Name: visualization of germinosomes and the inner membrane in bacillus subtilis spores
Uploaded: 2019-04-15T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores at JoVE.com

Forfatterne takker Christiaan Zeelenberg for hans hjelp under SIM avbilding. JW erkjenner Kina stipend Rådet for en PhD fellesskap og takk Irene Stellingwerf for hennes hjelp under den primære stadiet av tenkelig.

1. B. subtillis Sporulation (Timing: 7 dager før mikroskopiske observasjon)
<ol><li>
Dag 1
	<ol>
<li>Strek en bakteriell kultur på en Luria-Bertani kjøttkraft (LB) agar plate (1% tryptone 0,5% gjærekstrakt 1% NaCl, 1% agar)13 og ruge over natten på 37 ° C å få enkelt kolonier. Bruke B. subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry katten, gerD-gfp kan) belastning og dens overordnede bakgrunn belastning B. subtilis PS4150 (PS832 ...

<ol>
	<li>Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germination+of+spores+of+Bacillus+species:+what+we+know+and+do+not+know.">Germination of spores of Bacillus species: what we know and do not know.</a> Journal of Bacteriology. 196 (7), 1297-1305 (2014).</li><li>Setlow, P., Wang, S., Li, Y. -. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germination+of+spores+of+the+orders+Bacillales+and+Clostridiales.">Germination of spores of the orders Bacillales and Clostridiales.</a> Annual Review of Microbiology. 71 (1), (2017).</li><li>Vepachedu, V. R., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+interactions+between+nutrient+germinant+receptors+and+SpoVA+proteins+of+Bacillus+subtilis+spores.">Analysis of interactions between nutrient germinant receptors and SpoVA proteins of Bacillus subtilis spores.</a> FEMS Microbiology Letters. 274 (1), 42-47 (2007).</li><li>Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Summer+meeting+2013&#8211;when+the+sleepers+wake:+the+germination+of+spores+of+Bacillus+species.">Summer meeting 2013&#8211;when the sleepers wake: the germination of spores of Bacillus species.</a> Journal of Applied Microbiology. 115 (6), 1251-1268 (2013).</li><li>Cowan, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipids+in+the+inner+membrane+of+dormant+spores+of+Bacillus+species+are+largely+immobile.">Lipids in the inner membrane of dormant spores of Bacillus species are largely immobile.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (20), 7733-7738 (2004).</li><li>Loison, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+investigation+of+viscosity+of+an+atypical+inner+membrane+of+Bacillus+spores:+a+molecular+rotor/FLIM+study.">Direct investigation of viscosity of an atypical inner membrane of Bacillus spores: a molecular rotor/FLIM study.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1828 (11), 2436-2443 (2013).</li><li>Griffiths, K. K., Zhang, J., Cowan, A. E., Yu, J., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germination+proteins+in+the+inner+membrane+of+dormant+Bacillus+subtilis+spores+colocalize+in+a+discrete+cluster.">Germination proteins in the inner membrane of dormant Bacillus subtilis spores colocalize in a discrete cluster.</a> Molecular Microbiology. 81 (4), 1061-1077 (2011).</li><li>Troiano, A. J., Zhang, J., Cowan, A. E., Yu, J., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+dynamics+of+a+Bacillus+subtilis+spore+germination+protein+complex+during+spore+germination+and+outgrowth.">Analysis of the dynamics of a Bacillus subtilis spore germination protein complex during spore germination and outgrowth.</a> Journal of Bacteriology. 197 (2), 252-261 (2015).</li><li>Wegel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cellular+structures+in+super-resolution+with+SIM,+STED+and+Localisation+Microscopy:+A+practical+comparison.">Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison.</a> Scientific Reports. 6, 27290 (2016).</li><li>Pandey, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+imaging+of+germination+and+outgrowth+of+individual+Bacillus+subtilis+spores;+the+effect+of+heat+stress+quantitatively+analyzed+with+SporeTracker.">Live cell imaging of germination and outgrowth of individual Bacillus subtilis spores; the effect of heat stress quantitatively analyzed with SporeTracker.</a> PloS One. 8 (3), e58972 (2013).</li><li>Demmerle, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategic+and+practical+guidelines+for+successful+structured+illumination+microscopy.">Strategic and practical guidelines for successful structured illumination microscopy.</a> Nature Protocols. 12 (5), 988-1010 (2017).</li><li>Ball, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SIMcheck:+a+toolbox+for+successful+super-resolution+structured+illumination+microscopy.">SIMcheck: a toolbox for successful super-resolution structured illumination microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 15915 (2015).</li><li>Bertani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STUDIES+ON+LYSOGENESIS+I.:+The+Mode+of+Phage+Liberation+by+Lysogenic+Escherichia+coli1.">STUDIES ON LYSOGENESIS I.: The Mode of Phage Liberation by Lysogenic Escherichia coli1.</a> Journal of Bacteriology. 62 (3), 293 (1951).</li><li>Pandey, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+the+effect+of+specific+tea+compounds+on+germination+and+outgrowth+of+Bacillus+subtilis+spores+at+single+cell+resolution.">Quantitative analysis of the effect of specific tea compounds on germination and outgrowth of Bacillus subtilis spores at single cell resolution.</a> Food Microbiology. 45, 63-70 (2015).</li><li>Zheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacillus+subtilis+spore+inner+membrane+proteome.">Bacillus subtilis spore inner membrane proteome.</a> Journal of Proteome Research. 15 (2), 585-594 (2016).</li><li>Vepachedu, V. R., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+SpoVAD+to+the+inner+membrane+of+spores+of+Bacillus+subtilis.">Localization of SpoVAD to the inner membrane of spores of Bacillus subtilis.</a> Journal of Bacteriology. 187 (16), 5677-5682 (2005).</li><li>Schouten, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+dendritic+spines+of+rat+primary+hippocampal+neurons+using+structured+illumination+microscopy.">Imaging dendritic spines of rat primary hippocampal neurons using structured illumination microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), (2014).</li><li>Mukaka, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+appropriate+use+of+correlation+coefficient+in+medical+research.">A guide to appropriate use of correlation coefficient in medical research.</a> Malawi Medical Journal. 24 (3), 69-71 (2012).</li><li>Stewart, K. A., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Numbers+of+individual+nutrient+germinant+receptors+and+other+germination+proteins+in+spores+of+Bacillus+subtilis.">Numbers of individual nutrient germinant receptors and other germination proteins in spores of Bacillus subtilis.</a> Journal of Bacteriology. 195 (16), 3575-3582 (2013).</li><li>Laflamme, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+analysis+of+germinating+Bacillus+spores,+using+membrane+potential+dye.">Flow cytometry analysis of germinating Bacillus spores, using membrane potential dye.</a> Archives of Microbiology. 183 (2), 107-112 (2005).</li><li>Magge, A., Setlow, B., Cowan, A. E., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+dye+binding+by+and+membrane+potential+in+spores+of+Bacillus+species.">Analysis of dye binding by and membrane potential in spores of Bacillus species.</a> Journal of Applied Microbiology. 106 (3), 814-824 (2009).</li><li>Ghosh, S., Scotland, M., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Levels+of+germination+proteins+in+dormant+and+superdormant+spores+of+Bacillus+subtilis.">Levels of germination proteins in dormant and superdormant spores of Bacillus subtilis.</a> Journal of Bacteriology. 194 (9), 2221-2227 (2012).</li><li>Abhyankar, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+sporulation+conditions+on+the+spore+coat+protein+composition+of+Bacillus+subtilis+Spores.">The influence of sporulation conditions on the spore coat protein composition of Bacillus subtilis Spores.</a> Frontiers in microbiology. 7, 1636 (2016).</li><li>Rose, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+properties+of+Bacillus+subtilis+spores+made+in+liquid+or+on+agar+plates.">Comparison of the properties of Bacillus subtilis spores made in liquid or on agar plates.</a> Journal of Applied Microbiology. 103 (3), 691-699 (2007).</li><li>Stewart, K. A., Yi, X., Ghosh, S., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germination+protein+levels+and+rates+of+germination+of+spores+of+Bacillus+subtilis+with+overexpressed+or+deleted+genes+encoding+germination+proteins.">Germination protein levels and rates of germination of spores of Bacillus subtilis with overexpressed or deleted genes encoding germination proteins.</a> J Bacteriol. 194 (12), 3156-3164 (2012).</li><li>Ramirez-Peralta, A., Zhang, P., Li, Y. -. q., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+sporulation+conditions+on+the+germination+and+germination+protein+levels+of+Bacillus+subtilis+spores.">Effects of sporulation conditions on the germination and germination protein levels of Bacillus subtilis spores.</a> Applied and Environmental Microbiology. 78 (8), 2689-2697 (2012).</li><li>Laue, M., Han, H. -. M., Dittmann, C., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+membranes+of+bacterial+endospores+are+reservoirs+for+spore+core+membrane+expansion+during+spore+germination.">Intracellular membranes of bacterial endospores are reservoirs for spore core membrane expansion during spore germination.</a> Scientific Reports. 8, 11388 (2018).</li><li>Strahl, H., B&#252;rmann, F., Hamoen, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+actin+homologue+MreB+organizes+the+bacterial+cell+membrane.">The actin homologue MreB organizes the bacterial cell membrane.</a> Nature Communications. 5, (2014).</li><li>Strahl, H., Hamoen, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+potential+is+important+for+bacterial+cell+division.">Membrane potential is important for bacterial cell division.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (27), 12281-12286 (2010).</li><li>Swarge, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="One-Pot"+sample+processing+methodfor+proteome-wide+analysis+of+microbial+cells+and+spores.">"One-Pot" sample processing methodfor proteome-wide analysis of microbial cells and spores.</a> Proteomics Clinical Applications. (5), 1700169 (2018).</li></ol>

Protokollen presentert inneholder en standard 3D-SIM fremgangsmåte for analyse av FM4-64 farget B. subtilis spores som inkluderer sporulation, lysbilde forberedelse og imaging prosesser. I tillegg protokollen beskriver en modifisert SIMcheck (ImageJ)-assistert 3D bildeprodukter prosessen for SIM mikroskopi av B. subtilis spore germinosomes merket med fluorescerende journalister. Sistnevnte prosedyren tillatt oss å observere denne dim underlaget med utvidet kontrast. Ved å koble to tenkelig prosedyrer...

Sporer av Bacillales og Clostridiales er metabolically sovende og ekstremt motstandsdyktig mot harde dekontaminering regimer, men med mindre de spire, kan forårsake skadelige effekter i mennesker1. Næringsstoff germinant utløste spiring av Bacillus subtilis (B. subtilis) sporer er hendelsen innvielse germinant binding til germinant reseptorer (GRs) i spore's indre membran (IM). Deretter transduce GRs signal å SpoVA kanal protein også plassert i chat. Dette resulterer i utbruddet av utveksling av spore kjernen pyridine-2,6-dicarboxylic syre (dipicolinic acid; DPA; bestående av 20% av spore kjernen tørr wt) for vann via SpoVA kanalen. Deretter DPA utgivelsen utløsere aktivering av cortex Peptidoglykan hydrolyse og vann opptak følger2,3,4. Disse hendelsene fører til mekanisk stress på frakken lagene, det påfølgende bruddet, utbruddet av utvekst og, endelig, vegetativ vekst. Men er den eksakte molekylære detaljer om spiring prosessen fortsatt langt fra løst.
Viktige spørsmål om spore spiring bekymringer Biofysiske egenskapene av lipider rundt IM spiring proteiner som IM SpoVA kanal proteiner. Denne hovedsakelig immobile IM lipid bilayer er den viktigste permeabilitet barrieren for mange små molekyler, inkludert giftige kjemiske konserveringsmidler, noen som utøver sin handling i spore kjernen eller vegetative cellen cytoplasma5,6. IM lipid bilayer er sannsynlig i gel tilstand, selv om det er en betydelig andel av mobile lipider i IM5. Spore's IM også har potensial for betydelig utvidelse5. Dermed øker arealet av chat 1.6-fold på spiring uten ekstra membran syntese og ledsages av tap av denne membranen karakteristiske lav permeabilitet og lipid ubevegelighet5,6.
Mens molekylær detaljer om aktivering av spiring proteiner og organisering av IM lipider i sporene er attraktive emner for studier, utgjør den lille størrelsen på B. subtilis sporer og relativt lav overflod av spiring proteiner, en utfordring til mikroskopiske analyser. Griffiths et al. overbevisende epifluorescence mikroskop bevis, antyder bruke fluorescerende journalister smeltet spiring proteiner, at i B. subtilis sporer stillaset protein GerD organiserer tre GR underavdelinger (A, B og C) for GerA, B og K GRs, i en klynge7. De innførte begrepet "germinosome" for denne klyngen spiring proteiner og beskrevet strukturer som ~ 300 nm store IM protein foci8. Ved innvielsen av spore spirende, fluorescerende germinosome foci slutt endre i større spre fluorescerende mønstre, med > 75% av spore befolkningsgrupper viser dette mønsteret i sporer spirer 1t med L-Valin8. Merk at papiret nevnt ovenfor brukte gjennomsnitt bilder fra dusinvis av påfølgende fluorescerende bilder, å få statistisk makt og overvinne hinder lav fluorescerende signaler observert under bildebehandling. Denne effekten av disse strukturene i bakteriell sporer var på kanten av det er teknisk mulig med klassisk mikroskopiske verktøy og verken en evaluering av fokus i en enkelt spore eller deres mer detaljert subcellular lokalisering var mulig med denne tilnærmingen.
Her viser vi bruk av strukturert belysning mikroskopi (SIM) å få en detaljert visualisering og måling av germinosome(s) i sporer av B. subtilis, samt deres IM lipid domener9. Protokollen inneholder også instruksjoner sporulation, lysbilde og bildeanalyse av SIMcheck (v1.0, en imageJ plugin) og ImageJ10,11,12.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Air dried glass slides</td>
			<td>Menzel Gl&#228;ser</td>
			<td>630-2870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APO TIRF N20R8 100&#215; oil objective (NA=1.49)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B. subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry cat, gerD-gfp kan)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B. subtilis PS4150 (PS832 &#916;gerE::spc, &#916;cotE::tet)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flasks 1 L</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z567868</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flasks 250 mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z723088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoSpheres carboxylate-modified microspheres</td>
			<td>Invitrogen, 0.1 &#956;m</td>
			<td>F8803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM4-64</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F34653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histodenz nonionic density gradient medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iXON3 DU-897 X-6515 CCD camera</td>
			<td>Andor Technology</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.net/Welcome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge tubes 1.5 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>3451PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope imaging software</td>
			<td>Nikon, Japan</td>
			<td>NIS-Element AR 4.51.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliQ Ultrapure Deminerilzed Water</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Milli-Q IQ 7003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Screw Cap Bottle 180 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75003800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Coverslips</td>
			<td>Paul Marienfeld</td>
			<td>117650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round Bottom tubes 15 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Nunc TM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap tubes 50 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Nunc TM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of germinosomes and the inner membrane in bacillus subtilis spores

Den lille størrelsen på sporer og relativt lav overflod av spiring proteiner, føre til vanskeligheter i sine mikroskopiske analyser bruker epifluorescence mikroskopi. Super-oppløsning tredimensjonalt strukturert belysning mikroskopi (3D-SIM) er et lovende verktøy for å overvinne dette hinderet og avsløre molekylær detaljer av spiring av Bacillus subtilis (B. subtilis) sporer. Her beskriver vi bruk av en modifisert SIMcheck (ImageJ)-assistent 3D avbildingsprosessen og fluorescerende reporter proteiner for SIM mikroskopi av B. subtilis spores germinosomes, sektorgruppene spiring proteiner. Vi presenterer også en (standard) 3D-SIM tenkelig prosedyre for FM4-64 farging av B. subtilis spore membraner. Ved hjelp av disse prosedyrene, vi fikk uovertruffen løsning for germinosome lokalisering og viser at > 80% av B. subtilis KGB80 sovende sporer innhentet etter sporulation på definerte minimal MOPPER medium har én eller to GerD-GFP og GerKB-mCherry Foci. Lyse foci ble også observert i FM4-64 farget spores 3D-SIM bilder foreslå at indre membran lipid domener av ulike flyt sannsynlig finnes. Videre er studier som bruker dobbel merking prosedyrer med membran fargestoffer og germinosome reporter proteiner vurdere co lokalisering og dermed få en optimal oversikt over organiseringen av Bacillus spiring proteiner i indre spore membranen mulig.

Gjeldende protokollen presenterer en SIM mikroskop tenkelig prosedyre for bakteriell sporer. Sporulation og skyv forberedelse prosedyrene ble utført som vist i figur 1 før bildebehandling. Senere, bildebehandling og analyse prosedyrene ble brukt både for dim (fluorescerende protein merket spiring proteiner) og lyse (lipofile sonde farget IM) spore prøver som vist i følgende tekst.
Lokal...

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores at JoVE.com

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

Visualisering av Germinosomes og interne membran i Bacillus subtilis Spores

Germinant reseptor proteiner klynge i 'germinosomes' i indre membran av Bacillus subtilis sporer. Vi beskriver en protokoll som super-oppløsning mikroskopi og fluorescerende reporter proteiner for å visualisere germinosomes. Protokollen identifiserer også spore indre membran domener som er fortrinnsvis beiset med membran fargestoff FM4-64.

The small size of spores and the relatively low abundance of germination proteins, cause difficulties in their microscopic analyses using epifluorescence ...

Superoppløsning strukturert belysning mikroskopi, 3D-SIM, er en innovativ teknikk for visualisering av fluorescerende reporter proteiner av spiring reseptor klynger i spore membraner. Ved hjelp av disse prosedyrene kan uovertruffen oppløsning av germinosom lokalisering og spore indre membran lipiddomener oppnås. Teknikken vil bli demonstrert av ph.d.-student Juan Wen og mastergradsstudent Raymond Pasman fra laboratoriet vårt.Før du begynner prosedyren, rengjør høy presisjon dekkerlips med en-molar saltsyre i 30 minutter i en forsiktig risting vannbad, etterfulgt av to, fem minutters vasker i ultrapure Type 1 vann. Etter den andre vasken, legg dekkglassene i 100% etanol i omtrent tre minutter før du tørker dekkslips og verifiserer deres klarhet. Deretter glir rent glassmikroskop med 70% etanol i ett minutt før lysbildene tørker og verifiserer klarheten.For fluorescerende mikrosfære og spore imaging, første pre-varme to lysbilder på en 70-graders Celsius varmeblokk i noen sekunder før du legger til en 70-graders Celsius, 65-mikroliter dråpe sterilisert 2% agarose på en av lysbildene. Plasser det andre lysbildet øverst for å spre oppstoen mellom lysbildene. Etter fem minutter fjerner du en av lysbildene og kutter den tørkede agarose i en en-til-en-centimeter seksjon.Legg en gang 10 til åttende fluorescerende mikrosfærer eller sporer i 0,4 mikroliter sterilt, ultrapure Type 1 vann til agarose, og plasser en høy presisjon dekslerslip på ved hjelp av dekkslips for å skyve av lysbildet på dekkslip overflaten. Deretter fikser du en 65-mikroliter, 1,5 ganger 1,6 centimeter Gene Frame på et tørket lysbilde, og plasserer dekkglasset på rammen, lukker alle hjørnene av rammen. For avbildning av prøvene plasserer du lysbildet på et strukturert belysningsmikroskop utstyrt med et 100X oljemål, og fokuser på 100 nanometer fluorescerende mikrosfærer.Juster korreksjonsringen på 100x-målet til en symmetrisk punktspredningsfunksjon oppnås for å minimere uskarphet av bildene, og velg et synsfelt med ca. 10 runde fluorescerende mikrosfærer. Påfør en ristefokusjustering for de utpekte eksitasjonsbølgelengdene, i dette tilfellet 561 og 488 nanometer, som en veiledning for bildeanalyseprogramvaren før du fokuserer på sporene med overføringslyset. Ta et overføringslysbilde i 16x gjennomsnittlig modus med 20-millisekundeksponeringer for hvert bilde.Deretter tar du opp 3D-strukturert belysningsmikroskop rå fluorescerende bilder av sporene med 3D-SIM-belysningsmodus. For skiverekonstruksjon klikker du Param på det strukturerte belysningsblokkfanearket for å åpne N-SIM Slice Reconstruction-vinduet. Følg de foreslåtte instruksjonene, og klikk på de riktige kontrollene for å sette belysningsmodulasjonskontrasten til automatisk, høyoppløselig støyundertrykkelse til en, og ut av fokususkarphetsdempingen til 0,05 som utgangspunkt.Deretter klikker du Rekonstruer slice for å rekonstruere bildet og evaluere kvaliteten på de rekonstruerte bildene med de raske Fourier-transformerte bildene og rekonstruksjonspoengsummen som vises etter rekonstruksjonen. Juster høyoppløselig støy fra 0,1 til fem og ut av fokus uskarphetsspuppresjonen fra 0,01 til 0,5 til de beste parameterinnstillingene er oppnådd. Klikk deretter Bruk for å bruke endringene.Klikk Lukk for å lukke vinduet. Åpne et FM4-64 farget PS4150 sporer rå bilde. Klikk deretter Rekonstruer slice for å utføre skiverekonstruksjonen, og lagre det rekonstruerte bildet.For å konvertere 3D-SIM raw-bildene av KGB80 geminosome til pseudo-widefield-bilder, venstreklikk på ImageJ SIMcheck plugin og velg Raw Data SI og Pseudo Widefield. Tilfeldig velge om 25 sporer i hvert invertert overføringsbilde for en senere germinosom analyse i fluorescerende pseudo-widefield bilder til ca 350 sporer er valgt. Deretter bruker du ImageJ til å vurdere maksimal intensitet for hvert fluorescerende signal uttrykt av hver gruppe sporer og den integrerte intensiteten til hvert 3D-sporbilde.For å analysere pseudo-widefield-bildene av KGB80-germinosomet, bruk den gjennomsnittlige integrerte intensitetsverdien på syv stabler som den integrerte signalintensiteten til KGB80-sporet. Deretter bestemmer du bakgrunnsintensitetene ved å forestille seg PS4150-bakgrunnsstammen ved hjelp av identiske innstillinger, og betrakter de fluorescerende flekkene i individuelle KGB80-sporer som germinosomfoci når de er tydelig skilles fra bakgrunnen. I dette representative eksperimentet dukket to foci av GerD-GFP fluorescing sporer opp i forskjellige stabler med tre totale GerD-GFP foci observert i den kompositive Z3-stakken.Her ble det observert en spore med bare ett GerD-GFP-fokuspunkt i sporet. Totalt hadde rundt 40 til 50% av sporene henholdsvis to eller en GerD-GFP og GerKB-mCherry-klynge. Mens den integrerte intensiteten av GerD-GFP stillasproteinet var forskjellig mellom ulike populasjoner, var den integrerte intensiteten av GerKB-mCherry omtrent den samme i forskjellige populasjoner.Når sporet hadde flere foci, maksimal fluorescens intensitet av GerD-GFP og GerKB-mCherry foci tendens til å redusere, og maksimal fluorescens av alle de lyse flekker, ansett som germinosome foci, var høyere enn den maksimale auto-fluorescens av PS4150 sporer. Spesielt vises lysere FM4-64 flekker som ligner på germinosomfoci i både intakte og decoated PS4150 sporer, noe som tyder på at disse lysere FM4-64 flekker kan være involvert i klyngen av germinosom proteiner i indre membran. Legge sporer til agarose og plassere agarose i rammen krever en kontinuerlig og forsiktig væskebevegelse for disse minis materialer.Konverteringen av 3D-SIM rå bilder av KGB80 germinosome til pseudo-widefield bilder og deres tolkning krever ekspertkunnskap om spore biologi. Vår strukturerte belysning mikroskopi prosedyre kan brukes til avbildning av lav rikelig proteiner eller dim fluorescens reportere i forskjellige bakterier eller andre bånd materialer. Organiseringen av germinosomet kan nå studeres ved hjelp av doble merkingsprosedyrer for å vurdere samtidig lokalisering av Bacillus spiringsproteiner og spesifikke membrandomener.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Visualisering av Cortex Organisasjon og Dynamics i Mikroorganismer, bruke Total Internal Reflection fluorescensmikroskopi

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

Membran-SPINE: En Biokjemisk verktøy for å identifisere protein-protein interaksjoner av membran proteiner<em&gt; I Vivo</em

Membrane proteins are essential for cell viability and are therefore important therapeutic targets1-3. Since they function in complexes4, methods to ...

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

Kvantifisering av Global diastolisk funksjon av Kinetisk modellering basert analyse av transmitral Flow via Parametrized diastolisk Fylling formalisme

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Analysis of Tubular Membrane Networks in Cardiac Myocytes from Atria and Ventricles

Analyse av Tubular Membran Networks i hjertemuskelceller fra Atria og ventriklene

In cardiac myocytes a complex network of membrane tubules - the transverse-axial tubule system (TATS) - controls deep intracellular signaling functions. ...

Luminescence Resonance Energy Transfer to Study Conformational Changes in Membrane Proteins Expressed in Mammalian Cells

Luminescence Resonance Energy Transfer til Studer konformasjonsendringer i membran proteiner uttrykt i pattedyrceller

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range ...

Three-Dimensionally Printed Microfluidic Cross-flow System for Ultrafiltration/Nanofiltration Membrane Performance Testing

Tredimensjonalt Trykt microfluidic Cross-flow system for ultrafiltrering / Nanofiltrering Membran Performance Testing

Minimization and management of membrane fouling is a formidable challenge in diverse industrial processes and other practices that utilize membrane ...

Treatment of Ligament Constructs with Exercise-conditioned Serum: A Translational Tissue Engineering Model

Behandling av ligamentkonstruksjoner med treningskondensert serum: en translasjonell vævsteknikkmodell

In vitro experiments are essential to understand biological mechanisms; however, the gap between monolayer tissue culture and human physiology is large, ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

en<em&gt; In Vitro</em&gt; Organ Culture Modell av Murine mellomvirvelskive

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

A Protocol for Decellularizing Mouse Cochleae for Inner Ear Tissue Engineering

En protokoll for Decellularizing musen Cochleae indre øret Tissue engineering

In mammals, mechanosensory hair cells that facilitate hearing lack the ability to regenerate, which has limited treatments for hearing loss. Current ...