto, sua rottura successiva, l'insorgenza di conseguenza e, infine, lo sviluppo vegetativo. Tuttavia, lungi dal vengono risolti i dettagli molecolari del processo di germinazione.
Una domanda importante sulla germinazione delle spore riguarda le proprietà biofisiche dei lipidi che circonda le proteine di germinazione di IM come pure le proteine canale IM SpoVA. Questo doppio strato lipidico in gran parte immobile IM è la barriera di permeabilità principale per molte piccole molecole, tra cui conservanti chimici tossici, alcuni dei quali esercitano la loro azione nel nucleo di spora o cellula vegetativa citoplasma5,6. Il doppio strato lipidico IM è probabilmente in uno stato di gel, anche se c'è una frazione significativa dei lipidi mobile in IM5. IM della spora ha anche il potenziale per un'espansione significativa5. Quindi, l'area della superficie dell'IM aumenta 1.6-fold su germinazione senza sintesi ulteriori della membrana ed è accompagnata dalla perdita di questa membrana caratteristica bassa permeabilità e lipidica immobilità5,6.
Mentre i dettagli molecolari dell'organizzazione dei lipidi IM in spore e l'attivazione delle proteine di germinazione sono argomenti interessanti per lo studio, la piccola dimensione delle spore di Bacillus subtilis e l'abbondanza relativamente basso di proteine di germinazione, rappresentano una sfida per analisi al microscopio. Griffiths et al epifluorescenza microscopio prova coercitiva, utilizzando reporter fluorescenti fuso a proteine di germinazione, suggerisce che nel b. subtilis spore la proteina dell'impalcatura GerD organizza tre subunità GR (A, B e C) di GerA, B e K GRs, in un cluster7. Hanno coniato il termine 'germinosome' per questo cluster di proteine di germinazione e descritto le strutture come ~ 300 nm grande IM proteina fuochi8. All'inizio della germinazione delle spore, fluorescente germinosome i fuochi alla fine trasformarsi in grandi disperdere modelli fluorescente, con > 75% delle popolazioni di spora visualizzano questo modello in spore germinati per 1 h con L-valina8. Si noti che il libro citato sopra usate media immagini da decine di immagini consecutive fluorescente, per guadagnare potere statistico e superare l'ostacolo dei segnali fluorescenti Bassi osservato durante la formazione immagine. Questa visualizzazione di queste strutture in spore batteriche era ai margini di ciò che è tecnicamente fattibile con strumenti microscopici classici e né una valutazione della quantità di fuochi in una singola spora né era loro localizzazione subcellulare più dettagliate possibile con questo approccio.
Qui, dimostriamo che l'uso della microscopia di illuminazione strutturata (SIM) per ottenere una visualizzazione dettagliata e quantificazione di germinosome(s) le spore di Bacillus subtilis, nonché dei loro domini lipidici IM9. Il protocollo contiene anche le istruzioni per la sporulazione, la preparazione del vetrino e l'analisi di immagine di SIMcheck (v 1.0, un plugin di imageJ) così come ImageJ10,11,12.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Air dried glass slides</td>
			<td>Menzel Gl&#228;ser</td>
			<td>630-2870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APO TIRF N20R8 100&#215; oil objective (NA=1.49)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B. subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry cat, gerD-gfp kan)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B. subtilis PS4150 (PS832 &#916;gerE::spc, &#916;cotE::tet)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flasks 1 L</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z567868</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flasks 250 mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z723088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoSpheres carboxylate-modified microspheres</td>
			<td>Invitrogen, 0.1 &#956;m</td>
			<td>F8803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM4-64</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F34653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histodenz nonionic density gradient medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iXON3 DU-897 X-6515 CCD camera</td>
			<td>Andor Technology</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.net/Welcome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge tubes 1.5 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>3451PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope imaging software</td>
			<td>Nikon, Japan</td>
			<td>NIS-Element AR 4.51.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliQ Ultrapure Deminerilzed Water</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Milli-Q IQ 7003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Screw Cap Bottle 180 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75003800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Coverslips</td>
			<td>Paul Marienfeld</td>
			<td>117650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round Bottom tubes 15 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Nunc TM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap tubes 50 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Nunc TM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of germinosomes and the inner membrane in bacillus subtilis spores

Le piccole dimensioni delle spore e la relativamente bassa abbondanza di proteine di germinazione, causare difficoltà nelle loro analisi microscopiche mediante epifluorescenza. Microscopia di Super-risoluzione tridimensionale strutturato illuminazione (3D-SIM) è uno strumento promettente per superare questo ostacolo e rivelare i dettagli molecolari del processo di germinazione delle spore di Bacillus subtilis (Bacillus subtilis). Qui, descriviamo l'uso di un SIMcheck modificato (ImageJ)-processo di imaging 3D assistente e proteine reporter fluorescenti per microscopia SIM di germinosomes di b. subtilis spore, interumana delle proteine di germinazione. Presentiamo anche una procedura di imaging 3D-SIM (standard) per la colorazione delle membrane di spore di Bacillus subtilis FM4-64. Utilizzando queste procedure, abbiamo ottenuto la risoluzione insuperabile per la localizzazione di germinosome e mostrano che > 80% dei KGB80 di b. subtilis spore dormienti ottenute dopo la sporulazione su medium MOPS minimo definito hanno uno o due GerD-GFP e GerKB-mCherry fuochi. I fuochi luminosi erano anche osservato in FM4-64 macchiati immagini 3D-SIM spore suggerendo che domini lipidici della membrana interna di differenti fluidità probabile che esistano. Ulteriori studi che utilizzano la doppia etichettatura procedure con membrana coloranti e germinosome proteine reporter per valutare co-localizzazione e quindi ottenere una panoramica ottimale dell'organizzazione delle proteine di germinazione del bacillo nella membrana interna spora sono possibile.

Il protocollo attuale presenta una procedura di imaging microscopio SIM per le spore batteriche. Le procedure di preparazione di sporulazione e diapositiva sono state effettuate come mostrato nella Figura 1 prima di formazione immagine. Più tardi, sono state applicate le procedure di imaging e l'analisi sia per dim (proteina fluorescente etichettata proteine germinazione) e brillante spora (sonda lipofilica macchiato IM) campioni come indicato nel testo segu...

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Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

Visualizzazione di Germinosomes e la membrana interna in Bacillus subtilis spore

Cluster di proteine recettoriali germinant in 'germinosomes' nella membrana interna di spore di Bacillus subtilis . Descriviamo un protocollo utilizzando super risoluzione di microscopia e fluorescenti di proteine reporter per visualizzare germinosomes. Il protocollo identifica anche domini di membrana interna di spore che sono preferenzialmente colorate con il colorante di membrana FM4-64.

The small size of spores and the relatively low abundance of germination proteins, cause difficulties in their microscopic analyses using epifluorescence ...

La microscopia ad illuminazione strutturata a super-risoluzione, 3D-SIM, è una tecnica innovativa per la visualizzazione delle proteine reporter fluorescenti dei cluster di recettori della germinazione nelle membrane spore. Utilizzando queste procedure, è possibile ottenere una risoluzione insuperabile della localizzazione germinosoma e dei domini lipidici della membrana interna delle spore. La tecnica sarà dimostrata dal dottorando Juan Wen e dallo studente di Master of Science Raymond Pasman del nostro laboratorio.Prima di iniziare la procedura, pulire le coperture ad alta precisione con acido cloridrico un molare per 30 minuti in un bagno d'acqua che trema delicatamente, seguito da due lavaggi di cinque minuti in acqua ultrapura di tipo 1. Dopo il secondo lavaggio, posizionare i copricapo in etanolo al 100% per circa tre minuti prima di asciugare i copricapo e verificarne la chiarezza. Quindi, pulire i vetrini in vetro con 70%etanolo per un minuto prima di consentire alle diapositive di asciugarsi e verificarne la chiarezza.Per l'imaging fluorescente di microsfere e spore, prima preriscaldare due diapositive su un blocco riscaldante Celsius di 70 gradi per alcuni secondi prima di aggiungere una goccia Celsius di 70 gradi Celsius, 65 microliter di agarosio sterilizzato al 2% su una delle diapositive. Posizionare l'altra diapositiva sopra per distribuire l'agarosio tra le diapositive. Dopo cinque minuti, rimuovere uno dei vetrini e tagliare l'agarosio essiccato in una sezione di uno per un centimetro.Aggiungere una volta 10 alle ottava microsfere fluorescenti o spore in 0,4 microlitri di acqua sterile ultrapura di tipo 1 all'agarosio e posizionare un coverslip ad alta precisione sul cerotto utilizzando il coverslip per far scorrere il cerotto dello scivolo sulla superficie del copripacchi. Quindi, fissare un gene frame da 65 microliter, 1,5 per 1,6 centimetri su uno scivolo essiccato e posizionare il coprisciuga sul telaio, chiudendo tutti gli angoli del telaio. Per l'imaging dei campioni, posizionare lo scivolo su un microscopio ad illuminazione strutturata dotato di un obiettivo di olio 100X e concentrarsi sulle microsfere fluorescenti da 100 nanometri.Regolare l'anello di correzione sull'obiettivo 100x fino a ottenere una funzione di diffusione del punto simmetrico per ridurre al minimo la sfocatura delle immagini e selezionare un campo visivo con circa 10 microsfere fluorescenti rotonde. Applicare una regolazione della messa a fuoco di griglia per le lunghezze d'onda di eccitazione designate, in questo caso 561 e 488 nanometri, come guida per il software di analisi delle immagini prima di concentrarsi sulle spore con la luce di trasmissione. Cattura un'immagine della luce di trasmissione in modalità media 16x con esposizioni di 20 millisecondi per ogni immagine.Quindi, cattura immagini fluorescenti grezze al microscopio ad illuminazione strutturata in 3D delle spore con la modalità di illuminazione 3D-SIM. Per la ricostruzione delle sezioni, fate clic su Param nel foglio di tabulazione del pad di illuminazione strutturata per aprire la finestra Ricostruzione fetta N-SIM. Seguire le istruzioni suggerite e fare clic sui controlli appropriati per impostare il contrasto di modulazione dell'illuminazione sull'auto, la soppressione del rumore ad alta risoluzione su uno e la soppressione della sfocatura fuori dalla messa a fuoco su 0,05 come punti di partenza.Quindi, fare clic su Ricostruisci sezione per ricostruire l'immagine e valutare la qualità delle immagini ricostruite dalle immagini veloci trasformate da Fourier e dal punteggio di ricostruzione visualizzato dopo la ricostruzione. Regolare il rumore ad alta risoluzione da 0,1 a cinque e l'eliminazione dalla sfocatura della messa a fuoco da 0,01 a 0,5 fino a ottenere le migliori impostazioni dei parametri. Quindi, fare clic su Applica per applicare le modifiche.Fare clic su Chiudi per chiudere la finestra. Aprire un'immagine grezza delle spore PS4-64 macchiate FM4-64. Quindi, fare clic su Ricostruisci sezione per eseguire la ricostruzione della sezione e salvare l'immagine ricostruita.Per convertire le immagini grezze 3D-SIM del geminosome KGB80 in immagini pseudo-widefield, fare clic con il pulsante sinistro del mouse sul plug-in ImageJ SIMcheck e selezionare Raw Data SI e Pseudo Widefield. Selezionare casualmente circa 25 spore in ogni immagine di trasmissione invertita per una successiva analisi germinosoma nelle immagini fluorescenti pseudo-widefield fino a quando non sono state selezionate circa 350 spore. Quindi, utilizzare ImageJ per valutare l'intensità massima per ogni segnale fluorescente espresso da ogni gruppo di spore e l'intensità integrata di ogni immagine spora 3D.Per analizzare le immagini pseudo-widefield del germinosoma KGB80, utilizzare il valore di intensità integrato medio di sette pile come intensità del segnale integrato della spora KGB80. Quindi, determinare le intensità di fondo imaging del ceppo di fondo PS4150 utilizzando impostazioni identiche e considerare le macchie fluorescenti nelle singole spore KGB80 come focolai germinososi quando sono chiaramente distinguibili dallo sfondo. In questo esperimento rappresentativo, due fuochi delle spore fluorescenti GerD-GFP apparvero in diverse pile con tre focolai totali di GerD-GFP osservati nella pila Z3 compositiva.Qui, è stata osservata una spora con un solo punto focale GerD-GFP nella spora. In totale, circa il 40-50% delle spore aveva rispettivamente due o uno cluster GerD-GFP e GerKB-mCherry. Mentre l'intensità integrata della proteina dell'impalcatura GerD-GFP era diversa tra diverse popolazioni, l'intensità integrata di GerKB-mCherry era all'incazzata in popolazioni diverse.Quando la spora aveva focolai multipli, l'intensità massima di fluorescenza dei focolai GerD-GFP e GerKB-mCherry tendeva a diminuire, e la fluorescenza massima di tutti i punti luminosi, considerati come focolai germinosomi, era superiore alla massima autofluorescenza delle spore PS4150. In particolare, macchie FM4-64 più luminose simili ai focolai germinosomi compaiono sia nelle spore PS4150 intatte che decocate, suggerendo che queste macchie FM4-64 più luminose potrebbero essere coinvolte nel raggruppamento di proteine germinosoma nella membrana interna. L'aggiunta di spore all'agarosio e il posizionamento dell'agarosio nel telaio richiedono un movimento fluido continuo e attento per questi materiali minis.La conversione di immagini grezze 3D-SIM del germinosoma KGB80 in immagini pseudo-widefield e la loro interpretazione richiede conoscenze specialistiche sulla biologia delle spore. La nostra procedura di microscopia ad illuminazione strutturata può essere applicata all'imaging di proteine a bassa abbondanza o reporter a fluorescenza fioca in diversi batteri o altri materiali a banda. L'organizzazione del germinosoma può ora essere studiata utilizzando procedure di doppia etichettatura per valutare la co-localizzazione delle proteine germinali del Bacillus e di specifici domini di membrana.

Research

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Ricerca

Bioingegneria

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