Name: visualization of germinosomes and the inner membrane in bacillus subtilis spores
Uploaded: 2019-04-15T13:00:00
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Los autores agradecen a Christiaan Zeelenberg por su ayuda durante la proyección de imagen de la SIM. JW reconoce al Consejo de becas de China para una beca predoctoral y gracias Irene Stellingwerf por su ayuda durante la etapa primaria de la proyección de imagen.

1. esporulación de B. subtillis (tiempo: 7 días antes de la observación microscópica)
<ol><li>
Día 1
	<ol>
<li>Raya un cultivo bacteriano en caldo de Luria-Bertani (LB) agar placa (1% triptona, extracto de levadura 0.5%, 1% NaCl, agar al 1%)13 e incubar durante una noche a 37 ° C para obtener las colonias individuales. Utilizar la cepa B. subtilis KGB80 (PS4150 Edwin gerKC gerKB mCherry gato, gerD-gfp kan) y su cepa parental de fondo PS4150 B...

<ol>
	<li>Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germination+of+spores+of+Bacillus+species:+what+we+know+and+do+not+know.">Germination of spores of Bacillus species: what we know and do not know.</a> Journal of Bacteriology. 196 (7), 1297-1305 (2014).</li><li>Setlow, P., Wang, S., Li, Y. -. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germination+of+spores+of+the+orders+Bacillales+and+Clostridiales.">Germination of spores of the orders Bacillales and Clostridiales.</a> Annual Review of Microbiology. 71 (1), (2017).</li><li>Vepachedu, V. R., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+interactions+between+nutrient+germinant+receptors+and+SpoVA+proteins+of+Bacillus+subtilis+spores.">Analysis of interactions between nutrient germinant receptors and SpoVA proteins of Bacillus subtilis spores.</a> FEMS Microbiology Letters. 274 (1), 42-47 (2007).</li><li>Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Summer+meeting+2013&#8211;when+the+sleepers+wake:+the+germination+of+spores+of+Bacillus+species.">Summer meeting 2013&#8211;when the sleepers wake: the germination of spores of Bacillus species.</a> Journal of Applied Microbiology. 115 (6), 1251-1268 (2013).</li><li>Cowan, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipids+in+the+inner+membrane+of+dormant+spores+of+Bacillus+species+are+largely+immobile.">Lipids in the inner membrane of dormant spores of Bacillus species are largely immobile.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (20), 7733-7738 (2004).</li><li>Loison, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+investigation+of+viscosity+of+an+atypical+inner+membrane+of+Bacillus+spores:+a+molecular+rotor/FLIM+study.">Direct investigation of viscosity of an atypical inner membrane of Bacillus spores: a molecular rotor/FLIM study.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1828 (11), 2436-2443 (2013).</li><li>Griffiths, K. K., Zhang, J., Cowan, A. E., Yu, J., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germination+proteins+in+the+inner+membrane+of+dormant+Bacillus+subtilis+spores+colocalize+in+a+discrete+cluster.">Germination proteins in the inner membrane of dormant Bacillus subtilis spores colocalize in a discrete cluster.</a> Molecular Microbiology. 81 (4), 1061-1077 (2011).</li><li>Troiano, A. J., Zhang, J., Cowan, A. E., Yu, J., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+dynamics+of+a+Bacillus+subtilis+spore+germination+protein+complex+during+spore+germination+and+outgrowth.">Analysis of the dynamics of a Bacillus subtilis spore germination protein complex during spore germination and outgrowth.</a> Journal of Bacteriology. 197 (2), 252-261 (2015).</li><li>Wegel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cellular+structures+in+super-resolution+with+SIM,+STED+and+Localisation+Microscopy:+A+practical+comparison.">Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison.</a> Scientific Reports. 6, 27290 (2016).</li><li>Pandey, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+imaging+of+germination+and+outgrowth+of+individual+Bacillus+subtilis+spores;+the+effect+of+heat+stress+quantitatively+analyzed+with+SporeTracker.">Live cell imaging of germination and outgrowth of individual Bacillus subtilis spores; the effect of heat stress quantitatively analyzed with SporeTracker.</a> PloS One. 8 (3), e58972 (2013).</li><li>Demmerle, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategic+and+practical+guidelines+for+successful+structured+illumination+microscopy.">Strategic and practical guidelines for successful structured illumination microscopy.</a> Nature Protocols. 12 (5), 988-1010 (2017).</li><li>Ball, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SIMcheck:+a+toolbox+for+successful+super-resolution+structured+illumination+microscopy.">SIMcheck: a toolbox for successful super-resolution structured illumination microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 15915 (2015).</li><li>Bertani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STUDIES+ON+LYSOGENESIS+I.:+The+Mode+of+Phage+Liberation+by+Lysogenic+Escherichia+coli1.">STUDIES ON LYSOGENESIS I.: The Mode of Phage Liberation by Lysogenic Escherichia coli1.</a> Journal of Bacteriology. 62 (3), 293 (1951).</li><li>Pandey, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+the+effect+of+specific+tea+compounds+on+germination+and+outgrowth+of+Bacillus+subtilis+spores+at+single+cell+resolution.">Quantitative analysis of the effect of specific tea compounds on germination and outgrowth of Bacillus subtilis spores at single cell resolution.</a> Food Microbiology. 45, 63-70 (2015).</li><li>Zheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacillus+subtilis+spore+inner+membrane+proteome.">Bacillus subtilis spore inner membrane proteome.</a> Journal of Proteome Research. 15 (2), 585-594 (2016).</li><li>Vepachedu, V. R., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+SpoVAD+to+the+inner+membrane+of+spores+of+Bacillus+subtilis.">Localization of SpoVAD to the inner membrane of spores of Bacillus subtilis.</a> Journal of Bacteriology. 187 (16), 5677-5682 (2005).</li><li>Schouten, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+dendritic+spines+of+rat+primary+hippocampal+neurons+using+structured+illumination+microscopy.">Imaging dendritic spines of rat primary hippocampal neurons using structured illumination microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), (2014).</li><li>Mukaka, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+appropriate+use+of+correlation+coefficient+in+medical+research.">A guide to appropriate use of correlation coefficient in medical research.</a> Malawi Medical Journal. 24 (3), 69-71 (2012).</li><li>Stewart, K. A., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Numbers+of+individual+nutrient+germinant+receptors+and+other+germination+proteins+in+spores+of+Bacillus+subtilis.">Numbers of individual nutrient germinant receptors and other germination proteins in spores of Bacillus subtilis.</a> Journal of Bacteriology. 195 (16), 3575-3582 (2013).</li><li>Laflamme, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+analysis+of+germinating+Bacillus+spores,+using+membrane+potential+dye.">Flow cytometry analysis of germinating Bacillus spores, using membrane potential dye.</a> Archives of Microbiology. 183 (2), 107-112 (2005).</li><li>Magge, A., Setlow, B., Cowan, A. E., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+dye+binding+by+and+membrane+potential+in+spores+of+Bacillus+species.">Analysis of dye binding by and membrane potential in spores of Bacillus species.</a> Journal of Applied Microbiology. 106 (3), 814-824 (2009).</li><li>Ghosh, S., Scotland, M., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Levels+of+germination+proteins+in+dormant+and+superdormant+spores+of+Bacillus+subtilis.">Levels of germination proteins in dormant and superdormant spores of Bacillus subtilis.</a> Journal of Bacteriology. 194 (9), 2221-2227 (2012).</li><li>Abhyankar, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+sporulation+conditions+on+the+spore+coat+protein+composition+of+Bacillus+subtilis+Spores.">The influence of sporulation conditions on the spore coat protein composition of Bacillus subtilis Spores.</a> Frontiers in microbiology. 7, 1636 (2016).</li><li>Rose, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+properties+of+Bacillus+subtilis+spores+made+in+liquid+or+on+agar+plates.">Comparison of the properties of Bacillus subtilis spores made in liquid or on agar plates.</a> Journal of Applied Microbiology. 103 (3), 691-699 (2007).</li><li>Stewart, K. A., Yi, X., Ghosh, S., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germination+protein+levels+and+rates+of+germination+of+spores+of+Bacillus+subtilis+with+overexpressed+or+deleted+genes+encoding+germination+proteins.">Germination protein levels and rates of germination of spores of Bacillus subtilis with overexpressed or deleted genes encoding germination proteins.</a> J Bacteriol. 194 (12), 3156-3164 (2012).</li><li>Ramirez-Peralta, A., Zhang, P., Li, Y. -. q., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+sporulation+conditions+on+the+germination+and+germination+protein+levels+of+Bacillus+subtilis+spores.">Effects of sporulation conditions on the germination and germination protein levels of Bacillus subtilis spores.</a> Applied and Environmental Microbiology. 78 (8), 2689-2697 (2012).</li><li>Laue, M., Han, H. -. M., Dittmann, C., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+membranes+of+bacterial+endospores+are+reservoirs+for+spore+core+membrane+expansion+during+spore+germination.">Intracellular membranes of bacterial endospores are reservoirs for spore core membrane expansion during spore germination.</a> Scientific Reports. 8, 11388 (2018).</li><li>Strahl, H., B&#252;rmann, F., Hamoen, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+actin+homologue+MreB+organizes+the+bacterial+cell+membrane.">The actin homologue MreB organizes the bacterial cell membrane.</a> Nature Communications. 5, (2014).</li><li>Strahl, H., Hamoen, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+potential+is+important+for+bacterial+cell+division.">Membrane potential is important for bacterial cell division.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (27), 12281-12286 (2010).</li><li>Swarge, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="One-Pot"+sample+processing+methodfor+proteome-wide+analysis+of+microbial+cells+and+spores.">"One-Pot" sample processing methodfor proteome-wide analysis of microbial cells and spores.</a> Proteomics Clinical Applications. (5), 1700169 (2018).</li></ol>

El protocolo presentado contiene un procedimiento estándar 3D-SIM para el análisis de FM4-64 tinción de esporas B. subtilis que incluye esporulación, preparación de los portaobjetos y procesos de la proyección de imagen. Además, el protocolo describe un SIMcheck modificado (ImageJ)-asistido 3D imaging proceso para microscopía SIM de germinosomes de esporas B. subtilis con reporteros fluorescentes. El último procedimiento nos ha permitido observar esta estructura tenue con contraste. Por acoplam...

Esporas de orden Bacillales y Clostridiales son metabólicamente inactivos y extraordinariamente resistente a los regímenes de descontaminación áspero, pero a menos que germinan, no pueden causar efectos nocivos en los seres humanos1. En la germinación activada germinant nutrientes de esporas de Bacillus subtilis (B. subtilis), el evento de iniciación es germinant Unión a los receptores germinant (GRs) situado en la membrana interna de la espora (IM). Posteriormente, el GRs transducen señales a la proteína de canal de SpoVA en el IM. Esto se traduce en el inicio del intercambio de esporas núcleo piridina-2, 6-dicarboxílico (ácido dipicolinic; DPA; comprende el 20% del peso seco de la base de espora) de agua a través del canal de SpoVA. Posteriormente, el lanzamiento DPA desencadena la activación de la hidrólisis del peptidoglicano de la corteza, y absorción de agua sigue2,3,4. Estos eventos conducen a esfuerzos mecánicos en las capas de la capa, su posterior ruptura, la aparición de la consecuencia y, finalmente, crecimiento vegetativo. Sin embargo, todavía lejos de se resuelven los detalles moleculares exactos del proceso de germinación.
Una cuestión importante sobre la germinación de esporas refiere a las propiedades biofísicas de los lípidos que rodean las proteínas de germinación IM así como las proteínas de canal de IM SpoVA. Esta bicapa de lipídica en gran parte inmóvil de IM es la barrera principal de la permeabilidad de muchas moléculas pequeñas, incluyendo conservantes químicos tóxicos, algunas de las cuales ejercen su acción en el núcleo de la espora o célula vegetativa citoplasma5,6. La bicapa lipídica IM es probable que en un estado de gel, aunque existe una fracción significativa de lípidos móviles en IM5. IM de la espora también tiene el potencial para una expansión significativa5. Así, aumenta la superficie de la IM 1.6-fold sobre germinación sin síntesis de membrana adicional y se acompaña de la pérdida de la membrana característica baja permeabilidad y lípidos inmovilidad5,6.
Mientras que los detalles moleculares de la activación de las proteínas de la germinación y organización de los lípidos de la IM en las esporas son atractivos temas de estudio, el pequeño tamaño de las esporas B. subtilis y la relativamente baja abundancia de proteínas de la germinación, plantean un desafío análisis microscópico. Griffiths et al. convincente evidencia de microscopio de epifluorescencia, utilizando reporteros fluorescentes fusionados a proteínas de la germinación, sugiere que en las esporas B. subtilis la proteína GerD organiza tres subunidades GR (A, B y C) de GerA, B y K GRs, en un cluster de7. Acuñó el término 'germinosome' para este grupo de proteínas de germinación y describe las estructuras como ~ 300 nm gran IM proteína focos8. Sobre la iniciación de la germinación de la espora, germinosome fluorescente focos en última instancia, cambian en mayor dispersar patrones fluorescentes, con > 75% de la población de esporas viendo este patrón en las esporas germinadas durante 1 h con L-valina8. Tenga en cuenta que el documento mencionado anteriormente usado promedio imágenes de docenas de imágenes fluorescentes consecutivos, para ganar potencia estadística y superar el obstáculo de baja señales fluorescentes observadas durante la proyección de imagen. Esta visualización de estas estructuras en esporas bacterianas estaba en el borde de lo que es técnicamente factible con herramientas microscópicas clásicas y ni una evaluación de la cantidad de focos en una sola espora ni su localización subcelular más detallada fue posible con este enfoque.
Aquí, demostramos que el uso de microscopía de iluminación estructurada (SIM) para obtener una visualización detallada y cuantificación de la germinosome(s) de las esporas de B. subtilis, así como de sus IM lípidos dominios9. El protocolo también contiene instrucciones para la esporulación, preparación de los portaobjetos y análisis de imagen por SIMcheck (v1.0, un plugin de imageJ) así como ImageJ10,11,12.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Air dried glass slides</td>
			<td>Menzel Gl&#228;ser</td>
			<td>630-2870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APO TIRF N20R8 100&#215; oil objective (NA=1.49)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B. subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry cat, gerD-gfp kan)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B. subtilis PS4150 (PS832 &#916;gerE::spc, &#916;cotE::tet)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flasks 1 L</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z567868</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flasks 250 mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z723088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoSpheres carboxylate-modified microspheres</td>
			<td>Invitrogen, 0.1 &#956;m</td>
			<td>F8803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM4-64</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F34653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histodenz nonionic density gradient medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iXON3 DU-897 X-6515 CCD camera</td>
			<td>Andor Technology</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.net/Welcome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge tubes 1.5 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>3451PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope imaging software</td>
			<td>Nikon, Japan</td>
			<td>NIS-Element AR 4.51.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliQ Ultrapure Deminerilzed Water</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Milli-Q IQ 7003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Screw Cap Bottle 180 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75003800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Coverslips</td>
			<td>Paul Marienfeld</td>
			<td>117650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round Bottom tubes 15 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Nunc TM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap tubes 50 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Nunc TM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of germinosomes and the inner membrane in bacillus subtilis spores

El pequeño tamaño de las esporas y la relativamente baja abundancia de proteínas de la germinación, causar dificultades en sus análisis microscópicos mediante microscopía de epifluorescencia. Microscopía de iluminación estructurada tridimensional súper resolución (3D-SIM) es una herramienta prometedora para superar este obstáculo y revelar los detalles moleculares del proceso de germinación de las esporas de Bacillus subtilis (B. subtilis). Aquí, describimos el uso de un SIMcheck modificado (ImageJ)-proceso de proyección de imagen 3D asistente y reportero fluorescente proteínas para microscopía SIM de germinosomes de esporas B. subtilis , clusters de las proteínas de la germinación. También presentamos un procedimiento de proyección de imagen 3D-SIM (estándar) para FM4-64 tinción de membranas de esporas B. subtilis . Mediante el uso de estos procedimientos, obtuvo una resolución para la localización de germinosome y demostrar que > 80% de B. subtilis KGB80 esporas latentes obtenidas después de la esporulación en el medio mínimo definido de MOPS tienen uno o dos GerD-GFP y GerKB-mCherry focos. Focos brillantes fueron también observados en FM4-64 manchados imágenes de 3D-SIM de esporas sugiriendo que existen dominios de lípidos de membrana interna probablemente diferentes fluidez. Otros estudios que utilizan doble etiquetado procedimientos con tintes de membrana y germinosome proteínas de reportero para evaluar la localización y así obtener un panorama óptimo de la organización de proteínas de bacilo germinación en la membrana interna de la espora son posible.

El protocolo actual presenta un procedimiento proyección de imagen del microscopio de la SIM para esporas bacterianas. Los procedimientos de preparación de esporulación y diapositiva se llevaron a cabo como se muestra en la figura 1 antes de la proyección de imagen. Más tarde, se aplicaron los procedimientos de análisis y proyección de imagen de ambos para dim (proteína fluorescente etiquetada proteínas de germinación) y brillante espora (sonda lipo...

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Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

Visualización de Germinosomes y la membrana interna de las esporas de Bacillus subtilis

Grupo de proteínas de receptor germinant en 'germinosomes' en la membrana interna de las esporas de Bacillus subtilis . Se describe un protocolo utilizando proteínas de super resolución microscopia y fluorescente reportera para visualizar germinosomes. El protocolo también identifica dominios de membrana interna de la espora que preferentemente se tiñen con el colorante de membrana FM4-64.

The small size of spores and the relatively low abundance of germination proteins, cause difficulties in their microscopic analyses using epifluorescence ...

La microscopía de iluminación estructurada de superresoría, 3D-SIM, es una técnica innovadora para la visualización de proteínas fluorescentes reporteras de los clusters receptores de germinación en membranas esporas. Usando estos procedimientos, se puede lograr una resolución insuperable de la localización del germos y los dominios lipídicos de la membrana interna de las esporas. La técnica será demostrada por el estudiante de doctorado Juan Wen y el estudiante de Maestría en Ciencias Raymond Pasman de nuestro laboratorio.Antes de comenzar el procedimiento, limpie los cubreobjetos de alta precisión con ácido clorhídrico de un molar durante 30 minutos en un baño de agua que agita suavemente, seguido de dos lavados de cinco minutos en agua ultrapura Tipo 1. Después del segundo lavado, coloque los cubreobjetos en 100% etanol durante unos tres minutos antes de secar los cubreobjetos y verificar su claridad. Luego, limpie los portaobjetos de vidrio con 70%etanol durante un minuto antes de permitir que las diapositivas se sequen y verificar su claridad.Para la microesfera fluorescente y la imagen de esporas, primero precalenta dos diapositivas en un bloque de calentamiento Celsius de 70 grados durante unos segundos antes de agregar una gota de 70 grados Celsius, 65 microlitr de 2% de ágarrose esterilizada en uno de los portaobjetos. Coloque la otra diapositiva en la parte superior para extender la agarosa entre las diapositivas. Después de cinco minutos, retire uno de los portaobjetos y corte la agarosa seca en una sección de uno por uno centímetro.Agregue una vez 10 a las octavas microesferas o esporas fluorescentes en 0,4 microlitros de agua estéril de tipo 1 ultrapura a la agarosa, y coloque un cubreobjetos de alta precisión sobre el parche utilizando el cubreobjetos para deslizar el parche fuera de la corredera sobre la superficie de la cubierta. A continuación, fije un marco genenador de 65 microlitro, 1,5 por 1,6 centímetros en un portaobjetos seco, y coloque el cubreobjetos en el marco, cerrando todas las esquinas del marco. Para obtener imágenes de las muestras, coloque la diapositiva en un microscopio de iluminación estructurado equipado con un objetivo de aceite 100X y concéntrese en las microesferas fluorescentes de 100 nanómetros.Ajuste el anillo de corrección en el objetivo 100x hasta obtener una función de propagación de punto simétrico para minimizar el desenfoque de las imágenes y seleccione un campo de visión con aproximadamente 10 microesferas fluorescentes redondas. Aplique un ajuste de enfoque de rejilla para las longitudes de onda de excitación designadas, en este caso, 561 y 488 nanómetros, como guía para el software de análisis de imágenes antes de centrarse en las esporas con la luz de transmisión. Capture una imagen de luz de transmisión en el modo promedio de 16x con exposiciones de 20 milisegundos para cada imagen.A continuación, capture imágenes fluorescentes crudas del microscopio de iluminación estructurada en 3D de las esporas con el modo de iluminación 3D-SIM. Para la reconstrucción de sectores, haga clic en Param en la hoja de pestañas del panel de iluminación estructurado para abrir la ventana Reconstrucción de sectores N-SIM. Siga las instrucciones sugeridas y haga clic en los controles adecuados para establecer el contraste de modulación de iluminación en automático, la supresión de ruido de alta resolución en uno y la supresión de desenfoque fuera del enfoque a 0,05 como puntos de partida.A continuación, haga clic en Reconstruir sector para reconstruir la imagen y evaluar la calidad de las imágenes reconstruidas mediante las imágenes transformadas rápidamente por Fourier y la puntuación de reconstrucción que se muestran después de la reconstrucción. Ajuste el ruido de alta resolución de 0,1 a cinco y la supresión de desenfoque fuera del enfoque de 0,01 a 0,5 hasta obtener los mejores ajustes de parámetros. A continuación, haga clic en Aplicar para aplicar los cambios.Haga clic en Cerrar para cerrar la ventana. Abre una imagen RAW de PS4150 esporas de PS4-64 manchada FM4-64. A continuación, haga clic en Reconstruir sector para ejecutar la reconstrucción del sector y guarde la imagen reconstruida.Para convertir las imágenes sin procesar 3D-SIM del geminosoma KGB80 en imágenes pseudo-widefield, haga clic izquierdo en el plugin ImageJ SIMcheck y seleccione RAW Data SI y Pseudo Widefield. Seleccione aleatoriamente unas 25 esporas en cada imagen de transmisión invertida para un análisis de germinosomas posteriores en las imágenes fluorescentes de pseudo-ancho hasta que se hayan seleccionado aproximadamente 350 esporas. A continuación, utilice ImageJ para evaluar la intensidad máxima de cada señal fluorescente expresada por cada grupo de esporas y la intensidad integrada de cada imagen de espora 3D.Para analizar las imágenes de pseudo-widefield del germinosoma KGB80, utilice el valor de intensidad integrado medio de siete pilas como la intensidad de señal integrada de la espora KGB80. A continuación, determinar las intensidades de fondo mediante la toma de imágenes de la cepa de fondo PS4150 utilizando ajustes idénticos, y considerar los puntos fluorescentes en las esporas individuales de KGB80 como focos de germosomas cuando son claramente distinguibles del fondo. En este experimento representativo, dos focos de las esporas fluoreste GerD-GFP aparecieron en diferentes pilas con tres focos totales de GerD-GFP observados en la pila com componetiva Z3.Aquí, se observó una espora con un solo punto focal de GerD-GFP en la espora. En total, alrededor del 40 al 50% de las esporas tenían dos o un cluster De GerD-GFP y GerKB-mCherry, respectivamente. Si bien la intensidad integrada de la proteína de andamio GerD-GFP era diferente entre las diferentes poblaciones, la intensidad integrada de GerKB-mCherry era aproximadamente la misma en diferentes poblaciones.Cuando la espora tenía múltiples focos, la intensidad máxima de fluorescencia de los focos de GerD-GFP y GerKB-mCherry tendía a disminuir, y la fluorescencia máxima de todos los puntos brillantes, considerados como los focos de germinosoma, era mayor que la autofluorescencia máxima de las esporas PS4150. En particular, las manchas FM4-64 más brillantes similares a los focos de germosoma aparecen en las esporas de PS4150 intactas y despofiadas, lo que sugiere que estas manchas FM4-64 más brillantes podrían estar involucradas en la agrupación de proteínas germosomas en la membrana interna. Añadir esporas a la agarosa y colocar la agarosa en el marco requiere un movimiento fluido continuo y cuidadoso para estos materiales minis.La conversión de imágenes crudas 3D-SIM del germinos de la KGB80 en imágenes pseudo-widefield y su interpretación requiere conocimientos expertos sobre biología de esporas. Nuestro procedimiento de microscopía de iluminación estructurada se puede aplicar a la imagen de proteínas de baja abundancia o reporteros de fluorescencia tenue en diferentes bacterias u otros materiales de banda. La organización del germinosoma ahora se puede estudiar utilizando procedimientos de etiquetado doble para evaluar la co-localización de proteínas de germinación de Bacillus y dominios de membrana específicos.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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Investigación

Bioingeniería

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