Name: visualization of germinosomes and the inner membrane in bacillus subtilis spores
Uploaded: 2019-04-15T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores at JoVE.com

Yazarlar Christiaan Zeelenberg SIM görüntüleme sırasında yaptığı yardım için teşekkür ederiz. JW Çin burs Konseyi için bir Doktora Bursu kabul eder ve Irene Stellingwerf görüntüleme birincil aşaması sırasında ona yardım için teşekkürler.

1. B. subtillis Sporulation (zamanlama: mikroskobik gözlem önce 7 gün)
<ol><li>
Gün 1
	<ol>
<li>Bir bakteri kültürü bir Luria-Bertani suyu (LB) agar plaka (%1 tryptone % 0.5 Maya ekstresi, %1 NaCl, %1 agar)13 tarihinde çizgi ve gecede 37 ° C de tek kolonileri elde etmek için kuluçkaya. B. subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry kedi, gerD-gfp kan) zorlanma ve onun üst arka plan zorlanma B. subtilis PS4150 kullanın (PS832<...

<ol>
	<li>Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germination+of+spores+of+Bacillus+species:+what+we+know+and+do+not+know.">Germination of spores of Bacillus species: what we know and do not know.</a> Journal of Bacteriology. 196 (7), 1297-1305 (2014).</li><li>Setlow, P., Wang, S., Li, Y. -. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germination+of+spores+of+the+orders+Bacillales+and+Clostridiales.">Germination of spores of the orders Bacillales and Clostridiales.</a> Annual Review of Microbiology. 71 (1), (2017).</li><li>Vepachedu, V. R., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+interactions+between+nutrient+germinant+receptors+and+SpoVA+proteins+of+Bacillus+subtilis+spores.">Analysis of interactions between nutrient germinant receptors and SpoVA proteins of Bacillus subtilis spores.</a> FEMS Microbiology Letters. 274 (1), 42-47 (2007).</li><li>Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Summer+meeting+2013&#8211;when+the+sleepers+wake:+the+germination+of+spores+of+Bacillus+species.">Summer meeting 2013&#8211;when the sleepers wake: the germination of spores of Bacillus species.</a> Journal of Applied Microbiology. 115 (6), 1251-1268 (2013).</li><li>Cowan, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipids+in+the+inner+membrane+of+dormant+spores+of+Bacillus+species+are+largely+immobile.">Lipids in the inner membrane of dormant spores of Bacillus species are largely immobile.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (20), 7733-7738 (2004).</li><li>Loison, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+investigation+of+viscosity+of+an+atypical+inner+membrane+of+Bacillus+spores:+a+molecular+rotor/FLIM+study.">Direct investigation of viscosity of an atypical inner membrane of Bacillus spores: a molecular rotor/FLIM study.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1828 (11), 2436-2443 (2013).</li><li>Griffiths, K. K., Zhang, J., Cowan, A. E., Yu, J., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germination+proteins+in+the+inner+membrane+of+dormant+Bacillus+subtilis+spores+colocalize+in+a+discrete+cluster.">Germination proteins in the inner membrane of dormant Bacillus subtilis spores colocalize in a discrete cluster.</a> Molecular Microbiology. 81 (4), 1061-1077 (2011).</li><li>Troiano, A. J., Zhang, J., Cowan, A. E., Yu, J., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+dynamics+of+a+Bacillus+subtilis+spore+germination+protein+complex+during+spore+germination+and+outgrowth.">Analysis of the dynamics of a Bacillus subtilis spore germination protein complex during spore germination and outgrowth.</a> Journal of Bacteriology. 197 (2), 252-261 (2015).</li><li>Wegel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cellular+structures+in+super-resolution+with+SIM,+STED+and+Localisation+Microscopy:+A+practical+comparison.">Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison.</a> Scientific Reports. 6, 27290 (2016).</li><li>Pandey, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+imaging+of+germination+and+outgrowth+of+individual+Bacillus+subtilis+spores;+the+effect+of+heat+stress+quantitatively+analyzed+with+SporeTracker.">Live cell imaging of germination and outgrowth of individual Bacillus subtilis spores; the effect of heat stress quantitatively analyzed with SporeTracker.</a> PloS One. 8 (3), e58972 (2013).</li><li>Demmerle, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategic+and+practical+guidelines+for+successful+structured+illumination+microscopy.">Strategic and practical guidelines for successful structured illumination microscopy.</a> Nature Protocols. 12 (5), 988-1010 (2017).</li><li>Ball, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SIMcheck:+a+toolbox+for+successful+super-resolution+structured+illumination+microscopy.">SIMcheck: a toolbox for successful super-resolution structured illumination microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 15915 (2015).</li><li>Bertani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STUDIES+ON+LYSOGENESIS+I.:+The+Mode+of+Phage+Liberation+by+Lysogenic+Escherichia+coli1.">STUDIES ON LYSOGENESIS I.: The Mode of Phage Liberation by Lysogenic Escherichia coli1.</a> Journal of Bacteriology. 62 (3), 293 (1951).</li><li>Pandey, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+the+effect+of+specific+tea+compounds+on+germination+and+outgrowth+of+Bacillus+subtilis+spores+at+single+cell+resolution.">Quantitative analysis of the effect of specific tea compounds on germination and outgrowth of Bacillus subtilis spores at single cell resolution.</a> Food Microbiology. 45, 63-70 (2015).</li><li>Zheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacillus+subtilis+spore+inner+membrane+proteome.">Bacillus subtilis spore inner membrane proteome.</a> Journal of Proteome Research. 15 (2), 585-594 (2016).</li><li>Vepachedu, V. R., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+SpoVAD+to+the+inner+membrane+of+spores+of+Bacillus+subtilis.">Localization of SpoVAD to the inner membrane of spores of Bacillus subtilis.</a> Journal of Bacteriology. 187 (16), 5677-5682 (2005).</li><li>Schouten, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+dendritic+spines+of+rat+primary+hippocampal+neurons+using+structured+illumination+microscopy.">Imaging dendritic spines of rat primary hippocampal neurons using structured illumination microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), (2014).</li><li>Mukaka, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+appropriate+use+of+correlation+coefficient+in+medical+research.">A guide to appropriate use of correlation coefficient in medical research.</a> Malawi Medical Journal. 24 (3), 69-71 (2012).</li><li>Stewart, K. A., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Numbers+of+individual+nutrient+germinant+receptors+and+other+germination+proteins+in+spores+of+Bacillus+subtilis.">Numbers of individual nutrient germinant receptors and other germination proteins in spores of Bacillus subtilis.</a> Journal of Bacteriology. 195 (16), 3575-3582 (2013).</li><li>Laflamme, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+analysis+of+germinating+Bacillus+spores,+using+membrane+potential+dye.">Flow cytometry analysis of germinating Bacillus spores, using membrane potential dye.</a> Archives of Microbiology. 183 (2), 107-112 (2005).</li><li>Magge, A., Setlow, B., Cowan, A. E., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+dye+binding+by+and+membrane+potential+in+spores+of+Bacillus+species.">Analysis of dye binding by and membrane potential in spores of Bacillus species.</a> Journal of Applied Microbiology. 106 (3), 814-824 (2009).</li><li>Ghosh, S., Scotland, M., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Levels+of+germination+proteins+in+dormant+and+superdormant+spores+of+Bacillus+subtilis.">Levels of germination proteins in dormant and superdormant spores of Bacillus subtilis.</a> Journal of Bacteriology. 194 (9), 2221-2227 (2012).</li><li>Abhyankar, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+sporulation+conditions+on+the+spore+coat+protein+composition+of+Bacillus+subtilis+Spores.">The influence of sporulation conditions on the spore coat protein composition of Bacillus subtilis Spores.</a> Frontiers in microbiology. 7, 1636 (2016).</li><li>Rose, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+properties+of+Bacillus+subtilis+spores+made+in+liquid+or+on+agar+plates.">Comparison of the properties of Bacillus subtilis spores made in liquid or on agar plates.</a> Journal of Applied Microbiology. 103 (3), 691-699 (2007).</li><li>Stewart, K. A., Yi, X., Ghosh, S., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germination+protein+levels+and+rates+of+germination+of+spores+of+Bacillus+subtilis+with+overexpressed+or+deleted+genes+encoding+germination+proteins.">Germination protein levels and rates of germination of spores of Bacillus subtilis with overexpressed or deleted genes encoding germination proteins.</a> J Bacteriol. 194 (12), 3156-3164 (2012).</li><li>Ramirez-Peralta, A., Zhang, P., Li, Y. -. q., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+sporulation+conditions+on+the+germination+and+germination+protein+levels+of+Bacillus+subtilis+spores.">Effects of sporulation conditions on the germination and germination protein levels of Bacillus subtilis spores.</a> Applied and Environmental Microbiology. 78 (8), 2689-2697 (2012).</li><li>Laue, M., Han, H. -. M., Dittmann, C., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+membranes+of+bacterial+endospores+are+reservoirs+for+spore+core+membrane+expansion+during+spore+germination.">Intracellular membranes of bacterial endospores are reservoirs for spore core membrane expansion during spore germination.</a> Scientific Reports. 8, 11388 (2018).</li><li>Strahl, H., B&#252;rmann, F., Hamoen, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+actin+homologue+MreB+organizes+the+bacterial+cell+membrane.">The actin homologue MreB organizes the bacterial cell membrane.</a> Nature Communications. 5, (2014).</li><li>Strahl, H., Hamoen, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+potential+is+important+for+bacterial+cell+division.">Membrane potential is important for bacterial cell division.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (27), 12281-12286 (2010).</li><li>Swarge, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="One-Pot"+sample+processing+methodfor+proteome-wide+analysis+of+microbial+cells+and+spores.">"One-Pot" sample processing methodfor proteome-wide analysis of microbial cells and spores.</a> Proteomics Clinical Applications. (5), 1700169 (2018).</li></ol>

Sunulan Protokolü FM4- B. subtilis sporlar lekeli sporulation, slayt hazırlama ve işlemleri görüntüleme içeren 64 çözümlenmesi için bir standart 3D-SIM yordam içerir. Ayrıca, değiştirilmiş SIMcheck (ImageJ) protokolünü açıklar-işlem için SIM mikroskobu ile floresan gazetecilere etiketli B. subtilis spor germinosomes, Imaging 3D destekli. İkinci yordamı bu loş altyapı geliştirilmiş kontrast ile gözlemlemek için bize izin. İki görüntüleme yordam kaplin tarafından böylec...

Sporlar siparişlerin Bacillales ve Clostridiales metabolik olarak uyuyan ve olağanüstü dayanıklı sert dekontaminasyon rejimler, ama onlar çimlenme sürece, zararlı etkileri insanlar1' neden olamaz. İçinde besin germinant tetiklenen çimlenme Bacillus subtilis (B. subtilis) sporlar, inisiyasyon olay germinant reseptörleri (gr) Spor'ın iç zar (IM) yer alan germinant bağlamadır. Daha sonra GRs sinyalleri de IM içinde bulunan SpoVA kanal protein transduce. Bu spor çekirdek pyridine-2,6-Dikarboksilik asit (dipicolinic asit; Satım başlangıcı olur DPA; spore çekirdek kuru wt % 20'si oluşan) SpoVA kanal üzerinden su için. Daha sonra korteks peptidoglikan hidroliz aktivasyonu DPA serbest tetikler ve2,3,4ek su alımını izler. Bu olaylar için mekanik stres yol kat kat, onun sonraki rüptürü, akıbet başlangıcı ve son olarak, bitkisel büyüme. Ancak, çimlenme işleminin tam moleküler ayrıntılarını hala uzakta çözümlenir.
Spor çimlenmesi hakkında önemli bir soru IM çimlenme proteinler ve IM SpoVA kanal proteinler çevreleyen lipidler biyofiziksel özellikleri ile ilgili. Bu büyük ölçüde hareketsiz IM lipid bilayer bazıları kendi eylem spor çekirdek veya bitkisel hücre sitoplazma5,6sarfetmek toksik kimyasal koruyucu dahil olmak üzere birçok küçük moleküller için ana geçirgenliği engeldir. IM5mobil lipidler önemli bir kısmını olsa bir jel durumda IM lipid bilayer olasıdır. Spore's IM de önemli genişleme5için potansiyele sahiptir. Böylece, 1.6-fold IM yüzey alanını artırır çimlenme olmadan ek membran sentezi üzerine ve bu zar'ın karakteristik düşük geçirgenlik ve lipid hareketsizlik5,6kaybı tarafından eşlik ediyor.
Çimlenme proteinler aktivasyonu ve sporlar IM lipidler organizasyonu moleküler ayrıntılarını çalışma için çekici konular olsa da, B. subtilis sporlar küçük boyutu ve çimlenme proteinler, nispeten düşük bolluk bir meydan okuma teşkil Mikroskopik analizler için. Griffiths vd. epifluorescence mikroskop kanıt zorlayıcı, floresan gazetecilere çimlenme proteinler için erimiş kullanarak önerir B. subtilis sporlar üç GR alt birimleri (A, B ve C) GerA, B ve K GRs iskele protein GerD düzenler, bir küme7'. Bu küme çimlenme proteinlerin için 'germinosome' terim icat ve yapıları ~ 300 nm büyük IM protein foci8olarak nitelendirdi. Spor çimlenmesi başlatılması floresan germinosome foci sonuçta değiştirmek içine daha büyük dağıtmak floresan desenleri ile > sporlar bu modeli görüntüleme spore nüfusun % 75 germinated L-Valin8ile 1 h için. Kullanılan yukarıda belirtilen kağıt istatistiksel güç kazanmak ve görüntüleme sırasında gözlenen düşük floresan sinyallerini engeli aşmak için ardışık floresan resimlerin düzinelerce görüntülerden ortalama Not. Bu görselleştirme bakteriyel sporlar bu yapıların klasik mikroskobik araçları ve ben de foci bir tek spor miktarı değerlendirilmesi teknik açıdan ne de ne de onların daha ayrıntılı hücre altı yerelleştirme yapıldı Bu yaklaşım ile mümkün.
Burada, biz, yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (detaylı görsel öğeyi almak için SIM) kullanımı ve sporlar B. subtilisyanı sıra kendi IM lipid etki alanları9germinosome(s) miktar göstermek. Protokol için de yönergeler sporulation, slayt hazırlama ve görüntü analizi SIMcheck (v1.0, bir imageJ eklenti) tarafından ImageJ10,11,12yanı sıra içermektedir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Air dried glass slides</td>
			<td>Menzel Gl&#228;ser</td>
			<td>630-2870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APO TIRF N20R8 100&#215; oil objective (NA=1.49)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B. subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry cat, gerD-gfp kan)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B. subtilis PS4150 (PS832 &#916;gerE::spc, &#916;cotE::tet)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flasks 1 L</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z567868</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flasks 250 mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z723088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoSpheres carboxylate-modified microspheres</td>
			<td>Invitrogen, 0.1 &#956;m</td>
			<td>F8803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM4-64</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F34653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histodenz nonionic density gradient medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iXON3 DU-897 X-6515 CCD camera</td>
			<td>Andor Technology</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.net/Welcome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge tubes 1.5 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>3451PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope imaging software</td>
			<td>Nikon, Japan</td>
			<td>NIS-Element AR 4.51.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliQ Ultrapure Deminerilzed Water</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Milli-Q IQ 7003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Screw Cap Bottle 180 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75003800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Coverslips</td>
			<td>Paul Marienfeld</td>
			<td>117650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round Bottom tubes 15 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Nunc TM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap tubes 50 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Nunc TM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of germinosomes and the inner membrane in bacillus subtilis spores

Sporlar küçük boyutu ve çimlenme proteinler, nispeten düşük bolluk neden epifluorescence mikroskobu kullanarak onların Mikroskopik analizler zorluklar. Süper çözünürlük üç boyutlu yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (3D-SIM) bu engeli aşmak ve Bacillus subtilis (B. subtilis) sporlar çimlenme sürecinin moleküler ayrıntıları ortaya çıkarmak için umut verici bir araçtır. Burada, değiştirilmiş SIMcheck (ImageJ) nasıl kullanılacağını açıklar-Yardımcısı 3D görüntüleme işlemi ve floresan muhabir proteinler B. subtilis sporlar germinosomes, kümelere çimlenme proteinlerin SIM mikroskopi için. B. subtilis spore zarı FM4-64 boyama için (Standart) 3D-SIM görüntüleme yordamı da mevcut. Bu yordamları kullanarak germinosome yerelleştirme için eşsiz çözünürlük elde edilen ve gösteri > uyuyan sporlar elde sporulation tanımlanmış en az BEZLERİ orta sonra B. subtilis KGB80% 80'i-si olmak bir ya da iki GerD-GFP ve GerKB-mCherry resimde. Parlak foci Ayrıca içinde gözlenen FM4-64 sporlar 3D-SIM görüntüleri iç membran lipid etki alanından farklı akışkanlık olasılığı bulunduğunu düşündüren lekeli edildi. Daha fazla co yerelleştirme değerlendirmek ve böylece en iyi genel Bacillus çimlenme proteinlerin kuruluşun iç spore membran almak için çift muhabir proteinler membran boyalar ve germinosome yordamları etiketleme kullanın çalışmalar vardır mümkün.

Geçerli protokol bakteriyel sporlar için bir SIM mikroskop düşsel yordam sunar. Sporulation ve slayt hazırlama işlemleri görüntüleme önce şekil 1 ' de gösterildiği gibi yapılmıştır. Daha sonra görüntüleme ve analiz prosedürleri uygulanmış olan her ikisi için dim (floresan protein çimlenme protein etiketli) ve parlak (lipofilik sonda IM lekeli) Spor örnekleri aşağıdaki metinde görüldüğü gibi.
<p class="jove_content" fo:kee...

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores at JoVE.com

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

Görselleştirme Germinosomes ve Bacillus subtilis sporlar iç zar

Germinant reseptör proteinler 'germinosomes' Bacillus subtilis sporlar iç zarda kümesinde. Biz süper çözünürlük mikroskobu ve floresan muhabir proteinleri germinosomes görselleştirmek için bir iletişim kuralı'nı açıklar. İletişim kuralı da tercihen membran boya FM4-64 ile lekeli spor iç zar etki alanları tanımlar.

The small size of spores and the relatively low abundance of germination proteins, cause difficulties in their microscopic analyses using epifluorescence ...

Süper çözünürlüklü yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu, 3D-SIM, spor membranlarda çimlenme reseptör kümelerinin floresan muhabir proteinlerin görselleştirilmesi için yenilikçi bir tekniktir. Bu işlemler kullanılarak, germiyotom lokalizasyonu ve spor iç membran lipid etki alanlarının eşsiz çözünürlüğü elde edilebilir. Bu teknik, laboratuvarımızdan doktora öğrencisi Juan Wen ve Fen Bilimleri Yüksek Lisans öğrencisi Raymond Pasman tarafından gösterilecek.İşleme başlamadan önce, yüksek hassasiyetli kapakları tek azılı hidroklorik asitle 30 dakika boyunca hafifçe sallayarak su banyosunda temizleyin ve ardından ultrasaf Tip 1 suda iki, beş dakikalık yıkamalar uygulayın. İkinci yıkamadan sonra, kapakları kurutmadan ve berraklıklarını doğrulamadan önce yaklaşık üç dakika boyunca kapakları %100 etanole yerleştirin. Daha sonra, slaytların kurumasını ve berraklıklarını doğrulamadan önce bir dakika boyunca %70 etanolile temiz cam mikroskop kaydırakları.Floresan mikrosfer ve spor görüntüleme için, 70 derecelik bir Santigrat Derece Lisan, sterilize 65 mikrolitrelik damlacık eklemeden önce birkaç saniye için 70 derecelik bir ısıtma bloğunda ilk ısıtma iki slayt, sterilize 2% agül slaytlar birine agarose. Slaytlar arasında agarose yaymak için üstüne diğer slayt yerleştirin. Beş dakika sonra, slaytlardan birini çıkarın ve kurutulmuş agarose bir-by-one-santimetre bölümü halinde kesti.Agarose'a 0,4 mikrolitre steril, ultrasaf Tip 1 sudaki sekizinci floresan mikroküre veya sporlara bir kez 10 kat ekleyin ve yamanın kapağını kapak yüzeyine kaydırmak için kapak kaymasını kullanarak yamanın üzerine yüksek hassasiyetli bir kapak kayması yerleştirin. Ardından, 65 mikrolitre, 1,5 x 1,6 santimetrelik Gen Çerçevesini kurutulmuş bir kaydıraktan üzerine sabitleyin ve kapağı çerçevenin tüm köşelerini kapatarak çerçevenin üzerine yerleştirin. Örneklerin görüntülenmesi için, slaytı 100X yağ hedefiyle donatılmış yapılandırılmış bir aydınlatma mikroskobuna yerleştirin ve 100 nanometrelik floresan mikrokürelere odaklanın.Görüntülerin bulanıklaşmasını en aza indirmek için simetrik nokta yayma fonksiyonu elde edilene kadar 100x hedefindeki düzeltme halkasını ayarlayın ve yaklaşık 10 yuvarlak floresan mikroküreiçeren bir görüş alanı seçin. İletim ışığı ile sporlara odaklanmadan önce görüntü analiz yazılımı için bir kılavuz olarak, bu durumda, 561 ve 488 nanometre, belirlenen uyarma dalga boyları için bir ızgara odak ayarı uygulayın. Her görüntü için 20 milisaniyelik pozlama ile 16x ortalama modunda bir iletim ışığı görüntüsü yakalayın.Ardından, 3D SIM aydınlatma modu ile sporların 3D yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu ham floresan görüntülerini yakalayın. Dilim yeniden yapılandırma için, N-SIM Dilim Yeniden Yapılandırma penceresini açmak için yapılandırılmış aydınlatma pedi sekmesi sayfasında Param'ı tıklatın. Önerilen yönergeleri izleyin ve aydınlatma modülasyon kontrastını otomatik olarak ayarlamak için uygun denetimlere tıklayın, yüksek çözünürlüklü gürültü bastırma bire ve odak bulanıklığı bastırmanın başlangıç noktası olarak 0,05'e yükseltin.Ardından, görüntüyü yeniden yapılandırmak ve yeniden yapılanma sonrasında görüntülenen hızlı Fourier dönüştürülmüş görüntüler ve yeniden yapılandırma puanıyla yeniden yapılandırılabilen görüntülerin kalitesini değerlendirmek için Dilim'i Yeniden Oluştur'u tıklatın. Yüksek çözünürlüklü gürültüyü 0,1'den beşe ve odak bulanıklığı bastırmayı 0,01'den 0,5'e en iyi parametre ayarları elde edilene kadar ayarlayın. Ardından, değişiklikleri uygulamak için Uygula'yı tıklatın.Pencereyi kapatmak için Kapat'ı tıklatın. Fm4-64 lekeli PS4150 sporlar ham görüntü açın. Ardından, dilim rekonstrüksiyonu yürütmek ve yeniden oluşturulmuş görüntüyü kaydetmek için Dilim'i Yeniden Oluştur'u tıklatın.KGB80 geminoomunun 3D-SIM ham görüntülerini sözde geniş alan görüntülerine dönüştürmek için ImageJ SIMcheck eklentisine sol tıklayın ve Raw Data SI ve Pseudo Widefield'ı seçin. Yaklaşık 350 spor seçilene kadar floresan psödo-widefield görüntülerde daha sonra germinozom analizi için her ters şanzıman görüntüsünde yaklaşık 25 spor seçin. Ardından, her bir spor grubu tarafından ifade edilen her floresan sinyal için maksimum yoğunluğu ve her 3D spor görüntüsünün entegre yoğunluğunu değerlendirmek için ImageJ'i kullanın.KGB80 mikroburyumunun sözde geniş alan görüntülerini analiz etmek için, KGB80 sporunun entegre sinyal yoğunluğu olarak yedi yığının ortalama entegre yoğunluk değerini kullanın. Daha sonra, ps4150 arka plan gerilimini aynı ayarları kullanarak görüntüleyerek arka plan yoğunluklarını belirleyin ve tek tek KGB80 sporlarında floresan noktaları arka plandan açıkça ayırt edilebildiklerinde çimomnom odakları olarak kabul edin. Bu temsili deneyde, GerD-GFP floresan sporlarının iki odak ları, compozitif Z3 destesinde gözlenen üç toplam GerD-GFP foci ile farklı yığınlarda ortaya çıkmıştır.Burada, sporda sadece bir GerD-GFP odak noktası olan bir spor gözlenmiştir. Toplamda, sporların yaklaşık %40-50'sinde sırasıyla iki veya bir GerD-GFP ve GerKB-mCherry kümesi vardı. GerD-GFP iskele proteininin entegre yoğunluğu farklı popülasyonlar arasında farklılık gösterirken, GerKB-mCherry'nin entegre yoğunluğu farklı popülasyonlarda hemen hemen aynıydı.Spor birden fazla foci olduğunda, GerD-GFP ve GerKB-mCherry foci maksimum floresan yoğunluğu azaltmak eğilimindedir, ve tüm parlak noktalar maksimum floresans, çimonozom foci olarak kabul, PS4150 sporların maksimum otomatik floresan daha yüksekti. Özellikle, çimomnom foci benzer parlak FM4-64 noktalar hem bozulmamış ve decoated PS4150 sporlar görünür, bu parlak FM4-64 noktalar iç membran da germiyotom proteinlerin kümeleme dahil olabileceğini düşündürmektedir. Agarose sporlar ekleme ve çerçeve içine agarose yerleştirerek bu minis malzemeler için sürekli ve dikkatli sıvı hareketi gerektirir.KGB80 mikrop lu mikropların 3D-SIM ham görüntülerinin sözde geniş alan görüntülerine dönüştürülmesi ve bunların yorumlanması spor biyolojisi konusunda uzman bilgi gerektirir. Yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu prosedürümüz, düşük miktarda protein veya loş floresan muhabirlerin farklı bakterilerde veya diğer bant malzemelerinde görüntülenmesinde uygulanabilir. Çimozom organizasyonu artık Bacillus çimlenme proteinleri ve belirli membran etki alanlarının birlikte lokalizasyonunu değerlendirmek için çift etiketleme prosedürleri kullanılarak incelenebilir.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

Fare Kalp Aksiyon Potansiyelleri ve Kalsiyum Geçici Optik Haritalama

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

Biyomühendislik

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Mikroorganizmalarda Cortex Organizasyon ve Dinamiği Görselleştirme, Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskobu kullanılarak

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

Membran-OMURGA: Membran Proteinleri protein-protein etkileşimleri belirlemek için bir Biyokimyasal Aracı<em&gt; In Vivo</em

Membrane proteins are essential for cell viability and are therefore important therapeutic targets1-3. Since they function in complexes4, methods to ...

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

Parametrized Diyastolik Dolum Biçimcilik yoluyla Transmitral Akışının Modellenmesi Kinematik tabanlı Analizi ile Küresel Diyastolik Fonksiyonu Kantitasyonu

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Analysis of Tubular Membrane Networks in Cardiac Myocytes from Atria and Ventricles

Kulakçık ve karıncığa gelen kardiyak miyozitlerde Boru Membran Ağlarının Analizi

In cardiac myocytes a complex network of membrane tubules - the transverse-axial tubule system (TATS) - controls deep intracellular signaling functions. ...

Luminescence Resonance Energy Transfer to Study Conformational Changes in Membrane Proteins Expressed in Mammalian Cells

Lüminesans Rezonans Enerji memeli hücrelerinde ifade Membran Proteinleri Konformasyonel Değişiklikleri Eğitim transfer

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range ...

Three-Dimensionally Printed Microfluidic Cross-flow System for Ultrafiltration/Nanofiltration Membrane Performance Testing

Ultrafiltrasyon / Nanofiltrasyon Membran Performans Testleri için üç boyutlu Baskılı mikroakışkan Çapraz akış Sistemi

Minimization and management of membrane fouling is a formidable challenge in diverse industrial processes and other practices that utilize membrane ...

Treatment of Ligament Constructs with Exercise-conditioned Serum: A Translational Tissue Engineering Model

Egzersiz Koşullandırılmış Serum İle Ligament Yapılarının Tedavisi: Bir Translasyonel Doku Mühendisliği Modeli

In vitro experiments are essential to understand biological mechanisms; however, the gap between monolayer tissue culture and human physiology is large, ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

bir<em&gt; İn Vitro</emKemirgen İntervertebral Disk&gt; Organ Kültürü Modeli

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

A Protocol for Decellularizing Mouse Cochleae for Inner Ear Tissue Engineering

Fare Cochleae iç kulak doku mühendisliği için Decellularizing için bir iletişim kuralı

In mammals, mechanosensory hair cells that facilitate hearing lack the ability to regenerate, which has limited treatments for hearing loss. Current ...