Name: direct measurement of kdm1a target engagement using chemoprobe-based immunoassays
Uploaded: 2019-06-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Direct Measurement of KDM1A Target Engagement Using Chemoprobe-based Immunoassays at JoVE.com

تم تمويل هذه الدراسة من قبل أورزون جينوميكس. S.A., هوفمان لاروش, وبدعم جزئي من CIIP-20152001 وRETOS برنامج التعاون RTC-2015-3332-1.

وتم الحصول على عينات من الدم من معهد البحوث الحيوية في سانت باو وفقا للتشريعات الإسبانية (Real Decreto de Biobancos 1716/2011) وموافقة لجان الأخلاقيات المحلية. أُجريت دراسات مع الأنسجة الحيوانية وفقاً للمبادئ التوجيهية المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية (توجيه مجلس الجماعات الأوروبية 86/6...

<ol>
	<li>Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+demethylation+mediated+by+the+nuclear+amine+oxidase+homolog+LSD1.">Histone demethylation mediated by the nuclear amine oxidase homolog LSD1.</a> Cell. 119 (7), 941-953 (2004).</li><li>Maiques-Diaz, A., Somervaille, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LSD1:+biologic+roles+and+therapeutic+targeting.">LSD1: biologic roles and therapeutic targeting.</a> Epigenomics. 8 (8), 1103-1116 (2016).</li><li>Maes, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ORY-1001,+a+Potent+and+Selective+Covalent+KDM1A+Inhibitor,+for+the+Treatment+of+Acute+Leukemia.">ORY-1001, a Potent and Selective Covalent KDM1A Inhibitor, for the Treatment of Acute Leukemia.</a> Cancer Cell. 33 (3), 495-511 (2018).</li><li>Sugino, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+LSD1+inhibitor+NCD38+ameliorates+MDS-related+leukemia+with+complex+karyotype+by+attenuating+leukemia+programs+via+activating+super-enhancers.">A novel LSD1 inhibitor NCD38 ameliorates MDS-related leukemia with complex karyotype by attenuating leukemia programs via activating super-enhancers.</a> Leukemia. 31 (11), 2303-2314 (2017).</li><li>Kleppe, M., Shank, K., Efthymia, P., Riehnhoff, H., Levine, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysine-Specific+Histone+Demethylase,+LSD1,+(KDM1A)+As+a+Novel+Therapeutic+Target+in+Myeloproliferative+Neoplasms.">Lysine-Specific Histone Demethylase, LSD1, (KDM1A) As a Novel Therapeutic Target in Myeloproliferative Neoplasms.</a> Blood. 126, 601 (2015).</li><li>Jutzi, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LSD1+Inhibition+Prolongs+Survival+in+Mouse+Models+of+MPN+by+Selectively+Targeting+the+Disease+Clone.">LSD1 Inhibition Prolongs Survival in Mouse Models of MPN by Selectively Targeting the Disease Clone.</a> HemaSphere. 2 (3), 54 (2018).</li><li>Mohammad, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Hypomethylation+Signature+Predicts+Antitumor+Activity+of+LSD1+Inhibitors+in+SCLC.">DNA Hypomethylation Signature Predicts Antitumor Activity of LSD1 Inhibitors in SCLC.</a> Cancer Cell. 28 (1), 57-69 (2015).</li><li>Rivers, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RN-1,+a+potent+and+selective+lysine-specific+demethylase+1+inhibitor,+increases+&#947;-globin+expression,+F+reticulocytes,+and+F+cells+in+a+sickle+cell+disease+mouse+model.">RN-1, a potent and selective lysine-specific demethylase 1 inhibitor, increases &#947;-globin expression, F reticulocytes, and F cells in a sickle cell disease mouse model.</a> Experimental Hematology. 43 (7), 546-553 (2015).</li><li>Rivers, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+administration+of+the+LSD1+inhibitor+ORY-3001+increases+fetal+hemoglobin+in+sickle+cell+mice+and+baboons.">Oral administration of the LSD1 inhibitor ORY-3001 increases fetal hemoglobin in sickle cell mice and baboons.</a> Experimental Hematology. 67, 60-64 (2018).</li><li>Buesa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dual+LSD1/MAO-B+inhibitor+ORY-2001+prevents+the+development+of+the+memory+deficit+in+samp8+mice+through+induction+of+neuronal+plasticity+and+reduction+of+neuroinflammation.">The dual LSD1/MAO-B inhibitor ORY-2001 prevents the development of the memory deficit in samp8 mice through induction of neuronal plasticity and reduction of neuroinflammation.</a> Alzheimer&#8217;s &amp; Dementia. 11 (7), P905 (2015).</li><li>Schmidt, D. M., McCafferty, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-2-Phenylcyclopropylamine+is+a+mechanism-based+inactivator+of+the+histone+demethylase+LSD1.">Trans-2-Phenylcyclopropylamine is a mechanism-based inactivator of the histone demethylase LSD1.</a> Biochemistry. 46 (14), 4408-4416 (2007).</li><li>Forneris, F., Binda, C., Vanoni, M. A., Battaglioli, E., Mattevi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+histone+demethylase+LSD1+reads+the+histone+code.">Human histone demethylase LSD1 reads the histone code.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (50), 41360-41365 (2005).</li><li>Gonz#225;lez, E. C., Maes, T., Crusat, C. M., Mu#241;oz, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oryzon+Genomics,+Methods+to+determine+kdm1a+target+engagement+and+chemoprobes+useful+therefor.">Oryzon Genomics, Methods to determine kdm1a target engagement and chemoprobes useful therefor.</a> , (2016).</li><li>Mascaró, C., Ortega, A., Carceller, E., Rruiz Rodriguez, R., Cicero, F., Lunardi, S., Yu, L., Hilbert, M., Maes, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoprobe-based+assays+of+histone+lysine+demethylase+1A+target+occupation+enable+in+vivo+pharmacokinetics+and+-dynamics+studies+of+KDM1A+inhibitors.">Chemoprobe-based assays of histone lysine demethylase 1A target occupation enable in vivo pharmacokinetics and -dynamics studies of KDM1A inhibitors.</a> Journal of Biological Chemistry. , (2019).</li><li>Rodriguez-Suarez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Homogeneous+Nonradioactive+Methyltransferase+and+Demethylase+Assays+Targeting+Histone+H3+Lysine+4.">Development of Homogeneous Nonradioactive Methyltransferase and Demethylase Assays Targeting Histone H3 Lysine 4.</a> Journal of Biomolecular Screening. 17 (1), 49-58 (2011).</li><li>Lynch, J. T., Cockerill, M. J., Hitchin, J. R., Wiseman, D. H., Somervaille, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD86+expression+as+a+surrogate+cellular+biomarker+for+pharmacological+inhibition+of+the+histone+demethylase+lysine-specific+demethylase+1.">CD86 expression as a surrogate cellular biomarker for pharmacological inhibition of the histone demethylase lysine-specific demethylase 1.</a> Analytical Biochemistry. 442 (1), 104-106 (2013).</li><li>Schulz-Fincke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-activity+studies+on+N-Substituted+tranylcypromine+derivatives+lead+to+selective+inhibitors+of+lysine+specific+demethylase+1+(LSD1)+and+potent+inducers+of+leukemic+cell+differentiation.">Structure-activity studies on N-Substituted tranylcypromine derivatives lead to selective inhibitors of lysine specific demethylase 1 (LSD1) and potent inducers of leukemic cell differentiation.</a> European Journal of Medicinal Chemistry. 144, 52-67 (2018).</li><li>Ishii, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CETSA+quantitatively+verifies+in+vivo+target+engagement+of+novel+RIPK1+inhibitors+in+various+biospecimens.">CETSA quantitatively verifies in vivo target engagement of novel RIPK1 inhibitors in various biospecimens.</a> Scientific Report. 7, 13000 (2017).</li><li>Maes, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ORY-2001:+An+Epigenetic+drug+for+the+treatment+of+cognition+defects+in+Alzheimer&#8217;s+disease+and+other+neurodegenerative+disorders.">ORY-2001: An Epigenetic drug for the treatment of cognition defects in Alzheimer&#8217;s disease and other neurodegenerative disorders.</a> Alzheimer&#8217;s &amp; Dementia. 12 (7), P1192 (2017).</li></ol>

تم تطوير البروتوكول المعروض هنا لقياس المشاركة المستهدفة KDM1A مباشرة باستخدام رواية القبض على المسبار الكيميائي KDM1A مقرها ELISA. وقد تم التحقق من صحة هذه الطريقة على خطوط الخلايا البشرية المستزرعة وعينات الجسم الحي السابق من الإنسان والفئران والفأر والبابون (بما في ذلك PBMCs والرئة والدماغ وال...

ليسين demethylase محددة 1 (KDM1A)1 هو demethylase تشارك في السيطرة على النسخ الجيني. وقد برز هذا البروتين كهدف الدوائية المرشح2 في علم الأورام; بما في ذلك سرطان الدم النقوي الحاد3 (AML), متلازمة خلل التنسج النقوي (MDS)4, التليف النقوي (MF)5,6, سرطان الرئة الخلية الصغيرة (SCLC)7; في مرض الخلايا المنجلية (SCD)8،9، وفي أمراض الجهاز العصبي المركزي بما في ذلك مرض الزهايمر (AD)، التصلب المتعدد (MS)؛ وفي العدوان10.
معظم المركبات المثبطة KDM1A في التنمية السريرية هي مشتقات السيكلوبروبيلان وتمنع البروتين عن طريق ربط covalent إلى الفلافين الدينوكليوتيد (FAD) عامل مساعد11. تثبيط KDM1A يحفز تغييرات التعبير الجيني، ولكن هذه التغييرات تختلف اختلافا كبيرا عبر الأنسجة، وأنواع الخلايا، أو حالات المرض. تثبيط KDM1A أيضا يغير علامات الهيستون12،ولكن يتم إنتاج هذه التغييرات عموما محليا في موقع معين في الجينوم، ومرة أخرى، والأنسجة العالية والخلية محددة.
وقد تم تطوير البروتوكول لقياس المشاركة المستهدفة KDM1A مباشرة في العينات البيولوجية، وقد تم تحسينه للاستخدام مع مثبطات سيكلوبروبيلامين المشتقة. ويستند هذا التقييم على تكنولوجيا ELISA ويحلل، في موازاة ذلك، توتال وفري (أي غير مقيدة بمثبط) KDM1A في استخراج البروتين الأصلي من عينة بيولوجية في اختبار مرحلة صلبة. وكخطوة أولى، يتم تحليل العينة البيولوجية في وجود البكيويند KDM1A الانتقائي ة العلاج الكيميائي OG-88113،14،المستمدة من مثبطات KDM1A الانتقائية ORY-1001 (iadademstat)، وهو مثبط قوي من KDM1A في السريرية تطوير لعلاج أمراض الأورام. يحتوي المسبار الكيميائي على50 IC لKDM1A من 120 nM ويشمل moiety ملزمة FAD مرتبطة بالبولي ايثيلين غليكول biotinylated (PEG) الذيل. يرتبط المسبار الكيميائي حصريًا بـ KDM1A المجاني، ولكن ليس بـ KDM1A المثبط في العينة. بعد ربط المسبار الكيميائي، يتم التقاط المجمعات التي تحتوي على KDM1A في العينة على لوحات ميكروتيدر مع سطح مطلي streptavidin لتحديد KDM1A مجانا، أو على لوحات مغلفة مع الأجسام المضادة أحادية النسيلة المضادة لKDM1A التقاط لتحديد مجموع KDM1A. بعد الغسيل، يتم احتضان كلا اللوحتين بجسم مضاد للكشف المضاد لـ KDM1A، وغسلهما مرة أخرى، واحتضنهما بجسم مضاد للأرنب مضاد للأرانب من نوع HRP-conju،( HRP-conju/ لكشفه باستخدام الركيزة المضيئة والقياس الكمي عن طريق قياس النسبية وحدات الضوء (RLU) في مقياسالإنارة (الشكل 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59390/59390fig1.jpg"> الشكل 1 مخطط إنزيم إليسا مرتبط بالفحص المناعي الكيموبي للمشاركة المستهدفة KDM1A: أ) تحديد إجمالي KDM1A باستخدام ساندويتش ELISA و B) تحديد KDM1A مجانا باستخدام العلاج الكيميائي ELISA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59390/59390fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
يتم تضمين منحنى قياسي في كل من لوحات ELISA للتحقق من خطية كل مستوى. ثم يتم حساب تحديد المشاركة المستهدفة KDM1A في كل عينة كقيمة نسبية للعينة قبل الجرعة أو السيارة المعالجة.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0,05% Trypsin-EDTA (1X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#25300-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 X Protease Inhibitor Tablets</td>
			<td>Roche</td>
			<td>#11836153001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 deep well storage block</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#734-1679</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well ELISA plates</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>#436110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive black Film</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>#6050173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive transparent Film</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#60941-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated KDM1A probe OG-881</td>
			<td>Oryzon Genomics S.A.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td># 3117057001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin Standard</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#23208)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford Protein Assay</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>#500-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lysis buffer 10X</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#9803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge for 96- well plates</td>
			<td>Hettich</td>
			<td>Rotina 420R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flask</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#156499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Full length, enzymatically active human Recombinant LSD1 / KDM1A</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>#31426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism 5 Project</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminol-Enhacer and Peroxide Solution (Chemiluminescent Substrate)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#37074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader Infinite 200-Tecan</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>Infinite 200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal capture antibody Anti-KDM1A (N-terminal epitope)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>#ab53269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle G18 gauge blunt</td>
			<td>BD</td>
			<td>#303129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ORY-1001 (iadademstat)</td>
			<td>Oryzon Genomics S.A.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBMC separation tubes 10 ml</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>#163288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBMC separation tubes 50 ml</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>#227288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1x</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate shaker</td>
			<td>Heidolph Instruments</td>
			<td>Rotamax 120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysorbate 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#P7949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit monoclonal detection antibody Anti-KDM1A (C-terminal epitope)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#672184BF-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody Peroxidase-conjugated Donkey Anti-rabbit IgG</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#31458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer cuvette 1.5</td>
			<td>Deltalab</td>
			<td>#302100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer for cuvette</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>GeneQuant 1300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>#Z704A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>#303172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 1 ultrapure water</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Milli-Q Advantage A10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic cleaner</td>
			<td>VWR</td>
			<td>USC200T</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct measurement of kdm1a target engagement using chemoprobe-based immunoassays

وتقييم المشاركة المستهدفة، التي تعرف بأنها تفاعل دواء مع البروتين الذي صمم له، هو شرط أساسي لتفسير النشاط البيولوجي لأي مركب في تطوير المخدرات أو في مشاريع البحوث الأساسية. في علم الوراثة، يتم تقييم المشاركة المستهدفة في معظم الأحيان عن طريق تحليل علامات الوكيل بدلاً من قياس اتحاد المركب إلى الهدف. تتضمن التبيّات البيولوجية في المصب التي تم تحليلها تعديل علامة الهيستون أو تغييرات التعبير الجيني. KDM1A هو demethylase يسين الذي يزيل مجموعات الميثيل من H3K4 أحادية وثنائية الميثيل، وهو تعديل يرتبط بإسكات التعبير الجيني. تعديل علامات الوكيل يعتمد على نوع الخلية ووظيفة التركيبة الوراثية للخلايا التي تم التحقيق فيها، والتي يمكن أن تجعل التفسير والمقارنة بين الحالات صعبة للغاية. وللتحايل على هذه المشاكل، يتم تقديم بروتوكول متعدد الاستخدامات لتقييم آثار الجرعة وديناميات المشاركة المستهدفة المباشرة في KDM1A. الفحص الموصوف يجعل استخدام مسبار كيميائي KDM1A لالتقاط وقياس الإنزيم غير المثبط، ويمكن تطبيقه على نطاق واسع على الخلايا أو عينات الأنسجة دون الحاجة إلى التعديل الوراثي، لديه نافذة ممتازة للكشف، ويمكن استخدامها على حد سواء للبحوث الأساسية وتحليل العينات السريرية.

خطية التحديد الكلي والحر KDM1A.
تم إعداد سلسلة قياسية كما هو موضح في الخطوة 5.3.2.، وذلك باستخدام 0 إلى 2500 pg من إنزيم KDM1A المؤتلف البشري كامل الطول. تم تقييم قيم RLU من المجموع وRKDM1A الحرة للتحقق من الخطية (الشكل2A و 2B).</s...

Watch this Scientific Journal Video about Direct Measurement of KDM1A Target Engagement Using Chemoprobe-based Immunoassays at JoVE.com

Direct Measurement of KDM1A Target Engagement Using Chemoprobe-based Immunoassays

القياس المباشر للمشاركة المستهدفة KDM1A باستخدام الاختبارات المناعية المستندة إلى العلاج الكيميائي

هنا، نقدم بروتوكوللقياس المشاركة المستهدفة KDM1A في خلية بشرية أو حيوانية، أو أنسجة أو عينات دم عولجت بمثبطات KDM1A. يستخدم البروتوكول وضع علامات المسبار الكيميائي لإنزيم KDM1A المجاني والتحديد الكمي المباشر للمهنة المستهدفة باستخدام الاختبارات المناعية المستندة إلى العلاج الكيميائي ويمكن استخدامها في الدراسات ما قبل السريرية والسريرية.

The assessment of the target engagement, defined as the interaction of a drug with the protein it was designed for, is a basic requirement for the ...

وتقييم المشاركة المستهدفة، أي تفاعل المخدرات مع البروتين الذي صمم من أجله، هو شرط أساسي لتفسير النشاط البيولوجي لأي مركب في تطوير العقاقير، أو في مشاريع البحوث الأساسية. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بقياس تأثير الجرعة وديناميات الاشتباك المستهدف لـ KDM1A، بدلاً من قياسات تأثيرات المصب مثل علامات الهستون والتعبير. ويمكن تطبيق هذه التقنية في البحوث الأساسية وأيضا في التجارب السريرية، في الجهاز العصبي المركزي أو أمراض أخرى تخضع للعلاج مع مثبطات KDM1A لدراسة ديناميكا دوائية.ويستند هذا الأسلوب على العلاج الكيميائي وضعت لدراسة ORY-1001، iadademstat، ولكن يمكن استخدامها حقا لمثبطات KDM1A أخرى واستراتيجية يمكن تطبيقها على أهداف أخرى. سيتم إثبات الإجراء من قبل راكيل رويز، مدير العمليات في منصة اكتشاف PK/PD من مختبري. أثناء معالجة الخلية مع ORY-1001 يرتبط المركب إلى البروتين KDM1A الموجودة في النواة.لبدء هذا الإجراء، واسترداد 10 ميكرولتر واحد use aliquot من 20 ملليمترا biotinylated مسبار OG-881 حل المخزون من الثلاجة والسماح لها الاحماء في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة. باستخدام micropipet مع نصائح التصفية، بشكل متسلسل تخفيف حل الأسهم لإعداد حل العمل micromolar اثنين. بعد ذلك ، قم بحل قرص واحد من مثبطات البروتياز في ملليلتر واحد من PBS في أنبوب microcentrifuge.لكل ملليلتر من حجم المطلوب من 1x خلية تحلل العازلة مع العلاج الكيميائي، مزيج 100 ميكرولترات من التجارية التي تم الحصول عليها 10x خلية تحلل العازلة، 150 ميكرولترات من مثبطات البروتياز 10x، 12.5 ميكرولترات من اثنين من الحل العامل OG-881 micromolar و 737.5 ميكرولترات من نوع-1 مزدوجة الماء المقطر. يتم تحلل الخلايا في 1x تحلل العازلة في وجود الكيماوي الذي يربط مع أي بروتين KDM1A مجانا. للتحضير من الأنسجة ، استخدم هاون وحشرات مبردة على الجليد الجاف لسحق وتجانس قطعة سنتيمتر مكعب واحد من الأنسجة المجمدة.Aliquot الأنسجة في قارورة ذات استخدام واحد، مع التأكد من نقل ما يقرب من 40 ملليغرام من مسحوق الأنسجة في كل قارورة، مع تجنب الذوبان في جميع الأوقات. تخزين العينات في 80 درجة مئوية حتى جاهزة للمعالجة. لإعداد من الكريات الخلية، resuspend بيليه من حوالي 10 مليون خلية في 200 ميكرولترات من تحلل الخلايا 1x العازلة التي تحتوي على 25 نانوموللار OG-881.دوامة كل عينة لفترة وجيزة والاحتفاظ بها على الجليد لمدة خمس دقائق. باستخدام سونيكاتator، sonicate العينات مع ثلاث نبضات في 45 كيلو هيرتز دائم لمدة 20 ثانية لكل من. ضع العينات على الجليد لمدة 20 ثانية بين البقول.إبقاء العينات على الجليد لمدة خمس دقائق إضافية. ثم، دوامة لفترة وجيزة والطرد المركزي العينات في 14،000 مرات G لمدة 10 دقائق في جهاز طرد مركزي الذي هو ما قبل المبردة في أربع درجات مئوية. باستخدام ميكروبيبت ميليلتر واحد نقل كل عظمى في أنبوب منفصل 1.5 ملليلتر microcentrifuge.اترك الأنابيب على الجليد لمدة ساعتين قبل المعالجة. ثم، كمي البروتين الأصلي باستخدام مقايسة برادفورد كما هو موضح في بروتوكول النص. لوحة إجمالية مغلفة بالأجسام المضادة KDM1A.لوحة مجانية مغلفة مع streptavidin. ثم يضاف lysate الخلية إلى كل من لوحات ويتم التقاط مجمع KDM1A مباشرة أو من خلال العلاج الكيميائي. يتم غسلها لوحات ومحتضنة مع المضادة المضادة KDM1A المضادة المضادة والجسم المضاد الثانوية مقترنة بيروكسيديز الفجل.وأخيرا، يتم إضافة الركيزة الإنارة وإشارة ولدت. بالنسبة لمجموع KDM1A ELISA، قم بإعداد 10 ملليلترات من الأجسام المضادة KDM1A في برنامج تلفزيوني لتركيز نهائي من اثنين ميكروغرام لكل ملليلتر لكل لوحة. نقل 100 ميكروليتر في كل بئر من لوحة.لKDM1A ELISA مجانا، وإعداد 10 ملليلتر من streptavidin في برنامج تلفزيوني كتركيز 10 ميكروغرام لكل ملليلتر لكل لوحة. نقل 100 ميكروليتر في كل بئر من لوحة. ثم، ختم أعلى كل لوحة مع فيلم لاصق واحتضان بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية.في اليوم التالي، قم بإزالة الأطباق من الثلاجة واتركها توازن في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 دقيقة تقريبًا. اغسل كل طبق ثلاث مرات مع عازلة الغسيل، مع التأكد من الاستفادة من لوحة على المناشف الورقية بعد كل خطوة الغسيل لإزالة أي حل المتبقية. إضافة 200 ميكروليتر من العازلة حظر إلى كل بئر من كل من لوحات.أعلى ختم لوحات مع فيلم لاصق واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين. وفي الوقت نفسه، تمييع مستخلصات البروتين الأصلي التي تم الحصول عليها سابقا مع برنامج تلفزيوني إلى التركيز المناسب ووضع لوحة لإعداد منحنى قياسي باستخدام الإنسان rKDM1A كما هو مبين في بروتوكول النص. بعد اكتمال الحضانة لمدة ساعتين، تخلص من عازلة الحجب وغسل الأطباق مع عازلة غسل، مع التأكد من الاستفادة من لوحة على المناشف الورقية بعد كل خطوة الغسيل لإزالة أي حل المتبقية.نقل العينات المخففة المناسبة إلى كتلة تخزين آبار عميقة 96 المبردة بعد توزيع اللوحة الموجودة في الجدول الثاني من بروتوكول النص. الحفاظ على هذه الكتلة على الجليد في حين pipetting 100 ميكروليتر في البئر في لوحات ELISA المجموع والحرة بعد توزيع لوحة وجدت في الجدول الثالث من بروتوكول النص. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة، ثم تجاهل العينات وغسل لوحات خمس مرات مع عازلة الغسيل.إعداد 20 ملليلتر من الأرانب المضادة KDM1A المضادة للكشف في كتلة العازلة في تركيز 0.125 ميكروغرام لكل ملليلتر. إضافة 100 ميكرولترات من كشف حل الأجسام المضادة إلى كل بئر من كلا الصفائح، باستثناء تلك المقابلة للضوابط السلبية. أعلى ختم لوحات مع فيلم لاصقة واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة.بعد ذلك، تجاهل حل الأجسام المضادة للكشف وغسل لوحات ست مرات مع العازلة غسل. إعداد 25 ملليلتر من الأجسام المضادة المضادة الماعز الثانوية المضادة للأرانب، HRP، إلى تخفيف من واحد إلى 5،000 في عازلة منع. إضافة 100 ميكرولترات من حل الأجسام المضادة الثانوية إلى كل بئر من لوحات microtiter واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة.قبل 30 دقيقة من نهاية هذا الحضانة، مزيج أجزاء متساوية من محسن لومينول ومحلول بيروكسيد في زجاجة العنبر في ظل ظروف خفيفة لينة. اترك هذا الخليط في درجة حرارة الغرفة. عندما اكتمال الحضانة ساعة واحدة، والتخلص من حل الأجسام المضادة الثانوية وغسل لوحات ست مرات مع عازلة غسل.المقبل، pipet 100 ميكرولترات من حل العمل لومينول إلى كل بئر من لوحات، والتأكد من pipet ببطء شديد لتجنب تشكيل فقاعة. استخدام جهاز توقيت للسيطرة على الوقت بين إضافة الحل وقياس الإنارة من لوحات والحفاظ على هذا الوقت ثابت لتحقيق جيدة بين التكرار. قم بختم اللوحات بالأفلام اللاصقة وأجهزة الطرد المركزي بمعدل 500 مرة في G وفي درجة حرارة الغرفة لمدة 45 ثانية للقضاء على أي فقاعات متبقية.احتضان لوحات على لوحة شاكر في 100 دورة في الدقيقة لمدة دقيقة واحدة. ثم، إزالة فيلم لاصقة وإدراج لوحة في قارئ microplate وتركها لمدة ثلاث دقائق لتحقيق الاستقرار في درجة الحرارة عند 25 درجة مئوية. اقرأ وحدات الإنارة النسبية لكل مقايسة لوحة ELISA.حفظ القيم RAW RLU ونسخها من ملفات جدول البيانات الخام لمزيد من التحليل. في هذه الدراسة، يتم استخدام رواية KDM1A التقاط الكيماوي ELISA مقرها لقياس مباشرة KDM1A الاشتباك المستهدف في الخلايا وعينات الأنسجة. يتم تقييم قيم RLU من إجمالي و rKDM1A حرة للتحقق من الخطية.ثم يتم فرض قيم RLU من KDM1A المجموع والحرة التي تم الكشف عنها في PBMCs الإنسان من ثلاثة متطوعين مستقلين على المنحنى القياسي. يتم استزراع خلايا AML بعد توصيات الموفر ويتم التعامل معها إما بمركبة أو ORY-1001 بتركيزات مختلفة. يتم الحصول على استخراج البروتين الأصلي في وجود 25 ملليمتر OG-881 chemoprobe ويستخدم 0.5 ميكروغرام من البروتين الكلي لإجراء تحليل المشاركة المستهدفة.يتم بعد ذلك تحديد إجمالي وخالى KDM1A ويتم حساب النسب المئوية للمشاركة المستهدفة من ORY-1001 إلى KDM1A نسبة إلى السيارة. الجرعة المستجيبة KDM1A الهدف المشاركة في PBMCs وفي علاج الرئة من الفئران مع ORY-1001 عن طريق gavage عن طريق الفم، والنسبية المحسوبة مجموعة السيارة هو مبين هنا. الحضانة السابقين مع الحاضنة nanomolar ORY-1001 من مستخلصات البروتين الرئوي من الحيوانات المعالجة مركبة، وغلة TE كامل، ولكن لا زيادة في TE في عينات من الفئران المعالجة لمدة أربعة أيام مع 30 ميكروغرام لكل كيلوغرام ORY-1001، مؤكدا KDM1A بالفعل تماما في الجسم الحي.ويقيِّم هذا البروتوكول الالتزام المستهدف من قِبل KDM1A من خلال قياس الهدف الحر والمجموعي لـ KDM1A. تذكر أنه يتطلب استخراج البروتين الأصلي. ويمكن استخدام هذه التقنية على عينات من أنواع مختلفة لتقييم مثبطات محددة، وأيضا لفحص مثبطات جديدة.ويمكن أيضا أن يكون تطبيق العلاج الكيميائي المستخدمة في هذه الدراسة للمعالجة الكيميائية للمعالجة التفاعل KDM1A. تذكر أن تعمل بأمان وتحترم في جميع الأوقات التدابير الوقائية عند التعامل مع العينات البيولوجية والمركبات النشطة بيولوجيا مثل مثبطات KDM1A.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Covalent Binding of Antibodies to Cellulose Paper Discs and Their Applications in Naked-eye Colorimetric Immunoassays

التساهمية ملزم من الأجسام المضادة لالسليلوز أقراص الورق وتطبيقاتها في العين المجردة اللونية يمونواسايس

This report presents two methods for the covalent immobilization of capture antibodies on cellulose filter paper grade No. 1 (medium-flow filter paper) ...

Measurement of Basal and Forskolin-stimulated Lipolysis in Inguinal Adipose Fat Pads

قياس بازال و فورسكولين تحفيز انحلال الدهون في الأربطة الدهنية الدهنية

Lipolysis is a process by which the lipid stored as triglycerides in adipose tissues are hydrolyzed into glycerol and fatty acids. This article describes ...

Utilizing a Comprehensive Immunoprecipitation Enrichment System to Identify an Endogenous Post-translational Modification Profile for Target Proteins

استخدام نظام إثراء إيمونوبريسيبيتيشن شاملة لتحديد ملف تعريف تعديل بوستترانسلاشونال ذاتية للبروتينات المستهدفة

It is now well-appreciated that post-translational modifications (PTMs) play an integral role in regulating a protein&#39;s structure and function, which ...

Simultaneous Measurement of Superoxide/Hydrogen Peroxide and NADH Production by Flavin-containing Mitochondrial Dehydrogenases

قياس متزامنة من بيروكسيد الهيدروجين فائق أكسيد/وإنتاج NADH Dehydrogenases المتقدرية المحتوية على فلافين

It has been reported that mitochondria can contain up to 12 enzymatic sources of reactive oxygen species (ROS). A majority of these sites include ...

Measurement of Mitochondrial Oxygen Consumption in Permeabilized Fibers of Drosophila Using Minimal Amounts of Tissue

قياس استهلاك الأوكسجين المتقدرية في ألياف بيرميبيليزيد من المورفولوجية استخدام كميات ضئيلة من الأنسجة

The fruit fly, Drosophila melanogaster, represents an emerging model for the study of metabolism. Indeed, drosophila have structures homologous to human ...

A Direct Force Probe for Measuring Mechanical Integration Between the Nucleus and the Cytoskeleton

تحقيق قوة مباشرة لقياس التكامل الميكانيكية بين النواة وسيتوسكيليتون

The mechanical properties of the nucleus determine its response to mechanical forces generated in cells. Because the nucleus is molecularly continuous ...

Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells

استخدام المحتوى العالي من التصوير لقياس الهدف المشاركة في خلايا ملتصقة

Quantitating the interaction of small molecules with their intended protein target is critical for drug development, target validation and chemical probe ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

قياس حساسية عالية من الانتماءات الملزمة الحمض النووي عامل النسخ بالتنافسية معايرة باستخدام مجهر الأسفار

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Cortisol Measurement in Koala (Phascolarctos cinereus) Fur

Cortisol Measurement in Koala Phascolarctos cinereus Fur

قياس الكورتيزول في كوالا(فيسكولارتوس سينيريوس)الفراء

Optimal methods of hormone extraction used to measure stress in animals across sample types are not always the same. Australia&#39;s iconic marsupial ...

A Semi-Quantitative Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) assay for studying Rapamycin/mTOR interaction

A Semi-Quantitative Drug Affinity Responsive Target Stability DARTS assay for studying Rapamycin/mTOR interaction

شبه كمية المخدرات تقارب استجابة الهدف الاستقرار (DARTS) دراسة التفاعل راباميسين / mTOR

Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) is a robust method for detection of novel small molecule protein targets. It can be used to verify known ...