Name: visualization of germinosomes and the inner membrane in bacillus subtilis spores
Uploaded: 2019-04-15T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores at JoVE.com

Författarna vill tacka Christiaan Zeelenberg för hans hjälp under SIM-bildtagning. JW erkänner Kina stipendium rådet för ett PhD stipendium och tack Irene Stellingwerf för hennes hjälp under den primära fasen av imaging.

1. B. subtillis sporulering (Timing: 7 dagar före mikroskopisk Observation)
<ol><li>
Dag 1
	<ol>
<li>Streak en bakterieodling på en Luria-Bertani buljong (LB) agar plattan (1% trypton, 0,5% jästextrakt, 1% NaCl, 1% agar)13 och inkubera över natten vid 37 ° C att få enstaka kolonier. Använd den B. subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry katt, gerD-gfp kan) stammen och dess överordnade bakgrund stam B. subtilis PS4150 (PS832...

<ol>
	<li>Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germination+of+spores+of+Bacillus+species:+what+we+know+and+do+not+know.">Germination of spores of Bacillus species: what we know and do not know.</a> Journal of Bacteriology. 196 (7), 1297-1305 (2014).</li><li>Setlow, P., Wang, S., Li, Y. -. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germination+of+spores+of+the+orders+Bacillales+and+Clostridiales.">Germination of spores of the orders Bacillales and Clostridiales.</a> Annual Review of Microbiology. 71 (1), (2017).</li><li>Vepachedu, V. R., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+interactions+between+nutrient+germinant+receptors+and+SpoVA+proteins+of+Bacillus+subtilis+spores.">Analysis of interactions between nutrient germinant receptors and SpoVA proteins of Bacillus subtilis spores.</a> FEMS Microbiology Letters. 274 (1), 42-47 (2007).</li><li>Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Summer+meeting+2013&#8211;when+the+sleepers+wake:+the+germination+of+spores+of+Bacillus+species.">Summer meeting 2013&#8211;when the sleepers wake: the germination of spores of Bacillus species.</a> Journal of Applied Microbiology. 115 (6), 1251-1268 (2013).</li><li>Cowan, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipids+in+the+inner+membrane+of+dormant+spores+of+Bacillus+species+are+largely+immobile.">Lipids in the inner membrane of dormant spores of Bacillus species are largely immobile.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (20), 7733-7738 (2004).</li><li>Loison, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+investigation+of+viscosity+of+an+atypical+inner+membrane+of+Bacillus+spores:+a+molecular+rotor/FLIM+study.">Direct investigation of viscosity of an atypical inner membrane of Bacillus spores: a molecular rotor/FLIM study.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1828 (11), 2436-2443 (2013).</li><li>Griffiths, K. K., Zhang, J., Cowan, A. E., Yu, J., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germination+proteins+in+the+inner+membrane+of+dormant+Bacillus+subtilis+spores+colocalize+in+a+discrete+cluster.">Germination proteins in the inner membrane of dormant Bacillus subtilis spores colocalize in a discrete cluster.</a> Molecular Microbiology. 81 (4), 1061-1077 (2011).</li><li>Troiano, A. J., Zhang, J., Cowan, A. E., Yu, J., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+dynamics+of+a+Bacillus+subtilis+spore+germination+protein+complex+during+spore+germination+and+outgrowth.">Analysis of the dynamics of a Bacillus subtilis spore germination protein complex during spore germination and outgrowth.</a> Journal of Bacteriology. 197 (2), 252-261 (2015).</li><li>Wegel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cellular+structures+in+super-resolution+with+SIM,+STED+and+Localisation+Microscopy:+A+practical+comparison.">Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison.</a> Scientific Reports. 6, 27290 (2016).</li><li>Pandey, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+imaging+of+germination+and+outgrowth+of+individual+Bacillus+subtilis+spores;+the+effect+of+heat+stress+quantitatively+analyzed+with+SporeTracker.">Live cell imaging of germination and outgrowth of individual Bacillus subtilis spores; the effect of heat stress quantitatively analyzed with SporeTracker.</a> PloS One. 8 (3), e58972 (2013).</li><li>Demmerle, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategic+and+practical+guidelines+for+successful+structured+illumination+microscopy.">Strategic and practical guidelines for successful structured illumination microscopy.</a> Nature Protocols. 12 (5), 988-1010 (2017).</li><li>Ball, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SIMcheck:+a+toolbox+for+successful+super-resolution+structured+illumination+microscopy.">SIMcheck: a toolbox for successful super-resolution structured illumination microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 15915 (2015).</li><li>Bertani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STUDIES+ON+LYSOGENESIS+I.:+The+Mode+of+Phage+Liberation+by+Lysogenic+Escherichia+coli1.">STUDIES ON LYSOGENESIS I.: The Mode of Phage Liberation by Lysogenic Escherichia coli1.</a> Journal of Bacteriology. 62 (3), 293 (1951).</li><li>Pandey, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+the+effect+of+specific+tea+compounds+on+germination+and+outgrowth+of+Bacillus+subtilis+spores+at+single+cell+resolution.">Quantitative analysis of the effect of specific tea compounds on germination and outgrowth of Bacillus subtilis spores at single cell resolution.</a> Food Microbiology. 45, 63-70 (2015).</li><li>Zheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacillus+subtilis+spore+inner+membrane+proteome.">Bacillus subtilis spore inner membrane proteome.</a> Journal of Proteome Research. 15 (2), 585-594 (2016).</li><li>Vepachedu, V. R., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+SpoVAD+to+the+inner+membrane+of+spores+of+Bacillus+subtilis.">Localization of SpoVAD to the inner membrane of spores of Bacillus subtilis.</a> Journal of Bacteriology. 187 (16), 5677-5682 (2005).</li><li>Schouten, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+dendritic+spines+of+rat+primary+hippocampal+neurons+using+structured+illumination+microscopy.">Imaging dendritic spines of rat primary hippocampal neurons using structured illumination microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), (2014).</li><li>Mukaka, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+appropriate+use+of+correlation+coefficient+in+medical+research.">A guide to appropriate use of correlation coefficient in medical research.</a> Malawi Medical Journal. 24 (3), 69-71 (2012).</li><li>Stewart, K. A., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Numbers+of+individual+nutrient+germinant+receptors+and+other+germination+proteins+in+spores+of+Bacillus+subtilis.">Numbers of individual nutrient germinant receptors and other germination proteins in spores of Bacillus subtilis.</a> Journal of Bacteriology. 195 (16), 3575-3582 (2013).</li><li>Laflamme, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+analysis+of+germinating+Bacillus+spores,+using+membrane+potential+dye.">Flow cytometry analysis of germinating Bacillus spores, using membrane potential dye.</a> Archives of Microbiology. 183 (2), 107-112 (2005).</li><li>Magge, A., Setlow, B., Cowan, A. E., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+dye+binding+by+and+membrane+potential+in+spores+of+Bacillus+species.">Analysis of dye binding by and membrane potential in spores of Bacillus species.</a> Journal of Applied Microbiology. 106 (3), 814-824 (2009).</li><li>Ghosh, S., Scotland, M., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Levels+of+germination+proteins+in+dormant+and+superdormant+spores+of+Bacillus+subtilis.">Levels of germination proteins in dormant and superdormant spores of Bacillus subtilis.</a> Journal of Bacteriology. 194 (9), 2221-2227 (2012).</li><li>Abhyankar, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+sporulation+conditions+on+the+spore+coat+protein+composition+of+Bacillus+subtilis+Spores.">The influence of sporulation conditions on the spore coat protein composition of Bacillus subtilis Spores.</a> Frontiers in microbiology. 7, 1636 (2016).</li><li>Rose, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+properties+of+Bacillus+subtilis+spores+made+in+liquid+or+on+agar+plates.">Comparison of the properties of Bacillus subtilis spores made in liquid or on agar plates.</a> Journal of Applied Microbiology. 103 (3), 691-699 (2007).</li><li>Stewart, K. A., Yi, X., Ghosh, S., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germination+protein+levels+and+rates+of+germination+of+spores+of+Bacillus+subtilis+with+overexpressed+or+deleted+genes+encoding+germination+proteins.">Germination protein levels and rates of germination of spores of Bacillus subtilis with overexpressed or deleted genes encoding germination proteins.</a> J Bacteriol. 194 (12), 3156-3164 (2012).</li><li>Ramirez-Peralta, A., Zhang, P., Li, Y. -. q., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+sporulation+conditions+on+the+germination+and+germination+protein+levels+of+Bacillus+subtilis+spores.">Effects of sporulation conditions on the germination and germination protein levels of Bacillus subtilis spores.</a> Applied and Environmental Microbiology. 78 (8), 2689-2697 (2012).</li><li>Laue, M., Han, H. -. M., Dittmann, C., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+membranes+of+bacterial+endospores+are+reservoirs+for+spore+core+membrane+expansion+during+spore+germination.">Intracellular membranes of bacterial endospores are reservoirs for spore core membrane expansion during spore germination.</a> Scientific Reports. 8, 11388 (2018).</li><li>Strahl, H., B&#252;rmann, F., Hamoen, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+actin+homologue+MreB+organizes+the+bacterial+cell+membrane.">The actin homologue MreB organizes the bacterial cell membrane.</a> Nature Communications. 5, (2014).</li><li>Strahl, H., Hamoen, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+potential+is+important+for+bacterial+cell+division.">Membrane potential is important for bacterial cell division.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (27), 12281-12286 (2010).</li><li>Swarge, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="One-Pot"+sample+processing+methodfor+proteome-wide+analysis+of+microbial+cells+and+spores.">"One-Pot" sample processing methodfor proteome-wide analysis of microbial cells and spores.</a> Proteomics Clinical Applications. (5), 1700169 (2018).</li></ol>

Protokollet presenteras innehåller en standard 3D-SIM procedur för analys av FM4-64 målat B. subtilis sporer som innehåller sporulering, bild förberedelse och imaging processer. Protokollet beskrivs dessutom en modifierad SIMcheck (ImageJ)-assisted 3D imaging process för SIM-mikroskopi av B. subtilis spore germinosomes märkt med fluorescerande reportrar. Det sistnämnda förfarandet tillät oss att iaktta denna dim underkonstruktionen med förbättrad kontrast. Genom koppling två imaging förfar...

Sporer av order Bakteriologistubbar och Clostridiales är metaboliskt vilande och utomordentligt motståndskraftig mot hård sanering regimer, men om de gror, får inte orsaka skadliga effekter i människor1. I näringsrika germinant utlösta groning av Bacillus subtilis (B. subtilis) sporer är den inledande händelsen germinant bindning till germinant receptorer (GRs) ligger i Spors inre membranet (IM). Därefter transduce GRs signaler till SpoVA kanal proteinet också ligger i IM. Detta resulterar i uppkomsten av utbyte av spore core pyridin-2,6-dicarboxylic syra (dipicolinic syra; DPA; bestående av 20% av spore core torr wt) för vatten via SpoVA kanal. Därefter DPA utgivningen utlöser aktivering av cortex peptidoglykan hydrolys, och ytterligare vattenupptaget följer2,3,4. Dessa händelser leder till mekanisk stress på coat lager, dess efterföljande bristning, uppkomsten av utväxt och slutligen vegetativ tillväxt. De exakta molekylära detaljerna grobarhet processen löses dock fortfarande långt ifrån.
En viktig fråga om sporgroning angår de lipider som omger IM grobarhet proteinerna liksom IM SpoVA kanal proteinerna biofysiska egenskaper. Detta till stor del orörliga IM lipid lipidens är den huvudsakliga permeabilitet barriären för många små molekyler, inklusive giftiga kemiska konserveringsmedel, av vilka några utöva sina åtgärder i spore core eller vegetativ cell cytoplasman5,6. Den IM lipid lipidens sannolikt i en gel stat, även om det finns en betydande del av mobila lipider i IM5. Spors IM har också potential för betydande expansion5. Ytan av IM ökar därmed, 1,6 gånger på grobarhet utan ytterligare membran syntes och åtföljs av förlust av denna membranets karakteristiska låg permeabilitet och lipid orörlighet5,6.
Medan de molekylära detaljerna för aktivering av grobarhet proteiner och organisationen av IM lipider i sporer är attraktiva ämnen för studien, utgör B. subtilis sporer liten storlek och relativt låga överflödet av grobarhet proteiner, en utmaning mikroskopiska analyser. Griffiths et al. övertygande epifluorescence Mikroskop bevis, antyder med hjälp av fluorescerande reportrar smält grobarhet proteiner, att proteinet byggnadsställning GerD i B. subtilis sporer organiserar tre GR subenheter (A, B och C) för GerA, B och K GRs, i ett kluster7. De myntade termen 'germinosome' för detta kluster av grobarhet proteiner och beskrivs strukturerna som ~ 300 nm stora IM protein foci8. Vid initiering av sporgroning, skingra fluorescerande germinosome foci slutändan förändra i större fluorescerande mönster, med > 75% av spore populationer visar detta mönster i sporer grodde för 1 h med L-valin8. Observera att papperet nämns ovan används i genomsnitt bilder från dussintals konsekutiva fluorescerande bilder, att få statistisk power och övervinna hindret för låg fluorescerande signaler som observerats under imaging. Denna visualisering av dessa strukturer i bakteriesporer var vid kanten av vad som är tekniskt genomförbart med klassisk mikroskopisk verktyg och varken en utvärdering av mängden foci i en enda spore inte heller deras mer detaljerad subcellulär lokalisering var möjligt med detta synsätt.
Här visar vi användning av strukturerade belysningen mikroskopi (SIM) att få en detaljerad visualisering och kvantifiering av germinosome(s) i sporer av B. subtilissamt deras IM lipid domäner9. Protokollet innehåller även instruktioner för sporulering, bild förberedelse och bildanalys av SIMcheck (v1.0, en imageJ plugin) samt ImageJ10,11,12.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Air dried glass slides</td>
			<td>Menzel Gl&#228;ser</td>
			<td>630-2870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APO TIRF N20R8 100&#215; oil objective (NA=1.49)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B. subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry cat, gerD-gfp kan)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B. subtilis PS4150 (PS832 &#916;gerE::spc, &#916;cotE::tet)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flasks 1 L</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z567868</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flasks 250 mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z723088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoSpheres carboxylate-modified microspheres</td>
			<td>Invitrogen, 0.1 &#956;m</td>
			<td>F8803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM4-64</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F34653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histodenz nonionic density gradient medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iXON3 DU-897 X-6515 CCD camera</td>
			<td>Andor Technology</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.net/Welcome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge tubes 1.5 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>3451PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope imaging software</td>
			<td>Nikon, Japan</td>
			<td>NIS-Element AR 4.51.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliQ Ultrapure Deminerilzed Water</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Milli-Q IQ 7003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Screw Cap Bottle 180 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75003800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Coverslips</td>
			<td>Paul Marienfeld</td>
			<td>117650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round Bottom tubes 15 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Nunc TM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap tubes 50 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Nunc TM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of germinosomes and the inner membrane in bacillus subtilis spores

Den lilla storleken på sporer och relativt låga överflödet av grobarhet proteiner, orsaka svårigheter i deras mikroskopiska analyser med hjälp av epifluorescence mikroskopi. Super-resolution tredimensionellt strukturerad belysning mikroskopi (3D-SIM) är ett lovande verktyg för att övervinna detta hinder och avslöja de molekylära detaljerna om processen för groning av Bacillus subtilis (B. subtilis) sporer. Här beskriver vi användning av en modifierad SIMcheck (ImageJ)-assistent 3D avbildningsprocessen och fluorescerande reporter proteiner för SIM-mikroskopi av B. subtilis sporer germinosomes, varningsperioden av grobarhet proteiner. Vi presenterar också en (standard) 3D-SIM tänkbar procedur för FM4-64 färgning av B. subtilis spore membran. Med hjälp av dessa förfaranden, vi fått oöverträffad upplösning för germinosome lokalisering och visar att > 80% av B. subtilis KGB80 vilande sporer erhålls efter sporulering på definierade minimalmedium av moppar har en eller två GerD-GFP och GerKB-mCherry Foci. Ljusa foci var också observerade i FM4-64 målat sporer 3D-SIM bilder tyder på att inre membranet lipid domäner av olika smidighet sannolikt existerar. Ytterligare är studier som använder dubbel märkning förfaranden med membran färgämnen och germinosome reporter proteiner att bedöma samtidig lokalisering och därmed få en optimal överblick av organisationen av Bacillus grobarhet proteiner i inre spore membran möjligt.

Det nuvarande protokollet presenterar ett SIM Mikroskop avbildning förfarande för bakteriesporer. Sporulering och skjut förberedelse förfarandena genomfördes som visas i figur 1 innan imaging. Senare, bildbehandling och analys förfarandena tillämpades både för dim (fluorescerande protein märkt grobarhet proteiner) och ljusa (lipofila probe målat IM) spor prov som visas i följande text.
<...

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores at JoVE.com

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

Visualisering av Germinosomes och det inre membranet i Bacillus subtilis sporer

Germinant receptor protein kluster i 'germinosomes' i det inre membranet av Bacillus subtilis sporer. Vi beskriver ett protokoll med super upplösning Mikroskopi och fluorescerande reporter proteiner visualisera germinosomes. Protokollet identifierar också spore inre membranet domäner som är prioriterat fläckade membran färgämnet FM4-64.

The small size of spores and the relatively low abundance of germination proteins, cause difficulties in their microscopic analyses using epifluorescence ...

Super-upplösning strukturerad belysning mikroskopi, 3D-SIM, är en innovativ teknik för visualisering av fluorescerande reporter proteiner av groning receptorn kluster i spor membran. Med hjälp av dessa förfaranden, kan oöverträffad upplösning av germinosome lokalisering och spor inre membran lipid domäner uppnås. Tekniken kommer att demonstreras av doktoranden Juan Wen och civilingenjörsstudenten Raymond Pasman vid vårt laboratorium.Innan du påbörjar proceduren, rengör högprecisionsöverdrag med en-molar saltsyra i 30 minuter i ett försiktigt skakande vattenbad, följt av två, fem minuters tvättar i ultraren typ 1 vatten. Efter den andra tvätten, placera täcken i 100%etanol i ungefär tre minuter innan du torkar täcken och verifierar deras klarhet. Sedan, rengör glas mikroskop diabilder med 70%etanol i en minut innan bilderna att torka och verifiera deras klarhet.För fluorescerande mikrosfär och sporavbildning, först förvarm två diabilder på en 70-graders Celsius värmeblock i några sekunder innan du lägger till en 70-graders Celsius, 65-mikroliter droppe steriliserad 2%agarose på en av bilderna. Placera den andra bilden på toppen för att sprida agaros mellan bilderna. Efter fem minuter, ta bort en av bilderna och skär den torkade agarose i en en-av-en-centimeter avsnitt.Tillsätt en gång 10 till den åttonde fluorescerande mikrosfärer eller sporer i 0,4 mikroliter av sterila, ultrapure Typ 1 vatten till agarose, och placera en hög precision coverslip på plåstret med hjälp av täcket för att skjuta plåstret bort av bilden på täckplattan ytan. Sedan, fixa en 65-mikroliter, 1,5-by-1,6-centimeter Gene Frame på en torkad bildruta, och placera täckskydd på ramen, stänga alla hörn av ramen. För avbildning av proverna, placera bilden på ett strukturerat belysningsmikroskop utrustat med ett 100X-oljemål och fokusera på 100-nanometerfluorescerande mikrosfärer.Justera korrigeringsringen på målsättningen 100x tills en symmetrisk punktspridningsfunktion erhålls för att minimera oskärpa av bilderna, och välj ett synfält med cirka 10 runda fluorescerande mikrosfärer. Applicera en gallerfokusjustering för de utsedda excitationsvåglängderna, i detta fall 561 och 488 nanometer, som en guide för bildanalysprogramvaran innan fokusering på sporerna med sändningsljuset. Fånga en transmissionsljusbild i 16x-genomsnittsläget med 20-millisekunders exponeringar för varje bild.Fånga sedan 3D-strukturerade belysningsmikroskop råa fluorescerande bilder av sporerna med 3D-SIM-belysningsläget. Om du vill ha segmentrekonstruktion klickar du på Param på det strukturerade tabbbladet för belysningsdynan för att öppna fönstret Ombyggnad av segment för N-SIM. Följ de föreslagna instruktionerna och klicka på lämpliga kontroller för att ställa in belysningsmoduleringskontrasten till auto, högupplösningsbrusdämpningen till en och ur fokus oskärpa till 0,05 som utgångspunkter.Klicka sedan på Rekonstruera skiva för att rekonstruera bilden och utvärdera kvaliteten på de rekonstruerade bilderna genom de snabba Fourier-transformerade bilderna och rekonstruktionspoängen som visas efter rekonstruktionen. Justera det högupplösta bruset från 0,1 till fem och den out of the focus oskärpa suppression från 0,01 till 0,5 tills de bästa parameterinställningarna erhålls. Klicka sedan på Verkställ för att tillämpa ändringarna.Klicka på Stäng för att stänga fönstret. Öppna en FM4-64 färgat PS4150 sporer rå bild. Klicka sedan på Rekonstruera skiva för att exekvera segmentrekonstruktionen och spara den rekonstruerade bilden.För att konvertera 3D-SIM råa bilder av KGB80 geminosome till pseudo-widefield bilder, vänsterklicka på ImageJ SIMcheck plugin och välj Rådata SI och Pseudo Widefield. Välj slumpmässigt omkring 25 sporer i varje inverterad överföringsbild för en senare germinosomanalys i de fluorescerande pseudo-widefield-bilderna tills ungefär 350 sporer har valts. Använd sedan ImageJ för att bedöma den maximala intensiteten för varje fluorescerande signal som uttrycks av varje grupp av sporer och den integrerade intensiteten i varje 3D-sporbild.För att analysera de pseudo-widefield bilder av KGB80 germinosome, använd medelvärdet integrerade intensitetsvärdet av sju stackar som den integrerade signalintensiteten av KGB80 spor. Sedan, bestämma bakgrunden intensiteter genom att avbilda PS4150 bakgrundsstam med hjälp av identiska inställningar, och betrakta fluorescerande fläckar i enskilda KGB80 sporer som germinosome foci när de är tydligt urskiljbara från bakgrunden. I detta representativa experiment, två högborgar av GerD-GFP fluorescing sporer dök upp i olika stackar med tre totala GerD-GFP högborgar observeras i compositive Z3 stack.Här observerades en spor med endast en GerD-GFP-brännpunkt i sporen. Totalt hade omkring 40 till 50 % av sporerna två eller ett GerD-GFP- respektive GerKB-mCherry-kluster. Medan den integrerade intensiteten i GerD-GFP-byggnadsställningens protein var olika mellan olika populationer, var den integrerade intensiteten hos GerKB-mCherry ungefär densamma i olika populationer.När sporen hade flera högborgar, den maximala fluorescens intensitet GerD-GFP och GerKB-mCherry högborgar tenderade att minska, och den maximala fluorescens av alla ljusa fläckar, betraktas som germinom högborgar, var högre än den maximala auto-fluorescens av PS4150 sporer. Noterbart är att ljusare FM4-64-ställen som liknar groddar visas i både intakta och avkodade PS4150 sporer, vilket tyder på att dessa ljusare FM4-64 fläckar kan vara inblandade i klustring av germinosome proteiner i det inre membranet. Att lägga sporer till agaros och placera agarose i ramen kräver en kontinuerligt och noggrann flytande rörelse för dessa minis material.Omvandlingen av 3D-SIM råa bilder av KGB80 germinosome till pseudo-widefield bilder och deras tolkning kräver expertkunskap om sporbiologi. Vår strukturerade belysning mikroskopi förfarande kan tillämpas på avbildning av låg rikliga proteiner eller dim fluorescens reportrar i olika bakterier eller andra band material. Organisationen av grodden kan nu studeras med hjälp av dubbelmärkning förfaranden för att bedöma samlokalisering av Bacillus grobarhet proteiner och specifika domäner membran.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

Optisk Kartläggning av aktionspotentialer och transienter Kalcium i musen hjärta

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Visualisering av Cortex Organisation och Dynamics i mikroorganismer, med total inre Mikroskopi fluorescens

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

Membran-SPINE: A Biochemical verktyg för att identifiera protein-proteininteraktioner av membranproteiner<em&gt; In Vivo</em

Membrane proteins are essential for cell viability and are therefore important therapeutic targets1-3. Since they function in complexes4, methods to ...

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

Kvantifiering av Global diastoliska funktionen av kinematisk modellering baserad Analys av Transmitral Flow via Parametrized diastoliska Filling Formalism

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Analysis of Tubular Membrane Networks in Cardiac Myocytes from Atria and Ventricles

Analys av Tubular Membran Networks i hjärtmuskelceller från förmak och kammare

In cardiac myocytes a complex network of membrane tubules - the transverse-axial tubule system (TATS) - controls deep intracellular signaling functions. ...

Luminescence Resonance Energy Transfer to Study Conformational Changes in Membrane Proteins Expressed in Mammalian Cells

Luminiscens Resonance Energy Transfer att studera strukturförändringar i membranproteiner i däggdjursceller

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range ...

Three-Dimensionally Printed Microfluidic Cross-flow System for Ultrafiltration/Nanofiltration Membrane Performance Testing

Tredimensionellt Tryckt mikroflödes Cross-flödessystem för Ultrafiltrering / nanofiltreringsmembran Performance Test

Minimization and management of membrane fouling is a formidable challenge in diverse industrial processes and other practices that utilize membrane ...

Treatment of Ligament Constructs with Exercise-conditioned Serum: A Translational Tissue Engineering Model

Behandling av ligamentkonstruktioner med träningskonditionerad serum: en translationsvävnadsteknikmodell

In vitro experiments are essential to understand biological mechanisms; however, the gap between monolayer tissue culture and human physiology is large, ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

En<em&gt; In Vitro</em&gt; Organ Kultur Modell av murina mellankotskivan

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

A Protocol for Decellularizing Mouse Cochleae for Inner Ear Tissue Engineering

Ett protokoll för Decellularizing mus Cochleae för innerörat Tissue Engineering

In mammals, mechanosensory hair cells that facilitate hearing lack the ability to regenerate, which has limited treatments for hearing loss. Current ...