Name: visualization of germinosomes and the inner membrane in bacillus subtilis spores
Uploaded: 2019-04-15T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores at JoVE.com

Авторы благодарят Christiaan Zeelenberg за его помощь во время визуализации SIM. JW признает Совет Китая стипендии PhD стипендии и спасибо Ирен Stellingwerf за ее помощь на начальном этапе обработки изображений.

1. б. subtillis заспорение (сроки: 7 дней до микроскопические наблюдения)
<ol><li>
1 день
	<ol>
<li>Полоска бактериальной культуры на пластине (1% Триптон, экстракт дрожжей 0,5%, 1% NaCl, 1% агар) агар бульоне Лурия Бертани (LB)13 и инкубировать на ночь при 37 ° C для получения единого кол...

<ol>
	<li>Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germination+of+spores+of+Bacillus+species:+what+we+know+and+do+not+know.">Germination of spores of Bacillus species: what we know and do not know.</a> Journal of Bacteriology. 196 (7), 1297-1305 (2014).</li><li>Setlow, P., Wang, S., Li, Y. -. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germination+of+spores+of+the+orders+Bacillales+and+Clostridiales.">Germination of spores of the orders Bacillales and Clostridiales.</a> Annual Review of Microbiology. 71 (1), (2017).</li><li>Vepachedu, V. R., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+interactions+between+nutrient+germinant+receptors+and+SpoVA+proteins+of+Bacillus+subtilis+spores.">Analysis of interactions between nutrient germinant receptors and SpoVA proteins of Bacillus subtilis spores.</a> FEMS Microbiology Letters. 274 (1), 42-47 (2007).</li><li>Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Summer+meeting+2013&#8211;when+the+sleepers+wake:+the+germination+of+spores+of+Bacillus+species.">Summer meeting 2013&#8211;when the sleepers wake: the germination of spores of Bacillus species.</a> Journal of Applied Microbiology. 115 (6), 1251-1268 (2013).</li><li>Cowan, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipids+in+the+inner+membrane+of+dormant+spores+of+Bacillus+species+are+largely+immobile.">Lipids in the inner membrane of dormant spores of Bacillus species are largely immobile.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (20), 7733-7738 (2004).</li><li>Loison, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+investigation+of+viscosity+of+an+atypical+inner+membrane+of+Bacillus+spores:+a+molecular+rotor/FLIM+study.">Direct investigation of viscosity of an atypical inner membrane of Bacillus spores: a molecular rotor/FLIM study.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1828 (11), 2436-2443 (2013).</li><li>Griffiths, K. K., Zhang, J., Cowan, A. E., Yu, J., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germination+proteins+in+the+inner+membrane+of+dormant+Bacillus+subtilis+spores+colocalize+in+a+discrete+cluster.">Germination proteins in the inner membrane of dormant Bacillus subtilis spores colocalize in a discrete cluster.</a> Molecular Microbiology. 81 (4), 1061-1077 (2011).</li><li>Troiano, A. J., Zhang, J., Cowan, A. E., Yu, J., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+dynamics+of+a+Bacillus+subtilis+spore+germination+protein+complex+during+spore+germination+and+outgrowth.">Analysis of the dynamics of a Bacillus subtilis spore germination protein complex during spore germination and outgrowth.</a> Journal of Bacteriology. 197 (2), 252-261 (2015).</li><li>Wegel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cellular+structures+in+super-resolution+with+SIM,+STED+and+Localisation+Microscopy:+A+practical+comparison.">Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison.</a> Scientific Reports. 6, 27290 (2016).</li><li>Pandey, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+imaging+of+germination+and+outgrowth+of+individual+Bacillus+subtilis+spores;+the+effect+of+heat+stress+quantitatively+analyzed+with+SporeTracker.">Live cell imaging of germination and outgrowth of individual Bacillus subtilis spores; the effect of heat stress quantitatively analyzed with SporeTracker.</a> PloS One. 8 (3), e58972 (2013).</li><li>Demmerle, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategic+and+practical+guidelines+for+successful+structured+illumination+microscopy.">Strategic and practical guidelines for successful structured illumination microscopy.</a> Nature Protocols. 12 (5), 988-1010 (2017).</li><li>Ball, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SIMcheck:+a+toolbox+for+successful+super-resolution+structured+illumination+microscopy.">SIMcheck: a toolbox for successful super-resolution structured illumination microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 15915 (2015).</li><li>Bertani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STUDIES+ON+LYSOGENESIS+I.:+The+Mode+of+Phage+Liberation+by+Lysogenic+Escherichia+coli1.">STUDIES ON LYSOGENESIS I.: The Mode of Phage Liberation by Lysogenic Escherichia coli1.</a> Journal of Bacteriology. 62 (3), 293 (1951).</li><li>Pandey, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+the+effect+of+specific+tea+compounds+on+germination+and+outgrowth+of+Bacillus+subtilis+spores+at+single+cell+resolution.">Quantitative analysis of the effect of specific tea compounds on germination and outgrowth of Bacillus subtilis spores at single cell resolution.</a> Food Microbiology. 45, 63-70 (2015).</li><li>Zheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacillus+subtilis+spore+inner+membrane+proteome.">Bacillus subtilis spore inner membrane proteome.</a> Journal of Proteome Research. 15 (2), 585-594 (2016).</li><li>Vepachedu, V. R., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+SpoVAD+to+the+inner+membrane+of+spores+of+Bacillus+subtilis.">Localization of SpoVAD to the inner membrane of spores of Bacillus subtilis.</a> Journal of Bacteriology. 187 (16), 5677-5682 (2005).</li><li>Schouten, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+dendritic+spines+of+rat+primary+hippocampal+neurons+using+structured+illumination+microscopy.">Imaging dendritic spines of rat primary hippocampal neurons using structured illumination microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), (2014).</li><li>Mukaka, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+appropriate+use+of+correlation+coefficient+in+medical+research.">A guide to appropriate use of correlation coefficient in medical research.</a> Malawi Medical Journal. 24 (3), 69-71 (2012).</li><li>Stewart, K. A., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Numbers+of+individual+nutrient+germinant+receptors+and+other+germination+proteins+in+spores+of+Bacillus+subtilis.">Numbers of individual nutrient germinant receptors and other germination proteins in spores of Bacillus subtilis.</a> Journal of Bacteriology. 195 (16), 3575-3582 (2013).</li><li>Laflamme, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+analysis+of+germinating+Bacillus+spores,+using+membrane+potential+dye.">Flow cytometry analysis of germinating Bacillus spores, using membrane potential dye.</a> Archives of Microbiology. 183 (2), 107-112 (2005).</li><li>Magge, A., Setlow, B., Cowan, A. E., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+dye+binding+by+and+membrane+potential+in+spores+of+Bacillus+species.">Analysis of dye binding by and membrane potential in spores of Bacillus species.</a> Journal of Applied Microbiology. 106 (3), 814-824 (2009).</li><li>Ghosh, S., Scotland, M., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Levels+of+germination+proteins+in+dormant+and+superdormant+spores+of+Bacillus+subtilis.">Levels of germination proteins in dormant and superdormant spores of Bacillus subtilis.</a> Journal of Bacteriology. 194 (9), 2221-2227 (2012).</li><li>Abhyankar, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+sporulation+conditions+on+the+spore+coat+protein+composition+of+Bacillus+subtilis+Spores.">The influence of sporulation conditions on the spore coat protein composition of Bacillus subtilis Spores.</a> Frontiers in microbiology. 7, 1636 (2016).</li><li>Rose, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+properties+of+Bacillus+subtilis+spores+made+in+liquid+or+on+agar+plates.">Comparison of the properties of Bacillus subtilis spores made in liquid or on agar plates.</a> Journal of Applied Microbiology. 103 (3), 691-699 (2007).</li><li>Stewart, K. A., Yi, X., Ghosh, S., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germination+protein+levels+and+rates+of+germination+of+spores+of+Bacillus+subtilis+with+overexpressed+or+deleted+genes+encoding+germination+proteins.">Germination protein levels and rates of germination of spores of Bacillus subtilis with overexpressed or deleted genes encoding germination proteins.</a> J Bacteriol. 194 (12), 3156-3164 (2012).</li><li>Ramirez-Peralta, A., Zhang, P., Li, Y. -. q., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+sporulation+conditions+on+the+germination+and+germination+protein+levels+of+Bacillus+subtilis+spores.">Effects of sporulation conditions on the germination and germination protein levels of Bacillus subtilis spores.</a> Applied and Environmental Microbiology. 78 (8), 2689-2697 (2012).</li><li>Laue, M., Han, H. -. M., Dittmann, C., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+membranes+of+bacterial+endospores+are+reservoirs+for+spore+core+membrane+expansion+during+spore+germination.">Intracellular membranes of bacterial endospores are reservoirs for spore core membrane expansion during spore germination.</a> Scientific Reports. 8, 11388 (2018).</li><li>Strahl, H., B&#252;rmann, F., Hamoen, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+actin+homologue+MreB+organizes+the+bacterial+cell+membrane.">The actin homologue MreB organizes the bacterial cell membrane.</a> Nature Communications. 5, (2014).</li><li>Strahl, H., Hamoen, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+potential+is+important+for+bacterial+cell+division.">Membrane potential is important for bacterial cell division.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (27), 12281-12286 (2010).</li><li>Swarge, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="One-Pot"+sample+processing+methodfor+proteome-wide+analysis+of+microbial+cells+and+spores.">"One-Pot" sample processing methodfor proteome-wide analysis of microbial cells and spores.</a> Proteomics Clinical Applications. (5), 1700169 (2018).</li></ol>

Представил протокол содержит стандартный 3D-SIM процедуры для анализа FM4-64 окрашенных B. subtilis споры, включающий заспорение, подготовка слайдов и визуализации процессов. Кроме того, протокол описывает изменение SIMcheck (ImageJ)-при содействии 3D визуализации процесса для SIM микроскопии B. subt...

Споры по приказу Bacillales и Clostridiales метаболически неактивных и чрезвычайно устойчивы к суровым обеззараживания режимов, но если они прорастают, не может вызывать вредное воздействие на людей1. В питательных germinant срабатывает прорастания спор Bacillus subtilis (B. subtilis) инициирование событий является germinant привязку к germinant рецепторы (гр), расположенные в споро внутренняя мембрана (IM). Впоследствии гр передают сигналы на белок канала SpoVA, также расположенный в IM. Это приводит к начала обмена споро ядро пиридин-2,6-дикарбоновых кислота (dipicolinic кислота; DPA; состоит из 20% споро основной сухой wt) для воды через SpoVA канал. Впоследствии ДПВ релиз триггеров активации коры мукопептида гидролиза, а дополнительные воды следует за2,3,4. Эти события приводят к механическим воздействиям на слои пальто, его последующие разрыв, начала нарост и, наконец, вегетативного роста. Однако по-прежнему далеки от разрешаются точные детали молекулярный процесс прорастания.
Основной вопрос о прорастания спор касается биофизических свойств липидов, окружающих IM всхожесть белков, а также белки IM SpoVA канала. Это во многом неподвижной IM липидного бислоя является основным проницаемость барьером для многих маленьких молекул, включая токсичные химические консерванты, некоторые из которых оказывают их действий в споро ядро или вегетативная клетка цитоплазме5,6. IM липидный бислой, вероятно, в состоянии геля, хотя значительная часть мобильных липидов в IM5. Споро IM также имеет потенциал для значительного расширения5. Таким образом, 1,6 раза увеличивает площадь поверхности им после прорастания без дополнительных мембраны синтеза и сопровождается потерей этой мембраны характерным низкая проницаемость и липидов неподвижность5,6.
В то время как молекулярные детали активации белков всхожесть и организация им липидов в споры являются привлекательные темы для исследования, небольшой размер спор B. subtilis и относительно низкой обилие всхожесть белков, представляют собой вызов микроскопические анализы. Гриффитс et al. неопровержимые доказательства эпифлуоресцентного микроскопа, с использованием флуоресцентных репортеров, сливается с прорастания белков, свидетельствует о том, что в спор B. subtilis эшафот белка Герд организует три подразделения GR (A, B и C) для Гера, B и K гр, в кластер7. Они придумал термин «germinosome» для этого кластера всхожесть белков и назвал ~ 300 Нм большой IM белка очагов8структур. После начала прорастания спор, флуоресцентный germinosome очагов в конечном итоге превращаются в большие разогнать флуоресцентные шаблоны, с > 75% населения споро, отображение этот шаблон в споры проросшие за 1 час с L-валин8. Обратите внимание, что упомянутые выше используется бумага среднем изображения из десятков последовательных флуоресцентных изображений, чтобы получить статистическую мощность и преодолеть барьер низкой флуоресцентные сигналов во время визуализации. Это мысленное представление этих структур в бактериальных спор был на краю того, что является технически осуществимым с классической микроскопических инструменты и ни оценки количества очагов в одном spore ни была их более подробные субцеллюлярные локализации возможно с этим подходом.
Здесь мы продемонстрировать использование структурированных освещения микроскопии (SIM) для получения подробной визуализации и количественной оценки germinosome(s) в спор B. subtilis, а также их IM липидных доменов9. Протокол также содержит инструкции для заспорение, слайд подготовки и анализа изображений, SIMcheck (v1.0, плагинов imageJ) а также ImageJ10,,1112.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Air dried glass slides</td>
			<td>Menzel Gl&#228;ser</td>
			<td>630-2870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APO TIRF N20R8 100&#215; oil objective (NA=1.49)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B. subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry cat, gerD-gfp kan)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B. subtilis PS4150 (PS832 &#916;gerE::spc, &#916;cotE::tet)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flasks 1 L</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z567868</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flasks 250 mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z723088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoSpheres carboxylate-modified microspheres</td>
			<td>Invitrogen, 0.1 &#956;m</td>
			<td>F8803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM4-64</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F34653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histodenz nonionic density gradient medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iXON3 DU-897 X-6515 CCD camera</td>
			<td>Andor Technology</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.net/Welcome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge tubes 1.5 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>3451PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope imaging software</td>
			<td>Nikon, Japan</td>
			<td>NIS-Element AR 4.51.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliQ Ultrapure Deminerilzed Water</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Milli-Q IQ 7003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Screw Cap Bottle 180 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75003800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Coverslips</td>
			<td>Paul Marienfeld</td>
			<td>117650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round Bottom tubes 15 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Nunc TM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap tubes 50 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Nunc TM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of germinosomes and the inner membrane in bacillus subtilis spores

Небольшой размер спор и относительно низкой обилие всхожесть белков, вызывают трудности в их микроскопического анализа с помощью эпифлуоресцентного. Супер-резолюции трехмерной структурированного освещения микроскопии (3D-SIM) является перспективным инструментом для преодолеть этот барьер и выявить молекулярные детали процесса прорастания спор Bacillus subtilis (B. subtilis). Здесь, мы описывают использование модифицированных SIMcheck (ImageJ)-помощник 3D визуализации процесса и флуоресцентные репортер белков для SIM микроскопии спор B. subtilis germinosomes, появление всходов белков. Мы также представляем (стандарт) 3D-SIM изображений процедура FM4-64 пятнать B. subtilis споро мембран. С помощью этих процедур, мы получили непревзойденное разрешение для germinosome локализации и показать, что > 80% B. subtilis KGB80 спящие споры, полученные после заспорение на определенный минимальный средний MOPS имеют один или два Герд-GFP и GerKB-mCherry очаги. Светлые очаги были также наблюдается в FM4-64 витражные изображения 3D-SIM споры, предполагая, что внутренняя мембрана липидов домены различных текучести вероятно существуют. Дальнейшие исследования, которые используют двойной маркировки процедур с мембраной красителей и germinosome репортер белки для оценки сотрудничества локализации и таким образом получить оптимальный обзор организации Bacillus всхожесть белков в мембраны внутренние споры возможно.

Текущий протокол представляет SIM Микроскоп изображений процедура для бактериальных спор. Процедуры подготовки заспорение и слайд были проведены, как показано на рисунке 1 до изображений. Позже, были применены процедуры обработки изображений и анализа...

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores at JoVE.com

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

Визуализация Germinosomes и внутренняя мембрана в спор Bacillus subtilis

Germinant рецептор белков кластера в «germinosomes» в внутренняя мембрана спор Bacillus subtilis . Мы описываем протокол, с помощью супер резолюции микроскопии и флуоресцентных белков репортер для визуализации germinosomes. Протокол также идентифицирует споро внутренняя мембрана доменов, которые преимущественно окрашенных краской мембраны FM4-64.

The small size of spores and the relatively low abundance of germination proteins, cause difficulties in their microscopic analyses using epifluorescence ...

Структурированная микроскопия освещения супер-разрешения, 3D-SIM, является инновационным методом визуализации флуоресцентных белков репортеров кластеров прорастающих рецепторов в споро-мембранах. Используя эти процедуры, непревзойденное разрешение зародышевой локализации и споры внутренней мембраны липидных областей могут быть достигнуты. Технику продемонстрируют аспирант Хуан Вэнь и магистр наук Раймонд Пасман из нашей лаборатории.Перед началом процедуры очистите высокоточные крышки одномололярной соляной кислотой в течение 30 минут в нежно трясущимся водяной бане, после чего две-пять минут промывают в ультрапурной воде типа 1. После второй стирки поместите крышки в 100%этанол в течение примерно трех минут до высыхания крышки и проверки их ясности. Затем, чистый стеклянный микроскоп слайды с 70% этанола в течение одной минуты, прежде чем позволить слайды высохнуть и проверки их ясности.Для флуоресцентной микросферы и споры изображения, первый предварительно теплый два слайда на 70-градусный блок отопления по Цельсию в течение нескольких секунд, прежде чем добавить 70-градусный по Цельсию, 65-микролитр капли стерилизованных 2%agarose на одном из слайдов. Поместите другой слайд на вершине, чтобы распространить агарозу между слайдами. Через пять минут снимите одну из горок и разрежьте высушенную агарозу на секцию один на один сантиметр.Добавьте один раз 10 к восьмой флуоресцентной микросфере или спорам в 0,4 микролитерах стерильной, ультрапурной воды типа 1 к агарозе и поместите высокоточную крышку на патч с помощью крышки, чтобы сдвинуть патч со слайда на поверхность крышки. Затем закрепим 65-микролитер 1,5 на 1,6-сантиметровый генный каркас на высушенную горку и поместите крышку на раму, закрыв все углы рамы. Для визуализации образцов поместите слайд на структурированный микроскоп освещения, оснащенный 100X масляной целью, и сосредоточьтесь на 100-нанометровых флуоресцентных микросферах.Отрегулируйте кольцо коррекции на цель 100x до тех пор, пока не будет получена симметричная функция распространения тока, чтобы свести к минимуму размытие изображений, и выберите поле зрения с приблизительно 10 круглыми флуоресцентными микросферами. Примените регулировку фокусировки решетки для обозначенных длин волн возбуждения, в данном случае 561 и 488 нанометров, в качестве руководства для программного обеспечения анализа изображений, прежде чем сосредоточиться на спорах со светом передачи. Захват светового изображения передачи в среднем режиме 16x с 20-миллисекундной экспозицией для каждого изображения.Затем захват 3D-структурированного освещения микроскопа сырые флуоресцентные изображения спор с режимом освещения 3D-SIM. Для реконструкции среза нажмите Param на структурированный лист вкладки осветительные площадки, чтобы открыть окно N-SIM Slice Reconstruction. Следуйте предложенным инструкциям, и нажмите на соответствующие элементы управления, чтобы установить контраст модуляции освещения к авто, подавление шума высокого разрешения до одного, и из фокуса подавления размытия до 0,05 в качестве отправной точки.Затем щелкните Reconstruct Slice, чтобы реконструировать изображение и оценить качество реконструированных изображений по быстрому преобразованию изображений и оценке реконструкции, которые отображаются после реконструкции. Отрегулируйте шум с высоким разрешением от 0,1 до 5, а подавление размытия фокуса - с 0,01 до 0,5 до получения наилучших параметров. Затем нажмите Применить применить изменения.Нажмите близко, чтобы закрыть окно. Откройте FM4-64 окрашенных PS4150 споры сырья изображения. Затем щелкните Reconstruct Slice, чтобы выполнить реконструкцию среза и сохранить реконструированное изображение.Для преобразования 3D-SIM сырые изображения КГБ80 geminosome в псевдо-широкое поле изображения, слева нажмите на ImageJ SIMcheck плагин и выберите сырье данных SI и Pseudo Widefield. Случайно выберите около 25 спор в каждом перевернутом изображении передачи для более позднего герминомического анализа в флуоресцентных псевдо-широких изображениях до тех пор, пока не будет выбрано около 350 спор. Затем используйте ImageJ для оценки максимальной интенсивности каждого флуоресцентного сигнала, выраженного каждой группой спор, и комплексной интенсивности каждого 3D-изображения спор.Для анализа псевдо-широкой полевых изображений germinosome KGB80, используйте среднее интегрированное значение интенсивности семи стеков в качестве интегрированной интенсивности сигнала споры KGB80. Затем определите интенсивность фона, изобразив фоновый штамм PS4150 с использованием одинаковых настроек, и посвястите флуоресцентные пятна в отдельных спорах КГБ80 зародышами, когда они четко различимы от фона. В этом репрезентативном эксперименте два очага флуоресцирования спор GerD-GFP появились в разных стеках с тремя общими очагами GerD-GFP, наблюдаемыми в композитном стеке No3.Здесь была замечена спора только с одним координационным центром GerD-GFP в спорах. В общей сложности от 40 до 50% спор имели два или один кластер GerD-GFP и GerKB-mCherry, соответственно. В то время как интегрированная интенсивность белка леса GerD-GFP отличалась между различными популяциями, интегрированная интенсивность GerKB-mCherry была примерно одинаковой в разных популяциях.Когда споры имели несколько очагов, максимальная интенсивность флуоресценции GerD-GFP и GerKB-mCherry foci, как правило, уменьшалась, а максимальная флуоресценция всех ярких пятен, считаются зародышевой foci, была выше, чем максимальная аутофлуоресценция спор PS4150. Примечательно, что более яркие пятна FM4-64, похожие на зародышевые очаги, появляются как в нетронутых, так и в декотированных спорах PS4150, что позволяет предположить, что эти яркие пятна FM4-64 могут быть вовлечены в кластеризацию зародышевых белков во внутренней мембране. Добавление спор в агарозу и размещение агарозы в раме требует непрерывного и тщательного движения жидкости для этих мини-материалов.Преобразование необработанных изображений 3D-SIM КГБ80 в псевдо-широкое поле изображения и их интерпретация требует экспертных знаний по биологии спор. Наша структурированная процедура микроскопии освещения может быть применена к изображению низких обильных белков или тусклых флуоресцентных репортеров в различных бактериях или других материалах полосы. Организация герминосомы теперь может быть изучена с помощью процедур двойной маркировки для оценки совместной локализации белков прорастания Bacillus и конкретных мембранных областей.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

Оптические карты потенциалов действия и кальция Переходные процессы в сердце мыши

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Визуализация Cortex организация и динамика у микроорганизмов, с помощью микроскопии полного внутреннего отражения флуоресценции

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

Мембрана-SPINE: Биохимический инструмента для выявления белок-белковых взаимодействий мембранных белков<em&gt; В Vivo</em

Membrane proteins are essential for cell viability and are therefore important therapeutic targets1-3. Since they function in complexes4, methods to ...

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

Количественная оценка глобальной диастолической функции по кинематическая Моделирование на основе анализа трансмитрального кровотока через Заполнение формализма Параметризованный диастолической

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Analysis of Tubular Membrane Networks in Cardiac Myocytes from Atria and Ventricles

Анализ трубчатой ​​мембраны сетей в кардиомиоциты от предсердий и желудочков

In cardiac myocytes a complex network of membrane tubules - the transverse-axial tubule system (TATS) - controls deep intracellular signaling functions. ...

Luminescence Resonance Energy Transfer to Study Conformational Changes in Membrane Proteins Expressed in Mammalian Cells

Свечение резонанс переноса энергии по изучению конформационных изменений мембранных белков выражается в клетках млекопитающих

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range ...

Three-Dimensionally Printed Microfluidic Cross-flow System for Ultrafiltration/Nanofiltration Membrane Performance Testing

Трехмерно Система Перекрестноточный Печатные Микрожидкостных для ультрафильтрации / нанофильтрации Тестирование производительности

Minimization and management of membrane fouling is a formidable challenge in diverse industrial processes and other practices that utilize membrane ...

Treatment of Ligament Constructs with Exercise-conditioned Serum: A Translational Tissue Engineering Model

Лечение связочных конструкций с помощью сыворотки, обусловленной упражнениями: модель трансляционной тканевой инженерии

In vitro experiments are essential to understand biological mechanisms; however, the gap between monolayer tissue culture and human physiology is large, ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

<em&gt; In Vitro</em&gt; Орган культуры Модель мышиной межпозвонкового диска

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

A Protocol for Decellularizing Mouse Cochleae for Inner Ear Tissue Engineering

Протокол для Decellularizing Cochleae мыши для внутреннего уха тканевая инженерия

In mammals, mechanosensory hair cells that facilitate hearing lack the ability to regenerate, which has limited treatments for hearing loss. Current ...