Name: visualization of germinosomes and the inner membrane in bacillus subtilis spores
Uploaded: 2019-04-15T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores at JoVE.com

저자는 SIM 이미징 동안 그의 도움에 대 한 크리스 쳔 Zeelenberg 감사합니다. JW 박사 화목을 위한 중국 장학금 위원회를 인정 하 고 아이 린 Stellingwerf 이미징의 기본 단계 그녀의 도움에 대 한 감사 합니다.

1. B. subtillis 포자 형성 (타이밍: 현미경 관찰 하기 전에 7 일)
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주 1
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<li>Luria Bertani 국물 (파운드) 한 천 격판덮개 (1 %tryptone, 0.5% 효 모 추출 물, 1 %NaCl, 1 %agar)13 에 세균성 문화를 행진 하 고 단일 식민지를 37 ° C에서 밤새 품 어. B. subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry 고양이, 게르트 gfp 칸) 긴장을 사용 하 여 그 부모 배경 스트레인 B. subt...

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	<li>Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germination+of+spores+of+Bacillus+species:+what+we+know+and+do+not+know.">Germination of spores of Bacillus species: what we know and do not know.</a> Journal of Bacteriology. 196 (7), 1297-1305 (2014).</li><li>Setlow, P., Wang, S., Li, Y. -. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germination+of+spores+of+the+orders+Bacillales+and+Clostridiales.">Germination of spores of the orders Bacillales and Clostridiales.</a> Annual Review of Microbiology. 71 (1), (2017).</li><li>Vepachedu, V. R., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+interactions+between+nutrient+germinant+receptors+and+SpoVA+proteins+of+Bacillus+subtilis+spores.">Analysis of interactions between nutrient germinant receptors and SpoVA proteins of Bacillus subtilis spores.</a> FEMS Microbiology Letters. 274 (1), 42-47 (2007).</li><li>Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Summer+meeting+2013&#8211;when+the+sleepers+wake:+the+germination+of+spores+of+Bacillus+species.">Summer meeting 2013&#8211;when the sleepers wake: the germination of spores of Bacillus species.</a> Journal of Applied Microbiology. 115 (6), 1251-1268 (2013).</li><li>Cowan, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipids+in+the+inner+membrane+of+dormant+spores+of+Bacillus+species+are+largely+immobile.">Lipids in the inner membrane of dormant spores of Bacillus species are largely immobile.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (20), 7733-7738 (2004).</li><li>Loison, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+investigation+of+viscosity+of+an+atypical+inner+membrane+of+Bacillus+spores:+a+molecular+rotor/FLIM+study.">Direct investigation of viscosity of an atypical inner membrane of Bacillus spores: a molecular rotor/FLIM study.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1828 (11), 2436-2443 (2013).</li><li>Griffiths, K. K., Zhang, J., Cowan, A. E., Yu, J., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germination+proteins+in+the+inner+membrane+of+dormant+Bacillus+subtilis+spores+colocalize+in+a+discrete+cluster.">Germination proteins in the inner membrane of dormant Bacillus subtilis spores colocalize in a discrete cluster.</a> Molecular Microbiology. 81 (4), 1061-1077 (2011).</li><li>Troiano, A. J., Zhang, J., Cowan, A. E., Yu, J., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+dynamics+of+a+Bacillus+subtilis+spore+germination+protein+complex+during+spore+germination+and+outgrowth.">Analysis of the dynamics of a Bacillus subtilis spore germination protein complex during spore germination and outgrowth.</a> Journal of Bacteriology. 197 (2), 252-261 (2015).</li><li>Wegel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cellular+structures+in+super-resolution+with+SIM,+STED+and+Localisation+Microscopy:+A+practical+comparison.">Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison.</a> Scientific Reports. 6, 27290 (2016).</li><li>Pandey, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+imaging+of+germination+and+outgrowth+of+individual+Bacillus+subtilis+spores;+the+effect+of+heat+stress+quantitatively+analyzed+with+SporeTracker.">Live cell imaging of germination and outgrowth of individual Bacillus subtilis spores; the effect of heat stress quantitatively analyzed with SporeTracker.</a> PloS One. 8 (3), e58972 (2013).</li><li>Demmerle, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategic+and+practical+guidelines+for+successful+structured+illumination+microscopy.">Strategic and practical guidelines for successful structured illumination microscopy.</a> Nature Protocols. 12 (5), 988-1010 (2017).</li><li>Ball, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SIMcheck:+a+toolbox+for+successful+super-resolution+structured+illumination+microscopy.">SIMcheck: a toolbox for successful super-resolution structured illumination microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 15915 (2015).</li><li>Bertani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STUDIES+ON+LYSOGENESIS+I.:+The+Mode+of+Phage+Liberation+by+Lysogenic+Escherichia+coli1.">STUDIES ON LYSOGENESIS I.: The Mode of Phage Liberation by Lysogenic Escherichia coli1.</a> Journal of Bacteriology. 62 (3), 293 (1951).</li><li>Pandey, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+the+effect+of+specific+tea+compounds+on+germination+and+outgrowth+of+Bacillus+subtilis+spores+at+single+cell+resolution.">Quantitative analysis of the effect of specific tea compounds on germination and outgrowth of Bacillus subtilis spores at single cell resolution.</a> Food Microbiology. 45, 63-70 (2015).</li><li>Zheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacillus+subtilis+spore+inner+membrane+proteome.">Bacillus subtilis spore inner membrane proteome.</a> Journal of Proteome Research. 15 (2), 585-594 (2016).</li><li>Vepachedu, V. R., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+SpoVAD+to+the+inner+membrane+of+spores+of+Bacillus+subtilis.">Localization of SpoVAD to the inner membrane of spores of Bacillus subtilis.</a> Journal of Bacteriology. 187 (16), 5677-5682 (2005).</li><li>Schouten, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+dendritic+spines+of+rat+primary+hippocampal+neurons+using+structured+illumination+microscopy.">Imaging dendritic spines of rat primary hippocampal neurons using structured illumination microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), (2014).</li><li>Mukaka, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+appropriate+use+of+correlation+coefficient+in+medical+research.">A guide to appropriate use of correlation coefficient in medical research.</a> Malawi Medical Journal. 24 (3), 69-71 (2012).</li><li>Stewart, K. A., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Numbers+of+individual+nutrient+germinant+receptors+and+other+germination+proteins+in+spores+of+Bacillus+subtilis.">Numbers of individual nutrient germinant receptors and other germination proteins in spores of Bacillus subtilis.</a> Journal of Bacteriology. 195 (16), 3575-3582 (2013).</li><li>Laflamme, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+analysis+of+germinating+Bacillus+spores,+using+membrane+potential+dye.">Flow cytometry analysis of germinating Bacillus spores, using membrane potential dye.</a> Archives of Microbiology. 183 (2), 107-112 (2005).</li><li>Magge, A., Setlow, B., Cowan, A. E., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+dye+binding+by+and+membrane+potential+in+spores+of+Bacillus+species.">Analysis of dye binding by and membrane potential in spores of Bacillus species.</a> Journal of Applied Microbiology. 106 (3), 814-824 (2009).</li><li>Ghosh, S., Scotland, M., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Levels+of+germination+proteins+in+dormant+and+superdormant+spores+of+Bacillus+subtilis.">Levels of germination proteins in dormant and superdormant spores of Bacillus subtilis.</a> Journal of Bacteriology. 194 (9), 2221-2227 (2012).</li><li>Abhyankar, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+sporulation+conditions+on+the+spore+coat+protein+composition+of+Bacillus+subtilis+Spores.">The influence of sporulation conditions on the spore coat protein composition of Bacillus subtilis Spores.</a> Frontiers in microbiology. 7, 1636 (2016).</li><li>Rose, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+properties+of+Bacillus+subtilis+spores+made+in+liquid+or+on+agar+plates.">Comparison of the properties of Bacillus subtilis spores made in liquid or on agar plates.</a> Journal of Applied Microbiology. 103 (3), 691-699 (2007).</li><li>Stewart, K. A., Yi, X., Ghosh, S., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germination+protein+levels+and+rates+of+germination+of+spores+of+Bacillus+subtilis+with+overexpressed+or+deleted+genes+encoding+germination+proteins.">Germination protein levels and rates of germination of spores of Bacillus subtilis with overexpressed or deleted genes encoding germination proteins.</a> J Bacteriol. 194 (12), 3156-3164 (2012).</li><li>Ramirez-Peralta, A., Zhang, P., Li, Y. -. q., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+sporulation+conditions+on+the+germination+and+germination+protein+levels+of+Bacillus+subtilis+spores.">Effects of sporulation conditions on the germination and germination protein levels of Bacillus subtilis spores.</a> Applied and Environmental Microbiology. 78 (8), 2689-2697 (2012).</li><li>Laue, M., Han, H. -. M., Dittmann, C., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+membranes+of+bacterial+endospores+are+reservoirs+for+spore+core+membrane+expansion+during+spore+germination.">Intracellular membranes of bacterial endospores are reservoirs for spore core membrane expansion during spore germination.</a> Scientific Reports. 8, 11388 (2018).</li><li>Strahl, H., B&#252;rmann, F., Hamoen, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+actin+homologue+MreB+organizes+the+bacterial+cell+membrane.">The actin homologue MreB organizes the bacterial cell membrane.</a> Nature Communications. 5, (2014).</li><li>Strahl, H., Hamoen, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+potential+is+important+for+bacterial+cell+division.">Membrane potential is important for bacterial cell division.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (27), 12281-12286 (2010).</li><li>Swarge, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="One-Pot"+sample+processing+methodfor+proteome-wide+analysis+of+microbial+cells+and+spores.">"One-Pot" sample processing methodfor proteome-wide analysis of microbial cells and spores.</a> Proteomics Clinical Applications. (5), 1700169 (2018).</li></ol>

제시 하는 프로토콜 FM4-64 스테인드 B. subtilis 포자 포자 형성, 슬라이드 준비와 이미징 프로세스의 분석을 위한 표준 3D-SIM 절차를 포함 합니다. 또한, 프로토콜 설명 수정된 SIMcheck (ImageJ)-3D 이미징 B. subtilis 포자 germinosomes 형광 기자 표시의 SIM 현미경 검사 법에 대 한 프로세스를 지원. 후자의 절차를 사용 하 여 향상 된 콘트라스트와 함께 희미 한이 구조를 관찰할 수 있었습니다. 두 가...

Bacillales 및 Clostridiales의 포자 metabolically 휴면 하 고 가혹한 오염 정권에 매우 저항력이 있지만 그들은 발 아 하지 않는 인간1해로운 효과 일으킬 수 없습니다. 새 균의 subtilis (B. subtilis) 포자의 영양소 germinant 트리거 발 아, 개시 이벤트는 germinant 수용 체 (GRs) 포자의 내부 막 (IM)에 위치한 germinant 바인딩입니다. 그 후,는 GRs transduce 메신저에 있는 또한 SpoVA 채널 단백질에 신호. 이 포자 코어 피리 딘-2, 6-dicarboxylic 산 (dipicolinic 산; 교류의 결과 DPA; 포자 코어 건조 중량의 20% 함유) SpoVA 채널을 통해 물에 대 한. 그 후, DPA 릴리스 트리거 피 peptidoglycan 가수분해의 활성화 고 추가 물 통풍 관2,,34. 이러한 이벤트 코트 레이어, 그것의 연속적인 파열, 파생물의 발병에 기계적 스트레스를 리드 하 고, 마지막으로, 식물 성장. 그러나, 발 아 과정의 정확한 분자 세부 정보는 여전히 멀리에서 해결 되었습니다.
포자 발 아에 대 한 주요 질문 임 발 아 단백질 IM SpoVA 채널 단백질 주변의 지질 생물 속성을 염려 한다. 이 크게 움직이지 IM 지질 bilayer 일부는 포자 코어 또는 식물 세포 세포질5,6에 그들의 활동을 발휘 하는 독성 화학 방부 제, 포함 하는 많은 작은 분자에 대 한 주요 침투성 방 벽 이다. 메신저5모바일 지질의 중요 한 일부분 이지만 메신저 지질 bilayer 젤 상태에서 가능성이 높습니다. 포자의 메신저는 또한 중요 한 확장5에 대 한 잠재력이 있다. 따라서, 메신저의 표면적 증가 하면 추가 막 합성 없이 발 아 시이 막의 특성 낮은 침투성 및 지질 부동5,6의 손실에 의해 동반입니다.
B. subtilis 포자의 작은 크기와 발 아 단백질의 상대적으로 낮은 풍부한 도전을 제기 발 아 단백질의 활성화 및 포자에 IM 지질 조직 분자 세부 연구를 위한 매력적인 주제는, 에 현미경 분석입니다. 그리피스 그 외 여러분 epifluorescence 현미경 증거 돋보이는, B. subtilis 포자에 비 계 단백질 식도 3 GR 소 단위 (A, B 및 C) 게 라, B 및 K GRs 구성 제안 형광 기자 발 아 단백질, 융합을 사용 하 여 클러스터7에서. 그들은 발 아 단백질의이 클러스터에 대 한 'germinosome' 라는 용어를 만들어낸 고 ~ 300 nm 큰 메신저 단백질 foci8구조 설명. 포자 발 아의 시작, 시와 형광 패턴, 분산 foci 궁극적으로 변화에 더 큰 형광 germinosome > 포자에이 패턴을 표시 하는 포자 인구의 75% L valine81 h에 대 한 출 아 했다. Note 사용 위에서 언급 한 종이 이미지 사진의 연속 형광, 통계 전원 낮은 형광 신호 이미징 동안 관찰의 장애물을 극복 하기를 수십에서 평균. 세균성 포자에 이러한 구조의이 시각화 했다 이란 기술적으로 가능한 클래식 미세한 도구와 단일 포자에서 foci의 금액의 두 평가의 가장자리에도 그들의 더 상세한 subcellular 지 방화 했다 이 방법으로 가능 합니다.
여기, 우리 상세한 시각화를 구조화 조명 현미경 (SIM)의 사용 및 B. subtilis, 뿐만 아니라 그들의 IM 지질 도메인9의 포자에서 germinosome(s)의 정량화를 보여 줍니다. 프로토콜은 또한 ImageJ10,,1112뿐만 아니라 포자 형성, 슬라이드 준비와 SIMcheck (v1.0, imageJ 플러그인) 이미지 분석에 대 한 지침을 포함합니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Air dried glass slides</td>
			<td>Menzel Gl&#228;ser</td>
			<td>630-2870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APO TIRF N20R8 100&#215; oil objective (NA=1.49)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B. subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry cat, gerD-gfp kan)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B. subtilis PS4150 (PS832 &#916;gerE::spc, &#916;cotE::tet)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flasks 1 L</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z567868</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flasks 250 mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z723088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoSpheres carboxylate-modified microspheres</td>
			<td>Invitrogen, 0.1 &#956;m</td>
			<td>F8803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM4-64</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F34653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histodenz nonionic density gradient medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iXON3 DU-897 X-6515 CCD camera</td>
			<td>Andor Technology</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.net/Welcome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge tubes 1.5 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>3451PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope imaging software</td>
			<td>Nikon, Japan</td>
			<td>NIS-Element AR 4.51.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliQ Ultrapure Deminerilzed Water</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Milli-Q IQ 7003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Screw Cap Bottle 180 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75003800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Coverslips</td>
			<td>Paul Marienfeld</td>
			<td>117650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round Bottom tubes 15 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Nunc TM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap tubes 50 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Nunc TM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of germinosomes and the inner membrane in bacillus subtilis spores

포자의 작은 크기와 발 아 단백질의 상대적으로 낮은 풍부한 epifluorescence 현미경 검사 법을 사용 하 여 그들의 미세한 분석에 어려움이 발생할. 슈퍼 해상도 3 차원 구조화 조명 현미경 (3D-SIM)이이 장애물을 극복 하 고 새 균의 subtilis (B. subtilis) 포자의 발 아 과정의 분자 세부 정보를 공개 하는 유망한 도구입니다. 여기, 우리는 수정 된 SIMcheck (ImageJ)를 사용 하 여 설명-보조 3D 이미징 프로세스 및 형광 기자 단백질 B. subtilis 포자 germinosomes, 발 아 단백질의 클러스터의 시뮬레이션입니다. 우리는 또한 FM4-64 B. subtilis 포자 막의 얼룩에 대 한 (표준) 3D 시뮬레이션 이미징 절차를 제시. 이 절차를 사용 하 여 우리는 germinosome 지역화에 대 한 탁월한 해상도 얻을 하 고 표시 > B. subtilis KGB80 정의 된 최소 MOPS 매체에 포자 형성 후 얻은 휴면 포자의 80%는 하나 또는 두 개의 식도 GFP와 GerKB-mCherry 포커스입니다. 밝은 foci에서 관찰된 FM4-64 스테인드 포자 3D 시뮬레이션 이미지 내부 막 지질 도메인 가능성이 다른 유동성의 존재를 제안 했다. 공동 지역화를 평가 하 고 따라서 내부 포자 막에서 균 발 아 단백질의 조직에 대 한 최적의 개요를 얻을을 더블 라벨 막 염료와 germinosome 프로시저 기자 단백질을 사용 하는 연구는 더 가능.

현재 프로토콜 세균성 포자에 대 한 SIM 현미경 이미징 절차를 제공합니다. 포자 형성 및 슬라이드 준비 절차 이미징 하기 전에 그림 1 에 표시 된 대로 실행 되었다. 이미징 및 분석 절차 적용 후, 모두 (발 아 단백질을 분류 하는 형광 단백질)을 흐리게 하 고 밝은 (닥터지 프로브 IM 스테인드) 포자 샘플 다음 텍스트와 같이.
<p class="jove_content" fo:keep-t...

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Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

Germinosomes과 새 균의 subtilis 포자에 내부 막의 시각화

'Germinosomes' 새 균의 subtilis 포자의 내부 막에서에 germinant 수용 체 단백질 클러스터. 우리는 슈퍼 해상도 현미경 및 형광 기자 단백질 germinosomes 시각화를 사용 하 여 프로토콜을 설명 합니다. 프로토콜 또한 우선적으로 막 염료 FM4-64와 스테인드 포자 내부 막 도메인을 식별 합니다.

The small size of spores and the relatively low abundance of germination proteins, cause difficulties in their microscopic analyses using epifluorescence ...

초분해능 구조화 조명 현미경 검사법인 3D-SIM은 포자 막에서 발아 수용체 클러스터의 형광 기자 단백질을 시각화하는 혁신적인 기술입니다. 이러한 절차를 사용하여 발거국화 및 포자 내부 막 지질 도메인의 타의 추종을 불허하는 해상도를 달성할 수 있습니다. 이 기술은 박사 과정 학생 후안 웬과 과학 학생 레이몬드 파스만의 우리의 실험실에 의해 입증될 것입니다.시술을 시작하기 전에, 부드럽게 흔들리는 수조에서 30 분 동안 1 개의 어금니 염산으로 고정밀 커버립을 청소하고 초순수 타입 1 물에 2 5 분 세척합니다. 두 번째 세척 후 커버립을 100% 에탄올에 약 3분간 놓고 커버립을 건조시키고 선명도를 확인합니다. 그런 다음, 깨끗한 유리 현미경은 슬라이드가 건조하고 선명도를 확인하기 전에 1 분 동안 70 %의 에탄올로 슬라이드.형광 마이크로스피어 및 포자 이미징의 경우, 70도 섭씨 가열 블록에 처음 두 개의 슬라이드를 한 후 몇 초 동안 미리 따뜻하게 두 개의 슬라이드를 한 후 70도 섭씨, 65 마이크로리터 액적인 멸균 2%의 아가게로 슬라이드 중 하나에 연결됩니다. 슬라이드 사이에 아가로즈를 퍼뜨리기 위해 다른 슬라이드를 위에 놓습니다. 5분 후 슬라이드 중 하나를 제거하고 말린 아가로즈를 1-1센티미터 섹션으로 자른다.멸균의 0.4 마이크로리터에 8번째 형광 마이크로스피어 또는 포자를 1회 10번 추가하고, 아가로즈에 초순수 타입 1물을 넣고, 커버슬립을 사용하여 패치에 고정밀 커버슬립을 배치하여 슬라이드의 패치를 커버슬립 표면으로 밀어넣습니다. 그런 다음 65 마이크로리터, 1.5-1.6센티미터 유전자 프레임을 말린 슬라이드에 고정하고 커버슬립을 프레임에 배치하여 프레임의 모서리를 모두 닫습니다. 시료의 이미징을 위해 슬라이드를 100X 오일 목표를 갖춘 구조화 된 조명 현미경에 배치하고 100 나노 미터 형광 현미경에 집중하십시오.이미지의 흐림을 최소화하기 위해 대칭 점 확산 함수가 얻어질 때까지 100x 목표에서 보정 링을 조정하고 약 10개의 둥근 형광 마이크로스피어를 사용하여 시야를 선택합니다. 지정된 여기 파장에 대한 격자 초점 조정을 적용, 이 경우, 561 및 488 나노미터, 전송 광과 포자에 초점을 맞추기 전에 이미지 분석 소프트웨어에 대한 가이드로. 각 이미지에 대해 20밀리초 노출되는 16x 평균 모드에서 전송 광 이미지를 캡처합니다.이어서, 3D-SIM 조명 모드로 포자의 3D 구조화 조명 현미경 원시 형광 영상을 캡처한다. 슬라이스 재구성의 경우 구조화된 조명 패드 탭 시트의 Param을 클릭하여 N-SIM 슬라이스 재구성 창을 엽니다. 제안된 지침을 따르고 적절한 컨트롤을 클릭하여 조명 변조 대비를 자동으로 설정하고 고해상도 노이즈 억제를 시작점으로 0.05로 초점 흐림 억제합니다.그런 다음 슬라이스 재구성을 클릭하여 이미지를 재구성하고 재구성 후 표시되는 빠른 Fourier 변환 이미지와 재구성 점수로 재구성된 이미지의 품질을 평가합니다. 고해상도 노이즈를 0.1에서 5로 조정하고 초점 블러 억제를 0.01에서 0.5로 조정하여 최상의 매개 변수 설정을 얻을 때까지 조정합니다. 그런 다음 적용을 클릭하여 변경 사항을 적용합니다.창을 닫기 위해 가까이 를 클릭합니다. FM4-64 스테인드 PS4150 포자 원시 이미지를 엽니다. 그런 다음 슬라이스 재구성을 클릭하여 슬라이스 재구성을 실행하고 재구성된 이미지를 저장합니다.KGB80 geminosome의 3D-SIM 원시 이미지를 의사 와이드 필드 이미지로 변환하려면 ImageJ SIMcheck 플러그인을 왼쪽 클릭하고 원시 데이터 SI 및 의사 와이드 필드를 선택합니다. 약 350개의 포자가 선택될 때까지 형광 의사 와이드필드 이미지에서 나중에 발아성 분석을 위해 각 반전 전송 이미지에서 약 25개의 포자를 임의로 선택한다. 그런 다음 ImageJ를 사용하여 각 포자 그룹과 각 3D 포자 이미지의 통합 강도에 의해 표현된 각 형광 신호에 대한 최대 강도를 평가합니다.KGB80 germinosome의 의사 와이드필드 이미지를 분석하려면 7개의 스택의 평균 통합 강도 값을 KGB80 포자의 통합 신호 강도로 사용합니다. 그런 다음 동일한 설정을 사용하여 PS4150 배경 변형을 이미징하여 배경 강도를 결정하고, 개별 KGB80 포자의 형광 반점을 배경과 명확하게 구별할 수 있을 때 발거성 포시로 간주합니다. 본 대표적인 실험에서, GerD-GFP 형광 포자의 2개의 포시가 컴포지티브 Z3 스택에서 관찰된 3개의 총 GerD-GFP 포시와 다른 스택에 나타났다.여기서, 포자에서 하나의 GerD-GFP 초점만을 가진 포자관찰되었다. 총, 포자의 약 40 ~50%는 각각 두 개 또는 하나의 GerD-GFP와 GerKB-mCherry 클러스터를 가지고 있었다. GerD-GFP 스캐폴드 단백질의 통합 강도는 다른 인구마다 달랐지만 GerKB-mCherry의 통합 강도는 다른 인구에서 거의 동일했습니다.포자가 여러 포시를 가졌을 때, GerD-GFP및 GerKB-mCherry 포시의 최대 형광 강도는 감소하는 경향이 있었고, 발거성 포시로 간주되는 모든 밝은 반점의 최대 형광은 PS4150 의 최대 자동 형광보다 높았다. 특히, 발거성 포시와 유사한 밝은 FM4-64 반점은 그대로 코팅된 PS4150 포자 모두에 나타나며, 이러한 밝은 FM4-64 반점은 내부 막에 있는 발거성 단백질의 클러스터링에 관여할 수 있음을 시사한다. 아가로즈에 포자를 추가하고 프레임에 아가로즈를 배치하려면 이러한 미니 재료에 대한 연속적이고 신중한 유체 움직임이 필요합니다.KGB80 의 3D-SIM 원시 이미지를 의사 와이드 필드 이미지로 변환하고 해석은 포자 생물학에 대한 전문가의 지식이 필요합니다. 우리의 구조화 된 조명 현미경 검사는 다른 박테리아 또는 다른 밴드 재료에서 낮은 풍부한 단백질 또는 희미한 형광 기자의 이미징에 적용 될 수있다. germinosome의 조직은 지금 바실러스 발아 단백질 및 특정 막 도메인의 공동 현지화를 평가하기 위하여 이중 라벨링 절차를 사용하여 공부될 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

마우스 중심에 액션 후보와 칼슘 과도의 광학 매핑

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연구

생체공학

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

미생물에 접속 조직 및 역학 시각화, 총 내부 반사의 형광 현미경을 사용하여

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

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매개 변수화 이완기 충전 형식주의를 통해 Transmitral 흐름의 운동 학적 모델링 기반의 분석에 의하여 세계적인 이완기 기능의 정량화

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

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심방과 심실에서 심장 근육 세포에 관형 막 네트워크 분석

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발광 공명 에너지는 포유 동물 세포에 표현 막 단백질의 구조 변화를 연구에 전송

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range ...

Three-Dimensionally Printed Microfluidic Cross-flow System for Ultrafiltration/Nanofiltration Membrane Performance Testing

한외 여과 / 나노 멤브레인 성능 테스트 용 삼차원 인쇄물 미세 유체 교차 유동 시스템

Minimization and management of membrane fouling is a formidable challenge in diverse industrial processes and other practices that utilize membrane ...

Treatment of Ligament Constructs with Exercise-conditioned Serum: A Translational Tissue Engineering Model

운동 조건의 혈청을 이용한 인대 구조의 치료 : Translational Tissue Engineering Model

In vitro experiments are essential to understand biological mechanisms; however, the gap between monolayer tissue culture and human physiology is large, ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

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<em&gt; 체외</em쥐의 추간판의&gt; 장기 문화 모델

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

A Protocol for Decellularizing Mouse Cochleae for Inner Ear Tissue Engineering

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In mammals, mechanosensory hair cells that facilitate hearing lack the ability to regenerate, which has limited treatments for hearing loss. Current ...