Name: visualization of germinosomes and the inner membrane in bacillus subtilis spores
Uploaded: 2019-04-15T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores at JoVE.com

著者はクリスティアーン ・ Zeelenberg の SIM イメージング中に彼の援助をありがちましょう。JW は中国奨学金博士課程フェローシップ委員会を認識し、アイリーン Stellingwerf とイメージングの第一次段階の間に彼女の助けをありがちましょう。

1 B. subtillis胞子形成 (タイミング: 顕微鏡観察する前に 7 日間)。
<ol><li>
日 1
	<ol>
<li>ルリア ベルターニカミラ スープ (LB) 寒天培地プレート (1% トリプトン、0.5% 酵母エキス、1% 食塩水, 1% 寒天)13に細菌培養を連勝し、シングル コロニーを取得する 37 ° C で一晩インキュベートします。B. subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB mCherry 猫、逆流性食道炎 gfp ?...

<ol>
	<li>Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germination+of+spores+of+Bacillus+species:+what+we+know+and+do+not+know.">Germination of spores of Bacillus species: what we know and do not know.</a> Journal of Bacteriology. 196 (7), 1297-1305 (2014).</li><li>Setlow, P., Wang, S., Li, Y. -. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germination+of+spores+of+the+orders+Bacillales+and+Clostridiales.">Germination of spores of the orders Bacillales and Clostridiales.</a> Annual Review of Microbiology. 71 (1), (2017).</li><li>Vepachedu, V. R., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+interactions+between+nutrient+germinant+receptors+and+SpoVA+proteins+of+Bacillus+subtilis+spores.">Analysis of interactions between nutrient germinant receptors and SpoVA proteins of Bacillus subtilis spores.</a> FEMS Microbiology Letters. 274 (1), 42-47 (2007).</li><li>Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Summer+meeting+2013&#8211;when+the+sleepers+wake:+the+germination+of+spores+of+Bacillus+species.">Summer meeting 2013&#8211;when the sleepers wake: the germination of spores of Bacillus species.</a> Journal of Applied Microbiology. 115 (6), 1251-1268 (2013).</li><li>Cowan, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipids+in+the+inner+membrane+of+dormant+spores+of+Bacillus+species+are+largely+immobile.">Lipids in the inner membrane of dormant spores of Bacillus species are largely immobile.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (20), 7733-7738 (2004).</li><li>Loison, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+investigation+of+viscosity+of+an+atypical+inner+membrane+of+Bacillus+spores:+a+molecular+rotor/FLIM+study.">Direct investigation of viscosity of an atypical inner membrane of Bacillus spores: a molecular rotor/FLIM study.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1828 (11), 2436-2443 (2013).</li><li>Griffiths, K. K., Zhang, J., Cowan, A. E., Yu, J., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germination+proteins+in+the+inner+membrane+of+dormant+Bacillus+subtilis+spores+colocalize+in+a+discrete+cluster.">Germination proteins in the inner membrane of dormant Bacillus subtilis spores colocalize in a discrete cluster.</a> Molecular Microbiology. 81 (4), 1061-1077 (2011).</li><li>Troiano, A. J., Zhang, J., Cowan, A. E., Yu, J., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+dynamics+of+a+Bacillus+subtilis+spore+germination+protein+complex+during+spore+germination+and+outgrowth.">Analysis of the dynamics of a Bacillus subtilis spore germination protein complex during spore germination and outgrowth.</a> Journal of Bacteriology. 197 (2), 252-261 (2015).</li><li>Wegel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cellular+structures+in+super-resolution+with+SIM,+STED+and+Localisation+Microscopy:+A+practical+comparison.">Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison.</a> Scientific Reports. 6, 27290 (2016).</li><li>Pandey, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+imaging+of+germination+and+outgrowth+of+individual+Bacillus+subtilis+spores;+the+effect+of+heat+stress+quantitatively+analyzed+with+SporeTracker.">Live cell imaging of germination and outgrowth of individual Bacillus subtilis spores; the effect of heat stress quantitatively analyzed with SporeTracker.</a> PloS One. 8 (3), e58972 (2013).</li><li>Demmerle, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategic+and+practical+guidelines+for+successful+structured+illumination+microscopy.">Strategic and practical guidelines for successful structured illumination microscopy.</a> Nature Protocols. 12 (5), 988-1010 (2017).</li><li>Ball, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SIMcheck:+a+toolbox+for+successful+super-resolution+structured+illumination+microscopy.">SIMcheck: a toolbox for successful super-resolution structured illumination microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 15915 (2015).</li><li>Bertani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STUDIES+ON+LYSOGENESIS+I.:+The+Mode+of+Phage+Liberation+by+Lysogenic+Escherichia+coli1.">STUDIES ON LYSOGENESIS I.: The Mode of Phage Liberation by Lysogenic Escherichia coli1.</a> Journal of Bacteriology. 62 (3), 293 (1951).</li><li>Pandey, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+the+effect+of+specific+tea+compounds+on+germination+and+outgrowth+of+Bacillus+subtilis+spores+at+single+cell+resolution.">Quantitative analysis of the effect of specific tea compounds on germination and outgrowth of Bacillus subtilis spores at single cell resolution.</a> Food Microbiology. 45, 63-70 (2015).</li><li>Zheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacillus+subtilis+spore+inner+membrane+proteome.">Bacillus subtilis spore inner membrane proteome.</a> Journal of Proteome Research. 15 (2), 585-594 (2016).</li><li>Vepachedu, V. R., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+SpoVAD+to+the+inner+membrane+of+spores+of+Bacillus+subtilis.">Localization of SpoVAD to the inner membrane of spores of Bacillus subtilis.</a> Journal of Bacteriology. 187 (16), 5677-5682 (2005).</li><li>Schouten, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+dendritic+spines+of+rat+primary+hippocampal+neurons+using+structured+illumination+microscopy.">Imaging dendritic spines of rat primary hippocampal neurons using structured illumination microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), (2014).</li><li>Mukaka, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+appropriate+use+of+correlation+coefficient+in+medical+research.">A guide to appropriate use of correlation coefficient in medical research.</a> Malawi Medical Journal. 24 (3), 69-71 (2012).</li><li>Stewart, K. A., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Numbers+of+individual+nutrient+germinant+receptors+and+other+germination+proteins+in+spores+of+Bacillus+subtilis.">Numbers of individual nutrient germinant receptors and other germination proteins in spores of Bacillus subtilis.</a> Journal of Bacteriology. 195 (16), 3575-3582 (2013).</li><li>Laflamme, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+analysis+of+germinating+Bacillus+spores,+using+membrane+potential+dye.">Flow cytometry analysis of germinating Bacillus spores, using membrane potential dye.</a> Archives of Microbiology. 183 (2), 107-112 (2005).</li><li>Magge, A., Setlow, B., Cowan, A. E., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+dye+binding+by+and+membrane+potential+in+spores+of+Bacillus+species.">Analysis of dye binding by and membrane potential in spores of Bacillus species.</a> Journal of Applied Microbiology. 106 (3), 814-824 (2009).</li><li>Ghosh, S., Scotland, M., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Levels+of+germination+proteins+in+dormant+and+superdormant+spores+of+Bacillus+subtilis.">Levels of germination proteins in dormant and superdormant spores of Bacillus subtilis.</a> Journal of Bacteriology. 194 (9), 2221-2227 (2012).</li><li>Abhyankar, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+sporulation+conditions+on+the+spore+coat+protein+composition+of+Bacillus+subtilis+Spores.">The influence of sporulation conditions on the spore coat protein composition of Bacillus subtilis Spores.</a> Frontiers in microbiology. 7, 1636 (2016).</li><li>Rose, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+properties+of+Bacillus+subtilis+spores+made+in+liquid+or+on+agar+plates.">Comparison of the properties of Bacillus subtilis spores made in liquid or on agar plates.</a> Journal of Applied Microbiology. 103 (3), 691-699 (2007).</li><li>Stewart, K. A., Yi, X., Ghosh, S., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germination+protein+levels+and+rates+of+germination+of+spores+of+Bacillus+subtilis+with+overexpressed+or+deleted+genes+encoding+germination+proteins.">Germination protein levels and rates of germination of spores of Bacillus subtilis with overexpressed or deleted genes encoding germination proteins.</a> J Bacteriol. 194 (12), 3156-3164 (2012).</li><li>Ramirez-Peralta, A., Zhang, P., Li, Y. -. q., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+sporulation+conditions+on+the+germination+and+germination+protein+levels+of+Bacillus+subtilis+spores.">Effects of sporulation conditions on the germination and germination protein levels of Bacillus subtilis spores.</a> Applied and Environmental Microbiology. 78 (8), 2689-2697 (2012).</li><li>Laue, M., Han, H. -. M., Dittmann, C., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+membranes+of+bacterial+endospores+are+reservoirs+for+spore+core+membrane+expansion+during+spore+germination.">Intracellular membranes of bacterial endospores are reservoirs for spore core membrane expansion during spore germination.</a> Scientific Reports. 8, 11388 (2018).</li><li>Strahl, H., B&#252;rmann, F., Hamoen, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+actin+homologue+MreB+organizes+the+bacterial+cell+membrane.">The actin homologue MreB organizes the bacterial cell membrane.</a> Nature Communications. 5, (2014).</li><li>Strahl, H., Hamoen, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+potential+is+important+for+bacterial+cell+division.">Membrane potential is important for bacterial cell division.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (27), 12281-12286 (2010).</li><li>Swarge, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="One-Pot"+sample+processing+methodfor+proteome-wide+analysis+of+microbial+cells+and+spores.">"One-Pot" sample processing methodfor proteome-wide analysis of microbial cells and spores.</a> Proteomics Clinical Applications. (5), 1700169 (2018).</li></ol>

提示されたプロトコルには、FM4-64 B. 枯草菌芽胞をステンド胞子形成、スライドの準備、画像形成プロセスの解析のための標準 3D SIM プロシージャが含まれています。さらに、プロトコルが変更された SIMcheck (ImageJ) について説明します-3 D イメージング蛍光レポーターの付いた菌胞子 germinosomes の SIM 顕微鏡のためのプロセスを支援します。後者の手順では、拡張されたコントラス...

注文 Bacillales と Clostridiales の胞子は休眠代謝と過酷な除染体制に非常に抵抗力があるが、彼らは発芽する、しない限り、人間1に有害な影響を引き起こすことはできません。枯草菌(枯草) 胞子の栄養 germinant トリガー発芽、開始イベント、germinant 受容体 (GRs) 胞子の内膜 (IM) に位置する germinant のバインディングです。その後、GRs は IM にもある SpoVA チャネル蛋白質に信号を変換します。これは、結果、胞子コア ピリジン-2, 6-ジカルボン酸 (ジピコリン酸; exchange の発症DPA;胞子コア乾燥重量の 20% を構成する) SpoVA チャネル経由で水のため。その後、DPA リリース トリガー皮質ペプチドグリカン加水分解の活性化、追加吸水2,3,4に従います。これらのイベントは、コート層、その後破断伸長の発症に機械的ストレスにつながる、そして最後に、生長します。ただし、発芽過程の分子の正確な詳細はまだ遠くから解決されています。
胞子の発芽についての主要な質問にかかわる周囲の IM SpoVA チャネル蛋白質と同様に、IM の発芽タンパク質脂質の生物物理プロパティ。この主不動 IM 脂質二分子膜は胞子コアまたは細胞細胞質5,6で彼らの行動を出すいくつかの毒性の化学防腐剤を含む多くの小さい分子の主な関門です。IM の脂質二重膜は、モバイル IM5脂質の大部分はあるもののゲル状態の可能性が高いです。胞子の IM も大幅な拡大5の可能性があります。したがって、IM の表面積増加 1.6 追加膜の合成することがなく発芽し、この膜の特性低透磁率および脂質不動5,6の損失と一緒に伴われます。
B. 枯草菌胞子のサイズが小さいと発芽蛋白質の比較的低い豊かさが課題を提起発芽蛋白の活性化と胞子の IM 脂質の組織の分子の詳細は学習の魅力的なテーマが、顕微鏡解析。B. 枯草菌芽胞の足場蛋白質逆流性食道炎整理ゲラ、B と K GRs のための 3 つの GR サブユニット (A、B および C) グリフィスら落射蛍光顕微鏡証拠を魅力的な発芽蛋白質に溶ける蛍光レポーターを使用して示唆しています。クラスター7。彼らは発芽蛋白質のこのクラスターの 'germinosome' という言葉し、~ 300 nm 大 IM タンパク質巣8として構造を説明しました。胞子の発芽の開始、時に巣最終的に変更に大きな蛍光 germinosome 分散蛍光パターンと > L-バリン8で 1 h の胞子でこのパターンを表示する胞子人口の 75% が発芽しました。上記の使用紙平均統計的検出力を得るために、イメージング中に観測された低蛍光信号のハードルを克服するための連続した蛍光画像の数十からの画像であることに注意してください。細菌の胞子のこれらの構造のこの可視化された古典的な顕微鏡ツールとも単胞子の巣量評価と技術的に実現可能なものの端になかったより詳細な局在この方法で可能です。
ここでは、詳細な可視化を取得する構造化照明顕微鏡 (SIM) の使用とその IM 脂質ドメイン9のと同様、枯草胞子で germinosome(s) の定量化を紹介します。プロトコルには、ImageJ10、11,12だけでなく、胞子形成、スライドの準備および SIMcheck (v1.0、imageJ プラグイン) による画像解析手順も含まれています。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Air dried glass slides</td>
			<td>Menzel Gl&#228;ser</td>
			<td>630-2870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APO TIRF N20R8 100&#215; oil objective (NA=1.49)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B. subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry cat, gerD-gfp kan)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B. subtilis PS4150 (PS832 &#916;gerE::spc, &#916;cotE::tet)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flasks 1 L</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z567868</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flasks 250 mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z723088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoSpheres carboxylate-modified microspheres</td>
			<td>Invitrogen, 0.1 &#956;m</td>
			<td>F8803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM4-64</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F34653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histodenz nonionic density gradient medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iXON3 DU-897 X-6515 CCD camera</td>
			<td>Andor Technology</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.net/Welcome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge tubes 1.5 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>3451PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope imaging software</td>
			<td>Nikon, Japan</td>
			<td>NIS-Element AR 4.51.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliQ Ultrapure Deminerilzed Water</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Milli-Q IQ 7003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Screw Cap Bottle 180 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75003800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Coverslips</td>
			<td>Paul Marienfeld</td>
			<td>117650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round Bottom tubes 15 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Nunc TM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap tubes 50 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Nunc TM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of germinosomes and the inner membrane in bacillus subtilis spores

胞子のサイズが小さく、発芽蛋白質の比較的低い豊かな落射蛍光顕微鏡を用いた顕微鏡分析の難しさを引き起こします。超解像 3次元構造化照明顕微鏡法 (3 D SIM) は、このハードルを克服し、枯草菌(枯草) 胞子の発芽の過程の分子の詳細を明らかにする有望なツールです。ここでは、変更された SIMcheck (ImageJ) の使用を述べる-アシスタント 3 D イメージング プロセスと枯草胞子 germinosomes、発芽蛋白質のクラスターの SIM 顕微鏡蛍光レポーター蛋白質。FM4 64枯草胞子膜の汚損のため (スタンダード) 3 D SIM イメージング手順を提案する.これらの手順を使用して、我々 は germinosome のローカリゼーションのための卓越した解像度を得られるし、示す > 休眠胞子は胞子形成培最小限モップの後得られた枯草KGB80 の 80% ある逆流性食道炎 GFP と GerKB mCherry の 1 つまたは 2 つ巣。明るい巣も観察した FM4 64 ステンド胞子 3 D シム画像可能性があります異なる流動性の内膜脂質ドメインが存在することを示唆しています。更なる研究の共局在を評価し、このように内部胞子膜の菌発芽蛋白質の組織の最適な概観を得るダブル レポーター蛋白質膜色素と germinosome 手順をラベリングを使用するが可能。

現在のプロトコルは細菌の胞子の SIM 顕微鏡イメージング手順を示します。胞子形成とスライドの準備手順は、イメージングの前に図 1に示すように、行われました。イメージングおよび分析手順が適用された後で、両方の点心 (発芽タンパク質を標識蛍光タンパク質) と明るい (脂溶性プローブ染色 IM) 胞子サンプル次のテキストのよう。
<p cl...

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores at JoVE.com

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

Germinosomes と枯草菌胞子の内部の膜の可視化

枯草菌胞子の内膜で 'germinosomes' の germinant 受容体蛋白質クラスター。超解像顕微鏡と蛍光レポーターのタンパク質を使用して germinosomes を視覚化するプロトコルについて述べる。プロトコルはまた、FM4 64 膜色素で染色が優先的に胞子内膜ドメインを識別します。

The small size of spores and the relatively low abundance of germination proteins, cause difficulties in their microscopic analyses using epifluorescence ...

超解像構造照明顕微鏡、3D-SIMは、胞毛膜における発芽受容体クラスターの蛍光レポータータンパク質の可視化のための革新的な技術です。これらの手順を用いて、発芽性局在および胞毛内膜脂質ドメインの卓越した分解能が達成できる。この技術は、博士課程の学生フアン・ウェンと私たちの研究室の科学修士レイモンド・パスマンによって実証されます。手順を開始する前に、穏やかに揺れる水浴で30分間、1モル塩酸を含む高精度のカバーリップを洗浄し、続いて超純粋なタイプ1水で2、5分の洗浄を行います。2回目の洗浄後、カバーリップを約3分間100%エタノールに入れてから、カバーリップを乾燥させて透明度を確認します。その後、きれいなガラス顕微鏡は、スライドを乾燥させ、その明瞭さを検証する前に、1分間70%エタノールでスライドします。蛍光微小球および胞子イメージングの場合、最初のプレウォーム2スライドは、70°Cの加熱ブロック上で数秒間、70度の摂氏65マイクロリットルの液滴をスライドの1つに添加した。他のスライドを上に置き、スライド間にアガロースを広げます。5分後、スライドの1つを取り出し、乾燥アガロースを1センチのセクションに切ります。8番目の蛍光微小球または胞子に0.4マイクロリットルの無菌、超純粋なタイプ1水を1回10回加え、カバースリップを使用してパッチに高精度のカバースリップを置き、スライドのパッチをカバースリップ表面にスライドさせます。その後、65マイクロリットル、1.5 x 1.6センチメートルのジーンフレームを乾燥スライドに固定し、カバースリップをフレームに置き、フレームのすべての角を閉じます。サンプルのイメージングのために、スライドを100Xの油性目的を備えた構造化された照明顕微鏡に置き、100ナノメートルの蛍光微小球に焦点を当てます。画像のぼかしを最小限に抑える対称点広がり関数が得られるまで、100xの目的で補正リングを調整し、約10の丸い蛍光微小球を有する視野を選択します。指定された励起波長(この場合は561および488ナノメートル)に対してグレーティングフォーカス調整を適用し、透過光で胞子に焦点を当てる前に画像解析ソフトウェアのガイドとして適用する。各画像に対して 20 ミリ秒の露出を持つ 16x 平均モードで、透過光画像をキャプチャします。次に、3D-SIM照明モードで胞子の蛍光画像を生で3D構造の照明顕微鏡を撮影します。スライスの再構成のために、構造化照明パッドタブシートの[Param]をクリックして、N-SIMスライス再構築ウィンドウを開きます。推奨される指示に従い、適切なコントロールをクリックして、照明変調コントラストを auto に設定し、高解像度ノイズ抑制を 1 に設定し、フォーカスブラーの非表示を開始点として 0.05 に設定します。次に、[スライスの再構築] をクリックしてイメージを再構築し、再構築後に表示される高速フーリエ変換画像と再構築スコアによって、再構築された画像の品質を評価します。0.1 から 5 までの高解像度ノイズを調整し、フォーカスブラーの除去を 0.01 から 0.5 に調整して、最適なパラメータ設定を取得します。次に、[適用] をクリックして変更を適用します。[閉じる] をクリックしてウィンドウを閉じます。FM4-64染色PS4150胞子の生画像を開きます。次に、[スライスの再構築] をクリックしてスライスの再構築を実行し、再構築したイメージを保存します。KGB80 geminosome の 3D-SIM 生画像を疑似ワイドフィールド画像に変換するには、ImageJ SIMcheck プラグインを左クリックして、生データ SI と疑似ワイドフィールドを選択します。蛍光擬広視野画像での発芽分析のために、各反転透過画像で約25個の胞子をランダムに選択し、約350個の胞子が選択された。次にImageJを使用して、各胞子群で表される蛍光シグナルの最大強度と、各3D胞子像の積分強度を評価します。KGB80の生殖細胞の擬似広視野画像を解析するには、7つのスタックの平均積分強度値をKGB80胞毛の統合信号強度として使用する。次に、同一の設定を用いてPS4150バックグラウンド株を画像化して背景強度を決定し、個々のKGB80胞子の蛍光スポットを、背景と明確に区別できる場合は発芽性病巣とみなします。この代表的な実験では、GerD-GFP蛍光胞子の2つの病巣が異なるスタックに現れ、3つの総GerD-GFP病巣がコプラスZ3スタックで観察された。ここでは、胞状D-GFP焦点が胞毛内に1つだけある胞状の胞状が観察された。合計で、胞子の約40〜50%がそれぞれ2つまたは1つのGerD-GFPおよびGerKB-mCherryクラスターを有していた。GerD-GFP足場タンパク質の積分強度は異なる集団間で異なっていましたが、GerKB-mCherryの積分強度は異なる集団で同じでした。胞子が複数の病巣を有すると、GerD-GFPおよびGerKB-mCherry病巣の最大蛍光強度は減少する傾向があり、ゲルミノソーム病巣とみなされるすべての明るいスポットの最大蛍光は、PS4150胞子の最大自発蛍光よりも高かった。特に、発芽病巣に似た明るいFM4-64スポットは、無傷および脱コーティングされたPS4150胞子の両方に現れ、これらの明るいFM4-64スポットが内膜のゲルミノソームタンパク質のクラスタリングに関与する可能性があることを示唆している。アガロースに胞子を追加し、フレームにアガロースを配置するには、これらのミニ材料のための継続的かつ慎重な流体の動きが必要です。KGB80の生殖細胞の3D-SIM生画像を疑似広視野画像に変換し、その解釈には胞毛生物学に関する専門知識が必要です。当社の構造化照明顕微鏡法は、異なる細菌や他のバンド材料における低い豊富なタンパク質または薄暗い蛍光レポーターのイメージングに適用することができます。発芽体の組織は、バチルス発芽タンパク質および特異的膜ドメインの共局在化を評価するために二重標識手順を用いて研究することが可能になりました。

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

マウスの心臓の活動電位およびカルシウムトランジェントの光学的マッピング

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

全内部反射蛍光顕微鏡を用いた微生物のCortex組織とダイナミクスの可視化、

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

膜脊柱：膜タンパク質のタンパク質 - タンパク質相互作用を識別するために、生化学的ツール<em&gt;インビボ</em

Membrane proteins are essential for cell viability and are therefore important therapeutic targets1-3. Since they function in complexes4, methods to ...

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

パラメータ化拡張期充満フォーマリズムを経由Transmitral流れの運動学的モデルベースの​​解析によるグローバル拡張期機能の定量化

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Analysis of Tubular Membrane Networks in Cardiac Myocytes from Atria and Ventricles

心房と心室から心筋細胞における管状膜ネットワークの解析

In cardiac myocytes a complex network of membrane tubules - the transverse-axial tubule system (TATS) - controls deep intracellular signaling functions. ...

Luminescence Resonance Energy Transfer to Study Conformational Changes in Membrane Proteins Expressed in Mammalian Cells

発光共鳴エネルギーは、哺乳動物細胞で発現膜タンパク質の立体構造変化を研究するために転送

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range ...

Three-Dimensionally Printed Microfluidic Cross-flow System for Ultrafiltration/Nanofiltration Membrane Performance Testing

限外濾過/ナノ濾過膜性能試験のための三次元プリントマイクロ流体クロスフローシステム

Minimization and management of membrane fouling is a formidable challenge in diverse industrial processes and other practices that utilize membrane ...

Treatment of Ligament Constructs with Exercise-conditioned Serum: A Translational Tissue Engineering Model

運動調節血清による靭帯構築物の治療：翻訳組織工学モデル

In vitro experiments are essential to understand biological mechanisms; however, the gap between monolayer tissue culture and human physiology is large, ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

アン<em&gt;インビトロ</emマウス椎間板の&gt;器官培養モデル

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

A Protocol for Decellularizing Mouse Cochleae for Inner Ear Tissue Engineering

内耳組織工学用マウス蝸牛を Decellularizing するためのプロトコル

In mammals, mechanosensory hair cells that facilitate hearing lack the ability to regenerate, which has limited treatments for hearing loss. Current ...