Name: visualization of germinosomes and the inner membrane in bacillus subtilis spores
Uploaded: 2019-04-15T13:00:00
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Os autores agradecer Christiaan Zeelenberg por sua assistência durante a imagem SIM. JW reconhece Conselho de bolsa da China para uma bolsa de doutorado e obrigado Irene Stellingwerf por sua ajuda durante a fase primária da imagem.

1. b. subtillis esporulação (tempo: 7 dias antes da observação microscópica)
<ol><li>
Dia 1
	<ol>
<li>Marcam uma cultura bacteriana em um caldo de Luria-Bertani (LB) ágar placa (triptona 1%, extrato de levedura 0,5%, 1% de NaCl, 1% de ágar)13 e incubar durante uma noite a 37 ° C para obter colônias única. Use o KGB80 de b. subtilis (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry gato, kan de gerD-gfp) tensão e sua estirpe de fundo PS4150 de b. subtili...

<ol>
	<li>Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germination+of+spores+of+Bacillus+species:+what+we+know+and+do+not+know.">Germination of spores of Bacillus species: what we know and do not know.</a> Journal of Bacteriology. 196 (7), 1297-1305 (2014).</li><li>Setlow, P., Wang, S., Li, Y. -. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germination+of+spores+of+the+orders+Bacillales+and+Clostridiales.">Germination of spores of the orders Bacillales and Clostridiales.</a> Annual Review of Microbiology. 71 (1), (2017).</li><li>Vepachedu, V. R., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+interactions+between+nutrient+germinant+receptors+and+SpoVA+proteins+of+Bacillus+subtilis+spores.">Analysis of interactions between nutrient germinant receptors and SpoVA proteins of Bacillus subtilis spores.</a> FEMS Microbiology Letters. 274 (1), 42-47 (2007).</li><li>Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Summer+meeting+2013&#8211;when+the+sleepers+wake:+the+germination+of+spores+of+Bacillus+species.">Summer meeting 2013&#8211;when the sleepers wake: the germination of spores of Bacillus species.</a> Journal of Applied Microbiology. 115 (6), 1251-1268 (2013).</li><li>Cowan, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipids+in+the+inner+membrane+of+dormant+spores+of+Bacillus+species+are+largely+immobile.">Lipids in the inner membrane of dormant spores of Bacillus species are largely immobile.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (20), 7733-7738 (2004).</li><li>Loison, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+investigation+of+viscosity+of+an+atypical+inner+membrane+of+Bacillus+spores:+a+molecular+rotor/FLIM+study.">Direct investigation of viscosity of an atypical inner membrane of Bacillus spores: a molecular rotor/FLIM study.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1828 (11), 2436-2443 (2013).</li><li>Griffiths, K. K., Zhang, J., Cowan, A. E., Yu, J., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germination+proteins+in+the+inner+membrane+of+dormant+Bacillus+subtilis+spores+colocalize+in+a+discrete+cluster.">Germination proteins in the inner membrane of dormant Bacillus subtilis spores colocalize in a discrete cluster.</a> Molecular Microbiology. 81 (4), 1061-1077 (2011).</li><li>Troiano, A. J., Zhang, J., Cowan, A. E., Yu, J., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+dynamics+of+a+Bacillus+subtilis+spore+germination+protein+complex+during+spore+germination+and+outgrowth.">Analysis of the dynamics of a Bacillus subtilis spore germination protein complex during spore germination and outgrowth.</a> Journal of Bacteriology. 197 (2), 252-261 (2015).</li><li>Wegel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cellular+structures+in+super-resolution+with+SIM,+STED+and+Localisation+Microscopy:+A+practical+comparison.">Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison.</a> Scientific Reports. 6, 27290 (2016).</li><li>Pandey, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+imaging+of+germination+and+outgrowth+of+individual+Bacillus+subtilis+spores;+the+effect+of+heat+stress+quantitatively+analyzed+with+SporeTracker.">Live cell imaging of germination and outgrowth of individual Bacillus subtilis spores; the effect of heat stress quantitatively analyzed with SporeTracker.</a> PloS One. 8 (3), e58972 (2013).</li><li>Demmerle, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategic+and+practical+guidelines+for+successful+structured+illumination+microscopy.">Strategic and practical guidelines for successful structured illumination microscopy.</a> Nature Protocols. 12 (5), 988-1010 (2017).</li><li>Ball, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SIMcheck:+a+toolbox+for+successful+super-resolution+structured+illumination+microscopy.">SIMcheck: a toolbox for successful super-resolution structured illumination microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 15915 (2015).</li><li>Bertani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STUDIES+ON+LYSOGENESIS+I.:+The+Mode+of+Phage+Liberation+by+Lysogenic+Escherichia+coli1.">STUDIES ON LYSOGENESIS I.: The Mode of Phage Liberation by Lysogenic Escherichia coli1.</a> Journal of Bacteriology. 62 (3), 293 (1951).</li><li>Pandey, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+the+effect+of+specific+tea+compounds+on+germination+and+outgrowth+of+Bacillus+subtilis+spores+at+single+cell+resolution.">Quantitative analysis of the effect of specific tea compounds on germination and outgrowth of Bacillus subtilis spores at single cell resolution.</a> Food Microbiology. 45, 63-70 (2015).</li><li>Zheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacillus+subtilis+spore+inner+membrane+proteome.">Bacillus subtilis spore inner membrane proteome.</a> Journal of Proteome Research. 15 (2), 585-594 (2016).</li><li>Vepachedu, V. R., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+SpoVAD+to+the+inner+membrane+of+spores+of+Bacillus+subtilis.">Localization of SpoVAD to the inner membrane of spores of Bacillus subtilis.</a> Journal of Bacteriology. 187 (16), 5677-5682 (2005).</li><li>Schouten, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+dendritic+spines+of+rat+primary+hippocampal+neurons+using+structured+illumination+microscopy.">Imaging dendritic spines of rat primary hippocampal neurons using structured illumination microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), (2014).</li><li>Mukaka, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+appropriate+use+of+correlation+coefficient+in+medical+research.">A guide to appropriate use of correlation coefficient in medical research.</a> Malawi Medical Journal. 24 (3), 69-71 (2012).</li><li>Stewart, K. A., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Numbers+of+individual+nutrient+germinant+receptors+and+other+germination+proteins+in+spores+of+Bacillus+subtilis.">Numbers of individual nutrient germinant receptors and other germination proteins in spores of Bacillus subtilis.</a> Journal of Bacteriology. 195 (16), 3575-3582 (2013).</li><li>Laflamme, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+analysis+of+germinating+Bacillus+spores,+using+membrane+potential+dye.">Flow cytometry analysis of germinating Bacillus spores, using membrane potential dye.</a> Archives of Microbiology. 183 (2), 107-112 (2005).</li><li>Magge, A., Setlow, B., Cowan, A. E., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+dye+binding+by+and+membrane+potential+in+spores+of+Bacillus+species.">Analysis of dye binding by and membrane potential in spores of Bacillus species.</a> Journal of Applied Microbiology. 106 (3), 814-824 (2009).</li><li>Ghosh, S., Scotland, M., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Levels+of+germination+proteins+in+dormant+and+superdormant+spores+of+Bacillus+subtilis.">Levels of germination proteins in dormant and superdormant spores of Bacillus subtilis.</a> Journal of Bacteriology. 194 (9), 2221-2227 (2012).</li><li>Abhyankar, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+sporulation+conditions+on+the+spore+coat+protein+composition+of+Bacillus+subtilis+Spores.">The influence of sporulation conditions on the spore coat protein composition of Bacillus subtilis Spores.</a> Frontiers in microbiology. 7, 1636 (2016).</li><li>Rose, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+properties+of+Bacillus+subtilis+spores+made+in+liquid+or+on+agar+plates.">Comparison of the properties of Bacillus subtilis spores made in liquid or on agar plates.</a> Journal of Applied Microbiology. 103 (3), 691-699 (2007).</li><li>Stewart, K. A., Yi, X., Ghosh, S., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germination+protein+levels+and+rates+of+germination+of+spores+of+Bacillus+subtilis+with+overexpressed+or+deleted+genes+encoding+germination+proteins.">Germination protein levels and rates of germination of spores of Bacillus subtilis with overexpressed or deleted genes encoding germination proteins.</a> J Bacteriol. 194 (12), 3156-3164 (2012).</li><li>Ramirez-Peralta, A., Zhang, P., Li, Y. -. q., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+sporulation+conditions+on+the+germination+and+germination+protein+levels+of+Bacillus+subtilis+spores.">Effects of sporulation conditions on the germination and germination protein levels of Bacillus subtilis spores.</a> Applied and Environmental Microbiology. 78 (8), 2689-2697 (2012).</li><li>Laue, M., Han, H. -. M., Dittmann, C., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+membranes+of+bacterial+endospores+are+reservoirs+for+spore+core+membrane+expansion+during+spore+germination.">Intracellular membranes of bacterial endospores are reservoirs for spore core membrane expansion during spore germination.</a> Scientific Reports. 8, 11388 (2018).</li><li>Strahl, H., B&#252;rmann, F., Hamoen, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+actin+homologue+MreB+organizes+the+bacterial+cell+membrane.">The actin homologue MreB organizes the bacterial cell membrane.</a> Nature Communications. 5, (2014).</li><li>Strahl, H., Hamoen, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+potential+is+important+for+bacterial+cell+division.">Membrane potential is important for bacterial cell division.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (27), 12281-12286 (2010).</li><li>Swarge, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="One-Pot"+sample+processing+methodfor+proteome-wide+analysis+of+microbial+cells+and+spores.">"One-Pot" sample processing methodfor proteome-wide analysis of microbial cells and spores.</a> Proteomics Clinical Applications. (5), 1700169 (2018).</li></ol>

O protocolo apresentado contém um procedimento padrão do 3D-SIM para análise de FM4-64 manchadas de esporos de b. subtilis que inclui esporulação, preparação de slide e processos de imagem. Além disso, o protocolo descreve um SIMcheck modificado (ImageJ)-assistida de processo para microscopia SIM de b. subtilis esporo germinosomes rotulado com fluorescentes repórteres de imagem 3D. O último procedimento nos permitiu observar esta subestrutura ofuscante com contraste aprimorado. Pelo acoplament...

Esporos das ordens Bacillales e Clostridiales são metabolicamente inativo e extraordinariamente resistente aos regimes de descontaminação dura, mas a menos que germinam, não podem causar efeitos deletérios em seres humanos1. Em nutriente germinant desencadeada germinação dos esporos de Bacillus subtilis (b. subtilis), o evento de iniciação é germinant ligação a receptores germinant (GRs), localizado na membrana interna do spore (IM). Posteriormente, as GRs transduce sinais à proteína de canal SpoVA também localizado no IM. Isso resulta no início da troca de esporo núcleo piridina-2,6-de ácido dicarboxílico (ácido dipicolínico; DPA; composto por 20% dos esporos núcleo seco wt) para a água através do canal SpoVA. Posteriormente, o lançamento DPA desencadeia a ativação da hidrólise de peptidoglicano do córtex, e absorção de água adicionais segue2,3,4. Esses eventos levam ao estresse mecânico sobre as camadas de revestimento, sua ruptura subsequente, o aparecimento de consequência e, finalmente, crescimento vegetativo. No entanto, os detalhes exatos moleculares do processo de germinação são ainda longe de resolvida.
Uma grande questão sobre a germinação dos esporos diz respeito as propriedades biofísicas dos lipídeos em torno das proteínas de germinação de IM, bem como as proteínas de canal SpoVA IM. Este imóvel em grande parte lipídica IM é a barreira de permeabilidade principal para muitas moléculas pequenas, incluindo preservativos químicos tóxicos, alguns dos quais exercem sua ação no núcleo do esporo ou no citoplasma de células vegetativas5,6. A bicapa lipídica IM é provável que em um estado de gel, embora haja uma fração significativa de lipídios móveis no IM5. IM do esporo também tem o potencial de expansão significativa5. Assim, aumenta a área de superfície do IM 1.6-fold sobre a germinação sem síntese de membrana adicional e é acompanhada pela perda de característico baixa permeabilidade e lipídios imobilidade5,6 de uma membrana.
Enquanto os detalhes moleculares da ativação de proteínas germinação e organização dos lipídios IM em esporos são temas atraentes para estudo, o tamanho pequeno de esporos de b. subtilis e a relativamente baixa abundância de proteínas de germinação, representam um desafio para análises microscópicas. Griffiths et al. evidências de microscópio de epifluorescência convincentes, usando fluorescentes repórteres fundidos às proteínas de germinação, sugere que em esporos de b. subtilis a proteína de andaime GerD organiza três subunidades GR (A, B e C) de GerA, B e K GRs, em um cluster7. Eles cunhou o termo 'germinosome' para este cluster de proteínas germinação e descreveu as estruturas como ~ 300 nm grande IM proteína focos8. Ao iniciar a germinação dos esporos, germinosome fluorescente focos, finalmente, transformar em maior dispersar padrões fluorescentes, com > 75% das populações esporo exibindo este padrão em esporos germinados para 1 h com L-valina8. Observe que o livro mencionado acima usado em média imagens de dezenas de fotos fluorescentes consecutivas, para ganhar poder estatístico e superar o obstáculo da baixos sinais fluorescentes observados durante a imagem latente. Esta visualização destas estruturas em esporos bacterianos foi no limite do que é tecnicamente viável com ferramentas microscópicas clássicas e nem uma avaliação da quantidade de focos em um único esporo nem foi sua localização subcellular mais detalhada possível com esta abordagem.
Aqui, vamos demonstrar o uso de estruturada iluminação microscopia (SIM) para obter uma visualização detalhada e quantificação do germinosome(s) em esporos de b. subtilis, bem como de seus IM lipídico domínios9. O protocolo também contém instruções para a esporulação, slide preparação e análise de imagens por SIMcheck (v 1.0, um plugin do imageJ) bem como ImageJ10,11,12.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Air dried glass slides</td>
			<td>Menzel Gl&#228;ser</td>
			<td>630-2870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APO TIRF N20R8 100&#215; oil objective (NA=1.49)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B. subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry cat, gerD-gfp kan)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B. subtilis PS4150 (PS832 &#916;gerE::spc, &#916;cotE::tet)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flasks 1 L</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z567868</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flasks 250 mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z723088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoSpheres carboxylate-modified microspheres</td>
			<td>Invitrogen, 0.1 &#956;m</td>
			<td>F8803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM4-64</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F34653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histodenz nonionic density gradient medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iXON3 DU-897 X-6515 CCD camera</td>
			<td>Andor Technology</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.net/Welcome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge tubes 1.5 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>3451PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope imaging software</td>
			<td>Nikon, Japan</td>
			<td>NIS-Element AR 4.51.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliQ Ultrapure Deminerilzed Water</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Milli-Q IQ 7003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Screw Cap Bottle 180 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75003800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Coverslips</td>
			<td>Paul Marienfeld</td>
			<td>117650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round Bottom tubes 15 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Nunc TM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap tubes 50 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Nunc TM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of germinosomes and the inner membrane in bacillus subtilis spores

O pequeno tamanho dos esporos e a relativamente baixa abundância de proteínas de germinação, causar dificuldades em suas análises microscópicas usando microscopia de epifluorescência. Super-resolução tridimensional estruturada iluminação microscopia (3D-SIM) é uma ferramenta promissora para superar este obstáculo e revelar os detalhes moleculares do processo de germinação de esporos de Bacillus subtilis (b. subtilis). Aqui, descrevemos o uso de um SIMcheck modificado (ImageJ)-processo de imagem 3D assistente e proteínas fluorescentes repórter para microscopia SIM de germinosomes dos esporos de b. subtilis , clusters de proteínas de germinação. Apresentamos também um procedimento de imagem 3D-SIM (padrão) para FM4-64 coloração das membranas de esporos de b. subtilis . Usando estes procedimentos, obteve resolução insuperável para a localização de germinosome e mostrar que > 80% de b. subtilis KGB80 esporos dormentes obtidos após esporulação no meio de MOPS mínimo definido têm um ou dois GerD-GFP e GerKB-mCherry focos. Focos luminosos também foram observados em FM4-64 manchado imagens de 3D-SIM dos esporos sugerindo que domínios de lipídios de membrana interna de fluidez diferente provável existirem. Mais estudos que usam dupla rotulagem procedimentos com corantes de membrana e germinosome proteínas repórter para avaliar localização co e, assim, obter uma óptima visão geral da organização das proteínas de germinação de Bacillus na membrana interna dos esporos são possível.

O protocolo atual apresenta um procedimento de imagem de microscópio SIM por esporos bacterianos. Os procedimentos de preparação de esporulação e slide foram realizados conforme mostrado na Figura 1 antes de imagem. Mais tarde, os procedimentos de imagem e análise foram aplicados tanto para dim (proteína fluorescente etiquetada proteínas germinação) e brilhante esporo (sonda lipofílicos manchado IM) amostras conforme mostrado no texto a seguir....

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Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

Visualização do Germinosomes e a membrana interna em esporos de Bacillus subtilis

Cluster de proteínas do receptor germinant em 'germinosomes' na membrana interna dos esporos de Bacillus subtilis . Descreveremos um protocolo usando proteínas de repórter de microscopia e fluorescente super resolução para visualizar germinosomes. O protocolo também identifica domínios de membrana interna de esporo que preferencialmente são corados com o corante de membrana FM4-64.

The small size of spores and the relatively low abundance of germination proteins, cause difficulties in their microscopic analyses using epifluorescence ...

Microscopia de iluminação estruturada de super resolução, 3D-SIM, é uma técnica inovadora para a visualização de proteínas fluorescentes de aglomerados receptores de germinação em membranas esporos. Utilizando esses procedimentos, pode-se alcançar a resolução insuperável da localização germinos e dos domínios lipídudos da membrana interna. A técnica será demonstrada pelo doutorando Juan Wen e pelo estudante de Mestrado em Ciências Raymond Pasman do nosso laboratório.Antes de iniciar o procedimento, limpe as tampas de alta precisão com ácido clorídrico de um molar por 30 minutos em um banho de água suavemente agitado, seguido por duas lavagens de cinco minutos em água ultrapura tipo 1. Após a segunda lavagem, coloque as tampas em 100% de etanol por cerca de três minutos antes de secar as tampas e verificar sua clareza. Em seguida, limpe os slides do microscópio de vidro com 70% de etanol por um minuto antes de permitir que os slides sequem e verifiquem sua clareza.Para microesfera fluorescente e imagens de esporos, primeiro pré-aqueça dois slides em um bloco de aquecimento Celsius de 70 graus por alguns segundos antes de adicionar uma gotícula Celsius de 70 graus, 65-microliter de 2% esterilizada em um dos slides. Coloque o outro slide em cima para espalhar a ágarose entre os slides. Após cinco minutos, remova um dos slides e corte a agarose seca em uma seção de um por um centímetro.Adicione uma vez 10 às oitavas microesferas fluorescentes ou esporos em 0,4 microliters de água estéril e ultrapura tipo 1 à ágarose, e coloque uma mancha de alta precisão no patch usando a mancha para deslizar o remendo para fora da superfície do deslizamento. Em seguida, fixe um quadro genético de 65 microliter, 1,5 por 1,6 centímetros em um slide seco e coloque a mancha na moldura, fechando todos os cantos do quadro. Para a imagem das amostras, coloque o slide em um microscópio de iluminação estruturado equipado com um objetivo de óleo de 100X e foque nas microesferas fluorescentes de 100 nanômetros.Ajuste o anel de correção no objetivo de 100x até que uma função de propagação de ponto simétrico seja obtida para minimizar o desfoque das imagens e selecione um campo de visão com aproximadamente 10 microesferas fluorescentes redondas. Aplique um ajuste de foco de grade para os comprimentos de onda de excitação designados, neste caso, 561 e 488 nanômetros, como guia para o software de análise de imagem antes de focar nos esporos com a luz de transmissão. Capture uma imagem de luz de transmissão no modo médio de 16x com exposições de 20 milissegundos para cada imagem.Em seguida, capture imagens fluorescentes brutas do microscópio de iluminação estruturada em 3D dos esporos com o modo de iluminação 3D-SIM. Para reconstrução de fatias, clique em Param na folha de guia de iluminação estruturada para abrir a janela de reconstrução de fatias N-SIM. Siga as instruções sugeridas e clique nos controles apropriados para definir o contraste de modulação de iluminação para auto, a supressão de ruído de alta resolução para um e a supressão de desfoque fora do foco para 0,05 como pontos de partida.Em seguida, clique em Reconstruir fatia para reconstruir a imagem e avaliar a qualidade das imagens reconstruídas pelas imagens rápidas transformadas em Fourier e escore de reconstrução que são exibidas após a reconstrução. Ajuste o ruído de alta resolução de 0,1 para cinco e a supressão de desfoque fora do foco de 0,01 para 0,5 até que as melhores configurações do parâmetro sejam obtidas. Em seguida, clique em Aplicar para aplicar as alterações.Clique em Fechar a janela. Abra uma imagem bruta de esporos PS4150 manchados FM4-64. Em seguida, clique em Reconstruir fatia para executar a reconstrução da fatia e salvar a imagem reconstruída.Para converter as imagens brutas 3D-SIM do geminosome KGB80 em imagens pseudo-widefield, clique à esquerda no plugin ImageJ SIMcheck e selecione Raw Data SI e Pseudo Widefield. Selecione aleatoriamente cerca de 25 esporos em cada imagem de transmissão invertida para uma análise germinosa posterior nas imagens de pseudo-widefield fluorescentes até que aproximadamente 350 esporos tenham sido selecionados. Em seguida, use ImageJ para avaliar a intensidade máxima para cada sinal fluorescente expresso por cada grupo de esporos e a intensidade integrada de cada imagem de esporo 3D.Para analisar as imagens pseudo-widefield do germinosomo KGB80, use o valor médio de intensidade integrada de sete pilhas como a intensidade de sinal integrado do esporo KGB80. Em seguida, determine as intensidades de fundo por imagem da cepa de fundo PS4150 usando configurações idênticas, e considere os pontos fluorescentes em esporos individuais KGB80 como focos germinos quando eles são claramente distinguíveis do fundo. Neste experimento representativo, dois focos dos esporos fluorescentes GerD-GFP apareceram em pilhas diferentes com três focos totais gerd-GFP observados na pilha z3 compositiva.Aqui, observou-se um esporo com apenas um ponto focal GerD-GFP no esporo. No total, cerca de 40 a 50% dos esporos tinham dois ou um aglomerado GerD-GFP e GerKB-mCherry, respectivamente. Embora a intensidade integrada da proteína do andaime GerD-GFP fosse diferente entre diferentes populações, a intensidade integrada do GerKB-mCherry era quase a mesma em diferentes populações.Quando o esporo tinha múltiplos focos, a intensidade máxima de fluorescência dos focos GerD-GFP e GerKB-mCherry tendia a diminuir, e a fluorescência máxima de todos os pontos brilhantes, considerados como os focos germinosos, era maior do que a auto-fluorescência máxima dos esporos PS4150. Notavelmente, manchas FM4-64 mais brilhantes semelhantes aos focos germinos aparecem em esporos PS4150 intactos e revestidos, sugerindo que esses pontos FM4-64 mais brilhantes podem estar envolvidos no agrupamento de proteínas germinosas na membrana interna. Adicionar esporos à ágarose e colocar agarose no quadro requer um movimento de fluido contínuo e cuidadoso para esses materiais minis.A conversão de imagens brutas 3D-SIM do germinosomo KGB80 em imagens pseudo-widefield e sua interpretação requer conhecimento especializado sobre biologia de esporos. Nosso procedimento estruturado de microscopia de iluminação pode ser aplicado à imagem de proteínas de baixa abundância ou repórteres de fluorescência fraca em diferentes bactérias ou outros materiais de banda. A organização do germinos pode agora ser estudada utilizando procedimentos de rotulagem dupla para avaliar a co-localização de proteínas de germinação bacilo e domínios específicos da membrana.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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Bioengenharia

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